ПАРАЛЛЕЛЬНОA 3;О ИММУНОЛОГИЧЕСКО ГО АНАЛИЗА СОЕДИНЕНИЙ И СПОСОБЫ ИММУНОАНАЛИЗА, В КОТОРЫХ ОН

ИСПОЛЬЗУЕТСЯ

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биохимии, медицине, молекулярной биологии, в частности, к аналитической биохимии и иммунохимическому анализу и касается множественной параллельной детекции и количественного определения различных соединений иммунохимическим методом с использованием трехмерных гидрогелевых микрочипов.

Предлагаемые биологические микрочипы для иммунологического анализа и способ проведения множественного параллельного анализа соединений могут найти применение в различных областях науки и техники для определения широкого круга низкомолекулярных и высокомолекулярных соединений, например, маркеров различных заболеваний, аллергенов, гормонов, физиологически-активных веществ в медицине, фармакологии, пищевой промышленности, охране окружающей среды, в научных исследованиях, в частности, для определения белков в протеомике.

Уровень техники

Иммунохимические методы анализа в настоящее время нашли широкое применение в аналитической биохимии. Наибольшее распространение получили твердофазные методы с использованием антител, адсорбированных или иммобилизованных в лунках иммунологических планшетов. Для детекции результатов анализа используют радиоактивно-меченные соединения (радиоиммунологический анализ (РИА)), флуоресцентно-меченные соединения, а также ферменты (например, метод ELISA). Преимуществами иммунологического анализа на планшетах является высокая чувствительность определения (пико- или нанограммы определяемого соединения в 1 мл исследуемого раствора), возможность автоматизации анализа (автоматизация стадий добавления

реагентов, промывок и одновременная регистрация сигналов из каждой из лунок планшета) (Теория и практика иммуноферментного анализа, под ред. A.M. Егорова, A.П. Осипова, Б. Б. Дзантиева, Е.М. Гавриловой, M.: Высшая школа. 1991).

К недостаткам традиционных иммунологических методов относится невозможность одновременно тестировать образец на наличие нескольких соединений. Применение микрочипов - массивов индивидуальных ячеек, содержащих различные зонды (белки, рецепторы, антитела, антигены и др.) - открывает новый этап в аналитической биохимии. Основное преимущество использования микрочипов состоит в том, что сотни или тысячи различных зондов могут быть иммобилизованы в ячейках одного микрочипа, и при этом, в отличие от традиционных методов, реализуется возможность одновременного количественного анализа многих веществ на одном микрочипе. Микрочипы позволяют проводить параллельный анализ образцов по многим параметрам, что значительно увеличивает эффективность анализа, позволяет миниатюризировать проведение исследований и значительно снижает требуемое количество исследуемого материала.

Описано несколько вариантов белковых микрочипов, которые используют для проведения иммуноанализов, например, массивы, где отдельные элементы закреплены на поверхности стекла, пластика и др., микрочипы в виде микроколодцев или микроструйных элементов (P. Апgепепdt, J. Glоklеr, D. Мurрhу, H. Lеhrасh, DJ. Саhill, Тоwаrd орtimizеd апtibоdу miсrоаrrауs: а соmрагisоп оf сurrепt miсrоаrrау suрроrt mаtеriаls, Апаl. Вiосhет., 2002, 309, 253- 260; J. Glоklеr, P. Апgепепdt, Рrоtеiп апd miсrоаrrау tесhпоlоgу, J. Сhrотаtоgr. В, 2003, 797, 229-240; S. Sеопg, С. Сhоi, Сurrепt stаtus оf рrоtеiп сhiр dеvеlорmепt iп tеrms оf fаbriсаtiоп апd аррliсаtiоп, Рrоtеотiсs, 2003, 3, 2176-2189).

В большинстве случаев белковые микрочипы являются двумерными, т.е. белки находятся на поверхности носителя; при этом белки могут быть адсорбированы или ковалентно связаны с подложкой. Для ковалентной иммобилизации поверхность носителя (стекло, мембраны и др.) подвергают химической обработке для введения амино-, альдегидо-, сульфгидрил- или эпоксигрупп. Для увеличения количества белка, связанного с поверхностью носителя, предложены различные спейсеры (P. Апgепепdt, J. Glоklеr, D. Мurрhу,

H. Lеhrасh, DJ. Саhill, Тоwаrd орtimizеd апtibоdу miсrоаrrауs: а соmраrisоп оf сurrепt miсrоаrrау suрроrt mаtеriаls, Апаl. Вiосhет., 2002, 309, 253-260; J. Glбкlеr, P. Апgепепdt, Рrоtеiп апd miсrоаrrау tесhпоlоgу, J. Сhrотаtоgr. В, 2003, 797, 229-240; S. Sеопg, С. Сhоi, Сurrепt stаtus оf рrоtеiп сhiр dеvеlорmепt iп tеrms оf fаbriсаtiоп апd аррliсаtiоп, Рrоtеотiсs, 2003, 3, 2176-2189; H. Zhu, M. Sпуdеr, Рrоtеiп сhiр tесhпоlоgу, Сиrr. Орiп. Сhет. ВiоL, 2003, 7, 55-63). К недостаткам двумерных чипов ОТНОСЯТСЯ денатурация белков на поверхности носителя и на границе раздела фаз, приводящая к потере белками функциональной активности, недостаточная концентрация активных белков в ячейках микрочипа и, вследствие этого, невысокая чувствительность анализа.

