FORMULACIONES BIOCIDAS QUE COMPRENDEN ACEITES ESENCIALES O EXTRACTOS VEGETALES Y METALES NOBLES

CAMPO TÉCNICO

La presente divulgación se encuentra en el campo de productos para la prevención y control de enfermedades infecciosas, como antimicrobianos y antisépticos. La divulgación se relaciona con productos biocidas (desinfectantes, antisépticos, antimicrobianos, antifüngicos e insecticidas), naturales, efectivos contra una amplia gama de microoiganismos, incluso microorganismos resistentes a los antimicrobianos disponibles. Particularmente los productos biocidas que se describen se basan en combinaciones de extractos vegetales y/o aceites esenciales y nanopartículas metálicas, los cuales tienen aplicación en medicina humana, veterinaria, industria de alimentos e industria agrícola.

DESCRIPCIÓN DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

La resistencia a los antimicrobianos ha sido catalogada como un problema sanitario de alto impacto ya que ha reducido considerablemente la capacidad de tratar y controlar las enfermedades infecciosas en todos los niveles. Adicionalmente este fenómeno constituye una caiga económica considerable, en vista de la necesidad de tratamientos más extensos o que utilizan fármacos de amplio espectro que resultan más costosos o son simplemente inaccesibles. En ese sentido existe una necesidad de encontrar tratamientos alternativos que sean eficaces frente a los microorganismos que causan la mayor cantidad de infecciones y que se han vuelto paulatinamente más resistentes frente a los antimicrobianos disponibles.

El estudio de los antimicrobianos está en permanente desarrollo y se han realizado esfuerzos de investigación multidisciplinaria para contribuir a controlar la resistencia antimicrobiana. Sin embargo, en los últimos tiempos, son pocos los nuevos productos desarrollados y aprobados para su uso por las entidades regulatorias. Adicionalmente, los antimicrobianos y otros productos antisépticos y desinfectantes empleados en todos los niveles de las cadenas de producción, poseen efectos indeseables que actualmente se busca evitar. Por ejemplo, los agroquímicos empleados en la industria bovina generan trazas tóxicas que se bioacumulan en la leche. El uso de antibióticos inadecuadamente en el tratamiento y prevención de enfermedades infecciosas, promueve la resistencia de los microorganismos y genera un grave problema de salud pública.

Ante la necesidad de obtener antimicrobianos nuevos y más efectivos, existe un auge creciente de productos naturales de diversos orígenes que poseen actividad contra múltiples microorganismos causantes de infecciones y que pueden ser efectivos contra una amplia gama de estos microorganismos, incluso aquellos que han adquirido resistencia antimicrobiana. Por ejemplo, la patente JP2008534675 divulga una composición que contiene un extracto natural de toronja, verdolaga (Portulaca olerácea L.) y Houttuyniae Herba (Houttuynia cordata Thunb); nanopartículas de plata; aceites naturales esenciales y etanol, en donde la composición tiene actividad antimicrobiana frente a bacterias y hongos.

Asimismo, la patente BR102019014242 ilustra una solución desinfectante acuosa que contiene un aceite orgánico esencial, particularmente aceite esencial de orégano (Origanum vulgare), y nanopartículas de plata biogénicas; así como el proceso para obtener dicha solución. Las soluciones desinfectantes descritas son efectivas contra una gran variedad de bacterias y hongos, y pueden ser utilizadas tanto en ambientes domiciliarios como en ambientes hospitalarios.

Por otro lado, la patente US9907812 divulga composiciones que comprenden agentes antifüngicos o antibacterianos, nanopartículas y un lípido, en donde las composiciones pueden ser utilizadas para el tratamiento de infecciones fungicas o bacterianas.

Adicionalmente, existen numerosos estudios y publicaciones científicas relacionadas con este campo, por ejemplo, autores como Basavegowda et al. y otros tantos han analizado esta problemática. En particular estos autores publicaron un artículo de revisión en el que se documentan diferentes estudios que demuestran la actividad antimicrobiana de aceites esenciales y de nanocompuestos mono/bi/tri-metálicos, así como el efecto sinérgico generado por su combinación (Basavegowda et al. 2020. Essential Oils and Mono/bi/tri-Metallic Nanocomposites as Alternative Sources of Antimicrobial Agents to Combat Multidrug-Resistant Pathogenic Microorganisms: An Overview. Molecules;25:1058). Dentro de los estudios incluidos en esta revisión se evaluó el efecto sinérgico producido por aceites esenciales de Origanum vulgare en combinación con nanoparticulas de plata contra Escherichia coli, Acinetobacter baumannii y Staphylococcus aureus; y el potencial antimicrobiano sinérgico de la combinación de aceites esenciales de romero y orégano y nanoparticulas de plata y óxido de zinc fíente a S', aureus, Listeria monocytogenes, E. coli y Salmonella typhimurium.

No obstante, el constante desarrollo y actividad investigativa en este campo, persiste la necesidad de agentes biocidas multifuncionales para aplicaciones como antimicrobianos, antisépticos y desinfectantes que sean efectivos y de fácil acceso para la población en general y que tengan pocos o ningún efecto secundario asociado.

