LACTITOL CON PROPIEDADES PREBIÓTICAS PARA LA PRODUCCIÓN DE

ALIMENTOS FUNCIONALES

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con el campo técnico de los procesos de síntesis de oligosacáridos con propiedades prebióticas, aplicables a la mejora de la producción industrial de alimentos funcionales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Dentro de las estrategias implementadas para rentabilizar los procesos de síntesis de oligosacáridos, la inmovilización de enzimas sobre diferentes tipos de soportes ha tenido un importante desarrollo.

En principio, las aplicaciones relacionadas con enzima libre presentan algunas limitaciones en los procesos industriales, debido a la inestabilidad de la enzima, la cual provoca la pérdida acelerada de la actividad catalítica durante los períodos de operación y almacenamiento, generando en consecuencia, la autólisis del despliegue o agregación de la proteína.

A su vez, la eliminación de la enzima libre de la mezcla de reacción se debe realizar para evitar la contaminación del producto.

En este sentido, la inmovilización de enzimas sobre diferentes tipos de soporte se presenta como solución, donde la enzima inmovilizada retiene la actividad bioquímica básica del catalizador libre, mientras se mantienen las características físicas del soporte.

La síntesis de oligosacáridos puede ser catalizada por dos tipos de enzimas: las glicosidasas, con actividad hidrolítica y de transglicosilación, activas frente a sustratos simples como la lactosa o la sacarosa, y las glicosil-transferasas, más específicas, pero que necesitan sustratos modificados como azúcares-nucleótidos, lo cual encarece el proceso [1 ]. Por este motivo, la mayor parte de los carbohidratos prebióticos se obtienen mediante síntesis enzimática, utilizando enzimas del primer tipo, que suelen ser de origen microbiano, provenientes de hongos filamentosos (A oryzae y A. niger), de levaduras {Kluyveromyces lactis y K. marxianus) y de bacterias {B. circulans y B. subtilis) [2]·

Respecto a la formación de oligosacáridos a partir de lactitol, en la literatura científica se encuentra reportada la reacción de transgalactosilación catalizada por b- galactosidasa de Aspergillus oryzae, obteniendo seis trisacáridos con una unidad de lactitol. Estos oligosacáridos contienen enlaces b-(1 3)-, b-(1 4)-, b-(1 6), b-(1 5) y b-(1 1) unidos a grupos D-galactopiranósido, con potenciales aplicaciones alimentarias y farmacéuticas [3].

Así mismo, la literatura reporta el uso de b-galactosidasa procedente de B. circulans para catalizar la transferencia de unidades de galactosa a varios derivados de glucosa y galactosa, formando enlaces b-(1 4), logrando la síntesis de varios tri- y tetrasacáridos biológicamente relevantes con rendimientos de entre 1 1 y 59%. La aplicación de esta enzima, pero empleando lactulosa y lactitol como sustratos donores, dio lugar a disacáridos regioisómeros b-(1 4) y b-(1 6), en una proporción 1 :1 y con rendimientos mucho menores, de 15 y 1 1 %, respectivamente. Al emplear el lactitol también se han obtenido como productos secundarios y en trazas el lactitol monogalactosilado (Trisacárido) b-ϋ-ΰ3ΐ-(1 4)- b-0-ΰ3ΐ-(1 4)-0-ΰIo-oI y el lactitol digalactosilado (Tetrasacárido), b-D-Gal- (1 4)- b-0-q3ΐ-(1 4)- b-0-q3ΐ-(1 4)-0-QIo- ol [4].

En el campo de las patentes relacionadas en el estado de la técnica cercano a la invención se observa el documento US 2009/01 17080 A1 , el cual, se refiere a una beta galactosidasa con actividad transgalactosilante aislada de Bifidobacterium bifidum. La beta-galactosidasa es capaz de convertir la lactosa en una mezcla de galactooligosacáridos que están ligados a la beta y, de manera inesperada, producen la galactobiosa disacárida ligada a la alfa.

El documento US 2009/0117080 A1 divulga una b-galactosidasa derivada de Bacillus circulans y un gen para la b-galactosidasa.

