TECNOFUNCIONALES, SU PROCESO DE OBTENCIÓN Y USOS

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención tiene su campo técnico en el área de la biotecnología, ya que proporciona moléculas bioconjugadas, de entre dos o más grupos funcionales siguientes: azúcares, prebióticos, oligosacáridos, polisacáridos, triglicéridos, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, antiinflamatorios; con su proceso de obtención (síntesis y purificación); y sus usos como nutracéutico prebiótico, antiinflamatorio, antitumoral, vector intestinal, ingrediente tecnofuncional para uso alimenticio (emulsíficante, sustituto de grasa) y cosmético; los cuales son posibles al tratarse de moléculas no tóxicas. Lo anterior tanto en uso humano como veterinario.

ANTECEDENTES

Los ésteres de carbohidratos con ácidos grasos (SFAE, "Sugar Fatty Acid Esters") clasificados químicamente como surfactantes no iónicos que contienen una unidad de carbohidratos como cabeza hidrófila con uno o más ácidos grasos como componente lipófilo, poseen interesantes propiedades biológicas y tecnofuncionales. Las principales propiedades de estos bioconjugados en comparación con otros surfactantes típicos derivados del petróleo son su biodegradabilidad y ausencia de toxicidad, además de poder producirse a partir de fuentes naturales renovables como son los ácidos grasos y carbohidratos (Alien and Tao, 1999). Por ello se emplean a menudo como surfactantes y emulgentes en las industrias farmacéuticas, cosméticas y de alimentación (Chang and Shaw, 2009). Los SFAE se pueden sintetizar por vía química y por vía enzimática (Plat and Linhardt, 2001).

Para el primer caso, el método tradicional de síntesis de ésteres de sacarosa se basa en una transesterificación entre un metil o etil éster de un ácido graso y el disacárido, en un disolvente polar aprótico con catálisis básica (carbonato potásico) a alta temperatura y presión. En función de la cantidad de agente acilante y el tiempo de reacción se obtienen sucroésteres con distinto grado de sustitución. La reacción produce una mezcla de regioisómeros y el rendimiento de producto es medio, por debajo del 50% (Osipow et al., 1956). Este, es el proceso que se suele emplear industrialmente. Además del bajo 5 rendimiento, tiene el problema de formar derivados coloreados como subproductos y que para poder aplicarlos en la alimentación se debe asegurar la eliminación total de los disolventes tóxicos empleados (lo cual no es sencillo debido a los altos puntos de ebullición que presentan).

Para el segundo caso, la acilación enzimática de carbohidratos (especialmente mono- y

0 disacáridos) es catalizada por hidrolasas en una técnica que aunque no es reciente presenta varios retos como elegir el solvente, enzima y soporte enzimático correctos (Plou et al., 2002). La principal ventaja de la acilación enzimática de carbohidratos respecto a la vía química es su alta regioselectividad que evita tener que recurrir a las típicas secuencias largas de protección/desprotección. Con la bioconjugación enzimática

5 se tiene también la ventaja de evitar la formación de jabones. Además, las condiciones de reacción son suaves mientras que las acilaciones químicas directas suelen emplear condiciones extremas (como temperaturas mayores a 100°C que ocasionan caramelización de los azúcares). Desde el punto de vista del "marketing" hay que añadir otra ventaja más y es que un SFAE preparado enzimáticamente se puede etiquetar como

!0 surfactante "natural" (Sarney and Vulfson, 1995).

Hasta el momento se han reportado esterificaciones enzimáticas de azúcares simples como glucosa (Ruela et al., 2013), fructooligosacáridos (FOS) de cadenas cortas (Sagis et al., 2008; ter Haar et al., 2010) e incluso almidón (Alissandratos et al., 2010). Sin embargo, a diferencia de la presente invención, los FOS utilizados en los trabajos