BREVE DESCRIPCIÓN

La presente divulgación hace referencia a composiciones biocidas que comprenden una mezcla de dos o más aceites esenciales, extractos o metabolitos de especies vegetales en combinación con nanoparticulas metálicas, vehículos y excipientes apropiados. Las composiciones comprenden extractos, aceites esenciales o metabolitos de las especies Lippia citriodora, Lippia origanoides, Lippia turbinata, Lippia hirsurta, Lippia schlimii Turcz, Thymus vulgaris, Rosmarinus officinalis, Zingiber officinale, Lantana camara, Cymbopogon citratus, Salviae folium, Lavandula dentata, Lavandula angustifolia, Lavandula x heterophylla, Gliricidia sepium, Minthostachys mollis, Pelargonium crispum Guazuma ulmifolia, Achyrocline bogotensis y pueden ser utilizadas como antimicrobianos en medicina humana, veterinaria, industria de alimentos e industria agrícola.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIG. l Actividad antimicrobiana de aceites esenciales frente a Staphylococcus spp., en comparación con antibióticos convencionales. A. Actividad de aceites esenciales de Lippia citriodora, Thymus vulgaris y Lippia alba. B. Sensibilidad de los mismos aislamientos fíente a antibióticos convencionales. FIG. 2 Actividad antimicrobiana de aceites esenciales frente a Staphylococcus aureus, en comparación con antibióticos convencionales. A Actividad de aceites esenciales de Lippia citriodora, Thymus vulgaris y Lippia alba. B. Sensibilidad de los mismos aislamientos frente a antibióticos convencionales.

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FIG. 3 Evaluación de la actividad antimicrobiana de combinaciones de extractos.

FIG. 4 Resultado comparativo de reducción de microorganismos patógenos entre la composición a base de aceites esenciales y la composición de base yodófora.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Para propósitos de interpretar los términos usados a lo largo del presente documento se debe tener en cuenta su significado usual en el campo técnico, a menos que se incorpore una definición particular o el contexto indique claramente lo contrario. Adicionalmente, los términos utilizados en forma singular también incluirán la forma plural.

Se ha evidenciado que mezclas de aceites esenciales, extractos o metabolites de las especies Lippia citriodora, Lippia origanoides, Lippia turbinata, Lippia hirsurta, Lippia schlimii Turcz, Thymus vulgaris, Rosmarinus officinalis, Zingiber officinale, Lantana camara. Cymbopogon citratus, Salviae folium, Iavandula dentata, Lavandula angustifolia. Lavandula x heterophylla, Gliricidia sepium, Minthostachys mollis, Pelargonium crispum, Guazuma ulmifolia, Achyrocline bogotensis en combinación con nanoparticulas metálicas exhiben un efecto sinérgico que incrementa su capacidad biocida. Dichas combinaciones, formuladas en un vehículo apropiado pueden tener aplicaciones biocidas para uso en medicina humana y veterinaria, en la industria agrícola y/o de alimentos y en el campo de la desinfección en general.

Los aceites esenciales de especies como Lippia citriodora y Lippia origanoides, contienen metabolites asociados a la actividad antimicrobiana. Esta actividad antimicrobiana se asocia al carvacrol y timol, mostrando capacidad frente a: S. aureus, E. coli, Salmonella. Pseudomonas, entre otros (Iturriaga, Olabarrieta, & Marañón, 2012). Específicamente, frente a Staphylococcus spp. aislados de casos positivos de mastitis bovina, incluyendo microorganismos resistentes a antibióticos convencionales, siendo un posible tratamiento. El aceite esencial de la L. origanoides en cultivos de Colombia contiene principalmente carvacrol (2 - 40%), p-cimeno (13%) , g-terpineno (11%) y timol (20 - 70%) y es de gran interés para la industria farmacéutica (Stashenko, y otros, 2010).

El timol empleado en el tratamiento de la mastitis bovina, en una concentración mínima inhibitoria (CIM) en un rango de 16 - 64 mg/mL puede reducir la intemalización del Staphylococcus aureus en células epiteliales mamarias bovinas e inhibir la producción de óxido nítrico (Zhengkai, y otros, 2014).

Igualmente, el aceite esencial Lippia citriodora ha mostrado capacidad antimicrobiana asociada a sus compuestos mayoritarios que varían según las condiciones de cultivo y climatológicas: limoneno 0,6 - 37%, neral 11 - 30%, geranial 14 - 37%, con inhibición frente a los aislamientos de Escherichia coli, Klebsiella ozaenae, Enterobacter aerogenes, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus y Enterococcus sp., con valores de CIM de 10 - 50 μg/ml.

Se han evaluado los cambios morfológicos en Staphylococcus aureus meticilina resistente frente a metabolitos como citral y la mezcla geranial- neral, encontrando daños en la membrana citoplasmática que pueden ser ocasionados por la sinergia de los mecanismos de acción de los compuestos que potencializan la actividad antimicrobiana. Estudios muestran que existe sinergia en la actividad antimicrobiana de plantas medicinales. Para el caso de la mezcla de aceites esenciales de L origanoides y L. citriodora se ha evidenciado sinergia frente aislados de casos positivos de mastitis bovina.

Composiciones

La presente divulgación describe composiciones biocidas que comprenden mezclas de dos o más aceites esenciales, extractos o metabolitos de especies vegetales y nanopartículas de plata o cobre, junto con un vehículo y excipientes apropiados. En particular, en la presente divulgación, las mezclas de dos o más aceites esenciales, extractos o metabolitos de especies vegetales se seleccionan del grupo que consiste en Lippia citriodora, Lippia origanoides, Lippia turbinata, Lippia hirsurta, Lippia schlimii Turcz, Thymus vulgaris, Rosmarinus officinalis, Zingiber officinale, Lantana camara, Cymbopogon citratus, Salviae folium, Lavandula dentata, Lavandula angustifolia, Lavandula x heterophylla, Gliricidia sepium, Minthostachys mollis, Pelargonium crispum, Guazuma ulmifolia, Achyrocline bogotensis.

