. Es ist bekannt, dass derzeit große Anstrengungen unternommen werden, Biomoleküle und lebende Zellen in anorganischen Matri- zen zu immobilisieren, da daraus im Vergleich zu den bislang verwendeten polymeren Matrizen insbesondere die folgenden Vor- teile erwartet werden : - hohe mechanische, thermische und photochemische Stabilität, hohe Transparenz, - biologische Inertheit (d. h. keine Nahrungsquelle für Mikro- organismen), und - steuerbare Porosität und variabler Immobilisierungsgrad.

Solche Biokompositmaterialien bieten zahlreiche neue potenziel- le vorteilhafte Anwendungsmöglichkeiten, z. B. zur Herstellung biokompatibler Oberflächen in der Medizintechnik, zur Biokata- lyse, Biogenese und für neuartige Wirkstoff-Freisetzungs- systeme.

Neben der Möglichkeit, Biomoleküle oder Bakterienzellen an an- organischen Trägern wie Silicagel, Bentonit u. a. adsorptiv an der Oberfläche zu fixieren, wie es beispielsweise in IN 171Q47 beschrieben wird, besteht die Möglichkeit einer direkten Ein- bettung von Biomolekülen in eine anorganische Matrix durch Nut- zung der Sol-Gel-Technik (vgl. C. J. Brinker und G. Scherer in "Sol-Gel Science : The Physics and Chemistry of Sol-Gel- Processing", Academic Press Inc., Boston 1990).

Auf diese Weise ist zum Beispiel die Einbettung von Enzymen o- der Proteinen in anorganische Matrizen möglich (siehe z. B. US 5 200 334 oder US 5 300 564). Nach der Immobilisierung von le- benden Hefezellen in Si02-Sol-Gel-Matrizen (G. Carturan et al. ; Mol. Catal.. 57 (1989) L13) wurden in prinzipiell ähnlicher Weise Zellgewebe in Organosilikone (US 5 693 513), Pflanzenzel- len in poröse Si02-Gele (WO 96/36703), tierische Zellen in ein' Gel, hergestellt aus einem Crganosilkon (US 5 739 020) bzw. ei- ne aus der Gasphase erzeugte Si02-Schicht eingekapselt (WO 97/45537). Zur Einkapselung von Mikroorganismen wird ferner die Kombination von SiO2-Gelen mit wasserlöslichen Polymeren wie Po- lyvinylalkohol, Gelatine (US 4 148 689) oder Alginaten (US 4 797 358, WO 96/35780) beschrieben.

Eine Alternative zu den Sol-Gel-Systemen sollte aus praktischer Sicht die homogene Einbettung von Biomolekülen in keramische Werkstoffe darstellen, da diese gegenüber Sol-Gel-Matrizen bil- liger, stabiler und formbar sind, und'zudem. eine etablierte Herstellungstechnologie zur Verfügung steht. Ein Hindernis be- steht jedoch bisher in der Notwendigkeit, klassische keramische Formkörper durch einen Sinterprozess bei hohen Temperaturen, zum Beispiel oberhalb 600°C zu verfestigen. Da bei diesen Tem- peraturen jede organische Materie zerstört wird, war es bislang nicht möglich, Biomoleküle oder lebende Zellen in konventionel- le keramische Massen einzubetten.

Aus DE 100 65 138 wird die Herstellung poröser Keramikformteile abweichend von den klassischen Verfahren bei niedrigen Tempera- turen beschrieben. Bei diesem Verfahren wird eine spezielle Zu- sammensetzung einer keramischen Suspension verwendet, die einem in bestimmter Weise gesteuerten Gefrier-Trocknungsvorgang un- terzogen wird. Bei. dem aus DE 100 65 138 bekannten Verfahren konnte jedoch eine Einbettung von Biomaterialien nicht in Be- tracht gezogen werden, da nach dem Trocknungsvorgang zur Ver- festigung der Keramikformteile eine für Biomaterialien schädli- che Zusatzbehandlung mit Säuren oder Laugen erforderlich war.

Die Zusatzbehandlung dient einer Auslaugung, die zur Komposit- verfestigung führt.