!5 citados anteriormente son fructanos lineales sólo con enlaces β(2→1). Hasta antes de la presente invención, no se ha encontrado ningún reporte de la esterificación enzimática utilizando fructanos ramificados como los fructanos de Agave tequilana, los cuales presentan enlaces β(2→1 ) y β(2→6) (López et al., 2003; Mellado-Mojica and López, 2012; Praznik et al., 2013). La presencia de este tipo de enlaces le daría propiedades diferentes, por ejemplo serían moléculas más hidrófitas respecto a los FOS que tienen cadenas lineales como inulina y tendrían un efecto en la salud intestinal como nivel prebiótico (Gómez et al., 2010). Otra novedad de esta invención es que tampoco se encontraron reportes donde se utilicen previamente aceites, ésteres o ácidos grasos omega-3 como acilantes de los azúcares para formar bioconjugados. Debido a lo anterior, la bioconjugación enzimática de los fructanos de A. tequilana con distintos ácidos grasos incluyendo los omega-3, representa una oportunidad de innovación; además de un reto científico, debido a la importancia de la regioselectividad hacia las diferentes posiciones de los OH's de los prebióticos, ante lo cual, la aplicación de la biocatálisis se presenta como una poderosa herramienta que aprovecha la selectividad enzimática en condiciones inocuas y amigables con el ambiente.

Para estas reacciones, la actividad y especificidad de las hidrolasas, así como las características de los productos obtenidos, están muy influenciadas por la naturaleza del disolvente orgánico. Las condiciones de reacciones óptimas suponen un compromiso entre la actividad enzimática máxima alcanzable y la solubilidad del sustrato. La dificultad del problema crece en el sentido del tamaño de la cadena de azúcares: monosacáridos<disacáridos<trisacáridos<oligosac� �ridos<polisacáridos mayores.

Se han empleado varias estrategias para superar estas limitaciones. La primera consiste en la hidrofobización del azúcar por diversos métodos como la complicación con ácidos borbónicos o la formación acétales (Sarney and Vulfson, 1995). La segunda consiste en la elección de un disolvente(s) adecuado(s) para solubilizar tanto el carbohidrato como el agente acilante y en el que la enzima presente una actividad razonable, tal como en los trabajos de bioconjugación enzimática citados anteriormente. La tercera es la elección de la enzima adecuada incluyendo el soporte enzimático. La optimización de estos últimos tres factores (solvente/enzima/soporte) constituye parte de la presente invención.

La purificación práctica de estos compuestos es un tema que se describe escasamente en la literatura. A nivel laboratorio, la cromatografía flash es útil (Baker et al., 2000), pero

5 es muy complicado implementarla a nivel industrial al igual que una cromatografía preparativa (Jaspers et al., 1987) que resulta igualmente complicada y más cara. En la mayoría de las patentes se describen métodos de purificación utilizando lavado con solventes (Schaefer, 2005), o un proceso en dos etapas: precipitación seguida de lavado con alcohol (de-la-Motte et al., 1991). Pero ninguno de estos métodos fue útil para

0 purificar nuestros bioconjugados, por lo que el proceso de purificación propuesto también es novedoso.

En cuanto a las aplicaciones de los productos de la presente invención, se derivan de las actividades biológicas y tecnofuncionales demostradas. En la literatura y patentes de bioconjugados de azúcares simples con ácidos grasos se describen principalmente

5 propiedades tecnofuncionales como emulsificantes y surfactantes alimenticio , en uso cosmético, tratamiento capilar, de pestañas, desodorante, antimicrobiano, en especial probiótico cuando se usan FOS, antitumoral y vector de medicamentos. Pero al no haberse sintetizado antes bioconjugados con fructanos ramificados como los de A, tequilana estas propiedades no habían sido investigadas en estas nuevas

0 moléculas y no era evidente que fueran a tener las mismas propiedades que los bioconjugados con azúcares simples o FOS lineales, por lo que las actividades biológicas o tecnofuncionales de las moléculas bioconjugadas y su aplicabilidad fueron comprobadas. Finalmente, la actividad antiinflamatoria no se había reportado para ningún bioconjugado de este tipo.

