La présente invention a pour objet un support solide revêtu d'un jeu de fragments représentatifs de gènes dont le profil d'expression pour l'ensemble de ces gènes chez un sujet atteint d'un cancer permet de prédire une chimiosensibilité ou une chimiorésistance à au moins un médicament anticancéreux donné, ainsi qu'un kit comprenant un tel support ; l'invention a également pour objet un procédé de prédiction in vitro de la réponse thérapeutique à partir d'un prélèvement tumoral chez un tel sujet, ledit procédé mettant en œuvre l'utilisation du support solide.

Le cancer peut être défini de façon très large comme une maladie liée à la prolifération et la diffusion incontrôlée de cellules de l'organisme devenues anormales : ces cellules anormales, dites « malignes », prolifèrent de manière anarchique à partir d'un foyer primitif, qui peut récidiver localement après son ablation, s'étendre aux tissus voisins et essaimer à distance (métastases).

Le cancer touche environ 10 millions de personnes dans le monde. Plus de 4,4 millions des cas proviennent d'Asie. L'Europe compte 2,8 millions de cas, l'Amérique du Nord 1,4 millions et l'Afrique 627 000 cas. Le cancer est l'une des premières causes de mortalité dans les pays développés ; en Europe et aux Etats- Unis, on estime qu'une personne sur cinq décédera d'un cancer. L'incidence des cancers sur les 100 dernières années paraît être en progression, mais cette observation doit être pondérée par le fait que la probabilité de développer un cancer augmente avec l'âge, et que globalement la proportion de la population âgée est aussi en augmentation.

En France, les cancers représentent la première cause de mortalité chez les hommes et la deuxième chez les femmes après . les maladies cardiovasculaires. Quatre cancers sont responsables de près de la moitié de tous les décès par cancer en France, à savoir le cancer du sein, le cancer de la prostate, le cancer du poumon et le cancer du côlon-rectum. Parmi les autres cancers, on compte par exemple le cancer de la lèvre-bouche-pharynx, de la vessie, des reins, le mélanome de la peau, le cancer de l'estomac, la leucémie, le cancer du foie, du système nerveux central, du col de l'utérus, de l'œsophage, du pancréas, des ovaires, du larynx, de la thyroïde, etc...

En général, la plupart des cancers sont traités par quatre moyens thérapeutiques : la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et l'hoπnonothérapie. Lorsque la tumeur est localisée et ne possède pas les caractéristiques d'invasivité ou de métastase, elle est dite bénigne ; dans le cas contraire on parle de tumeur maligne ou de cancer ; la chimiothérapie cytotoxique ne s'adresse qu'à ce dernier cas. Les médicaments chimiothérapeutiques sont des médicaments interférant dans le métabolisme et la vie cellulaire et qui, de ce fait, sont cytotoxiques : c'est par ce mécanisme que la chimiothérapie permet d'inhiber la croissance tumorale. Le plus souvent, la chimiothérapie est administrée par voie systémique, ce qui explique que la toxicité qu'elle induit soit générale.

Une conséquence importante, liée à la propriété principale de ces produits sur la division cellulaire, est d'affecter de la même façon les cellules normales et plus particulièrement les tissus présentant un taux de renouvellement important. La majorité des effets toxiques observés, à savoir une myélosuppression, des troubles de la cicatrisation, un retard de croissance (enfants), la stérilité, la tératogénicité (malformations), l'alopécie et l'atteinte des muqueuses des voies digestives, découlent de cette propriété. Ces substances peuvent en elles-mêmes êtres carcinogéniques. De plus, une destruction cellulaire massive entraînant un catabolisme des purines important, la précipitation tabulaire des urates, peut conduire à une défaillance rénale. Enfin, ces produits provoquent très souvent des nausées et vomissements sévères qui diminuent la compliance (mesure de la souplesse et des possibilités de distension d'un réservoir élastique tels que la vessie ou les poumons) des patients. En outre, d'autres effets toxiques sont observables de façon spécifique suivant les produits. Comme exemple de médicaments majeurs en chimiothérapie on peut citer les agents alkylants (oxazaphosphorines, nitroso-urées,...), les antibiotiques (anthracyclines, anthracènediones, actinomycine D, bléomycine sulfate, ....), les vinca-alcaloïdes (vincristine, vinblastine, vindésine, vinorelbine,...), les dérivés du platine (cisplatine, carboplatine, oxaliplatine,...), les antimétabolites (5-fluoro- uracile, méthotrexate, 6-mercaptopurine...), les taxanes (paclitaxel, docétaxel), les dérivés de la camptothécine (irinotécan, topotécan,...) et les epipadophyllotoxines (etoposide, teniposide).

Plus particulièrement, les taxanes sont des dérivés de plantes (if du Pacifique et if européen) très actifs sur les tumeurs du sein et de l'ovaire mais relativement toxiques : neuropathies, aplasies (arrêt du développement ou développement parfois insuffisant d'un tissu) parfois profondes et risque de survenue d'oedèmes des membres voire des séreuses (épanchements pleuraux et péricardiques). Les taxanes inhibent la formation des microtubules et entravent donc les transports intracellulaires ainsi que la mitose. Les taxanes comprennent le docétaxel, qui a d'abord été indiqué dans le traitement des stades localement avancés ou métastatiques de cancers du sein en monothérapie, puis en association avec les anthracyclines.