Biomoleküle oder Mikroorganismen wurden darum bislang nur als Hilfsmittel (porenbildende Substanzen) keramischen Massen zuge- setzt, die beim Sintervorgang eine gesteuerte Porosität der Ke- ramik ergeben, z. B. für künstliche Knochen-Materialien (GB 2 365 423) oder andere funktionelle Keramiken (US 5 683 664, EP 631 998).

Die Immobilisierung von lebenden Mikroorganismen an Keramiken war bislang nur durch nachträgliche Tränkung poröser kerami- scher Oberflächen mit wässrigen Dispersionen von Mikroorganis- men möglich (WO 98/13307). Dieses Verfahren hat jedoch eine Reihe von Nachteilen : der Immobilisierungsgrad ist gering, die Reproduzierbarkeit schlecht und die dazu geeigneten Keramiken erfordern mittlere Porengrößen, die über der z. T. beträchtli- chen Größe der Mikroorganismen liegen.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, verbesserte keramische Kompo- sitmaterialien bereitzustellen, die mindestens ein Biomaterial enthalten, wobei die Kompositmaterialien die Nachteile herkömm- licher Kompositmaterialien vermeiden sollen. Die Aufgabe der Erfindung besteht insbesondere in der Bereitstellung von Kompo- sitmaterialien mit einem verbesserten Immobilisierungsgrad für . das mindestens eine Biomaterial und einer erhöhten Lebensfähig- keit und/oder Wirksamkeit des Biomaterials. Erfindungsgemäße Kompositmaterialien sollen ferner mit einem erweiterten Bereich mittlerer Porengrößen herstellbar und für neue Anwendungen nutzbar sein. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ver- besserte Verfahren zur Herstellung derartiger Kompositmateria- lien bereitzustellen, die sich insbesondere durch eine für das Biomaterial schonende Verfahrensführung auszeichnen.

Diese Aufgaben werden durch Kompositmaterialien und Verfahren mit den Merkmalen gemäß den Patentansprüchen 1 oder 15 gelöst.

Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Eine erste Grundidee der Erfindung ist es, ein keramisches Kom- positmaterial, das auf der Basis eines keramischen Substratma- terials gebildet ist, dahingehend weiterzubilden, dass in das Substratmaterial mindestens ein biologisches Material und min- destens ein Verfestigungsmaterial homogen eingebettet sind, wo- bei das Verfestigungsmaterial miteinander verbundene, aus einem nanopartikulären Sol gebildete, anorganische Nanopartikel um- fasst. Es wird ein nanopartikuläres, gelbildendes und vernet- zendes Verfestigungsmaterial verwendet. Eine homogene Einbet- tung des Biomaterials in das Kompositmaterial bedeutet einen hohen Immobilisierungsgrad und damit eine hohe Stabilität und langdauernde Wirksamkeit des Kompositmaterials. Das im Kompo- sitmaterial enthaltene Verfestigungsmaterial ermöglicht die An- wendung einer für das Biomaterial schonenden Prozedur zur Kera- mikverfestigung bei niedrigen Temperaturen.

Das erfindungsgemäße bioaktive keramische Kompositmaterial, be- stehend aus einem keramischen Substrat und darin homogen ver- teilten, z. B. lebenden Zellen, kann bei so niedrigen Temperatu- ren hergestellt werden, dass keine Denaturierung des Zellmate- rials während des Verfestigungsprozesses erfolgt. Die Erfindung gewährleistet eine so hohe Lebensfähigkeit der eingebetteten Zellen, dass eine Verwendung des Biokompositmaterials z. B. als Biokatalysator oder Biofilter zur Reinigung von schadstoff- belastetem Abwasser möglich ist.

Verfahrensbezogen basiert die Erfindung insbesondere auf einer Abwandlung des aus DE 100 65 138 bekannten Verfahrens dahinge- hend, dass durch die erfindungsgemäße Verwendung des nanoparti- kulären Verfestigungsmaterials auf den herkömmlichen Einsatz von Säuren zur Auslaugung, die zur Kompositverfestigung führt, verzichtet werden kann. Es hat sich überraschenderweise ge- zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren eine Verfestigung des Komposits bei Raumtemperatur oder bei niedrigeren Tempera- turen ermöglicht.