En una modalidad, la mezcla de dos o más aceites esenciales, extractos o metabolitos de especies vegetales está en una proporción entre 1 : 1 y 1 :3. En modalidades particulares, la mezcla de dos o más aceites esenciales, extractos o metabolitos de especies vegetales está entre 0,001 y 30% (p/p) de la composición total, entre 0,5 y 25%, entre 0,5 y 10% o entre 3 y 15%.

En una modalidad particular, las nanopartículas metálicas son nanopartículas de plata o cobre coloidal. En una modalidad particular las nanopartículas de plata o cobre coloidal están entre 0,005 y 100 ppm, entre 0,5 y 50 ppm, entre 1 y 25 ppm o entre 5 y 15 ppm. En una modalidad particular, las nanopartículas de plata o cobre están entre 0,001 y 25% de la composición, entre 1 y 20% o entre 5 y 15%.

Para efectos de la presente divulgación, el vehículo se puede seleccionar, sin limitarse a agua, alcoholes, sueros, azúcares, sales, minerales, geles, lípidos animales, vegetales o sintéticos, petrolato y mezclas de los mismos. Los excipientes se seleccionan del grupo que consiste en estabilizantes, viscosantes, emulsificantes, jabones, dimetil sulfóxido y mezclas de los mismos. Opcionalmente la composición puede incluir otros excipientes para mejorar las características organolépticas o la aplicación tales como colorantes, saborizantes, compactantes, entre otros.

Entre los estabilizantes se encuentran goma de celulosa, adipato de diisopropilo, benzotriazolil butilfenol sulfonate de sodio, ciclodextrina, fosfato de almidón, citrato sódico, goma guar, goma rizobiana, bicarbonato de sodio, goma esclerocio, ácido cítrico, goma xantana, entre otros. Los viscosantes se pueden seleccionar entre almidón de tapioca, celulosa y hectorita de disteardimonio.

Los emulsificantes pueden ser naturales o sintéticos, iónicos y no iónicos; seleccionados entre, sin limitarse a sales biliares, proteínas, gomas, colesteroles, saponinas, sales de ácidos grasos, esteres de glicol, esteres de propilenglicol, esteres de sacarosa, esteres de ácidos grasos.

Los jabones se pueden seleccionar, sin limitarse a aguas miscelares, cocoamida, cocoanfodiacetaio disódico, coconoato de glicerilo, colato de sodio, lauril sulfato de amonio, lauril sulfato de sodio, PPG-1 TRIDECETH-6, propil betaina cocoamida y sodio cocoil glutamate.

Las formas de presentación de las composiciones que se describen en la presente divulgación comprenden composiciones antimicrobianas de uso tópico, bucal o nasal, así como desinfectantes, e incluyen, sin limitarse a champús desinfectantes, enjuagues bucales, inhaladores nasales, pastas dentífricas, desodorantes y selladores mamarios- formulación antiséptica, entre otras.

En una modalidad, la composición en forma de champú desinfectante comprende una mezcla de dos o más aceites esenciales, extractos o metabolitos de especies vegetales, entre el 0,5 y el 25 %; nanopartículas de plata o cobre al 0,005 y 100 ppm en 0,001- 25%, glicerol, coco sulfato de sodio, glucósido de coco, cocoamida y agua.

En otra modalidad la composición en forma de pasta dentífrica comprende una mezcla de dos o más aceites esenciales, extractos o metabolitos de especies vegetales entre el 0,5 y el 30 %; nanopartículas de platao cobre al 0,005 y 100 ppm en 0.001-25%,, propilenglicol, glicerol, aceite vegetal (coco, oliva, ricino), ácido cítrico, carbonato de calcio, sílice hidratada, arcilla blanca caolín, goma xantana, xilitol y agua.

En una modalidad adicional, la composición en forma de desodorante comprende una mezcla de dos o más aceites esenciales, extractos o metabolitos de especies vegetales entre el 0,5 y el 25 %; nanopartículas de plata o cobre al 0,005 y 100 ppm en 0,001- 25%, glicerol, aceite vegetal (coco, oliva, ricino), goma xantana y agua. En otra modalidad, la composición en forma de sellador mamario - formulación antiséptica, comprende una mezcla de dos o más aceites esenciales, extractos o metabolitos de especies vegetales entre el 0,5 y el 25%; nanopartículas de plata o cobre al 0,005 y 100 ppm en un 5-30%, agua, metil etil celulosa (<1%) y glicerina. En otra modalidad particular, la composición comprende un sellador mamario - formulación antiséptica que comprende aceites esenciales de las plantas Thymus vulgaris y Lippia ciíriodora en relación (1:2), en una concentración de entre 0,5 y 10%, nanopartículas de plata 0,005 ppm en un 5%, un gel polisacárido de metil etil celulosa en una concentración inferior al 1%, glicerol como plastificante y suavizador en una concentración entre el 30-50%, agua, y colorantes empleados en la industria de alimentos.

En una modalidad particular la composición comprende un enjuague bucal que comprende aceite esencial de Cymbopogon citratus y Lippia origanoides en relación 1:1 (3%), plata coloidal 15 ppm (20%), propilenglicol (30%), y agua. En otra modalidad particular, la relación entre el aceite esencial de Cymbopogon citratus y Lippia origanoides es 2: 1.

En otra modalidad particular, la composición comprende un inhalador nasal que comprende aceite esencial de Cymbopogon citratus y Minthostachys mollis en relación 1:1 (3%), plata coloidal 15 ppm (20%), suero fisiológico (30%), y agua. En otra modalidad particular el inhalador nasal comprende aceite esencial de Lippia origanoides y Lippia citriodora.