Chez la femme, le cancer du sein et le plus fréquent : on note ainsi 43 000 nouveaux cas et 11 000 décès par an en France. Il est la première cause de décès par cancer chez la femme. Les échecs thérapeutiques sont dus aux mécanismes de chimiorésistance développés chez certaines patientes. Un effort est donc fait pour développer de nouvelles molécules thérapeutiques afin d'augmenter le taux de survie.

Son efficacité démontrée, le docétaxel a été ensuite incorporé dans le traitement des stades précoces en adjuvant (chimiothérapie réalisée après chirurgie) et en néoadjuvant (chimiothérapie « d'induction », ou « première », c'est-à-dire avant chirurgie). Il a ainsi été montré une amélioration de 30 % de la survie et une diminution de 28 % du risque de rechute en faveur de l'association de docétaxel chez les femmes atteintes de cancers du sein à un stade précoce avec atteinte ganglionnaire, par rapport au traitement de référence en situation adjuvante (étude BIRG 001, « San Antonio Breast Cancer Symposium », décembre 2003). Le docétaxel semble être le seul taxane à démontrer un bénéfice en termes de survie sans rechute, quel que soit le statut hormonal de la patiente.

Dans les protocoles de chimiothérapie néoadjuvante, l'administration de docétaxel après des anthracyclines permet une amélioration de la survie, une meilleure réponse clinique entraînant un plus grand nombre de traitements conservateurs et une augmentation du taux de réponse complète histologique. L'efficacité du docétaxel est donc démontrée dans les formes avancées et précoces du cancer du sein.

Toutefois, la cytotoxicité liée à l'utilisation d'un anticancéreux tel que le docétaxel implique la nécessité d'identifier les patientes qui peuvent bénéficier de ce type de traitement ; en effet, les cellules tumorales peuvent être résistantes à un traitement de chimiothérapie, lequel traitement s'avère alors inutile et toxique pour le patient. Comme moyen de prédiction, on peut citer par exemple l'étude in vitro des modifications cellulaires causées par un agent anticancéreux, qui se fait sur des cellules isolées qui, après incubation, peuvent être altérées par la présence d'un anticancéreux, ou bien au contraire résistantes à cet anticancéreux. La lecture de ces modifications métaboliques peut se faire par l'étude des variations dans l'incorporation d'un nucléotide marqué tel que la thymidine traitée. Cette étude in vitro peut se faire également à partir de cultures de cellules. Après dissociation cellulaire d'un fragment tumoral, on ensemence des boîtes de Pétri contenant un milieu nutritif. La pousse des cultures est plus ou moins inhibée par l'agent anticancéreux qui peut être mis en contact à des concentrations variables. Toutefois, ces conditions sont loin de celles des traitements in vivo.

Ainsi, il existe un réel besoin de pouvoir disposer d'une nouvelle technique qui permette de déterminer au préalable si un patient atteint d'un cancer sera sensible ou bien au contraire résistant à un médicament chimiothérapeutique, tel que notamment le docétaxel, en particulier pour des patientes atteintes d'un cancer du sein. Les inventeurs ont pu apporter une solution à ce problème, et ont mis au point l'invention telle que présentée ci-après.

La présente invention a pour objet un support solide revêtu d'un jeu de fragments représentatifs de gènes dont le profil d'expression pour l'ensemble de ces gènes chez un sujet atteint d'un cancer permet de prédire une chimiosensibilité ou une chimiorésistance à au moins le médicament anticancéreux de formule (I) suivante :

caractérisé en ce que ledit jeu : - comprend au moins 23 fragments, chacun des 23 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes du Tableau A, et - est en outre constitué au maximum par 366 fragments, chacun des 366 fragments étant représentatif d'un gène choisi parmi les gènes du Tableau B.

Le composé de formule générale (I) est le docétaxel (ou taxotere).

Un tel support solide selon l'invention permet de déterminer quelles patientes peuvent bénéficier au moins du traitement anticancéreux au docétaxel, et le cas échéant, de tester leur chimiosensibilité ou leur chimiorésistance à d'autres traitements anti cancéreux, en fonction du profil biologique des tumeurs. L'étude du profil biologique d'une tumeur passe par l'analyse de son profil génétique. En effet, les tumeurs sont hétérogènes car elles résultent de l'accumulation de combinaisons de multiples altérations moléculaires. Les indications thérapeutiques et diagnostiques sont fondées sur des facteurs pronostics classiques (histologiques et cliniques) qui ne révèlent pas cette hétérogénicité. Une caractérisation moléculaire globale et détaillée permet donc d'affiner le diagnostic, les indications thérapeutiques et donc la survie du patient.

Ce jeu, qui comprend au moins lesdits 23 fragments, est en outre constitué au maximum par 366 fragments, chacun des 366 fragments étant représentatif d'un gène choisi parmi les gènes du Tableau B. L'expression « en outre constitué au maximum par » signifie que le jeu, comprenant au moins les 23 fragments, peut en outre contenir de 1 à 366 autres fragments représentatifs de gènes tels que définis dans le Tableau B. De préférence, le jeu est en outre constitué par 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 358, 360, 365 fragments représentatifs de gènes tels que définis dans le Tableau B.