Die erfindungsgemäßen keramischen Komposite werden vorzugsweise durch Verfestigung an sich bekannter keramischer Schlicker, be- stehend aus wäßrigen Dispersionen von Aluminiumoxid-oder Alu- mosilikat-Pulvern oder-Fasern, erzeugt. Besonders vorteilhaft. ist die Verwendung von Fasermaterial, da es die Herstellung me- chanisch besonders stabiler Formkörper bei Raumtemperatur gestattet. Durch den Einsatz wäßriger Dispersionen ist auch die Zumischung wäßriger Zelldispersionen ohne Probleme möglich.

Ein wesentliches Merkmal der Erfindung besteht nun darin, durch die Zumischung gelierungsfähiger anorganischer Nanosole den Schlicker zu verfestigen. Dazu werden vorzugsweise Nanosole mit einem mittleren Teilchendurchmesser unter 200 nm verwendet. Die verfestigenden Nanosole bestehen gemäß bevorzugten Ausführungs- formen der Erfindung aus nanopartikulären Oxiden von Elementen der II. bis V. Haupt-oder Nebengruppe des Periodensystems oder deren Gemische in Wasser oder einem wässrig-organischen Lö- sungsmittel. Es können beispielsweise Nanosole aus Si02, A1203, Zr02, TiO2, B203, ZnO, CaO, P205 oder deren Gemische verwendet werden, die man z. B. durch saure oder alkalische Hydrolyse der entsprechenden Metallalkoxide erhält.

Für die Modifizierung der Nanosol-Eigenschaften kann. der Hydro- lyseprozeß der Metallalkoxide in Gegenwart zugemischter Trial- koxysilane R-Si (OR') 3 und/oder Dialkoxysilane R2-Si (OR') 2 durch- geführt werden, wodurch modifizierte Metalloxidsole gebildet werden, die bezogen auf 1 Gewichtsanteil Metalloxid 0 bis 2 Gewichtsanteile R-Si03/2 und/oder R2=SiO enthalten. R ist dabei ein organischer Alkyl-oder Arylrest, der Amino-, Hydroxy-, E- poxy-oder Alkoxygruppen enthalten kann oder durch Halogene substituiert ist. R'ist ein Alkylrest, vorzugsweise mit 1 bis 16 Kohlenstoffatomen. Durch diese Modifizierung können z. B. die mechanischen und Oberflächen-Eigenschaften der Komposite ge- zielt an die jeweils gewünschte Anwendung angepasst werden. Der Anteil des Verfestigungsmaterials im Komposit kann je nach ge- wünschtem Verfestigungsgrad bis zu 70 Gewichtsprozent betragen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von bioaktiven keramischen Kompositmaterialien gestattet die effektive Immobi- lisierung eines breiten Spektrums verschiedener Biomaterialien, speziell den Einsatz lebender Organismen wie z. B. Bakterien, Pilzen, Algen und Protozoen. Entsprechend können vielzellige tierische und pflanzliche Zellverbunde immobilisiert werden.

Der Anteil der lebenden Zellen kann dabei vorteilhafterweise bis 30 Gew.-% bezogen auf das getrocknete Biokomposit betragen.

Das Verfahren eignet sich alternativ zur Immobilisierung von toten Zellen, Zellbestandteilen, Enzymen und anderen Proteinen, Biopolymeren und anderen bioaktiven molekularen Stoffen.

Für die Erhöhung der Gebrauchswerteigenschaften der bioaktiven keramischen Kompositmaterialien kann der Zusatz spezieller Ad- ditive vorteilhaft sein. Zur Erhöhung der biologischen Aktivi- tät können Glycerol oder andere Polyole und/oder Nährstoffe zu- gesetzt werden.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfin- dung kann durch den Zusatz wasserlöslicher Polymere wie Polyvi- nylalkohol oder Polyacrylsäure die Dispergierbarkeit der Schlickerbestandteile verbessert und durch polare Wechselwir- kungen der anorganischen Oxidmatrix die mechanische Stabilität der bioaktiven keramischen Kompositmaterialien erhöht werden.