:5 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La presente invención se refiere a moléculas bioconjugadas, de entre dos o más grupos funcionales siguientes: prebióticos, triglicéridos, ácidos grasos, azúcares, antiinflamatorios; con su proceso de obtención (síntesis y purificación); y sus usos como nutracéutico prebiótico, antiinflamatorio, antitumoral, vector intestinal, ingrediente tecnofuncional para uso alimenticio como emulsificante, sustituto de grasa y para uso cosmético; los cuales son posibles al tratarse de moléculas no tóxicas. Los detalles característicos de estas moléculas y su proceso de obtención se muestran claramente en la siguiente descripción y figuras, las cuales se mencionan a manera de ejemplo y no deben ser consideradas como limitativas a la presente invención: Figura 1. Proceso general de producción y obtención de bioconjugados.

Figura 2. Proceso opcional de secado para eliminar trazas de solvente y agua de los bioconjugados.

Figura 3. Proceso opcional de purificación con álcali diluido para la eliminación de acilante de los bioconjugados.

Figura 4. Proceso opcional de purificación con agua caliente donde se separan los bioconjugados solubles en agua.

Figura 5. Proceso opcional de purificación con agua a temperatura ambiente donde se separan los bioconjugados solubles en agua.

Figura 6. Proceso opcional para el secado de bioconjugados con trazas de acilante.

Figura 7. Proceso opcional para el secado de los bioconjugados en solución acuosa. Figura 8. Cromatograma (HPLC) de los Bioconjugados sintetizados de acuerdo a los ejemplos 1 (A) y 2 (B).

Figura 9. Evaluación toxicológica de los Bioconjugados.

Figura 10. Efecto prebiótico de las nuevas moléculas bioconjugadas. Figura 11. Actividad antiinflamatoria de las nuevas moléculas bioconjugadas. (A) in vitro, (B) in vivo.

Figura 12. Actividad antitumoral las nuevas moléculas bioconjugadas.

Figura 13. Seguimiento de la cinética de hidrólisis de las nuevas moléculas bioconjugadas en un simulador del tracto digestivo.

Figura 14. Ejemplos de aplicación tecnofuncional en alimentos de las nuevas moléculas bioconjugadas: (A) como emulsificante, (B) como sustituto de grasa.

MEJOR MÉTODO CONOCIDO PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN

El proceso de ta presente invención se ilustra en las figuras 1 a 4 para mejor comprensión. En la figura 1 , los azúcares, oligosacáridos o polisacáridos a los que se refiere la presente invención son FOS, GOS u otros oligosacáridos ramificados con enlaces β(2→1) y β(2→6), tales como los fructanos de agave, crudos o purificados, cuando son purificados pueden utilizarse tanto grado de polimerización (DP) cortos de DP<10, o largos de DP>10. Al ser los azúcares una mezcla, no se obtiene una molécula bioconjugada aislada sino una mezcla de las mismas de acuerdo al sustrato con la parte azúcar y al acilante.

El acilante puede ser un a) ácido carboxílico (ácido graso libre) de cadena media (8-12 carbonos) o larga (>12 carbonos); o b) uno de sus ésteres (metílico, etílico, vinílico, etc.); o c) un aceite que contenga diversos ácidos carboxílicos, ya sea saturados o insaturados como los omega-3; o d) una mezcla de ésteres de aceites como las que existen comercialmente en forma de ésteres etílicos. Cuando se usan acilantes que contienen mezclas de ácidos grasos o sus ésteres se aumenta la complejidad de las moléculas bioconjugadas obtenidas.

La enzima a la que se refiere la presente invención es del grupo de las serina-hidrolasas, tales como proteasa, lipasa, esterasa, cutinasa o alguna otra que actúe sobre o sintetice un enlace éster. Para una mayor productividad la enzima puede estar inmovilizada facilitando su recuperación y reciclado. Si las moléculas bioconjugadas serán aplicados en alimentos la enzima deberá ser grado alimenticio, si serán aplicados en fármacos o cosméticos, igualmente la enzima deberá cumplir con los estándares requeridos.