El documento describe un método enzimático para preparar Gal-sorbitol, en donde el azúcar de la leche y el sorbitol se toman como sustratos, la beta-Dgalactosidasa de Bacillus circulans, Aspergillus oryzae o Penicillium chrysogenum y similares se toma como catalizador, y una isomerización del lactitol, a saber Gal-beta- (1 -3) Sorbitol, se prepara mediante síntesis catalítica y cromatografía en columna.

En estas condiciones, la presente invención resuelve la problemática relacionada con la síntesis de oligosacáridos derivados del lactitol, mediante un biocatalizador que incorpora una enzima inmovilizada y soportada en un material mesoporoso.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En un primer objeto, la presente invención divulga un biocatalizador para la síntesis de oligosacáridos derivados del lactitol (LaOS), con potenciales propiedades prebióticas, y aplicables a la mejora de la producción industrial de alimentos funcionales. El biocatalizador comprende una o más enzimas b-galactosidasas inmovilizadas en un soporte mesoporoso de sílice.

En una modalidad preferida, el biocatalizador emplea un soporte mesoporoso tipo MCM- 41 , útil para la inmovilización de enzimas.

En una modalidad específicamente preferida, la invención se relaciona con un proceso de transgalactosilación entre el lactitol y el biocatalizador constituido por la b galactosidasa, inmovilizada en el soporte tipo MCM-41 para sintetizar di- y trisacáridos.

En un objeto adicional, la invención divulga un método de Síntesis de oligosacáridos para la producción de alimentos funcionales que comprende las etapas de:

Inmovilizar una o más enzimas b-galactosidasa en un soporte mesoporoso de sílice mediante un enlace covalente.

- Suministrar lactitol.

Incubar a temperaturas y a una velocidad de agitación definidas.

Los objetos anteriormente descritos, al igual que los objetos adicionales a que hubiere lugar, serán expuestos al detalle y con la suficiencia necesaria en el capítulo descriptivo que se divulga a continuación, el cual constituirá el fundamento del capítulo reivindicatorío.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIG 1. Muestra el proceso de inmovilización de la enzima b-galactosidasa mediante un enlace covalente al soporte de sílice modificado mediante un proceso de activación.

FIG 2. Muestra La reacción que se lleva a cabo (transgalactosilación), donde se transfieren unidades de galactosa a otra molécula de lactitol, liberando el sorbitol, generando oligosacáridos derivados del lactitol.

FIG 3. Muestra reacciones del proceso de activación del soporte MCM-41 .

FIG 4. Muestra la Reacción de hidrólisis de una b-galactosidasa.

FIG 5. Muestra el Método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS). 5a) Reacción Método de DNS. 5b) Fotografía resultado de la curva patrón de galactosa en placa multipocillos.

FIG 6. Cromatograma comparativo obtenido por GC/FID a 50°C, 1400rpm, buffer fosfato de sodio y MgCI2 y 3 horas de reacción para 50 mg de Lactozym®6500/MCM-41 (Rojo) y Biolactasa NTLx2/MCM-41 (Azul). FIG 7. Resultados para los reúsos de las modalidades de Biocatalizadores de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención surge como respuesta a la necesidad de incorporar procesos optimizados de síntesis de oligosacáridos, en especial, la de producir disacáridos y trisacáridos mediante un proceso cíclico, a través de un biocatalizador reutilizable en varios ciclos o procesos enzimáticos, lo cual, genera el consecuente aprovechamiento de costos y mejoras procedimentales en diferentes tipos de aplicaciones en la industria de alimentos, al configurarse una mejora significativa en el aprovechamiento de subproductos provenientes de la industria lechera.

La descripción de la realización de la presente invención, no pretende limitar su alcance, sino servir como un ejemplo particular de la misma. Se espera que una persona versada en la materia comprenda que las modalidades equivalentes no se apartan del espíritu y alcance de la presente invención en su forma más amplia.

La presente invención divulga un novedoso biocatalizador que comprende un soporte mesoporoso de sílice en el que se inmovilizan una o más enzimas de b-galactosidasa, utilizando lactitol como sustrato.