De préférence, le support solide selon la présente invention est revêtu d'un jeu qui : comprend lesdits au moins 23 fragments, chacun des 23 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes du Tableau A, et - est en outre constitué au maximum par 100 fragments, chacun des 100 fragments étant représentatif d'un gène choisi parmi les gènes du Tableau B.

Ainsi, le support solide selon la présente invention permet de prédire chez un sujet une chimiosensibilité ou une chimiorésistance à au moins un autre médicament anticancéreux.

Par l'expression « médicament anticancéreux » on entend désigner dans la présente demande un composé de chimiothérapie, ou une association d'au moins deux composés de chimiothérapie, utilisé pour traiter ou prévenir un cancer. On peut citer par exemple, mais sans s'y limiter, un agent alkylant (oxazaphosphorines, nitroso-urées,...), un antibiotique (anthracyclines, anthracènediones, actinomycine D, bléomycine sulfate, ....), un vinca-alcaloïde (vincristine, vinblastine, vindésine, vinorelbine,...), un dérivé du platine (cisplatine, carboplatine, oxaliplatine,...), un antimétabolite (5-fhioro-uracile, méthotrexate, 6-mercaptopurine...), un taxane (paclitaxel, docétaxel), les dérivés de la camptothécine (irinotécan, topotécan,...) ou une epipadophyllotoxine (etoposide, teniposide).

De préférence, le support solide selon la présente invention permet en outre de prédire chez un sujet une chimiosensibilité ou une chimiorésistance à au moins la composition FEC, qui est une association comprenant les composés F, E et C, de formules respectives (II), (III) et (FV) suivantes :

(IV). Les composés F (II), E (III) et C (W) correspondent respectivement au 5- fluorouracile, à Pépirubicine, et au cyclophosphamide.

De manière encore préférée, le support solide selon la présente invention permet en outre de prédire chez un sujet une chirniosensibilité ou une cliimiorésistance à la composition FEC.

Les phénomènes de chirniosensibilité ou de chimiorésistance résultent de mécanismes complexes liés en partie à des variations au niveau de l'expression de plusieurs gènes. Si la surexpression de gènes impliqués dans le transport des drogues ainsi qu'une augmentation des processus de réparation de l'ADN sont identifiés comme intervenant dans la sensibilité des cellules aux drogues, de nombreux autres gènes peuvent influencer cette sensibilité. Les facteurs de transcription, les gènes régulant le cycle celullaire, les facteurs de croissance et leur récepteur sont autant d'acteurs potentiels impliqués dans les phénomènes de chimiosensibilité ou de cliimiorésistance.

Sept grands groupes fonctionnels de gènes sont identifiés dans les tableaux A et B : les gènes impliqués dans le métabolisme, le cycle cellulaire, l'apoptose, la transcription, l'adhésion cellulaire, la transduction du signal, et les gènes impliqués dans la réparation. D'autres gènes sont caractéristiques de cibles potentielles de drogues.

Le profil d'expression, qui est obtenu en utilisant le support solide selon la présente invention, contient les informations relatives à l'expression de l'ensemble des gènes dont un fragment représentatif a été déposé sur ledit support solide.

Par l'expression « fragment représentatif » d'un gène du Tableau A ou du Tableau B on entend désigner dans la présente demande tout fragment d'un de ces gènes qui est suffisamment long pour s'hybrider spécifiquement, dans des conditions appropriées pour l'hybridation, avec un fragment présent dans l'échantillon d'acide nucléique test ou avec un fragment présent dans l'échantillon d'acide nucléique de référence, et permet ainsi d'identifier ledit fragment présent dans l'échantillon d'acide nucléique test ou de référence comme étant un fragment constitutif dudit gène donné, ledit gène étant donc présent dans l' échantillon d'acide nucléique test ou dans l'échantillon d'acide nucléique de référence ; lorsqu'un tel fragment représentatif d'un gène du Tableau A ou B est séquence, la séquence identifiée permet de conclure sans ambiguïté que ledit fragment appartient audit gène donné du Tableau A ou B. De préférence, ledit fragment représentatif est un fragment représentatif de l'ARNm dudit gène. La séquence dudit ARNm peut notamment être celle décrite dans la banque de données Unigene accessible sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/, pour la référence Unigene telle que donnée dans la colonne Unigene des Tableaux A et B.

De préférence, le fragment représentatif d'un gène selon l'invention contient au moins 15, de préférence 20, 25, 30, 35, 40, 45, 47, 48, 49 et de manière particulièrement préférée 50 nucléotides identiques à ceux du fragment de l'acide nucléique test ou de référence constitutif dudit gène donné, ledit gène étant donc présent dans l'acide nucléique test et dans l'acide nucléique de référence. Le terme « sonde » est également utilisé dans la présente demande pour désigner un fragment représentatif.