Métodos de obtención

Para efectos de la presente divulgación, el material vegetal tiene como origen cultivos jóvenes del municipio de Machetá - Cundinamarca, Colombia, a una altura de 1850 metros sobre el nivel del mar (msnm), clima templado a cálido con temperatura promedio anual de 17,8 °C.

Los aceites esenciales, extractos y metabolitos de las especies vegetales se obtienen por procesos conocidos en la técnica, tales como destilaciones, extracción con ultrasonido, macerados, decocciones, digestiones, oleates, extracciones con disolventes, liofilizaciones, extracción a presiones controladas, extracción con fluidos supercriticos, mecánicas, entre otras. En una modalidad, los aceites esenciales se obtienen por destilación por arrastre de vapor, por ser un proceso de fácil manejo, económico y de buen rendimiento. En otra modalidad, para optimizar la extracción se pueden realizar pre-tratamientos del material vegetal con un secado parcialmente al sol y disminución del tamaño de partícula para contribuir a la extracción.

En una modalidad particular, la extracción de aceites esenciales como el caso del aceite esencial de Lippia origanoidaes, se realiza a partir material vegetal seleccionado con un secado previo a temperatura <60 °C y/o ultrasonido para favorecer la concentración de los metabolites antes de la hidrodestilación/arrastre de vapor.

En una modalidad particular, después de la extracción, se mezclan los aceites esenciales a temperatura ambiente, en relación 1:1; 1:2 o 1:3; según el efecto potenciador de la mezcla y su aplicación biocida. La mezcla obtenida se diluye inicialmente en una solución coloidal de plata o cobre en concentración entre 0,005 y 100 ppm, a temperatura ambiente. Opcionalmente se agrega dimetil sulfóxido al 99% entre el 1 % y 15% o agua carbonatada entre el 0,1 y 40% para optimizar la suspensión. Finalmente, la formulación emplea un vehículo inerte de naturaleza acuosa u oleosa, que puede consistir, sin limitarse a agua, alcoholes, sueros, azúcares, sales, geles, minerales, lípidos animales, vegetales o sintéticos, petrolato y mezclas de los mismos. La mezcla con el vehículo se puede realizar a temperatura ambiente o incrementar la temperatura para homogenizar los ingredientes sin superar los 60 °C para garantizar la calidad de los aceites esenciales y su efecto.

La presente invención será presentada en detalle a través de los siguientes ejemplos, los cuales son suministrados solamente con propósitos ilustrativos y no con el objetivo de limitar su alcance.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Composiciones a base de mezclas de aceites esenciales, extractos o metabolites de especies vegetales en combinación con nanopartículas metálicas Se obtuvieron las siguientes composiciones:

Tabla 1. Composiciones generales elaboradas

3 O

I I hd n i

©

I

3 o

K> I

I hd n i

©

I

Ejemplo 2. Caracterización de aceites esenciales / extractos / metabolitos de especies vegetales

Los aceites esenciales fueron obtenidos por destilación por arrastre de vapor y su análisis se desarrolló mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-MS).

En las Tablas 2 y 3 se relacionan los tiempos de retención (tR), cantidad relativa y compuestos más representativos presentes en los aceites esenciales de Lippia citriodora y Lippia origanoides:

Tabla 2. Compuestos mayoritarios aceite esencial de Lippia citriodora

Tabla 3. Compuestos aceite esencial Lippia origanoides En las Tablas 4 y 5 se relacionan los tiempos de retención (tR), cantidad relativa y compuestos más representativos presentes en los aceites esenciales de Rosmarinus officinalis y Pelargonium crispum:

Tabla 4. Compuestos aceite esencial Rosmarinus officinalis

Tabla 5. Compuestos aceite esencial Pelargonium crispum

Otras caracterizaciones incluyen además el aceite esencial de Lippia citriodora (LUe'r.) es un aceite transparente amarillo pálido de densidad djo 0,86 g/mL, insoluble en agua y soluble en aceites vegetales y el aceite de Thymus vulgaris (L) está compuesto principalmente por timol y cimeno, trazas de bomeol, acetato de bomilo. La densidad dio 0,88 g/mL, insoluble en agua, soluble en aceites y solventes orgánicos.

Ejemplo 3. Evaluación de la actividad biocida

3.1 Microorganismos evaluados

Se aislaron microorganismos patógenos causantes de infección de muestras clínicas así:

• Caso 1: perro adulto con infección cavidad oral (hisopo mandíbula), la cepa aislada corresponde a Staphylococcus sp. resistente a los marcadores de resistencia de los betalactámicos (oxacilina), sensible a enrofloxacino y cloranfenicol. Los extractos naturales que mostraron mejor efectividad frente a la cepa son Cymbopogon citratus y Lippia origanoides.

• Caso 2: perro adulto con infección cavidad oral, la cepa aislada de una muestra de hisopo mandibular, corresponde a Corynebacterium sp. sensible a cloranfenicol y azitromicina. Los extractos naturales que mostraron mejor efectividad frente a la cepa son: Cymbopogon citratus y Lippia origanoides.

• Caso 3: perro adulto con infección nasal la cepa es aislada de una muestra de hisopo nasal, corresponde a Staphylococcus sp. sensible a doxicilina, tobramicina, azitromicina, enrofloxacino y cloranfenicol. Los extractos naturales que mostraron mejor efectividad frente a la cepa son: Cymbopogon citratus y Minthostachys mollis.

• Caso 4: peno adulto con infección nasal la cepa es aislada de una muestra de hisopo nasal, corresponde a Staphylococcus sp.y Pseudomonas sp. sensibles a tobramicina. Los extractos naturales que mostraron mejor efectividad frente a las dos cepas son: Lippia origanoides y Lippia ci inodora.