Трехмерные микрочипы на основе полиакриламидных гидрогелей, содержащие иммобилизованные молекулы ДНК и белков, впервые были разработаны в ИМБ РАН (G.М. Бrshоv, A.D. Мirzаbеkоv, Меthоd оf mашfасturiпg а mаtriх fоr thе dеtесtiоп оf misrшtсhеs, US Patent JNs 5770721). Технология изготовления этих микрочипов состояла из нескольких этапов, включающих: (1) подготовку подложки, ^' (2) формирования на ней матрицы ячеек геля, (3) нанесения на ячейки растворов биологических макромолекул в соответствии с заранее составленной схемой биочипа, (4) химической обработки ячеек с целью иммобилизации молекул-зондов, (5) отмывки и просушки полученных биочипов (G.М. Еrshоv, A.D. Мirzаbеkоv, Меthоd оf mапufасturiпg а mаtriх fоr thе dеtесtiоп оf mismаtсhеs, US Patent Ks 5770721; D. Gusсhiп, G. Yеrshоv, А. Zаslаvskу, А. Gеmmеll, V. Shiсk, D. Рrоudпikоv, P. Аrепkоv, А. Мirzаbеkоv, Мапuаl mапufасturiпg оf оligопuсlеоtidе, DNA, апd рrоtеiп miсrосhiрs, Апаl Вiосhет., 1997, 250, 203-211).

Недостатком этих микрочипов являлось то, что они изготавливались по сложной и малоэффективной технологии, при которой отсутствовала равномерность нанесения и иммобилизации зондов, и зонды (белки или ДНК) были иммобилизованы, в основном, на поверхности геля. Эти недостатки были преодолены при разработке гелевых микрочипов последующих поколений, которые получают методами сополимеризации и полимеризационной иммобилизации (A.Д. Мирзабеков, A.Ю. Рубина, CB. Паньков, Б.К. Чернов, Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гелях при формировании микрочипа, Патент N 2175972, 20 ноября 2001 (Б.И. 2001, N 25); A.Д. Мирзабеков, A.Ю. Рубина, CB. Паньков, Способ

полимергоационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления, Патент РФ N 2216547 (Б.И.П.М. N 32, 20.11.2003). IпtеmаtiопаlАррliсаtiоп РСТ/RU 01/004204, WO 03/033539).

Фирмой Вiосерt запатентованы микрочипы на основе полиуретанового гидрогеля, которые, в частности, использовали для иммобилизации антител и проведения иммуноанализа (Меthоd оf mаkiпg biосhiрs апd thе biосhiрs rеsultiпg thеrеfrоm. US раtепt 6,174,683, Jап. 16, 2001).

Для микрочипов фирмы Вiосерt показана лишь принципиальная возможность их использования в иммуноанализе, однако, конкретных примеров и результатов анализа (чувствительность, воспроизводимость и т.д.) не приводится.

Описано применение чипов различной конструкции для иммунологической детекции маркеров различных заболеваний, аллергенов, цитокинов и др., например, двумерные микрочипы, содержащие антитела, сорбированные на мембранах Нуbопd (R.P. Нuапg, R. Нuапg, Y. Fап, Y. Liп, Simultапеоus dеtесtiоп оf шultiрlе суtоkiпеs frоm сопditiопеd mеdiа апd раtiепt's sеrа Ъу ап апtibоdу-bаsеd рrоtеiп аrrау sуstеm, Апаl. Вiосhет., 2001, 294, 55-62), использовали для иммунохимического определения 24 цитокинов в сыворотках крови методом сэндвич-анализа.

После инкубации мембран с биологическими образцами микрочипы проявляли конъюгатами вторичных антител с биотином и стрептавидин- пероксидазой. Регистрировали сигнал от катализируемой пероксидазой хемилюминесценции.

В работах Нааb и др. описаны микрочипы, содержащие антитела, для идентификации и анализа опухолеассоциированных маркеров (J. С. Мillеr, H. Zhоu, J. Кwеkеl, R. Саvаllо, J. Вurkе, Е.В. Вutlеr, В.S. Теh, В.В. Нааb, Апtibоdу miсrоаrrау рrоfiliпg оf humап рrоstаtе сапсеr sеrа, Рrоtеотiсs, 2003, 3, 56-63).

Микрочипы были изготовлены на двух подложках: стекло, обработанное поли-L- лизином, и гидрогель на основе полиакриламида. Микрочипы содержали 184 различных антитела. Флуоресцентные сигналы от элементов микрочипа на основе полиакриамидного геля были в 6 раз выше, чем от элементов двумерного микрочипа, что показывает преимущество иммобилизации в объеме гелевого слоя по сравнению с иммобилизацией на двумерной поверхности даже при ее модификации.

Для определения специфических IgE при анализе аллергии предложен микрочип — стеклянный слайд, на который нанесено 94 различных наиболее распространенных аллергена (R. Нillеr, S. Lаffеr, С. Наrwапеgg, M. Нubеr, W.М. Sсhmidt, А. Тwаrdоsz, В. Ваrlеttа, W.М. Весkеr, К. Вlаsеr, H. Вrеitепеdеr, M. Сhарmап, R. Сrаmеri, M. Duсhепе, F. Fеrrеirа, H. Fiеbig, К. Нопmашi- Sоmmеrgrubеr, Т.Р. Кiпg, T. Кlеbеr-Jапkе, V.Р. Кuruр, S.В. Lеhrеr, J. Lidhоlm, U. Мullеr, С. Рiпi, G. Rееsе, О. Sсhеiпеr, А. Sсhеупius, Н.D. Shеп, S. Sрitzаuеr, R. Suсk, I. Swоbоdа, W. Тhоmаs, R. Тiпghiпо, M. Vап Наgе-Наmstеп, T. Virtапеп, D. Кrаft, M. W. Мullеr, R. Vаlепtа, Мiсrоаrrауеd аllеrgеп mоlесulеs: diаgпоstiс gаtеkеереrs fоr аllеrgу trеаtmепt, FASEB J., 2002, 15, 414-416).

Использовали очищенные аллергены-белки как рекомбинантные, так и из природных источников, а также пептиды и низкомолекулярные соединения. Для анализа требовалось 40 мкл сыворотки крови. После взаимодействия микрочипа с сывороткой крови чип обрабатывали флуоресцентно-меченными антителами против IgE человека. Наблюдали хорошую корреляцию между интенсивностью флуоресцентных сигналов на микрочипе из ячеек, содержащих соответствующие специфические IgE, и результатами измерений этих же сывороток крови стандартными методами (ЕLISА-тест, иммуноблот и др.)