L'expression "conditions appropriées pour l'hybridation" dans la présente invention désigne des conditions de forte stringence qui permettent l'hybridation lorsque des séquences complémentaires à au moins 80, 82, 85, 87, 89, 90, 92, 95, 97 or 99 % sont capables de s'hybrider spécifiquement. Les conditions de forte stringence sont largement décrites dans la littérature, par exemple dans Sambrook et al., (1989, « Molecular cloning, A laboratory Manual », CoId Spring Harbor), Maniatis et al., 1982 (« Molecular cloning, A laboratory Manual », CoId Spring Harbor Lab. CSH, N.Y. USA ou l'une de ses récentes rééditions et dans Ausubel et al., Eds. (1995) "Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2" (Greene Publishing and Wiley-Interscience, N. Y.), et ces conditions peuvent être adaptées par l'homme du métier en fonction de la taille des fragments nucléotidiques, selon les enseignements appropriés connus. On utilisera par exemple des tampons d'hybridation ou de lavage appropriés (Corning), ou encore les conditions d'hybridation suivantes : (1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (2OmM, pH 7,5) contenant 5X SSC (IX SSC correspond à une solution 0.15M NaCl + 0.015 M de citrate de sodium), 50% de formamide, 7% de sodium dodecyl sulfate (SDS), 10X de solution de Denhardt's, 5% de dextran sulfate et 1% d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (par exemple 55°C pour une sonde de taille d'environ 50 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 200C en 2X SSC + 2% SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0.1X SSC + 0.1% SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0.1X SSC + 0.1% SDS pendant 30 minutes à 60°C pour une sonde de taille d'environ 50 nucléotides.

Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques, on entend désigner un pourcentage de nucléotides identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après leur meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé à l'aide d'algorithmes mathématiques. D'une manière préférée, non limitative, on peut citer différents algorithmes rappelés dans le document Fundamentals of database searching (review) Stephen F., Altschul, Bioinformatics : A trends Guide, 1998 :5 :7-9, notamment les algorithmes de Karlin et Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, modifié dans Karlin et Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. On pourra utiliser en particulier les programmes : -BLAST, notamment BLASTN, BLAST2 (Tatusova et al., 1999, "Blast 2 séquences - a new tool for comparing protein and nucleotide séquences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250), gapped BLAST (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25(17) :3389-3402), -FASTA (Altschul S. F. et al, 1990, J. Mol. Biol., 403-410), -Clustal W (Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res. 22, 4673-SO), -BESTFIT. L'algorithme BLAST est décrit en détail sur le site du NCBI (http :ww.ncbi.nih.gov).

Les fragments représentatifs selon la présente invention peuvent être de n'importe quel type d'acide nucléique donné, tel que PADN5 l'ADNc, TARN, etc...

Le support solide utilisé pour la réalisation de la présente invention peut être de manière générale tout support miniaturisé de verre, de silicium ou de polymère qui peut être revêtu de séquences nucléotidiques de séquence connue, en particulier les fragments représentatifs de gènes selon la présente invention déposés en arrangement ordonné, et dont la fonction est de reconnaître, dans un mélange, leurs séquences nucléotidiques complémentaires. Comme exemple de support solide on peut citer, mais sans s'y limiter, des membranes telles que les membranes de nylon à densité élevée (par exemple Performa, Genetix, New Milton, UK) ; on utilisera de préférence des lames microréseau en amino-silane, disponibles notamment chez Corning (ultraGAP™, NY). La surface du support est traitée pour former un réseau dense et régulier de microsurfaces sur lesquelles les fragments représentatifs sont fixés ; l'emplacement de chacun d'entre eux est précisément connu. De tels supports solides sont bien connus de l'homme de l'art, qui saura choisir le type de support à utiliser et les conditions appropriées pour un test d'hybridation donné.

Le sujet atteint d'un cancer est de préférence un mammifère, et de manière particulièrement préférée l'homme. Le cancer dont est atteint le sujet peut être de n'importe quel type tel que par exemple, mais sans s'y limiter, le cancer du sein, le cancer de la prostate, le cancer du poumon, le cancer du côlon-rectum, le cancer de la lèvre-bouche-pharynx, de la vessie, des reins, le mélanome de la peau, le cancer de l'estomac, la leucémie, le cancer du foie, du système nerveux central, du col de l'utérus, de l'œsophage, du pancréas, des ovaires, du larynx ou de la thyroïde. De manière préférée, le support solide selon l'invention est caractérisé en ce que le sujet est atteint d'un cancer du sein, d'un cancer de la prostate, d'un cancer du poumon ou d'un cancer du côlon-rectum, De manière particulièrement préférée, le sujet est atteint d'un cancer du sein.