En una modalidad preferida de la invención, el soporte mesoporoso es tipo MCM- 41 , reactivo obtenido en presentación comercial, útil para la inmovilización de enzimas. En la modalidad específicamente preferida de la invención, el biocatalizador se encuentra conformado por la b-galactosidasa, inmovilizada en el soporte tipo MCM-41 para sintetizar di- y tri-sacáridos, como consecuencia de un proceso de transgalactosilación entre el sustrato (lactitol) y el biocatalizador.

La presente invención involucra un proceso enzimático de síntesis de oligosacáridos derivados del lactitol con potenciales propiedades prebióticas, aplicables a la mejora de la producción industrial de alimentos funcionales. El lactitol es un compuesto derivado de la lactosa que se puede obtener como subproducto de la industria láctea o comercialmente como lactitol anhidro.

En el biocatalizador, la enzima b-galactosidasa se inmoviliza mediante un enlace covalente al soporte MCM-41 , el cual ha sido modificado mediante un proceso de activación para que la enzima se pueda unir a él, como se observa en la Figura 1 . La reacción que se lleva a cabo es una transgalactosilación, donde se transfieren unidades de galactosa a otra molécula de lactitol, liberando el sorbitol y generando oligosacáridos derivados del lactitol (LaOS), como se observa en la Figura 2.

Las b-galactosidasas se encuentran en microorganismos (bacterias, hongos, levaduras), plantas (especialmente en almendras, melocotones, albaricoques, manzanas) y órganos animales [5-6] Las b-galactosidasas están ampliamente distribuidas en los tejidos vegetales. Se ha demostrado que estas enzimas están implicadas en procesos biológicos como el crecimiento de las plantas, la maduración de los frutos y la hidrólisis de la lactosa [7 - 8].

Las b-galactosidasas (b-D-galactohidrolasa) son enzimas que hidrolizan residuos de b D-galactosilo de polímeros, oligosacáridos o metabolitos secundarios. Las b- galactosidasas específicas de polisacáridos incluyen b-galactanasas, que atacan los polímeros pécticos y las b-galactosidasas que atacan xiloglucanos. Estas enzimas tienen dos aplicaciones principales; la eliminación de la lactosa de los productos lácteos para las personas intolerantes a la lactosa y la producción de productos galactosilados [9-10]. También es ampliamente utilizada en la industria alimentaria para mejorar el dulzor, la solubilidad, el sabor y la digestibilidad de los productos lácteos. Las principales enzimas industriales se obtienen de Aspergillus sp. y Kluyveromyces sp. [1 1 -12].

Estas enzimas se clasifican en la familia de glucósido hidrolasa 2 (GH-2) y glucósido hidrolasa 35 (GH-35). Las enzimas de la familia GH-2 se encuentran predominantemente en microorganismos, mientras que cerca del 70% de GH-35 están presentes en las plantas [13-14], funcionan en un rango de pH relativamente amplio dependiendo de la fuente.

La inmovilización de enzimas es una técnica ampliamente utilizada en aplicaciones industriales, ya que presenta ventajas tales como: aumento de la estabilidad de las enzimas, posibilidad de re-utilización del biocatalizador, aplicación en sistemas continuos. Las enzimas inmovilizadas se han utilizado principalmente en la producción de alimentos, productos farmacéuticos y otros productos biológicamente importantes [15-16]

La inmovilización se define como una unión o el atrapamiento de un biocatalizador en una fase distinta o separada que permite el intercambio de la fase donde se dispersan y/o monitorizan las moléculas de sustrato y/o inhibidor [17] La inmovilización enzimática se ha estudiado durante años, lo que indica un interés continuo en esta área [18 - 19]. Esto es probablemente debido a los beneficios conocidos de la inmovilización enzimática y el deseo de mejorar las matrices y métodos de inmovilización [20-21 ] para mejorar la actividad de las enzimas inmovilizadas. Los requisitos exactos para la matriz de inmovilización están dictados por el tipo de enzima y la aplicación prevista, siendo el material no degradable y compatible con las enzimas. El proceso de inmovilización debe realizarse en condiciones suaves; debido a que se debe unir tanta enzima como sea posible al soporte, pero durante el procedimiento de inmovilización, la enzima no se debe desnaturalizar [22-23]. El proceso de inmovilización conduce muy a menudo a un aumento de la resistencia de las enzimas contra diversos factores desnaturalizantes tales como pH extremo, temperatura, elevada fuerza iónica, desnaturalizantes químicos, proteasas, etc.