Для характеристики качества препаратов крови, определения группы крови, определения совместимости донора и реципиента могут применяться микрочипы с иммобилизованными олигосахаридами. В работе О. E. Gаlапiпа, M. Месklепburg, N. E. Nifапtiеv, G. V. Раzупiпа, N. V. Воviп, GlусоСhiр: multiаrrау fоr thе studу оf саrbоhуdrаtе-biпdiпg рrоtеiпs, Lаb Сhiр, 2003, 3, 260-265, предложены микрочипы с иммобилизованными олигосахаридами, полученными на стандартной подложке для ДНК-микрочипов ХNАопGОLD™ фирмы Iпtеrасtivа Вiоtесhпоlоgiе GmbН (Gеrmапу).

На покрытое стрептавидином предметное стекло, содержащее 2 х 96 ячеек, пипеткой наносили растворы биотинилированных конъюгатов олигосахаридов с 30 кДа полиакриламидом (1 мкл на ячейку). Микрочипы использовали для исследования специфичности антител к углеводным антигенам. Полученные результаты соответствовали результатам, полученным стандартным методом ELISA на плашках.

Для детекции результатов иммуноанализа на микрочипах наиболее часто используют флуоресценцию (детекция на флуоресцентных микроскопах, сканерах, конфокальном микроскопе), хеми- и биолюминесценцию (при введении ферментных меток, таких как пероксидаза, щелочная фосфатаза, люцифераза и др.), масс-спектрометрию.

Для усиления сигнала при проведении сэндвич-иммуноанализа авторами (T. Sапо, CL. Smith, CR. Сапtоr, Immшю-РСR: vеrу sепsitivе апtigеп dеtесtiоп bу mеапs оf sресifiс апtibоdу-DNА сопjugаtеs, Sсiепсе, 1992, 258, 120-122) был предложен метод иммуно-ПЦР. Анализ проводили в 96-лyнoчнoй плашке, результат прохождения ПЦР далее оценивали по данным электрофореза. Авторами было показано, что использование ПЦР для иммуноанализа дает лучшие результаты, чем классический иммуноферментный и даже радиоиммуноанализ ((T. Sапо еt аl, suрrа; Б.R. Непdriсksоп, T. M. Тгаbу, R.D. Jоеrgеr, W.R.Marjariaп, R.C Еbеrsоlе, Нigh sепsitivitу multiапаlуtе iшmшюаssау usiпg соvаlепt DNА-lаbеlеd апtibоdiеs апd роlуmеrаsе сhаiп rеасtiоп, Nисlеiс Асids Rеs., 1995, 23, 522-529).

Еще один вариант усиления сигнала - метод кольцевой амплификации (Rоlliпg сirсlе аmрlifiсаtiоп, RCA) предложенный в 2000 году для анализа в формате 2D микрочипа (В. Sсhwеitzеr, S. Wϊltshirе, J. Lаmbеrt, S. О'Маllеу, К. Кukапskis, Z. Zhu, S. Кiпgsmоrе, P. M. Lizаrdi, D.С Wаrd, Immuпоаssауs with rоlliпg сirсlе DNA аmрlifiсаtiоп: а vеrsаtilе рlаtfоrm fоr ultrаsепsitivе апtigеп dеtесtiоп. Рrос. Nаtl. Асаd. ScI USA, 2000, 97, 10113-10119).

Иммуноанализ с использованием масс-спектральной детекции описан для чипов фирмы Сiрhеrgеп Вiоsуstеms (США). Фирмой сконструированы чипы и прибор для анализа белков непосредственно с чипов методом SELDI масс- спектрометрии (T. W. Нutсhепs, T. -T. Yiр, Sшfасе-епhапсеd пеаt dеsоrрtiоп fоr disоrрtiоп апd dеtесtiоп оf апаlуtеs. USA раtепt N 5,894,063).

Чипы представляют собой алюминиевые полоски размером приблизительно 8 x 1 см, содержащие 8 отдельных одинаковых элементов для нанесения образцов - аффинных носителей для специфического связывания белков. При изготовлении микрочипа для иммуноанализа мембранного специфического антигена простаты (ПСМА) антитела были иммобилизованы на предварительно активированной поверхности алюминиевой полоски. После

инкубации с сывороткой крови и образования комплекса антитело-ПСМА связанный ПСМА определяли с помощью SELDI масс-спектрометрии (Z. Хiао, BX. Аdаm, L.Н. Саzаrеs, М.А. Сlеmепts, J.W. Dаvis, P. F. Sсhеllhаmmеr, Е.А. Dаlmаssо, G.L. Wright, Quапtitаtiоп оf sегаm рrоstаtе-sресifiс membrane antigen bу а поvеl рrоtеiп Ъiосhiр immuпоаssау disсrimiпаtеs benign malignant рrоstаtе disеаsе, Сапсеr Rеs., 2001, 61, 6029-6033).

Предлагаемые фирмой Сiрhеrgеп Вiоsуstеms чипы (полоски) являются двумерными, специфическая сорбция белков происходит на поверхности носителя. Каждая алюминиевая полоска позволяет анализировать лишь 8 образцов, и данные элементы, строго говоря, не являются микрочипами.

Продолжительность иммунохимического анализа определяется скоростью образования комплексов антиген-антитело, а в случае микрочипов лимитирующим фактором может являться диффузия антигена (антитела) к антителам (антигенам), иммобилизованным в ячейках микрочипа. Одним из способов ускорения анализа является введение перемешивания образца. Ускорение реакции наблюдали, например, при перемешивании образца на двумерных ДНК-микрочипах (А. Тоеgl, R. Кirсhпеr, С. Gаuеr, А. Wiхfоrсе, Enhancing rеsults оf miсrоаrгау hуdridizаtiопs thгоugh miсrоаgitаtiоп, J. Вiотоl. Тесhпiqиеs, 2003, 4, 197-204).