Selon une autre préférence, l'un au moins des fragments représentatifs des gènes du Tableau A ou du Tableau B est choisi parmi les fragments suivants : a) les fragments de séquence SEQ E) N0 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N0 4, SEQ ID N0 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N0 107, SEQ ID N0 114, SEQ ID N0 136, -SEQ ID N° 211, SEQ BD N0 214, SEQ ID N° 219, SEQ ID N° 246, SEQ ID N0 250, SEQ ID N0 298, SEQ ID N° 338 et SEQ ID N0 382 à 389 pour le Tableau A et SEQ ID N0 3, SEQ ID N0 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 8, SEQ ID N0 10 à 106, SEQ ID N0 108 à 113, SEQ ID N0 1 15 à 135, SEQ ID N° 137 à 210, SEQ ID N0 212, SEQ ID N° 213, SEQ ID N° 215 à 218, SEQ ID N0 220 à 245, SEQ ID N0 247 à 249, SEQ ID N0 251 à 297, SEQ ID N° 299 à 337 et SEQ ID N° 339 à 3Sl pour le Tableau B, ou b) les fragments ayant au moins 70 % d'identité avec les fragments tels que définis en a), ou c) les fragments comprenant les fragments tels que définis en a) ou en b), ou d) les fragments dont les séquences sont complémentaires des séquences des fragments tels que définis en a), b) ou c).

Les fragments tels que définis au point b), qui restent représentatifs des gènes donnés, résultent par exemple d'un polymorphisme nucléotidique ou d'une mutation (délétion, insertion, substitution...).

De manière encore préférée, chaque fragment représentatif des gènes du Tableau A ou du Tableau B est choisi parmi les fragments suivants : a) les fragments de séquence SEQ ID N0 1, SEQ ID N0 2, SEQ DD N0 4, SEQ ID N0 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N0 107, SEQ ID N0 114, SEQ ID N° 136, SEQ ID N° 211, SEQ ID N° 214, SEQ ID N0 219, SEQ ID N0 246, SEQ ID N° 250, SEQ ID N° 298, SEQ ID N0 33S et SEQ ID N0 3S2 à 389 pour le Tableau A et SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° S5 SEQ ID N° 10 à 106, SEQ ID N° 108 à 113, SEQ ID N° 115 à 135, SEQ ID N0 137 à 210, SEQ ID N° 212, SEQ ID N° 213, SEQ ID N° 215 à 218, SEQ ID N° 220 à 245, SEQ ID N° 247 à 249, SEQ ID N° 251 à 297, SEQ ID N° 299 à 337 et SEQ ID N° 339 à 381 pour le Tableau B, ou b) les fragments ayant au moins 70 % d'identité avec les fragments tels que définis en a), ou c) les fragments comprenant les fragments tels que définis en a) ou en b), ou d) les fragments dont les séquences sont complémentaires des séquences des fragments tels que définis en a), b) ou c).

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le jeu est constitué par 23 fragments, chacun des 23 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes du Tableau A.

Un deuxième aspect de la présente invention concerne un procédé de prédiction in vitro de la réponse thérapeutique à au moins un médicament anticancéreux chez un sujet atteint d'un cancer à partir d'un prélèvement tumoral chez ledit sujet, caractérisé en ce que ledit procédé comprend une étape dans laquelle on dépose un échantillon d'un extrait d'acide nucléique, le cas échéant après rétro-transcription, issu dudit prélèvement tumoral, sur un support solide selon la présente invention, et en ce qu'on analyse la quantité d'acide nucléique ayant hybride avec le jeu de fragments représentatifs déposé sur ledit support.

De préférence, le procédé de prédiction in vitro de la réponse thérapeutique à un médicament anticancéreux chez un sujet atteint d'un cancer à partir d'un prélèvement tumoral chez ledit sujet est caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) l'extraction d'un échantillon d'acide nucléique test à partir du prélèvement tumoral, b) le marquage de l'acide nucléique test de l'échantillon obtenu à l'étape a) à l'aide d'un premier marqueur, c) en parallèle, le marquage d'un échantillon d'acide nucléique de référence à l'aide d'un deuxième marqueur différent du premier marqueur de l'étape b), d) la mise en contact de l'échantillon d'acide nucléique test marqué obtenu à l'étape b) et de l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué obtenu à l'étape c) avec le support selon l'invention dans des conditions appropriées pour l'hybridation, chaque fragment représentatif d'un gène du support solide étant capable de s'hybrider avec un fragment du gène présent dans l'échantillon d'acide nucléique test marqué et un fragment du gène présent dans l'échantillon d'acide nucléique de référence, e) la normalisation, pour chaque fragment représentatif de gène déposé sur le support, de l'intensité d'hybridation obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique test marqué et celle obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué, f) la comparaison, pour chaque fragment représentatif de gène déposé sur le support, de l'intensité d'hybridation normalisée obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique test marqué avec celle obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué, de sorte à obtenir un profil d'expression des gènes dont les fragments représentatifs ont été déposés sur le support solide, g) le classement de la réponse thérapeutique du sujet au médicament anticancéreux dans la classe cliimiosensibilité ou dans la classe cbimiorésistance par analyse en fonction du profil d'expression obtenu à l'étape f).

L'extraction d'un échantillon d'acide nucléique test à partir du prélèvement tumoral telle que définie à l'étape a) du procédé de prédiction selon la présente invention est une technique couramment employée en biologie moléculaire. De manière générale, les techniques de biologie moléculaire employées pour la réalisation de la présente invention sont bien connues de l'homme de l'art, et sont largement décrites dans la littérature (voir par exemple Sambrook, Russell et al, "Molecular cloning: A lάboratoiy mannal", Vol.3, January 15, 2001, CoId Spring Harbor Laboratory ; « Nucleic acid hybridization », BD Haines, SJ Higgins (Eds), 1985, IRL Press). Ainsi, l'homme du métier saura appliquer la procédure nécessaire pour l'extraction d'un échantillon de l'acide nucléique test à partir du prélèvement tumoral.