La inmovilización elimina además las etapas de purificación posteriores y también disminuye el coste del catalizador en la industria alimentaria [24] Además, elevados rendimientos de inmovilización, expresión de alta actividad de la enzima unida y estabilización frente a la inactivación por varios parámetros desnaturalizantes son algunos de los puntos importantes que determinan el éxito de cualquier procedimiento de inmovilización en la industria [25].

El soporte mesoporoso de sílice se somete a un proceso de activación que consta de varios pasos sucesivos, cada uno con condiciones de reacción específicas. El soporte mesoporoso de sílice es activado con reactivos enlazantes: 3-aminopropil trietoxosilano (APTES) y glutaraldehído.

En la Figura 3 se aprecian las reacciones que corresponden a las adiciones de los reactivos enlazantes dando lugar a tres pasos principales, donde: (Paso 1 ) se liberan los grupos hidroxilo del soporte mesoposoro por adición de ácido fuerte y temperatura, (Paso 2) estos grupos reaccionan con los grupos etoxi del 3- aminopropil trietoxisilano (APTES) uniéndose esta molécula al soporte y quedando el grupo amino libre; (Paso 3) el cual reacciona con el siguiente reactivo, el glutaraldehído, que se une al soporte por el ataque nucleofílico del nitrógeno al carbono del grupo carboxilo formando una imina y dejando el grupo aldehido como grupo funcional del soporte en estado activo.

El proceso de inmovilización de las enzimas en el soporte mesoporoso activado fue de tipo covalente. En la modalidad preferida de la invención, La relación pL de enzima por mg de soporte activo fue 10 pL / 1 mg.

En el proceso de inmovilización, reaccionan los grupos carbonilos del soporte activo con los grupos amino terminales de las enzimas b-galactosidasas, llevándose a cabo una reacción de condensación que culmina con la formación de un enlace tipo imina y la eliminación de una molécula de agua, como se muestra en la Figura 1 .

Los ejemplos que se describen a continuación son presentados con el objetivo de describir los aspectos preferidos de la invención, pero no constituyen una limitación al alcance de esta.

EJEMPLO 1.

Se emplearon la enzima comercial de Kluyveromyces lactis Lactozym®6500 y 1 ,2 mL/3,5 mL para Biolactasa NTLx2, enzima comercial de Bacillus c., las cuales fueron las dos enzimas a inmovilizar. Las enzimas fueron purificadas usando columnas de desalinización PD-10 que contienen Sephadex G-25 Médium. Se realizó la caracterización comparativa de las enzimas purificadas libres e inmovilizadas en el soporte MCM-41 .

Al ponerse en contacto los preparados enzimáticos con la solución de lactitol, de inmediato se lleva a cabo la reacción de hidrólisis de éste; obteniendo como resultado sorbitol y galactosa (Figura 4). La actividad se calculó mediante una concentración linealmente creciente de productos, para lo cual se retiraron alícuotas cada 15, 30, 60 y 120 minutos, para ver durante cuánto tiempo era lineal la liberación de galactosa. Luego, se realizó la reacción con el reactivo de DNS y finalmente, se midió espectrofotométricamente.

Se realizó el seguimiento a la molécula de galactosa, debido a que es un azúcar reductor y existen varias pruebas espectrofotométricas sencillas para detectarlo. En la segunda parte de la prueba, la galactosa obtenida es puesta a reaccionar con un volumen constante de una solución de ácido 3,5-dinitrosalicílico que contiene el medio necesario para llevar a cabo la reacción redox endotérmica que genera el 3-amino-5-nitrosalicíco (Figura 5a), éste compuesto presenta una coloración característica; así, una mayor coloración indica una mayor concentración de galactosa, como se muestra en la Figura 5b.