Der Anteil der Zusätze kann vorteilhafterweise bis 30 Gew.-% bezogen auf das trockene Biokomposit betragen.

Das Verfahren zur Herstellung eines bioaktiven keramischen Kom- positmaterials ist insbesondere durch die folgenden Schritte gekennzeichnet : (1) Mischung eines Schlickers aus einer wäßriger Dispersionen von Aluminiumoxid-oder Alumosilikat-Pulvern oder-Fasern und dem dispergiertem Biomaterial, insbesondere bioaktiven Zellmaterial (2) Zugabe des nanopartikulären Verfestigungsmaterials und ggf. anderer Additive zur Verbesserung der biologischen Aktivität und Erhöhung der mechanischen Stabilität, und (3) Verfestigung des Materials ; ggf. in Gussformen, durch (a) einen Freezecasting-Prozeß (vgl. Beispiel 1) Freezecasting (oder : Gefriergelieren) ist ein Formgebungsver- fahren, bei dem die Mischung eines keramischen Pulvers und des verfestigenden Nanosols in einem Gefrierschrank oder einem Stickstoffbad eingefroren wird, wobei sich das Sol irreversibel in die Gelphase umwandelt und damit die keramischen Körner um- schließt und miteinander vernetzt. Das auskristallisierte Was- ser wird entweder durch Auftauen und Verdampfen oder (im Falle der üblichen Gefriertrocknung) durch Sublimation entfernt. Der Freezecasting-Prozeß zeichnet sich in vorteilhafter Weise durch ein homogenes Gefüge und eine gute Maßhaltigkeit der Formkörper sowie durch geringe Trocknungsschwindung nach. dem Gefrieren aus, wodurch geringe Nachbearbeitungen erforderlich sind.

(b) Neutralisation bei Raumtemperatur (vgl. Beispiel 2) Insbesonders im Fall von Schlickermaterialien auf Basis faser- förmiger Oxide (z. B. Sintermullit) gelingt eine Verfestigung bei Raumtemperatur durch Neutralisation, da am Neutralpunkt die Nanosole spontan gelieren und ähnliche Vernetzungs-und Ver- festigungs-Prozesse wie beim Freezecasting ablaufen.

Gemäß einem besonderen Vorteil der Erfindung kann die Formge- bung gemäß (3a) bei Temperaturen unterhalb des Gefrierpunkts von Wasser durchgeführt werden, bei denen die Lebensfähigkeit von Biomaterialien erhalten bleibt. Besonders vorteilhaft kann es sein, wenn das Freezecasting bei Temperaturen bis-80°C und die mögliche Gefriertrocknung bei Temperaturen bis zu-40°C durchgeführt wird.

Nach dem Gefrieren entsprechend (3a) wird der sog. Grünkörper im gefrorenen Zustand aus der Metallform entfernt und gefrier- getrocknet. Entsprechend (3b) wird nach Neutralisation und Er- starrung der Grünkörper bei Raumtemperatur an der Luft oder im Vakuum getrocknet.

Aufgrund der Herstellung des bioaktiven keramischen Kompositma- terials bei niedrigen Temperaturen und geringer Restfeuchten ist eine hohe Lebensfähigkeit der immobilisierten Zellen und Bioaktivität gewährleistet. Darum können derartige Kompositma- terialien in Form eines Formkörpers oder einer Membran als Bio- katalysator oder Biofilter zur Reinigung von schadstoffbelaste- tem Abwasser verwendet werden. Aufgrund ihrer guten mechani- schen Stabilität bieten sich zerkleinerte Formteile vorteilhaft als Säulenfüllungsmaterial in Bioreaktoren an.

Erfolgreiche Versuche wurden durchgeführt zur Verwendung von erfindungsgemäßen Kompositen mit (i) immobilisierten Hefezellen Saccharomyces cerevisiae als Fermentationskatalysator (ii) immobilisierte Bakterien Bacillus sphaericus als Biofil- ter zur Entfernung von Schwermetallionen aus Uranabwäs- sern (iii) immobilisierte Bakterien Rhodococcus spec. als Biokataly- sator zum Abbau von Phenol und Glykolen in salzhaltigen Industrieabwässern.