En cuanto al solvente, la reacción se puede llevar a cabo en solventes orgánicos, tanto hidrófobos como hexano, heptano, ¡sooctano, decano, etc.; como en solventes hidrófiles tales como 2-metil-2-propanol, 2-metil-2-butanol, acetona, etc.; así como en medio bifásicos solvente hidrófobo/agua. O en ausencia de solvente adicionado, siendo el solvente el mismo acilante. El tamiz molecular (sílica porosa, zeolita o arcilla con tamaños de poro de 3-4 A, o algún otro adsorbente de agua), se agrega opcionalmente cuando el acilante produce agua como producto secundario en la reacción.

El proceso para la síntesis de una mezcla de moléculas bioconjugadas, denotadas también en la presente invención como "bioconjugados", comprende las siguientes etapas:

1. Reacción de síntesis. En esta etapa se conjugan (esterifican) los azúcares, oligo o polisacáridos con el acilante en una proporción de 1 :1 a 1 :10 p/p, en una reacción biocatalizada por la enzima que se agrega en una proporción de 1 :1 a 1 :10 p/p respecto al acilante; en un solvente, en una proporción de 1 :2 a 1 :100 p/v respecto al acilante; dentro de un recipiente cerrado herméticamente, calentado a una temperatura tal que el acilante se encuentre en estado líquido cuando la reacción no se realiza en presencia de solvente o a una temperatura inferior a la temperatura de ebullición del solvente (generalmente entre 40 y 80 °C), con una agitación manual, mecánica, magnética, orbital, por vibración, térmica o difusión pasiva que permita una adecuada transferencia de masa (100-1000 revoluciones por minuto, r.p.m.). Opcionalmente se agrega tamiz molecular u otro adsorbente cuando se utiliza un acilante que produce agua durante la reacción en una proporción de 1 :1 a 1 :5 p/p. La reacción se deja transcurrir durante 48 a 120 h. Al terminar a la mezcla reaccional la denominamos "mezcla cruda de reacción" (2) y comprende tanto los bioconjugados como el acilante y azúcares sin reaccionar y la enzima (y tamiz si fue agregado).

Filtrado. Como se observa en la figura 1 , en el proceso de la presente invención, a diferencia de las invenciones descritas anteriormente, se recuperan bioconjugados también de la fase sólida {10) además de en la fase líquida (6), por medio de un filtrado o centrifugado (3), utilizando filtros Whatman número 1 , 3, 4, o similares y/o por centrifugación. De esta etapa se obtienen en el líquido la "fase orgánica" (FO, 4) que contiene los bioconjugados, el solvente y el acilante sin reaccionar y en el retenido sólido la "fase sólida (FS, 7) con la enzima, el tamiz (si fue agregado); azúcares sin reaccionar y otra parte del acilante sin reaccionar. Recuperación de bioconjugados de la "fase orgánica". Se realiza simplemente mediante la evaporación del solvente (o se omite si el acilante fue el solvente). Para este fin se utiliza calentamiento por encima de la temperatura de ebullición del solvente utilizado o un rotavapor a presión reducida y temperatura acorde. El producto seco se denomina "bioconjugados de la fase orgánica" (BFO, 6) y aunque pueden contener acilante sin reaccionar, son utilizables para los fines descritos en las aplicaciones.

Recuperación de bioconjugados de la "fase sólida". Se realiza mediante un lavado con alcohol, pudiendo ser metanol, etanol, í-butanol, isopropanol u otro solvente hidrófilo, en proporciones 1 :2 a 1 :15 p/v. En la parte sólida del lavado (8) se recupera la enzima, el tamiz (si fue agregado) y azúcares sin reaccionar, mientras que en la líquida, después de evaporar el alcohol de la misma manera que lo descrito en el paso 3, quedan los "bioconjugados de la fase sólida" (BFS, 10) y aunque pueden contener acilante sin reaccionar, son utilizables para los fines descritos en las aplicaciones. Secado (opcional). En la figura 2 se observa el proceso opcional para secar completamente los bioconjugados. Tanto los BFO como los BFS se lavan con un solvente hidrófilo pudiendo ser un alcohol lineal o ramificado de cadena corta, o una cetona. En el lavado (11) se elimina el solvente de reacción residual. Posteriormente el solvente de lavado se evapora al igual que en el paso 3, pudiéndolo recuperar y reciclar (12). Los bioconjugados sin solvente (13) pueden someterse opcionalmente a un flujo de gas nitrógeno cuando el solvente de reacción tiende a retenerse en los bioconjugados para eliminarlo completamente y obtener los bioconjugados (14). Sin embargo una vez eliminado el solvente orgánico, los bioconjugados todavía pueden contener un poco de agua debido al carácter hidrófilo de la parte azúcar del bioconjugado, por lo que pueden someterse a congelación (15) a una temperatura de -5 a -80 °C y liofilizarse (16) para eliminar el agua residual y obtener los bioconjugados lavados y secos (17). Purificación (opcional). En caso de que la reacción de bioconjugacion no se haya llevado a cabo al 100% o que el acilante haya estado presente en exceso, el acilante sin reaccionar puede eliminarse por varios métodos de purificación que se describen a continuación:

a. Con álcali diluido (figura 3). Los BFS (10) o BFO (6) se disuelven en un solvente hidrófobo en una proporción de 1 :1 a 1 :10 p/v (esto no es necesario si la reacción se hizo en un solvente hidrófobo para los BFO). A la solución 18 se le agrega una solución acuosa (19) de álcali diluido a una concentración de 0.1 a 1 N en una proporción 1 :1 a 1 :5 v/v. Después de agitación manual, mecánica, magnética, orbital, por vibración, térmica o difusión pasiva (20), se deja decantar (21) para separar las 3 fases: 1 ) fase orgánica (22) que contiene bioconjugados con un tiempo de retención mayor a 3.5 min (figura 8-A) y puede evaporarse como en el paso 3 (23) para recuperar el solvente (24); 2) la interfase (25) que contiene jabón y 3) la fase acuosa (26) que contiene bioconjugados con un tiempo de retención menor a 3.5 min (figura 8-A). Los bioconjugados de la fase acuosa (26) se secan por medio de flujo de aire u horno (27) para obtener finalmente los bioconjugados (28) con un tiempo de retención menor a 3.5 min (figura 8-A).

Con agua. Ya sea caliente (figura 4) o a temperatura ambiente (figura 5).

Con este método de purificación se pueden separar además la fracción de las moléculas bioconjugadas que son solubles en agua. Con agua caliente el proceso es como sigue: Los BFO (6) o BFS (10) se calientan en un rango de 40 a 70 °C (29) y se lavan con agua a una temperatura de 40 a

70 °C (30). La mezcla se agita manual o mecánicamente (31) y se centrifuga a 1000-10000 r.p.m. (32). En la fase superior (33) quedan los bioconjugados con el acilante sin reaccionar (si fuera el caso) y en la fase inferior el bioconjugado en solución acuosa con trazas de azúcar (34).

Alternativamente el producto soluble en agua se puede obtener a partir de la fase sólida de la reacción (FS, 7) mediante lavados con agua a temperatura ambiente (35). La mezcla se agita manual o mecánicamente

(36) y se centrifuga a 1000-10000 r.p.m. (37). En la fase superior (38) se obtiene el bioconjugado en solución con trazas de azúcar sin reaccionar (si fuera el caso), mientras que en la fase inferior (39) se recupera el bioconjugado no soluble en agua, la enzima, el tamiz (si fue agregado) y el acilante sin reaccionar (si es el caso). El bioconjugado de la fase superior con acilante sin reaccionar (33) se puede secar mediante congelación (40) y liofilización (41) o por secado en horno (42), obteniendo un bioconjugado seco no soluble en agua (43) con trazas de acilante (si es el caso). Los bioconjugados que son solubles en agua (34 o 38), con o sin trazas de azúcares, pueden secarse directamente a partir de la solución acuosa (figura 7), por congelación (44), seguida de liofilización (45) o por aspersión (46) para obtener los bioconjugados solubles en agua secos (47).

Dependiendo del método de purificación empleado es el estado final del producto, quedando como gel los solubles en agua, y como un polvo los de mayor tiempo de retención.

La presente invención tiene uso humano y veterinario

EJEMPLOS DE APLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

Ejemplo 1. Moléculas bioconjugadas FOS de agave + ácido láurico.