• Caso 5: casos clínicos con reporte positivo de dermatitis infecciosa relacionados con muestras clínicas de patologías óticas, dérmicas, entre otras en perros. Las cepas aisladas correspondieron a Pseudomonas sp., Staphylococcus sp. y Proteus sp. El 63.2% de las cepas aisladas de Staphylococcus sp., tenían como origen muestras de piel; mientras que el 78% de las cepas aisladas de Pseudomonas sp. y el 67% de las cepas de Proteus sp. predominaban en las muestras óticas. Los porcentajes de sensibilidad in vitro a los antibióticos de los aislados clínicos de Staphylococcus sp., fueron los siguientes (p<0.05): rifampicina 96.8% amikacina 89.1%, ácido fusídico y cloranfenicol 84% y amoxicilina/ácido clavulánico y doxiciclina 80%. Se observó el mayor porcentaje de resistencia frente a la clindamicina (65%) y sulfametoxazol- trimetoprim (56%).

• Caso 6: aislamientos de Staphylococcus spp de mastitis bovina sensibles a cloranfenicol y resistentes a clindamicina

• Caso 7: cepas aisladas de Staphylococcus spp, de casos positivos de mastitis bovina de la sabana de Bogotá previamente caracterizados como Staphylococcus coagulasa negativo y Staphylococcus aureus.

3.2 Evaluación de la actividad biocida de aceites, extractos, metabolitos de especies vegetales

Aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris), aceite esencia de pronto alivio (Lippia Alba), aceite esencial de Cdrón (Lippia citriodora), resina guácimo (Guazuma ulmifolia) decocción, resina guácimo maceration e infusión, resina Vira vira (Achyrocline bogotensis) decocción, resina Vira vira maceración e infusión se probaron fíente a aislamientos de Staphylococcus spp de mastitis bovina mediante el método de difusión de disco, impregnando discos de 7 mm de papel filtro estéril (densidad 140g/cm ² ), con 20 μL de cada aceite o extracto. Se midió el diámetro de inhibición de crecimiento fíente a los aceites esenciales y las resinas y se calcularon la estadística descriptiva: mínimo, máximo, media y error estándar. A partir de estos valores se definió una sensibilidad para discos mayores de 20 mm y resistencia para discos menores a este valor. Se utilizó la prueba de Chi cuadrada (X ² ) y se consideró una diferencia significativa con un valor de p < 0.05.

El análisis de los datos se realizó mediante el paquete estadístico SPSS para valorar la tendencia de proporciones y concordancias. Los resultados se observan en la Tabla 6.

Tabla 6. Actividad antimicrobiana - Estadística descriptiva

Media Error Estadístico estándar

Aceite esencial de cidrón ( Lippta citriodora) 27,2 0,91

Aceite esencial de pronto alivio (Lippia alba) 21,3 1,30

Aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris) 26,7 0,83

Resina guácimo (Guazuma ulmifolia) decocción 5,1 1,55

Resina guácimo maceración e infusión 0,00 0,00

Resina Vira vira ( Achyrocline bogotensis^

0,00 0,00 decocción

Resina Vira vira maceración e infusión. 0,00 0,00

Los aceites esenciales evaluados presentaron actividad antimicrobiana con los siguientes porcentajes de inhibición de cepas de Staphylococcus spp.: Lippta citriodora (85%), Thymus vulgaris (83.5%) y Lippia alba (50.6%), en comparación con la sensibilidad de los mismos aislamientos frente a antibióticos convencionales, como se observa en la Figura 1 A y B. Un comportamiento similar se observó en los aislados de Staphylococcus aureus como se observa en la Figura 2 A y B, sin embargo, se observó mayor resistencia fíente a los antibióticos convencionales y se mantuvo la sensibilidad presentada fíente a Lippia citriodora (83.8%) y Thymus vulgaris (83,8%). Adicionalmente, se evidencia que existen diferencias significativas en la sensibilidad de las cepas de Staphylococcus spp.

3.3 Evaluación del efecto sinérgico de mezclas de aceites esenciales

Se evaluó la actividad antimicrobiana de aceites esenciales de Thymus vulgaris (L) y Lippia citriodora (L' He'r.) en ensayos in vitro en cepas aisladas de Staphylococcus coagulasa negativo y Staphylococcus aureus provenientes de casos positivos para mastitis bovina de la sabana de Bogotá - Colombia. Se evaluó el efecto sinérgico/potenciador de la mezcla de estos dos aceites esenciales respecto a los aceites esenciales puros.

Se usó la técnica del tablero de ajedrez y el método de Kirby-Bauer. Se concluyó que existe efecto sinérgico de la mezcla de aceites esenciales Thymus vulgaris (L) y Lippia citriodora (L'He'r.) en relación 2:1, que potencia su actividad antimicrobiana optimizando su eficiencia terapéutica (p < 0.05). La concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración mínima bactericida (CBM) de la mezcla fue determinada por la técnica de micro dilución en caldo (n=80).

El aceite esencial de Lippia citriodora (L'He'r.) previamente caracterizado, principalmente compuesto de limoneno, citral y linalool, había mostrado un 85% de inhibición en las cepas de estudio, con un halo medio de 27,2 mm. Igualmente se evaluó el aceite de Thymus vulgaris (L) que está compuesto principalmente por timol y cimeno, trazas de bomeol, acetato de bomilo previamente había mostrado un 82,5% de inhibición en las cepas de estudio, con un halo medio de 26,7 mm. Se utilizó como disolvente miristato de isopropilo estéril, que ha demostrado no tener actividad antimicrobiana en las condiciones de ensayo, con dio 0.856 g/mL, empleado como excipiente en ensayos de esterilidad y en productos cosméticos a base de aceites y grasas. Se empleó la técnica de tablero de ajedrez, que se usa en el estudio de actividad combinada, en la cual hay múltiples diluciones de los antimicrobianos en concentraciones superiores e inferiores a la Concentración Mínima Inhibitoria - CMI reportada para estos aceites. De esta forma, quedan representadas todas las posibles combinaciones de diluciones para los dos aceites esenciales de estudio en 19 mezclas descritas en la tabla a continuación.