Darüber hinaus bieten die erfindungsgemäßen bioaktiven kerami- schen Kompositmaterialien neue Möglichkeiten zur Herstellung poröser Keramiken mit definierter einheitlicher Porengröße, in- dem durch thermische Zersetzung der biologischen Bestandteile bei Temperaturen von mindestens 500°C keramische Werkstoffe mit einer Porenstruktur erzeugt werden, die der Form und der Menge der immobilisierten Biokomponente entspricht (vgl. Bei- spiel 3). Von besonderem Interesse sind aufgrund ihrer leichten Zugänglichkeit und ihrer fast monodispersen Größenverteilung sphärische Hefesporen, die beim Verflüchtigen während des Sin- terns formgetreue Poren hinterlassen Es wurde beobachtet, dass verschiedene biologische Bestandteile wie ein organischer Bin- der fungieren und bei Temperaturen von mindestens 70°C feste schwindungsfreie Grünkörper bilden. Dadurch lsåßt sich der An- teil nanopartikulärer Verfestigungsmittel zur Herstellung bio- aktiver keramischer kompositmaterialien drastisch senken.

Damit lassen sich die Vorteile der erfindungsgemäßen bioaktiven keramischen Komposit-materialien gegenüber dem Stand der Tech- nik in folgenden Punkten zusammenfassen : - es können erstmals lebende Zellen in homogener Verteilung und hoher biologischer Aktivität unter Erhaltung der Lebensfähig- keit in einem keramischen Formkörper immobilisiert werden, die bioaktiven keramischen Kompositmaterialien sind beliebig je nach den Anforderungen der konkreten Anwendung formbar und zeigen eine hohe mechanische Stabilität, - durch die Art der Zusammensetzung und Herstellungstechnologie kann die Porosität der Komposite und damit deren biologische Aktivität und Reaktivität in weiten Grenzen gesteuert werden - das Verfahren ist universell anwendbar, - unterschiedliche Mikroorganismen und Zellsysteme können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in ein Komposit überführt werden, - es sind zahlreiche Anwendungen als Biokatalysator oder Bio- filter möglich, und - die thermische Entfernung der Biokomponente bietet neue Mög- lichkeiten zur Herstellung poröser Keramiken.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Immobilisierung von Bacillus spaericus und Saccharomyces ce- revisiae durch Freezecasting (a) Herstellung des Kompositmaterials Als Zellmaterial wurden Bacillus sphaericus Zellen, entspre- chende Sporen (die aus den Zellen durch verringertes Nahrungs- angebot und Zusatz von Mangan-Salzen erhalten wurden), sowie normale Bäckerhefe-Zellen (Saccharomyces cerevisiae) verwendet.

Der Schlicker hatte folgende Zusammensetzung : + 54 Gew.-% Mullit (Mullit73, Osthoff-Petrasch, Hamburg) und 16 Gew.-% A1203 (mittlerer Teilchendurchmesser 700 nm) als ke- ramische Matrix + 27 Gew.-% Nyacol 1440 (Akzo Nobel Chemicals Wurzen) als nano- partikuläres Verfestigungsmaterial, Kieselsäuresol mit 40 % Feststoffgehalt und mittlerem Partikeldurchmesser von 14 nm 3 % Glycerol als Additiv.

+ 4 ml der Schlickerlösung wurden mit jeweils 1 ml Zellkultur mit definierten Zellzahlen gemischt und auf eine-40°C- Metallplatte getropft, wodurch Pellets (mit 3 bis 6 mm Durch- messer) bzw. Scheiben (3 cm Durchmesser, 1 cm Höhe) gebildet werden, die anschließend gefriergetrocknet werden.