Los resultados de absorbancias se calcularon usando patrones de galactosa de concentraciones entre 0,03 a 10 mg/mL, obteniendo la recta de calibrado y = 30 0,102x - 0,014 con un R2 de 0,9941 para las enzimas en estado libre y de y = 0,1714x - 0,043 con un R ² de 0,9952 para los biocatalizadores inmovilizados. Los ensayos se realizaron por triplicado. La unidad para la actividad catalítica es el katal (kat) según el Sistema Internacional de Unidades, pero es una unidad demasiado grande y suele usarse la actividad enzimática (UE) siendo, 1 pmol 35 sustrato convertido por minuto, en este caso 1 pmol de galactosa por mL y por minuto a 50°C y pH 7. La ecuación usada fue la siguiente:

Donde, [Gal] se refiere a la concentración de galactosa hallada que se encuentra en miligramos/ mililitro (mg/ml_). Venzima corresponde al volumen de enzima añadido y por ende, Vsolución, al volumen usado del sustrato más en volumen añadido de enzima; en este trabajo; 1 ,0 ml_ de solución de lactitol en buffer de síntesis y 0,02 ml_ de enzima. Otros valores constantes en la ecuación son 1000, factor de conversión de miligramos a microgramos y PMGal, peso molecular de la galactosa en gramos (g). Las actividades enzimáticas encontradas usando el método de mínimos cuadrados y posteriormente la Ecuación 1 para cada una de las enzimas b-galactosidasas libres e inmovilizadas se encuentran condensados en la Tabla 1 .

Tabla 1. Resultados Actividad Enzimática Las actividades enzimáticas de mayores valores se encontraron con las enzimas libres, debido a que tienen todos sus grados de libertad. Además, se observa que 20 los biocatalizadores inmovilizados aunque menores, también presentaron actividad sobre lactitol, lo cual no ha sido reportado previamente, obteniendo valores de 12,19 y 9,86 UE para el Lactozym®6500/MCM-41 y BiolactasaNTLx2/MCM-41 , respectivamente. Por otro lado, al considerar la actividad encontrada con las enzimas libres como el 25 100%, se logra unir un 34,9% de esta actividad en el caso de Lactozym®6500 y un 19,9% para la BiolactasaNTLx2 en el soporte MCM-41.

Medida del contenido de Proteína

Se calculó el contenido en proteína de los preparados comerciales de b- galactosidasas y en los biocatalizadores inmovilizados mediante el método de Bradford. Luego, haciendo uso de una recta de calibrado con albúmina sérica bovina (BSA) de concentraciones entre 0,8 y 0,016 mg/mL se llegó a la recta y = 1 ,4398x + 0,0483 con un R ² de 0,9917 para las enzimas libres y y =1 ,2954x + 0,0594 con un R ² de 0.9955 para la enzima soportada. Los resultados se encuentran condensados en la Tabla 2.

Tabla 2. Resultados Contenido de proteína

Considerando la proteína encontrada con las enzimas libres como el 100%, se observa que en ambos casos se logró inmovilizar más del 50% de enzimas b-galactosidasas que se encontraban en solución. Se enlazó covalentemente por medio de un enlace tipo imina al soporte MCM-41 una enzima b-galactosidasa (Biolactasa NTLx2, Bacillus circulans).

En el caso de las enzimas inmovilizadas, se calcula la actividad específica, ésta se refiere a la actividad de una enzima por miligramo de proteína y se suele expresar en pmol de sustrato obtenido por minuto. Este cálculo sirve para conocer el porcentaje de la inmovilización, definida en este caso, como la cantidad de enzima inmovilizada que libera 1 pmol de galactosa por mg de biocatalizador y por minuto a 50°C y pH 7. Por esto, en adición, se calculó la actividad específica, haciendo uso de la ecuación 2.

Donde, [Proteína] se encuentra en miligramos de proteína por mililitro de enzima (mg/ml_).