Микрочип (предметное стекло) для проведения реакции с перемешиванием прикрепляли к специально сконструированной камере (АdvаСаrd). Перемешивание осуществляли с помощью акустических волн. Используемый объем образца - 10 мкл и менее. Отмечено, что в результате перемешивания уменьшалось время реакции, увеличивалось соотношение сигнал-фон и улучшалась воспроизводимость результатов.

Недостатки

В известных способах проведения иммуноанализа на микрочипах в основном используются двумерные микрочипы, в которых антитела или антигены закреплены на поверхности носителя (стекла, пластика, мембраны и др.). Недостатками двумерных микрочипов являются низкая и неконтролируемая эффективность иммобилизации, наличие контакта иммобилизованных соединений с гидрофобной поверхностью носителя, что приводит к потере

биологической активности зондов, особенно зондов белковой природы, и, соответственно, к уменьшению чувствительности иммуноанализа. Для большинства иммунологических микрочипов при увеличении числа иммобилизованных антител резко падает чувствительность анализа и воспроизводимость результатов (коэффициент вариации ~50%) (В. Sсhwеitzеr, S. F. Кiпgsmоrе, Меаsuriпg рrоtеiпs on miсrоаrrауs. Сиrr. Орiп. Вiоtесhпоl, 2002, 13, 14-19).

К недостаткам микрочипов другой конструкции (микроколодды, электронные микрочипы, микроструйные элементы и др.) относится сложная технология изготовления и регистрации сигналов с использованием сложной и дорогостоящей аппаратуры (конфокального микроскопа, Рамановской спектроскопии и др.) Для регистрации сигналов методом масс-спектрометрии предложены только чипы фирмы Сiрhеrgеп Вiоsуstеms (США) для анализа методом SELDI MS, состоящие из 8 элементов, с большим размером ячеек.

Недостатки микрочипов, известных из уровня техники, и способов иммунологического анализа, в которых они используются, преодолены настоящим изобретением, обеспечивающим способы иммунологического анализа соединений с использованием трехмерных микрочипов на основе гидрогелей.

Раскрытие изобретения

Первым аспектом изобретения является биологический микрочип для множественного параллельного иммунологического анализа соединений, представляющий собой массив трехмерных гидрогелевых элементов заданного объема, сформированных на подложке методом фото- или химически индуцируемой полимеризации и содержащих одинаковые или различные по своей природе биологические молекулы (лиганды). Биологический микрочип может одновременно содержать ячейки с иммобилизованными белками, ферментами, антителами, полисахаридами, ДНК, РНК и низкомолекулярными соединениями, причем в каждой отдельной ячейке иммобилизовано индивидуальное соединение. Биологический микрочип допускает последовательное проведение реакций различного типа, например, последовательное взаимодействие антигена с антителом (иммунологическая реакция) и фермента с субстратами (ферментативная реакция) при использовании конъюгатов антител или антигенов

с ферментами. В другом воплощении предусмотрено последовательное взаимодействие антигена с антителом (иммунологическая реакция), полимеразная цепная реакция (ПЦР) на микрочипе при использовании конъюгатов антител или антигенов с олигонуклеотидами и гибридизация с образованием специфического комплекса между олигонуклеотидами, полученными в результате TTTTP, с комплементарными им олигонуклеотидами, иммобилизованными в других ячейках того же микрочипа.

Трехмерные гидрогелевые элементы микрочипа ковалентно закреплены на поверхности подложки (стекло, кремний или пластик) и отделены друг от друга гидрофобной поверхностью подложки. В каждом гелевом элементе содержится иммобилизованный лиганд белковой или небелковой природы, который при инкубации микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу соединения, образует специфический иммунный комплекс типа «aнтигeн-aнтитeлo». На этой стадии происходит разделение анализируемых соединений из смеси по их способности к специфическому связыванию с иммобилизованными лигандами, что позволяет проводить одновременный, параллельный анализ нескольких объектов на одном микрочипе.

Трехмерные гелевые элементы обладают значительно большей емкостью по сравнению с элементами двумерных микрочипов, что увеличивает чувствительность анализа. Гидрофильное окружение иммобилизованных в структуре гидрогеля лигандов стабилизирует их структуру, что позволяет им полностью сохранять свою биологическую активность.

Лиганды, иммобилизованные в гидрогелевых ячейках биологического микрочипа, выбирают из группы, включающей антитела любого типа и антигены различной природы.

В качестве исследуемых объектов для количественного иммунологического анализа согласно изобретению предпочтительно предлагаются:

• опухолеассоциированные антигены, являющиеся маркерами ряда онкологических заболеваний;

• общий иммуноглобулин E человека;

• специфические антитела (иммуноглобулины E) к различным аллергенам;

• антитела к различным полисахаридам;

• различные полисахариды.

Для иммуноанализа опухолеассоциированных антигенов - маркеров онкологических заболеваний в качестве иммобилизованных лигандов используют антитела к указанным опухолеассоциированным антигенам и/или сами опухолеассоциированные антигены. Для иммунологического определения общего иммуноглобулина E человека, например, при определении иммунного статуса организма, в качестве иммобилизованных лигандов биологического микрочипа используют антитела против иммуноглобулинов E человека и/или иммуноглобулины E человека. Для иммуноанализа специфических антител к различным аллергенам иммобилизованными лигандами биологического микрочипа являются аллергены. Для иммуноанализа специфических антител к полисахаридам и полисахаридов с использованием биологического микрочипа в качестве иммобилизованных лигандов используют различные полисахариды и антитела против полисахаридов.