Tabla 7. Tablero concentraciones AET/AEC

Se inocularon las placas de agar Muller -Hilton con una solución de caldo Muller Hilton a una escala de turbidez 0,5 McFarland, se colocaron los discos previamente preparados y se incubó durante 24 horas a 37 °C, posteriormente, se midieron los halos de inhibición de las placas en mm.

Para el análisis estadístico se calculó el tamaño de la muestra con GRANMO 7.12 y el paquete estadístico IBM SPSS, se utilizó la prueba de Mann Whitney para grupos no paramétricos independientes.

En el ensayo preliminar se evaluó la actividad antimicrobiana con el método de difusión de disco y micro dilución a fin de descartar aquellas mezclas no relevantes para el ensayo. Se descartaron 15 mezclas las cuales se muestran sombreadas en la Tabla 8, quedando 14 mezclas a evaluar una posible sinergia significativa: Tabla 8. Mezclas con actividad antimicrobiana (mezclas sombreadas no tienen actividad significativa)

Las mezclas que presentaron actividad antimicrobiana fueron evaluadas con el total de aislamientos (n=80), mediante el método de difusión de disco encontrando que únicamente 6 de las mezclas mostraban una actividad antimicrobiana relevante (24-29), como se observa en la Figura 3.

Se midieron los halos de inhibición para el total de aislamientos y se calculó la media, también se observó un incremento en los halos de inhibición a partir de la mezcla 24, como se puede observar en la Tabla 9.

Tabla 9. Diámetro del Ihalo inhibición expresado en mm.

El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS; para variables no paramétricas con la prueba de Mann -Whitney, aceptando diferencia significativa en las medias de los halos de inhibición de la mezcla comparada con el aceite esencial de cedrón pino y el aceite esencial de tomillo con un p<0.05.

Tabla 10. Pmeba de Mann-Whitney

Estadísticos de prueba*

Frente a ambos aceites puros el valor p es <0.05, mostrando una diferencia significativa en la actividad antimicrobiana de la mezcla frente a los microorganismos aislados de estudio. Se evidencia que existen efecto sinérgico de la mezcla de aceites esenciales (2: 1) que potencia su actividad antimicrobiana optimizando su eficiencia terapéutica (p < 0.05), con un halo medio de inhibición de 34 mm y un porcentaje de inhibición del 96%, por encima del aceite esencial de Thymus vulgaris (L) halo medio de 26 mm y 83% de porcentaje de inhibición y del aceite esencial de Lippia citriodora (LHe'r.) con un halo medio de 27 mm y 85 % de porcentaje de inhibición.

Ejemplo 4. Formulación de un sellador mamario - formulación antiséptica para prevenir la mastitis

Con el propósito de prevenir la mastitis en los hatos, se emplean selladores antimicrobianos de barrera que crean una película en el canal del pezón, el agente antimicrobiano impide el ingreso de microorganismos patógenos. Regularmente este tipo de productos son a base soluciones yodóforas, con efectos corrosivos, generando efectos secundarios sobre el bienestar de la ubre y no siendo del todo efectivos sobre los microorganismos causantes de la mastitis. Por lo anterior, se evaluó la eficacia de un sellador de barrera a base de una mezcla de aceites esenciales de tomillo y cedrón, usando como control un sellador de barrera de base yodóforas; sobre la incidencia de mastitis bovina haciendo seguimiento al recuento de células somáticas por microscopia directa, el Test de California, así como muestreo microbiológico para identificar la presencia de bacterias patógenas.

4.1 Prueba de California para Mastitis (CMT)

Esta prueba permite obtener una apreciación del recuento de células somáticas presente en la leche, es una prueba subjetiva que da una valoración de bajo o alto. Empleando una paleta con 4 placas, se depositan uno o dos chonos de leche posterior al despunte y limpieza previa del pezón, la paleta se inclina para que el volumen de las placas sea aproximadamente homogéneo. Posteriormente, en cada placa se deposita un volumen equivalente del reactivo del test de California, se agita y se procede a evaluar la reacción, entre más células somáticas estén presentes en la muestra de leche, más viscosa y espesa será la mezcla según los criterios de la Tabla 11.

Tabla 11. Reacciones test de california ¹

4.2 Recuento de células somáticas por microscopía directa

Este método es considerado el más preciso para el recuento, y es empleado para calibrar equipos y otras técnicas. A partir de la muestra recolectada (posterior a la limpieza y despunte), debidamente homogenizada y atemperada a 24°C, se recolecta con una pipeta 0,01 mi y se distribuye en un área aforada de 1 cm ³ en un portaobjetos. La muestra en el portaobjetos se seca en una estufa a 40 °C durante 15 min y se realiza la tinción Diff - quik™. Se hace el recuento de células somáticas directamente en el microscopio tomando 30 a 40 campos. El promedio de células es multiplicado por el factor del microscopio (dependerá del modelo y marca) para dar el valor total de células somáticas por mi (Lagos, C. R. (1998). Determinación de Células Somáticas en Calostro Post- Parto de vacas de lechería mediante dos métodos de recuento. Chile: UNIVERSIDAD

AUSTRAL DE CHILE ).