Esta nueva unidad permite hacer una comparación directa entre las b- galactosidasas libres e inmovilizadas debido a que no incluye la fase en la que se encuentra la enzima como mI_ de preparado enzimática o mg de soporte. Los valores encontrados se encuentran en la Tabla 3. Tabla 3. Resultados Actividad específica.

Los resultados obtenidos para la obtención de los biocatalizadores inmovilizados BiolactasaNTLx2/MCM-41 y Lactozym®6500/MCM-41 se encuentran resumidos en la Tabla 4.

^a Cantidad de proteína inmovilizada expresada como porcentaje de la cantidad proteína aplicada (rendimiento de inmovilización por proteína). ^b Cantidad actividad inmovilizada expresada como porcentaje de la cantidad de actividad 15 aplicada (rendimiento de actividad aplicada).

Tabla 4. Resumen de resultados para obtención del Biocatalizador

En consecuencia, se inmovilizaron dos tipos de enzimas b-galactosidasas, Lactozym®6500 y BiolactasaNTLx2, en el soporte mesoporoso ordenado MCM- 41 , mediante enlace covalente teniendo en cuenta el grado de inmovilización (porcentaje de proteína unida al soporte entre 40% y 70%) y la actividad de la enzima inmovilizada (porcentaje de actividad específica unida al soporte entre 0,3 y 0,6 mg de enzima / mg de soporte mesoporoso de sílice).

En estas condiciones, se midió la actividad hidrolítica sobre el lactitol, siendo ésta bien conocida desde Mahoney (1998), la que permite la síntesis de oligosacáridos derivados del lactitol (LaOS); Por esto, luego de comprobar que los dos tipos de enzimas tenían actividad hidrolítica sobre el lactitol (liberando galactosa que se midió por el método de DNS), se realizó el análisis de todas las mezclas de reacción para conocer el tipo de oligosacáridos (mono-, di-, tri-sacáridos) que se están sintetizando, midiendo el contenido de carbohidratos en el tiempo de reacción.

EJEMPLO 2.

SÍNTESIS ENZIMÁTICA DE OLIGOSACÁRIDOS DERIVADOS DEL LACTITOL

(LaOS)

Se efectuó la síntesis de LaOS con las b-galactosidasas comerciales inmovilizadas y libres utilizando lactitol como único sustrato y su medición por medio de la técnica GC FID.

El lactitol en todos los casos se usó como único sustrato en una concentración entre 200 mg/mL y 400 mg/mL. Las condiciones elegidas fueron: pH entre 6 y 8.5, agitación entre 900 y 2100 rpm y temperatura entre 35°C a 70°C usando como medio de reacción tampón de fosfato sódico y de MgCI2 (buffer de síntesis).

La síntesis de LaOS se genera mediante el proceso de transgalactosilación seguido por la familia 2 de glicosidas hidrolasas (GH 2) de la cual hacen parte las enzimas b- galactosidasas extraídas de microorganismos. Las GH 2 tienen un sitio activo que está compuesto por dos restos catalíticos: un nucleófilo catalítico y un catalizador ácido / base en general corresponden a residuos de glutamato [55-57] Se presentan dos formas de degalactosilación que puede seguir el mecanismo de reacción de estas enzimas donde se escinde la unión covalente de galactosa y el sitio activo de la enzima por (A) reacción de hidrólisis, utilizando agua como sustrato aceptor y (B) reacción de transglicosilación, usando lactitol como sustrato aceptor. Ambas reacciones proceden de acuerdo con un mecanismo de doble desplazamiento y usan lactitol como sustrato donante y requieren también la asistencia de un catalizador ácido/base general.

A continuación se presentan los resultados de las síntesis de oligosacáridos derivados del lactitol con las b-galactosidasas Lactozym®6500 y BiolactasaNTLx2 libres e inmovilizadas en el soporte MCM-41 .

Tabla 5. Resultados obtenidos para la síntesis de derivados del lactitol y las condiciones usadas por las enzimas b-galactosidasas comerciales libres e inmovilizadas.