Вторым аспектом изобретения является способ детекции соединений на биологическом микрочипе по первому аспекту, включающий их идентификацию методом масс-спектрометрии, характеризующийся тем, что идентификацию проводят непосредственно на гидрогелевом элементе микрочипа по результатам прямого масс-спектрального анализа связавшегося с лигандом соединения. Разработана методика получения MALDI TOF масс-спектров непосредственно с гелевых ячеек микрочипа. В ходе взаимодействия микрочипа с реакционной средой, содержащей исследуемые соединения, происходит образование комплекса между иммобилизованным на биологическом микрочипе лигандом и исследуемым соединением. После элюирования в условиях, разрушающих комплекс, проводят прямой масс-спектральный анализ с каждого гелевого элемента и идентифицируют соединение по его молекулярной массе и способности связываться с определенным лигандом.

Следующим аспектом изобретения является способ детекции соединений белковой природы на биологическом микрочипе по первому аспекту изобретения, включающий их идентификацию методом масс-спектрометрии, характеризующийся тем, что идентификацию проводят непосредственно на гидрогелевом элементе микрочипа по результатам прямого масс-спектрального

И анализа связавшегося с лигандом белка и/или пептидов, полученных путем проведения непосредственно на гидрогелевом элементе микрочипа протеолитического гидролиза связавшегося с лигандом белка.

Следующим аспектом изобретения является способ множественного параллельного иммуноанализа соединений на биологическом микрочипе, включающий проведение нескольких стадий: а) инкубацию биологического микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу соединения, для образования иммунных комплексов с иммобилизованными на микрочипе лигандами, которую при необходимости проводят в условиях перемешивания; б) детекцию образовавшегося комплекса; в) при необходимости, количественное определение анализируемого соединения.

На первой стадии анализа проводят инкубацию биологического микрочипа в реакционной среде для образования комплексов типа "антиген-антитело". При необходимости эту стадию проводят в условиях перемешивания, что значительно ускоряет проведение иммуноанализа.

Способ множественного параллельного иммуноанализа соединений на биологическом микрочипе может осуществляться в любом формате (прямой, непрямой, конкурентный, сэндвич-иммуноанализ и др.).

В случае прямого иммуноанализа реакционная среда на стадии а) содержит анализируемое соединение, которое образует специфический комплекс с иммобилизованными на чипе антителами против этого соединения. Чем выше концентрация анализируемого соединения в образце, тем выше сигнал, регистрируемый с соответствующих гелевых ячеек микрочипа.

Конкурентный анализ проводят на микрочипах с иммобилизованными антителами либо на микрочипах с иммобилизованными антигенами, например, соединениями, подлежащие анализу. В одном из воплощений в реакционную среду на стадии а) дополнительно добавляют анализируемое соединение в определенной концентрации, содержащее метку. Происходит конкуренция между меченым и немеченым соединением за связывание с иммобилизованными на биологическом микрочипе антителами. В другом воплощении конкурентного

анализа реакционная среда на стадии а) дополнительно содержит меченые антитела против анализируемого соединения, и происходит конкуренция меченых антител за связывание с анализируемым соединением в растворе и соединением, иммобилизованным на микрочипе. В случае конкурентного анализа чем выше сигнал, регистрируемый с соответствующих гелевых ячеек микрочипа, тем меньше концентрация анализируемого соединения в образце.

Способы прямого и конкурентного анализа возможны как для соединений белковой природы, так и для низкомолекулярных соединений. Сэндвич-вариант иммуноанализа возможен для соединений белковой природы, для которых доступны антитела, специфичные к разным эпитопам белковой молекулы.

В случае сэндвич-иммуноанализа биологический микрочип содержит иммобилизованные антитела против анализируемого соединения, реакционная среда на стадии а) содержит анализируемое соединение, и происходит образование специфического комплекса антиген - иммобилизованное антитело. После образования комплекса микрочип проявляют мечеными антителами, специфичными к другому эпитопу анализируемого соединения. Для сэндвич- иммуноанализа возможен также вариант, когда реакционная среда на стадии а) дополнительно содержит проявляющие антитела, что сокращает время проведения анализа, так как инкубация микрочипа с анализируемым соединением и проявление происходят одновременно. Чем выше концентрация анализируемого соединения в образце, тем выше сигнал, регистрируемый с соответствующих гелевых ячеек микрочипа.

Регистрация результатов иммуноанализа проводится с использованием флуоресценции, хемилюминесценпии, масс-спектрометрии непосредственно с гелевых элементов микрочипа. Для количественного определения анализируемых соединений на стадии в) проводят стадии a)-б) со стандартными (эталонными) образцами, содержащими известные концентрации анализируемого соединения и строят калибровочную зависимость сигнал — концентрация анализируемого соединения, по которой определяют содержание анализируемого соединения в образце.

Калибровочную зависимость можно также получить с использованием лигандов, иммобилизованных на микрочипе. Например, микрочип содержит гелевые элементы с иммобилизованными антителами против анализируемого

антигена и гелевые элементы с иммобилизованным антигеном в разных концентрациях. После проведения стандартного сэндвич-иммуноанализа, то есть после инкубации микрочипа с образцом и мечеными проявляющими антителами, сигналы, получаемые от гелевых элементов с известными концентрациями иммобилизованного антигена, служат для построения калибровочной кривой, по которой определяют неизвестную концентрацию антигена в образце. Таким образом, микрочип одновременно содержит калибровочную кривую и служит для определения неизвестной концентрации антигена в образце.

Детекцию результатов иммуноанализа осуществляют флуориметрически, хемилюминометрически, масс-спектрометрически или путем проведения иммуно- ПЦР с последующей регистрацией результатов ПЦР на том же микрочипе. Антитела и другие соединения, используемые для детекции, могут содержать флуоресцентные метки или являться конъюгатами с белками или другими соединениями, способными участвовать в реакциях, приводящих к излучению света (хеми- или биолюминесценции). Для масс-спектральной детекции не требуется введения дополнительных меток.