4.3 Evaluación microbiolósica por cultivo

La muestra es recolectada posterior a la limpieza, desinfección con alcohol a 70° y despunte, para evitar contaminación, almacenada conservando la cadena de frío a 4°C. Para realizar el cultivo es retirada del refrigerador y atemperada a temperatura ambiente. A partir de una alícuota de 10μl empleando un asa aforada, se realiza la siembra por agotamiento de muestra, en agar sangre de cordero y se incuba durante 24 - 48 horas a 37°C. Las placas se examinan a 24 h y a 48 h para evidenciar el crecimiento de microorganismos patógenos (Calvinho, L. (2010). DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO DE MASTITIS Y SU IMPORTANCIA EN LOS PROGRAMAS DE

CONTROL Argentina: INTA ). La prueba de California da un valor aproximado de las células somáticas presentes en cada pezón, sin embargo, es un resultado subjetivo que depende de la estimación del evaluador.

La microscopía directa, determina más exactamente el recuento de células somáticas. Las células somáticas elevadas indican una respuesta inmunitaria de la glándula mamaria, aunque en la mayoría de casos infecciosos existe un incremento de células somáticas, no siempre un elevado recuento de células somáticas responde a casos infecciosos, también pueden ser generados por alguna lesión física en la glándula. Una proporción elevada de neutrófílos, son consecuencia de una respuesta inmunológica por infección generada por agentes patógenos.

Finalmente, la identificación de patógenos presentes en la leche, determina la infección intramamaria.

En los casos estudiados, los pezones no presentaban ninguna irritación, grieta o daño visible en el momento de la prueba, lo que corresponde posiblemente a casos de mastitis subclínica.

4.4 Formulación

Para la formulación del sellador - formulación antiséptica se emplearon aceites esenciales como ingrediente activo de las plantas Thymus vulgaris (L) y Lippia citriodora (H.B.K.) previamente obtenidos y caracterizados por cromatografía de gases masas, en una concentración de 0,6 - 2.5% en mezcla potenciando su efecto de acuerdo con los experimentos anteriores. La citotoxicidad de los aceites esenciales, fue comparada previamente con otros agentes antimicrobianos, así como sus dosis, para garantizar la inocuidad del sellador.

Para la formación de película se empleó un gel polisacárido, factor determinante en el proceso de sellado del canal del pezón, en este caso metil etil celulosa en una concentración inferior al 1%. Adicionalmente se empleó el glicerol como plastificante y suavizador, con una concentración cercana al 30-50%, entre otros excipientes entre ellos agua, colorantes empleados en la industria de alimentos para evidenciar visualmente la impregnación en el pezón garantizar su correcta aplicación.

Esta formulación preliminar tomó como referencia el producto comercial y productos similares en el mercado. Actualmente, para mitigar los efectos corrosivos del yodo se emplean gliceroles para humectar y proteger la ubre. Otros productos, emplean parafinas y ceras como base, pero para garantizar la humectación y efectos suavizadores se empleó en la formulación el glicerol.

Dado que el sellador- formulación antiséptica debe formar una película y una capilaridad en el canal del pezón para garantizar una barrera protectora que impida la migración de microorganismos patógenos además de su efecto bactericida, se realizó prueba de capilaridad y viscosidad comparando con el producto comercial a base de yodo. El propósito es garantizar un taponamiento en el canal del pezón. Dentro de estas pruebas se garantizó el tiempo de descenso en un capilar de 3 mm de una cantidad de 200 μl, una longitud mínima de 4 cm, fuese igual que el producto comercial, así como un mínimo goteo al impregnar la ubre. Otro de los factores adicionales es que no se disolviera inmediatamente al contacto con el agua, es decir que la gota de sellador permaneciera en el tiempo dentro de un recipiente con agua, a pesar de ser de fácil retiro y limpieza.

La evaluación a través del cultivo microbiológico para detectar microorganismos patógenos en la leche, muestra la efectividad del producto en el periodo de estudio, según la Figura 4, se puede observar que 2/6 casos tuvieron presencia de patógenos al terminar el estudio, es decir tan solo un 66,6% de los pezones el producto con base yodófora actuó preventivamente, mientras que para el grupo sellador a base de aceites esenciales el producto mantuvo su efecto preventivo en 7 de los 8 casos, es decir en un 85,7%.

Durante el periodo de estudio no se evidenciaron daños visibles en la ubre, muestra de dolor, grietas o cualquier daño que pusiera en riesgo el animal.

Ejemplo 5. Evaluación de una formulación biocida con aceites esenciales/extractos y un metal noble, frente a microorganismos estándar y resistentes Se evaluó el poder bactericida y la estabilidad durante el almacenamiento de un sellador mamario - formulación antiséptica que comprende mezclas de aceites esenciales de las especies Lippia citriodora y Lippia origanoides en relación (1:1) entre 5 % y 20 % (p/p) y nanopartículas de plata a 15 ppm en un 20% (p/p); un gel polisacárido de metil etil celulosa en una concentración inferior al 1%, glicerol como plastificante y suavizador en una concentración entre el 30-50%, agua y colorantes empleados en la industria de alimentos.

El poder bactericida y estabilidad de almacenamiento fue evaluado por triplicado (3 lotes), efectivo frente a patógenos de interés con una reducción del 99.9% de los patógenos Escherichia cali ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 a los 5 minutos; y una reducción del 99.9% del patógeno Staphylococcus aureus resistente a meticilina ATCC 33591 a los 15 min.

Así mismo se evaluó la estabilidad mediante el control de sus características físico- químicas y se verificó la ausencia de hongos, levaduras y E. coli.