(b) Test des Kompositmaterials Tabelle 1 : Anzahl lebender Bacillus sphaericus-Zellen und Spo- ren (CFU) nach Lagerung bei 4°C (bestimmt durch Kultivierungs- test) Lagerzeit Lebende Zellen Lebende Sporen /Tage CFU/g Komposit CFU/g Komposit 6 1.2 x 106 6. 4 x 106 124 9.0 x 105 5. 7 x 106 Tabelle 2 : Anzahl lebender Zellen (bestimmt durch Kultivie- rungstest) B. sphaericus Saccharomyces cerevisiae Nicht control 1.1 x 109 / 15 µl 3.2 x 106/1. 5 mg immo- bili- sierte dried 2. 1 x 105/15 µl Zellen 7 x 104 / 15 µl Freezecasting Kom- 4 x 103 / 1.5 mg resp. resp. 100 mg posit 100 mg Komposit Komposit Tabelle 3 : Biologische Aktivität von 100 mg Biokomposit vergli- chen mit der entsprechenden Menge nicht-immobilisierter Zellen (anhand mikrobiologischer Standardtests) Bacillus sphaeri- Substrate cus Saccharomyces cerevisiae nicht Biokom- nicht-immo- Biokom-posit immo- posit bilisiert bili- siert FDA 1) 7 nMol/h - - nMol/h Resazurin 89 2) 40 nMol/h - - nMol/h Glucose 3) - - 16 µMol/h 2.2 µmol/h von den Zellen gebildete Enzyme (Esterasen) hydrolysieren Fluorescein-diacetat (FDA) 2) von den Zellen gebildete Enzyme (Dehydrgenasen) reduzieren Resazurin (blau) zu Ressorufin (pink) biokatalytische Umsetzung von Glucose Beispiel 2 : Immobilisierung von Saccharomyces cerevisiae bei Raumtemperatur und Lufttrocknung (a) Herstellung des Kompositmaterials Der Schlicker hatte folgende Zusammensetzung : 20,5 Gew. -% Al203-Fasern 20,5 Gew.-% A1203-Pulver (mittlerer Teilchendurchmesser 700 nm) 56,5 Gew.-% Nyacol 1440 (Akzo Nobel Chemicals Wurzen) 2,5 Gew.-% Trockenhefe Das Nyacol wird mit HC1 neutralisiert. In ca. 1/3 des Nyacols wird die Trockenhefe suspendiert. Die A1203 Fasern und Pulver werden mit dem verbleibenden Nyacol durchmischt und dann das Nyacol-Hefe-Gemisch zugegeben. Es entsteht eine pastöse Masse in der die Hefezellen homogen verteilt sind. Der Schlicker wird als Schicht mit ca. 0,5 cm Dicke ausgestrichen, bei einem Pressdruck von 1, 5kN verdichtet und luftgetrocknet. Die Gießfä- higkeit kann durch Zugabe von Wasser oder ggf. Erhöhung des An- teils an Nyacol verbessert werden. Die Platten wurden anschlie- ßend in Würfel zersägt und hinsichtlich ihrer biologischen Wirksamkeit getestet.

(b) Test des Kompositmaterials Tabelle 4 : Anzahl lebender Saccharomyces cerevisiae Zellen und deren biologische Aktivität in 100 mg Biokomposit verglichen mit der entsprechenden Menge nicht-immobilisierter Zellen (an- hand mikrobiologischer Standardtests) Lebende Zellen Biologische Aktivität Biokomposit 7 x 105 CFU/100 mg 7, 3 pMol/hxlOO mg Komposit Komposit Nicht- 1,6 x 107 CFU/2,5 mg 60,3 µMol/hx2,5 mg freie- immobilisierte freie Zellen Zellen Zellen Beispiel 3 : Thermische Umwandlung eines bioaktiven keramischen Kompositmaterials in eine poröse Keramik Ein wässriger Schlicker aus 40g A1203-Pulver, 45g A1203-Fasern und 5g Nyacol 1440 wird als Vormischung getrocknet und in eine.

Suspension mit 10g Bacillus späericus gegeben. Die Suspension wird in eine Form gegossen und bei 70°C getrocknet. Nach der Trocknung liegt ein fester Grünkörper vor, der formtreu bleibt.

Der Grünkörper kann z. B. bis 1400°C gesintert werden, so dass eine hochporöse schwindungsfreie Keramik entsteht.