В случае детекции путем проведения иммуно-ПЦР биологический микрочип содержит одновременно в разных гелевых ячейках иммобилизованные лиганды для проведения иммуноанализа (антитела или антигены) и олигонуклеотиды. В ходе взаимодействия микрочипа с реакционной средой, содержащей исследуемые соединения, происходит образование комплекса между иммобилизованным на биологическом микрочипе лигандом и исследуемым соединением. В качестве метки для детекции образовавшегося комплекса используют олигонуклеотид, комплементарный олигонуклеотиду, иммобилизованному в гелевых ячейках. Далее проводят ПЦР непосредственно на биологическом микрочипе с флуоресцентно-меченным праймером, и наработанный флуоресцентно-меченный ПЦР-продукт образует специфический комплекс с комплементарными олигонуклеотидами, иммобилизованными в других ячейках микрочипа. При использовании данного метода происходит значительное возрастание сигнала по сравнению с обычной флуоресцентной детекцией, так как в ходе TTTTP нарабатывается флуоресцентно-меченный олигонуклеотид в количестве, которое на несколько порядков больше исходного, что значительно увеличивает чувствительность детекции.

Способ настоящего изобретения позволяет проводить множественный параллельный иммунологический анализ нескольких соединений. Биологический микрочип для параллельного множественного анализа одновременно содержит ячейки с иммобилизованными антителами против всех анализируемых соединений и/или другие иммобилизованные соединения, причем в каждой отдельной гелевой ячейке иммобилизовано индивидуальное соединение. После инкубации микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий несколько подлежащих анализу соединений, образуются специфические иммунные комплексы антиген - антитело, и проводится одновременная детекция образовавшихся комплексов в соответствующих ячейках микрочипа. В случае сэндвич-иммуноанализа после инкубации в реакционной среде, включающей образец, осуществляют проявление смесью меченых антител против всех анализируемых соединений. Возможен также вариант, когда реакционная среда на стадии а) одновременно содержит анализируемые соединения и меченые проявляющие антитела.

Чувствительность предлагаемого множественного параллельного иммуноанализа соединений на биологическом микрочипе не уступает чувствительности стандартного варианта иммуноанализа на плашках (стрипах), например, предел обнаружения простата-специфического антигена (маркер рака простаты) сэндвич-иммуноанализом с использованием гелевых микрочипов составил 0,05 нг/мл (Таблица 1).

Следующим аспектом настоящего изобретения является способ множественного параллельного иммуноанализа онкомаркеров на биологическом микрочипе по первому аспекту изобретения, содержащем иммобилизованные антитела против онкомаркеров и/или иммобилизованные онкомаркеры, предусматривающий: а) инкубацию биологического микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлелсащие анализу онкомаркеры, для образования иммунного комплекса с иммобилизованными на микрочипе лигандами, которую при необходимости проводят в условиях перемешивания; б) детекцию образовавшегося комплекса; в) количественное определение анализируемого онкомаркера.

Различные воплощения способа могут представлять собой иммуноанализ любого типа (прямой, непрямой, конкурентный, сэндвич-анализ и др.). Для количественного определения онкомаркера на стадии в) проводят стадии а) - б) с известными концентрациями анализируемого онкомаркера и строят калибровочную зависимость, по которой определяют содержание анализируемого онкомаркера в образце. Детекцию образовавшегося комплекса на стадии б) осуществляют флуориметрически, хемилюминометрически, масс- спектр ометрически или путем проведения иммуно-ПЦР с последующей регистрацией результатов TTTTP на том же микрочипе.

Возможен также вариант, когда микрочип одновременно с иммобилизованными антителами против онкомаркеров содержит гелевые элементы с иммобилизованными онкомаркерами в разных концентрациях для построения калибровочной зависимости. После инкубации микрочипа с образцом, содержащим онкомаркер в неизвестной концентрации, и мечеными антителами против анализируемого онкомаркера (сэндвич-иммуноанализ) от гелевых элементов с известной концентрацией иммобилизованного онкомаркера получают зависимость сигнала от концентрации онкомаркера - калибровочную кривую, которую используют для определения неизвестной концентрации онкомаркера в образце.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ иммуноанализа общего иммуноглобулина E человека на биологическом микрочипе, являющемся первым аспектом настоящего изобретения, содержащем иммобилизованные антитела против иммуноглобулинов E человека (анти-IgЕ) или иммобилизованные иммуноглобулины E человека (IgE), предусматривающий: а) инкубацию биологического микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу общие иммуноглобулины человека, для образования иммунного комплекса с иммобилизованными на микрочипе лигандами, которую при необходимости проводят в условиях перемешивания; б) детекцию образовавшегося комплекса; в) при необходимости, количественное определение анализируемого общего иммуноглобулина E человека.

Различные воплощения способа могут представлять собой иммуноанализ любого типа (прямой, непрямой, конкурентный, сэндвич-анализ и др.). Для количественного определения общего иммуноглобулина E человека на стадии в) проводят стадии а) - б) с известными концентрациями анализируемого общего иммуноглобулина E и строят калибровочную зависимость, по которой определяют содержание анализируемого общего иммуноглобулина E в образце. Детекцию образовавшегося комплекса на стадии б) осуществляют флуориметрически, хемилюминометрически, масс-спектрометрически или путем проведения иммуно-ПЦР с последующей регистрацией результатов ПЦР на том же микрочипе.

Калибровочную зависимость для определения общего иммуноглобулина E можно также получить непосредственно на микрочипе, если использовать микрочип, содержащий гелевые элементы с иммобилизованным IgE в разных концентрациях. После инкубации микрочипа с образцом, содержащим IgE в неизвестной концентрации, и вторыми мечеными антителами против IgE (сэндвич-иммуноанализ) от гелевых элементов с иммобилизованным IgE получают зависимость сигнала от концентрации IgE, которую используют как калибровочную кривую для определения неизвестной концентрации IgE.

Следующим аспектом настоящего изобретения является способ множественного параллельного иммуноанализа аллергенспецифических иммуноглобулинов E на биологическом микрочипе по первому аспекту настоящего изобретения, содержащем иммобилизованные специфические аллергены, предусматривающий: а) инкубацию биологического микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу аллергенспецифические IgE, для образования комплекса иммобилизованный аллерген - аллергенспецифическое антитело, которую при необходимости проводят в условиях перемешивания; б) детекцию образовавшегося комплекса; в) при необходимости, количественное определение анализируемого аллергенспецифического IgE.