Les expressions « acide nucléique », « séquence nucléique » ou « d'acide nucléique », « polynucléotide », « oligonucléotide », « séquence de polynucléotide », « séquence nucléotidique », pourront être employés de manière indifférente dans la présente demande pour désigner un enchaînement précis de nucléotides pouvant correspondre aussi bien à de PADN qu'à ses produits de transcription (ARN). Ces acides nucléiques sont isolés de leur environnement naturel.

Le marquage de l'échantillon d'acide nucléique test à l'étape b) et celui de l'échantillon d'acide nucléique de référence à l'étape c) permet l'émission d'un signal détectable et quantifiable, caractéristique de l'intensité d'hybridation obtenue lorsqu'un fragment représentatif d'un gène donné s'hybride d'une part avec un fragment présent dans l'échantillon d'acide nucléique test, d'autre part avec un fragment présent dans l'échantillon d'acide nucléique de référence. L'intensité d'hybridation obtenue est proportionnelle au niveau d'expression du gène représenté par le fragment déposé sur le support solide.

Le marquage peut consister en un radio-marquage (tel que 32P, 33P ,35S, qui peut être détecté en utilisant par exemple un compteur gamma ou un scintillateur, autoradiographie,...), un marquage enzymatique (biotine, digoxigénine,...), un marquage chimioluminescent (luminol, dioxétane, luciférase, luciférine) ou un marquage fluorescent. Lorsqu'on utilise le marquage radioactif, le support solide ne doit pas être en verre.

Le marquage fluorescent est particulièrement préféré pour la réalisation de la présente invention. Comme exemple de marqueurs fluorescents on peut citer, mais sans s'y limiter, la fluorescéine et ses dérivés, tels que l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), les coumarines, les cyanines 2, 3 et 5, les dérivés de la phycocyanine, Pallophycocyanine (APC)5 la phycoérythrine-cyanine 5 (PC5) et la phycoérythrine (PE), la calcéine (AM), la tetraméthyl-rhodamine de fluorescence rouge ou la rhodamine et ses dérivés, la protéine de fluorescence verte ou GFP (« Green Fluorescent Protein »), le chlorure de dansyl, l'umbelliferone etc.. (voir également W. T. Mason (1999), « Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity », Académie Press, Londres, 2è édition).

On choisira les deux marqueurs pour l'échantillon d'acide nucléique test et pour l'échantillon d'acide nucléique de référence de sorte à obtenir deux signaux caractéristiques de l'intensité d'hybridation comparables entre eux. Les méthodes de marquage sont bien connues de l'homme de l'art et sont largement décrites dans la littérature (voir par exemple "Pratique de l'utilisation des sondes nucléiques et de l'hybridation moléculaire", Gérard Lacotte, May 1992, Ed. Lavoisier, Paris, et W. T. Mason (1999), « Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity », Académie Press, Londres, 2è édition) ; les kits et les marqueurs sont disponibles dans le commerce (voir par exemple le kit « Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification Kit », disponible chez Agilent Technologies, ou d'autres kits/marqueurs disponibles par exemple chez Molecular Probes, Leiden, NL, Clontech, PaIo Alto, CA, Stratagene, La Jolla, CA, etc .).

On entend désigner par « échantillon d'acide nucléique de référence » dans la présente demande un pool d'acide nucléique obtenu à partir de différentes lignées cellulaires normales et tumorales. Ces lignées cellulaires sont de manière générale mises en culture à l'échelle industrielle afin de produire des lots de taille importante, qui subissent des procédures de contrôle qualité stringentes. Un tel échantillon d'acide nucléique de référence sert de contrôle pour obtenir les informations relatives à l'expression des gènes présents dans l'échantillon d'acide nucléique test après hybridation avec les fragments représentatifs déposés sur le support solide.

Comme exemple d'échantillon d'acide nucléique de référence on peut citer, mais sans s'y limiter, le pool d'ARN « Universal human référence RNA », commercialisé par Stratagene. La normalisation à l'étape e) permet de s'affranchir des différences causées par le bruit de fond, la durée de l'hybridation, le marquage plus ou moins important des échantillons d'acides nucléiques test et de référence, les quantités variables des échantillons d'acides nucléiques test et de référence déposés sur le support solide, etc... La normalisation des résultats est couramment utilisée dans les expériences de biologie moléculaire et est bien connue de l'homme de l'art. Tous types de méthodes peuvent être utilisés pour la réalisation de la présente invention, tels que notamment la méthode « Lowess Global » (Yang IV et al. Within the fold: assessing differential expression measures and reproducibility in microarray assays. Génome Biol. 3, research 0062.1-0062.12, 2002).

L'analyse à l'étape g) en fonction du profil d'expression obtenu à l'étape f) est réalisée à l'aide de la méthode d'Analyse en Composantes Principales développée par le laboratoire Génome et Informatique d'Evry (logiciel GeneAnova, voir point 5 « analyse des données » de l'exemple). D'autres méthodes d'analyse à plusieurs variables appropriées pourront être utilisées pour classer la réponse thérapeutique du sujet dans la classe chimiosensibilité ou dans la classe chimiorésistance.