16 g de FOS de agave

50 g de Vinil laurato

500 mi de hexano

50 g de lipasa inmovilizada (C. antárctica B)

50 g de tamiz molecular de 3 A y 1.6mm

Se deja la mezcla en agitación a 60 °C por 96 h, se filtra y se purifica de acuerdo a alguno de los métodos citados en el punto 6. El cromatograma de los bioconjugados así sintetizados se presenta en la figura 8-A.

Ejemplo 2. Moléculas bioconjugadas FOS de agave + omega-3.

16 g de FOS de agave

50 g de aceite de pescado

500 mi de hexano

50 g de lipasa inmovilizada (C. antárctica B)

50 g de tamiz molecular de 3 A y 1.6mm

Se deja la mezcla en agitación a 60 °C por 96 h, se filtra y se purifica de acuerdo a alguno de los métodos citados en el punto 6. El cromatograma de los bioconjugados así sintetizados se presenta en la figura 8-B. Ejemplo 3. Aplicabilidad de los bioconjugados en alimentos y fármacos.

A los bioconjugados sintetizados de acuerdo al ejemplo 1 y purificados de acuerdo al proceso de las figura 2 y 3, se les evaluó la toxicidad para confirmar su aplicabilidad en alimentos y fármacos. En la figura 9 se observa ausencia de toxicidad por los dos métodos evaluados: (A) evaluación de mutagenicidad con la cepa TA98 por generación de compuestos alquilantes; (B) evaluación de mutagenicidad con la cepa TA102 por generación de compuestos oxidantes. Ambos de acuerdo al método de Marrón y Ames (Marrón and Ames, 1983), que ha sido postulado como una prueba muy aceptable para detectar como no mutagénico los compuestos no carcinogénicos (Dobo et al., 2006). Los tratamientos fueron: (A): 1- Reversión espontánea, 2-DMSO (solvente), 3-TVVEN (solvente), 4-Ácido Picrolónico, 5-Control1 , 6-Control2, 7-Bioconjugados. (B): 1- Reversión espontánea

2-DMSO (solvente), 3-TWEN (solvente), 4-4-nitroquinolona, 5-Control1 , 6-Control2, 7- Bioconjugados.

Ejemplo 4. Aplicación de los bioconjugados como prebióticos.

Las moléculas bioconjugadas sintetizadas de acuerdo al ejemplo 1 (purificadas por alguno de los métodos de las figuras 2 a 7), se utilizaron como fuente de carbono para el crecimiento de microorganismos probióticos, los cuales mostraron aceptación por el consumo de los bioconjugados (figura 10). Lactobacillus casei y L. rhamnosus mostraron las tasa de crecimiento más altas, sin diferencia estadística, por lo que se concluye que los bioconjugados de oligosacáridos ramificados con ácidos grasos son sustancias con funciones prebiótícas.

Ejemplo 5. Aplicación de los bioconjugados como antiinflamatorios. Las moléculas bioconjugadas sintetizadas de acuerdo al ejemplo 1 (purificadas por alguno de los métodos de las figuras 2 a 7), pueden utilizarse como antiinflamatorios como lo muestra la figura 1 1. En la figura 1 1 -A se muestra la actividad antiinflamatoria in vitro medida como inhibición de la enzima COX-2 con una metodología de acuerdo a (Szymczak et al., 2008). Se comparan los bioconjugados con un antiinflamatorio conocido como Diclofenaco. Las concentraciones 1 , 2 y 3 para Diclofenaco fueron 50, 100 y 200 pg/ml respectivamente; para los bioconjugados fueron 400, 800 y 1600 pg/ml. (Se presentan los valores promedio de dos determinaciones. La desviación estándar media fue de 4.5%).

En la figura 11-B se presenta la actividad antiinflamatoria in vivo de los bioconjugados con una metodología por inducción de edema plantar (Xu et al., 2012). Las muestras se evaluaron a una dosis de 100 mg/kg. Los resultados muestran la inducción de edema plantar de los animales de experimentación, dos horas después de la inducción de inflamación con carragenina. Mientras menor es el edema, mayor la actividad antiinflamatoria. En esta figura los "Bioconjugados 1 " fueron purificados de acuerdo al método de la figura 2 y los "Bioconjugados 2" fueron purificados de acuerdo al método de la figura 3.