В различных воплощениях способ может представлять собой иммуноанализ любого типа (прямой, непрямой, конкурентный, сэндвич-анализ и

др.). Для количественного определения аллергенспецифического IgE на стадии в) проводят стадии а) - б) с известными концентрациями аллергенспецифических IgE и строят калибровочную зависимость, по которой определяют содержание анализируемого аллергенспецифического IgE в образце. Детекцию образовавшегося комплекса иммобилизованный аллерген — аллергенспецифическое антитело на стадии б) осуществляют флуориметрически, хемилюминометрически, масс-спектрометрически или путем проведения иммуно- TTTTP с последующей регистрацией результатов ПНР на том же микрочипе.

Для количественного анализа аллергенспецифического IgE используют также микрочип, который одновременно с иммобилизованными аллергенами содержит гелевые элементы с иммобилизованными аллергенспецифическими IgE в разных концентрациях для построения калибровочной зависимости. После инкубации микрочипа с образцом, содержащим аллергенспецифический IgE в неизвестной концентрации, и мечеными проявляющими антителами (сэндвич- иммуноанализ), от гелевых элементов с иммобилизованными аллергенспецифическими IgE в известных концентрациях получают зависимость сигнала от концентрации анализируемого антигена, которую используют для определения неизвестной концентрации антигена в образце.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ множественного параллельного иммуноанализа антител против полисахаридов на биологическом микрочипе по первому аспекту настоящего изобретения, содержащем иммобилизованные полисахариды или антитела против полисахаридов, предусматривающий: а) инкубацию биологического микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу антитела против полисахаридов для образования комплекса полисахарид — антитело, которую при необходимости проводят в условиях перемешивания; б) детекцию образовавшегося комплекса; в) при необходимости, количественное определение антител против полисахаридов.

В одном из воплощений способа иммобилизованные полисахариды представляют собой трисахариды А и В — агглютиногены эритроцитов крови,

определяющие группу крови человека. Для количественного определения анализируемого антитела против полисахарида на стадии в) проводят стадии а) - б) с известными концентрациями анализируемого антитела против полисахарида и строят калибровочную зависимость, по которой определяют содержание анализируемого антитела против полисахарида в образце. В различных воплощениях способ может представлять собой иммуноанализ любого типа (прямой, непрямой, конкурентный, сэндвич-анализ и др.). Детекцию образовавшегося комплекса полисахарид — антитело на стадии б) осуществляют флуориметрически, хемилюминометрически, масс-спектрометрически или путем проведения иммуно-ПЦР с последующей регистрацией результатов TTTTT ³ на том же микрочипе.

Калибровочную зависимость для определения антител против полисахаридов можно получить непосредственно на микрочипе, если использовать микрочип, содержащий гелевые ячейки с иммобилизованными антителами против данных полисахаридов в разных концентрациях. Микрочип инкубируют с образцом, содержащим антитела против полисахаридов в неизвестной концентрации, и мечеными проявляющими антителами (сэндвич- иммуноанализ), и от гелевых элементов, содержащих иммобилизованными антитела против данных полисахаридов в известных концентрациях получают зависимость сигнала от концентрации, которую используют как калибровочную кривую для определения неизвестной концентрации антигена.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ множественного параллельного иммуноанализа полисахаридов на биологическом микрочипе по первому аспекту настоящего изобретения, содержащем иммобилизованные полисахариды или антитела против полисахаридов, предусматривающий: а) инкубацию биологического микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу полисахариды, для образования комплекса полисахарид — антитело, которую при необходимости проводят в условиях перемешивания; б) детекцию образовавшегося комплекса; в) при необходимости, количественное определение полисахаридов.

Для количественного определения анализируемого полисахарида на стадии в) проводят стадии а) - б) с известными концентрациями анализируемого полисахарида и строят калибровочную зависимость, по которой определяют содержание анализируемого полисахарида в образце. В различных воплощениях способ может представлять собой иммуноанализ любого типа (прямой, непрямой, конкурентный, сэндвич-анализ и др.). Детекцию образовавшегося комплекса полисахарид - антитело на стадии б) осуществляют флуориметрически, хемилюминометрически, масс-спектрометрически или путем проведения иммуно- ПЦР с последующей регистрацией результатов ПЦР на том же микрочипе.

Калибровочную зависимость для определения полисахаридов можно получить непосредственно на микрочипе, если использовать микрочип, содержащий гелевые ячейки с иммобилизованными полисахаридами в разных концентрациях. Микрочип инкубируют с образцом, содержащим анализируемые полисахариды в неизвестной концентрации, и мечеными проявляющими антителами (сэндвич-иммуноанализ), и от гелевых элементов, содержащих иммобилизованные полисахариды в известных концентрациях получают зависимость сигнала от концентрации, которую используют как калибровочную кривую для определения неизвестной концентрации полисахаридов.

Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на фигуры и примеры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.

Краткое описание фигур

Фигура 1 демонстрирует результаты иммуноанализа АФП на микрочипах. А. Прямой иммуноанализ. Микрочипы содержали гелевые элементы с иммобилизованными антителами против АФП, 0,1 мг/мл. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации АФП, меченного СуЗ, в растворе. Врезка показывает флуоресцентные сигналы при низких концентрациях АФП. Б. Конкурентный анализ. Микрочипы содержали гелевые элементы с иммобилизованным АФП, 0,05 мг/мл. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации АФП в растворе после инкубации микрочипа с раствором Cy-3 -меченных антител против АФП, 0,3 мкг/мл.

В. Сэндвич-анализ. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации

АФП в растворе. Микрочипы содержали гелевые элементы с иммобилизованными антителами против АФП, 0,1 мг/мл; микрочипы после инкубации с растворами АФП проявляли антителами к другому эпитопу АФП, меченными СуЗ, 20 мкг/мл.