Ejemplo 6. EEvvaalluuaacciióónn ddee efectos ecotóxicos, respuesta inflamatoria hipersensibilidad de contacto, y residualidad

Para desarrollar un producto a base de aceites esenciales, además de su efectividad se requiere profundizar en efectos residuales y efectos secundarios en animales.

El empleo de aceites en la elaboración de productos desinfectantes con fines agroindustriales requiere de ensayos que garanticen su inocuidad y seguridad. Existen productos avalados por la Administración de Medicamentos y Alimentos de Estados Unidos (FDA), para agricultura ecológica que emplean timol y carvacrol en casos de mastitis bovina. A pesar de ser compuestos seguros, se ha observado residualidad en plasma y leche, que requiere tiempos de espera, con administración intramamaria o tópica a concentraciones de aceite esencial de orégano del 3-15% para el caso del Uddersol, producto de uso tópico, empleado para el tratamiento de la mastitis bovina. Específicamente para el caso del timol se ha evaluado el producto Phyto-Masí, encontrando presencia en sangre hasta las primeras 4 horas, y en leche hasta 12 horas posterior al tratamiento. La aplicación de este producto es intramamaria y su contenido de timol es del 10%.

Se evaluó la ecotoxicidad con el bioensayo de Artemia salina y la residualidad de una mezcla de aceites esenciales de L origanoides y L. citriodora, considerando su efecto sinérgico en cepas resistentes, con aplicación tópica durante post ordeño (2 veces/día). Se evaluó la respuesta inflamatoria mediante el conteo de células somáticas en leche, hipersensibilidad de contacto, y residualidad en muestra de leche, en concentraciones adecuadas para un uso preventivo de mastitis bovina y utilizando como control un producto convencional.

Para el bioensayo con Artemia salina se siguió el método descrito por Meyer et al. (1982), usado para la investigación de productos naturales, a fin de encontrar la concentración letal CL50 en pg/mL para los aceites esenciales de Lippia citriodora y Lippia origanoides.

La Artemia salina, es un crustáceo perteneciente a la familia de Anostraca, distribuida y adaptada en agua salada en todo el mundo. Los huevos fueron eclosionados en agua salada artificial a 26°C y oxigenación constante después de 48 h. El bioensayo consistió en la preparación de siete soluciones salinas de aceites esenciales a concentraciones de 440, 220, 110, 22, 11, 5.5 y 2.75 pg/mL disuelto en dimetil sulfóxido (DMSO), empleando como control una solución salina de DMSO a 20 pg/mL y solución salina pina.

Preparadas las soluciones se sirvieron en tubos de ensayos 3 mi de cada solución por triplicado con 10 metanauplios de Artemia salina. Posterior a 24 h fueron contados los metanauplios vivos (con movimiento) y se procedió al análisis estadístico.

Los resultados del bioensayo de Artemia salina fueron 10,05 y 19,36 (pg/mL) respectivamente.

Los estudios in vivo fueron desarrollados con el aval (CB-FMVZ-UN-15-19) del Comité de Bioética de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia. Se trabajó con razas bovinas (n=20), hembras, en un rango 2-6 años con tamaño óptimo y saludable, ubicadas en el Municipio de Chocontá - Cundinamarca con una altura de 2.650-2.900 msnm. Sin problemas visuales en la ubre y conteo máximo de células somáticas <200.000 CCS/ mL, en periodo de lactancia, con pezones funcionales y sin tratamiento de antibiótico o antiinflamatorio.

Se realizó el análisis con dos grupos de animales cada uno con n=10 individuos (40 pezones) sin diferencias significativas en el análisis de la prueba de mastitis california, pH, acidez, densidad y recuento de células somáticas, ordeño mecánico (dos veces en el día), alimentación con pastoreo rotacional de Pennisetum clandestinum, suplementario con concentrado compuesto por cereales, melaza, y complementos nutricionales (vitaminas y minerales).

En el grupo de estudio se aplicó el producto a base de aceites esenciales mediante inmersión post ordeño y en el grupo control el producto comercial a base de yodo. El protocolo para ambos grupos fue de acuerdo a las directrices del producto comercial durante un periodo de 30 días.

El sellador a base de yodo contiene una concentración al 1,0% yodo activo. El producto de ensayo se formuló a base de aceites esenciales de Lippia citriodora y Lippia origanoides con una concentración al 0.5%, glicerina al 50%, gel polisacárido menor al 1% y agua.

La hipersensibilidad de contacto fue determinada con el seguimiento al estado visual del pezón: enrojecimiento, hinchazón, apertura del orificio, grietas o fisuras, rugosidad o callosidad. El seguimiento se realizó en la aplicación post ordeño durante los 30 días.

Para el recuento de células somáticas por microscopia directa se siguió el método descrito anteriormente. Las muestras se evaluaron 1 vez por semana durante un mes.

El análisis de la presencia de los compuestos mayoritarios de aceites esenciales en leche, se desarrolló por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-MS). La muestra fue diluida e inyectada directamente al equipo cromatografico en modo Split Viny=2μL. El equipo empleado es un cromatógrafo de gases AT 7890 Series Plus acoplado a un detector de masas MSD 5975, con una columna de análisis DB-5ms. La identificación de los compuestos de los aceites esenciales se realizó de acuerdo a sus espectros de masas y la base de datos de Adams, Wiley y NIS. La muestra fue analizada al final del estudio en el día 30.

No se observaron efectos negativos, ni hipersensibilidad de contacto, y no se encontraron metabolitos residuales en leche posterior al ensayo. El conteo de células somáticas mostró efectividad en la prevención de mastitis del 75% con el producto a base de aceites esenciales frente al 62,5% del producto convencional. La formulación evaluada podría ser utilizada en la prevención de la mastitis bovina de forma segura.