Para las concentraciones utilizadas, se observa en la figura 1 1 -A que los bioconjugados tienen entre el 60 y 70% de la actividad antiinflamatoria in vitro observada para el Diclofenaco pero sin presentar sus efectos secundarios y hepatotóxicos (Aithal, 201 ). En la figura 1 1-B se observa que en la antiinflamación in vivo, los Bioconjugados 1 tuvieron una actividad antiinflamatoria similar a la de Diclofenaco a la misma concentración y los Bioconjugados 2 algo menor. Ejemplo 6. Aplicación de los bioconjugados como antitumorales.

Los bioconjugados sintetizados de acuerdo al ejemplo 1 , purificados de acuerdo al método de la figura 3, se utilizaron como antitumorales en una línea celular de cáncer cérvico-uterino HeLa. Como se observa en la figura 12, los bioconjugados son antitumorales a partir de una concentración de 500 g/ml.

Ejemplo 7. Aplicación de los bioconjugados como vector intestinal.

5 Los bioconjugados sintetizados de acuerdo al ejemplo 1 , purificados de acuerdo a uno de los métodos del punto 6, se utilizaron como vector intestinal. En este caso la parte prebiótica no digerible de los bioconjugados vectoriza la parte acilo de las moléculas. Para ello se verifica que los bioconjugados no se hidrolizan antes de llegar al intestino en un simulador del tracto intestinal. El simulador es el descrito por González-Avila et al.,

10 (González-Avila et al., 2012). En la figura 13 se observa una cromatoplaca con muestras tomadas a lo largo del tracto digestivo en el simulador: 1 -Ácido láurico (estándar), 2- Bioconjugados (control), 3-con Bioconjugado en Estómago, 4-Alimento con Bioconjugado en Intestino Delgado, 5- Alimento con Bioconjugado en Colon Ascendente, 6- Alimento con Bioconjugado en Colon Transverso, 7- Alimento con Bioconjugado en Colon. Ya que

15 no se observó presencia de ácido láurico en Estómago e Intestino Delgado, se concluye que los bioconjugados funcionan como vector para llevar moléculas de interés hasta el Colon.

Ejemplo 8. Aplicación de los bioconjugados como emulsificante.

!0 Las moléculas bioconjugadas sintetizadas de acuerdo al ejemplo 1 (purificadas por alguno de los métodos de las figuras 2 a 7), se utilizaron como emulsificantes en la preparación de una "Mousse de fresa" (figura 14-A), de acuerdo a la siguiente fórmula (en

%)

Bioconjugados 0.5

!5 Grenetina 0.5

Fresa 47.6

Yogurt sin sabor 37.55 Crema 11.85

Azúcar 4.0

Ejemplo 9. Aplicación de los bioconjugados como sustituto de grasa.

Las moléculas bioconjugadas sintetizadas de acuerdo al ejemplo 1 (purificadas por alguno de los métodos de las figuras 2 a 7), se utilizaron como sustituto de grasa en la preparación de un "Batido de coco" (figura 14-B), de acuerdo a la siguiente fórmula (en

%):

Bioconjugados 0.43

Grenetina 0.43

Leche evaporada 31.56

Leche condensada 24.5

Esencia de vainilla-coco 0.16

Agua caliente 10.22

Ejemplo 10. Formulación cosmética utilizando los bioconjugados.

Las moléculas bioconjugadas sintetizadas de acuerdo a los ejemplo 1 o 2 (purificadas por alguno de los métodos de las figuras 2 a 7), se utilizaron en la preparación de una crema cosmética, de acuerdo a la siguiente fórmula (en %):

Bioconjugados 6.0

Silicona fluida 350 cts 10.0

Sorbo 5.0

Ácido estéarico 4.0

Aceite mineral 2.0

Lanolina 1.0

Alcohol cetílico 1.0

Trietanolamina 0.9 Antioxidante 0.1

Agua purificada es. p. 100

DOCUMENTOS CITADOS

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