Con la enzima Biolactasa NTLx2 se logró detectar una variedad de compuestos, esto es, 8 diferentes disacáridos y 12 distintos trisacáridos. Con la enzima b-galactosidasa comercial Lactozym®6500, la cual es una de las enzimas más usadas en la industria, se logró sintetizar 8 disacáridos y 5 trisacáridos.

Por otro lado, con la Biolactasa NTLx2 inmovilizada en el soporte mesoposoro MCM-41 , se logró sintetizar 8 diferentes disacáridos y 12 distintos trisacáridos. Para analizar los compuestos derivados del lactitol sintetizados, se puede observar en la Figura 6 los cromatogramas encontrados a las tres horas de reacción superpuestos.

EJEMPLO 3.

Reutilización del Biocatalizador Luego de realizar la síntesis de derivados del lactitol usando las modalidades de biocatalizadores preferidas de la invención, se realizaron diferentes pruebas con el objetivo de conocer la cantidad de ciclos que se puede realizar conservando una actividad significativa. La evaluación de la reutilización mediante reacciones de síntesis tipo batch de 2 horas a 50°C y 1400 rpm usando las modalidades de biocatalizadores preferidas de la invención, arrojó información acerca de la estabilidad de éstos. Los resultados obtenidos para cinco reúsos corresponden a porcentajes hallados al considerar la actividad específica inicial como el 100% y se encuentran consignados en la Tabla 6.

Tabla 6. Resultados para los Reúsos de los Biocatalizadores

Una visualización de los resultados para los Reúsos de los Biocatalizadores se representa en la Figura 7. En estas condiciones, la Biolactasa NTLx2 inmovilizada en el soporte mesoposoro MCM-41 evidenció la producción de LaOS, los cuales, corresponden a 8 diferentes disacáridos y 12 distintos trisacáridos. Así mismo, alcanzo 5 ciclos de reúso.

Mediante el empleo del biocatalizador objeto de la invención se logró detectar, por cromatografía de gases, 10 trisacáridos diferentes, identificados tentativamente: b-0-q3ΐ-(1 4)- bϋ-q3ΐ-(1 4)-Glc-ol (trisacárido 0), b-D-GaK^I)- b-D-Gal- (1 4)-D Glc-ol (trisacárido 1) y b-0-ΰ3ΐ-(1 6)-bO-ΰ3ΐ-(1 4)-0-OIo-oI (trisacárido 2), siendo más abundante el trisacárido 0, además de 7 diferentes disacáridos identificados tentativamente b-0-ΰ3ΐ-(1 1)-0-ΰIo-oI (disacárido 1), b-D- Gal- (1 6)-D-Glc-ol (disacárido 2), siendo más abundante el disacárido 2.

Entre los diferentes beneficios de la invención, cabe destacar el aprovechamiento de carbohidratos simples presentes en subproductos de la industria lechera, tales como el suero, para generar productos con valor agregado y contribuir en la consecución de ingredientes bioactivos, por ejemplo, nuevos compuestos con posibles propiedades prebióticas.

Así mismo, la invención resulta útil para diversificar los procesos convencionales de la industria láctea, ya que un proceso de fraccionamiento de este producto genera el sustrato para iniciar la síntesis de dichos oligosacáridos funcionales (diy trisacaridos). El consumo de alimentos infantiles con prebióticos, aumenta el número total de bífidobacterias en heces, estimula el tránsito intestinal y disminuye la consistencia de las deposiciones. El aporte de alimentos con prebióticos parece aumentar la tasa de absorción de calcio durante la adolescencia.

En este contexto, la presente invención incorpora una importante mejora en relación con otros procedimientos, fundamentada en la posibilidad de producir di- y trisacáridos en un proceso cíclico favorecido por la reutilización del biocatalizador hasta en cinco ciclos o procesos enzimáticos, generando la consecuente optimización de costos en distintas aplicaciones industriales.

Otras ventajas aportadas por la tecnología radican en la obtención de diferentes derivados del lactitol (LaOS), sin usar otro sustrato.

Aunque la presente invención ha quedado descrita con las realizaciones preferentes mostradas, queda entendido que las modificaciones y variaciones que conserven el espíritu y el alcance de esta invención se entienden dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

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