De préférence, le procédé selon la présente invention permet de prédire la réponse thérapeutique à au moins un médicament anticancéreux tel que défini précédemment, de préférence au moins le composé de formule (I) suivante :

la composition FEC, qui est une association comprenant les composés F, E et C, de formules respectives (II), (III) et (FV) suivantes :

De manière encore préférée, le classement à l'étape g) de la réponse thérapeutique est déterminé par comparaison du profil d'expression obtenu à l'étape f) avec le profil d'expression tel que défini dans le Tableau A5 à savoir que la surexpression des gènes ACP5, BAD, BARDl, BIRC3, COL4A2, CYP19, DHFR, ERCC5, ERCC6, FEN, GSTA3, LUC7A, MAP2K2, MCM6, NK4, PIP5 PSMD12, STK4 et TSN est caractéristique d'une chimiosensibilité et la surexpression des gènes CX3CL1, MAPKl 3, MYLK et XBPl est caractéristique d'une chimiorésistance.

Selon encore une autre préférence, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que la comparaison à l'étape f) de l'intensité d'hybridation normalisée obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique test marqué avec celle obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué comprend les étapes suivantes : a) le calcul, pour chaque fragment représentatif d'un gène déposé sur le support, du rapport entre l'intensité d'hybridation normalisée obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique test marqué et celle obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué, b) le calcul, pour chaque fragment représentatif d'un gène déposé sur le support, du log2 de chaque rapport obtenu à l'étape a).

Chaque fragment représentatif du jeu est déposé de manière générale une fois, de préférence deux fois, manière encore préférée trois fois, voire quatre fois sur le support solide. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que, lorsque chaque fragment du jeu est déposé trois fois sur le support, la moyenne des log2 des trois réplicats est calculée pour chacun de ces fragments.

Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que les échantillons d'acides nucléiques test et de référence sont de l'ARN.

De préférence, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que l'étape b) de marquage de l'ARN test de l'échantillon à l'aide du premier marqueur comprend les étapes suivantes : i) la rétrotranscription de l'ARN test de l'échantillon obtenu à l'étape a), ii) l'incorporation du premier marqueur lors de la transcription in vitro de PADN test obtenu à l'étape i).

Selon une autre préférence, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que l'étape c) de marquage de l'échantillon d'ARN de référence à l'aide du deuxième marqueur comprend les étapes suivantes : i) la rétrotranscription de l'ARN de référence de l'étape c), ii) l'incorporation du deuxième marqueur lors de la transcription in vitro de PADN test obtenu à l'étape i).

De manière encore préférée, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que les premier et deuxième marqueurs sont choisis parmi la cyanine 3 et la cyanine 5.

Selon un autre mode de réalisation préféré, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que le sujet est atteint d'un cancer du sein, d'un cancer de la prostate ou d'un cancer du colon.

Un dernier aspect de la présente invention concerne un kit comprenant le support solide selon la présente invention. Les kits comprenant un support solide d'hybridation sont suffisamment décrits dans la littérature, et comprennent de manière générale, outre le support solide, des réactifs nécessaires pour l'hybridation tels que notamment des marqueurs ou des tampons d'hybridation et de lavage.

Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinées à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.

FIGURES

Figure 1 : Classification des tumeurs étudiées (ACP, logiciel GeneAnova)

EXEMPLES

1. Patientes Les patientes (17) ont été vues en consultation en sénologie et plusieurs biopsies sont réalisées. Après examen anatomopathologique permettant de caractériser la tumeur au niveau histologique, la patiente reçoit une chimiothérapie néo-adjuvante composée de 6 cures de Taxotere (Docétaxel). La réponse thérapeutique est évaluée après l'intervention chirurgicale selon la classification de Sataloff qui prend en compte la régression tumorale au site primaire ainsi que la réponse ganglionnaire (Cf. Tableau 1, ci-dessous).

CLASSIFICATION DE SATALOFF Sataloff, JAm CoIl Surg 1995, 180 : 297-304

Réponse au site primaire :

TA : effet thérapeutique total ou pratiquement complet,

TB : effet thérapeutique supérieur objectivement à 50%.

TC : moins de 50% d'effet thérapeutique mais effet évident,

TD : pas d'effet thérapeutique.

Réponse ganglionnaire :

NA : effet thérapeutique présent, pas de métastase.

NB : pas de métastase, pas d'effet thérapeutique.

NC : aspect d'effet thérapeutique mais métastase.

ND : métastases viables, pas d'effet thérapeutique.

TABLEAU 1

2. Echantillons biologiques Les ARN sont extraits à partir des biopsies congelées dans l'azote liquide avec le protocole Trizol (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France). Après vérification de la qualité des ARN obtenus par microélectrophorèse sur le bioanalyseur (Agilent technologies, Massy, France). Un pool d'ARN de lignées cellulaires est utilisé comme ARN référence (Universal human référence RNA, Stratagene, La Jolla, CA). Ce pool d'ARN de référence, disponible dans le commerce, comprend une collection d'ARN obtenus à partir d'un certain nombre de lignées cellulaires pour couvrir une gamme optimale de gènes.

3. Préparation des biopuces (ou « support solides >>) Les sondes moléculaires (ou « fragments représentatifs ») sont des oligonucléotides de 50 bases synthétisés par la société MWG. La séquence de certains oligonucléotides sont disponibles dans les banques MWG, d'autres ont été recherchées à la demande des inventeurs. Ces oligonucléotides sont dilués à une concentration de 25 μM dans une solution de DMSO 50% (diméthylsulfoxide) puis déposés sur des lames Ultragaps (Corning, New York, US) grâce à un robot (Microgrid II, Biorobotics, Genomic Solutions, Cambridge, UK). Chaque sonde moléculaire est déposée en triplicat sur la lame. Après dépôt, les molécules d'ADN sont fixées par incubation des lames à 8O0C, pendant 2 heures. Un traitement chimique tel que défini par la société Corning est réalisé. Les lames sont alors conservées à température ambiante, à l'obscurité.

4. Marquage et hybridation Pour chaque échantillon, 1,5 μg d'ARN totaux sont rétrotranscrits puis, une transcription in vitro est réalisée avec incubation de cyanine 5 pour les ARN de la tumeur, de cyanine 3 pour les ARN référence (Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification Kit, Agilent Technologies). Les ARN antisens obtenus sont purifiés et séchés sous vide. Le culot est repris dans 16 μl de tampon d'hybridation (Corning) puis dénaturés à 1000C. L'hybridation se fait avec un coverslip qui permet de maintenir le contact entre la cible et la surface de la lame, à 370C et 50% d'humidité, pendant la nuit. Les lames sont ensuite lavées dans des solutions de SDS (dodécylsulfate de sodium) et SSC (citrate de sodium salin) à différentes concentrations. La fluorescence est détectée par le passage de la puce dans le scanner (GMS 418, Affymetrix).

5. Analyses des données Les images obtenues sont analysées avec un logiciel d'analyse d'image (Jaguar, Afrymetrix, UK). La normalisation des données est effectuée selon la méthode lowess global car il y a une dépendance systématique entre la valeur du Iog2(ratio) et l'intensité, qui apparaît généralement par des valeurs du Iog2(ratio) élevées pour des valeurs d'intensité faibles. Cette méthode permet d'enlever de tels effets. Ensuite, le ratio des intensités tumeur/référence est calculé, puis le log2 des ratios. Pour chaque gène, la moyenne des Iog2(ratio) des trois réplicats est calculée, chaque sonde moléculaire étant déposée trois fois sur la puce. Le test de Student est alors utilisé. Il s'agit d'un test de significativité qui peut être employé lors de la comparaison de deux moyennes. Le test t est calculé en effectuant le rapport de la différence des moyennes sur l'erreur standard. Une valeur p < 0,05 est considérée comme significative. Ce test est impliqué pour évaluer le niveau de significativité entre les moyennes d'expression des différents gènes entre le groupe des échantillons « sensibles » et le groupe des échantillons « résistantes ». Les profils d'expression des gènes discriminants (p<0,05) sont alors étudiés par une analyse en composantes principales (ACP). L'Analyse en Composantes Principales (logiciel GeneAnova, Laboratoire Génome et Informatique d'Evry, FR) est une méthode dite descriptive, elle vise à structurer et simplifier des données issues de plusieurs variables, sans privilégier l'une d'entre elles. L' ACP permet de visualiser la géométrie du nuage des observations quand l'espace à plus de 3 dimensions. Elle procède en 2 étapes, le détermination des axes d'inertie du nuage puis sa projection sur les plans déterminés par les axes d'inertie pris 2 à 2. L'analyse de la sphère des corrélations permet de visualiser les similitudes entre différents profils d'expression. La corrélation linéaire entre 2 profils est égale au cosinus de l'angle entre les vecteurs correspondants à ces conditions expérimentales (un angle de 90° montre une absence totale de corrélation). 6. Résultats et discussion Les 17 patientes avec lesquelles le test a été effectué sont réparties en 3 groupes Groupe 1 : bonne réponse thérapeutique. Groupe 2 : mauvaise réponse thérapeutique. Groupe 3 : réponse non déterminée.

TABLEAU 2

Résultats obtenus: Les données ont été analysées comme décrit précédemment. Le mode de représentation de la classification est une analyse en composante multiple réalisée à l'aide du logiciel GeneAnova (voir Figure 1). On observe 2 groupes correspondant au groupe 1 et au groupe 2 définis dans le tableau. Les patientes pour lesquelles la réponse thérapeutique n'est pas connue se répartissent dans les deux groupes. Il faut noter que d'après les données cliniques, la patiente 11 a bien répondu au traitement. Ceci justifie son classement dans le groupe 2. Vingt-trois gènes (cf. Tableau A - Le symbole « X » dans le Tableau A indique la surexpression d'un gène) sont sélectionnés pour la classification (p < 0,05). La puce utilisée ici permet de mettre en évidence un profil d'expression caractéristique de la réponse thérapeutique au taxotere (docétaxel). TABLEAU A

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N) TABLEAU B

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