Каждая точка на графиках является средним из четырех параллельных измерений.

Фигура 2 иллюстрирует хемилюминесцентную детекцию результатов иммуноанализа. Микрочипы содержали гелевые ячейки с иммобилизованными моноклональными антителами к пероксидазе хрена в концентрации 10-100 мкг /мл.

А. Хемилюминесцентные сигналы после обработки микрочипа раствором пероксидазы (10 нг/мл) и смесью субстратов, содержащей люминол, перекись водорода и усилитель.

Б. Зависимость интенсивность хемилюминесценции от концентрации пероксидазы в растворе, нанесенном на микрочип, в ячейках микрочипа с иммобилизованными антителами в концентрации 100 мкг/мл.

Фигура 3 представляет результаты одновременного сэндвич- иммуноанализа нескольких опухолеассопиированых маркеров на одном микрочипе. Флуоресцентное изображение микрочипов, содержащих иммобилизованные антитела к различным онкомаркерам, после нанесения образца и проявления антителами, меченными СуЗ. На чипе иммобилизованы моноклональные антитела против ПСА (свободная форма), CA 125, CA 19-9, CA 15-3, ПСА (общий), РЭА и АФП (сверху вниз по 3 гелевых элемента). Микрочипы обрабатывали сыворотками крови, содержащими (слева направо) ПСА, CA 125, CA 19-9, CA 15-3, РЭА и АФП, и проявляли смесью СуЗ -меченных антител против всех б анализируемых онкомаркеров.

Фигура 4 иллюстрирует сэндвич-иммуноанализ простата-специфического антигена (ПСА) с использованием микрочипа, содержащего гелевые элементы с иммобилизованным антигеном для построения калибровочного графика. А. Изображение микрочипа, полученное после инкубации микрочипа с раствором ПСА, 10 нг/мл, и проявления Cy-3 -меченными антителами. Структура микрочипа: иммобилизованные антитела против ПСА, 0,1 мг/мл (ряд 1); пустые гели (ряды 2

и 3); иммобилизованный ПСА для построения калибровочного графика в концентрациях, соответствующих рабочему диапазону калибровочной кривой (ряды 4-8).

Б. Диаграмма интенсивности флуоресцентных сигналов гелевых элементов микрочипа, показанного на рис. 4A.

Фигура 5 показывает результаты количественного анализа общего иммуноглобулина E в сыворотке крови больных. Зависимость интенсивности флуоресцентного сигнала от концентрации общего IgE в сыворотке крови в логарифмических координатах.

Фигура 6 демонстрирует результаты иммуноанализа специфического иммуноглобулина E (аллерген тимофеевки) в сыворотке крови больных. Микрочип содержал гелевые элементы с иммобилизованным аллергеном (тимофеевка), 0,5 мг/мл. Флуоресцентное изображение микрочипов после обработки сывороткой крови и проявления раствором антител против IgE человека, меченных СуЗ. Высокое содержание специфических IgE в сыворотке крови (чип 1), среднее содержание специфических IgE (чип 2), специфические IgE отсутствуют (чип 3).

Фигура 7 показывает результаты иммуноанализа сывороток крови, содержащих антитела против трисахаридов А (III группа крови, кривая 2) и трисахаридов В (II группа крови, кривая 1) с использованием микрочипов с иммобилизованными трисахаридами А и В.

Фигура 8 демонстрирует ускорение иммуноанализа при использовании перемешивания образца. Калибровочные графики для определения простата- специфического антигена (ПСА) методом сэндвич-иммуноанализа при инкубации микрочипов с реакционной средой, содержащей ПСА, в течение 2 час при перемешивании (1) и без перемешивания (2). Микрочипы содержали гелевые элементы с иммобилизованными антителами против ПСА, O ₃ 1 мг/мл. Микрочипы инкубировали в реакционной среде, содержащей одновременно ПСА и моноклональные антитела против другого эпитопа ПСА, меченные СуЗ, 20 мкг/мл.

Фигура 9 показывает проведение иммуноанализа с использованием метода иммуно-ПЦР. Структура микрочипа (А); флуоресцентное изображение микрочипа после иммуно-ПЦР с раствором, содержащим 1 нг/мл конъюгата антитело-

олигонуклеотид (Б); результаты обычной гибридизации микрочипа с комплементарным матрице олигонуклеотидом при той же концентрации конъюгата (В).

Фигура 10 демонстрирует MALDI-TOF масс-спектры инсулина, меченного красителем Воdiру (А), и биотинилированного лизоцима (Б), полученные с гелевых ячеек микрочипа с иммобилизованными моноклональными антителами против инсулина и лизоцима соответственно, 0,1 мг/мл, после инкубации микрочипа с растворами инсулина-Воdiру и биотинилированного лизоцима с концентрацией 100 мкг/мл.

Фигура 11 показывает MALDI-TOF масс-спектр пептидов в области m/z 500-3500, образовавшихся после триптического гидролиза иммобилизованного лизоцима, полученный непосредственно с гелевой ячейки микрочипа. Цифры показывают номер пептида в аминокислотной последовательности лизоцима; X - пики, полученные при гидролизе трипсина, и неидентифицированные пики.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает биологический микрочип для множественного параллельного иммунологического анализа - массив гидрогелевых элементов заданного объема, определяемого назначением микрочипа и соответствующим используемым оборудованием (например, размером рабочего органа (пина) робота), полученный методом фото- или химически индуцируемой радикальной полимеризации. Биологический микрочип способен одновременно содержать различные по своей природе биологические молекулы (лиганды), причем в каждой ячейке микрочипа иммобилизовано индивидуальное соединение (лиганд). Биологические микрочипы для иммунологического анализа соединений изготавливаются методом полимеризационной иммобилизации по запатентованной технологии (А. Д. Мирзабеков, А. Ю. Рубина, С. В. Паньков, Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления, Патент РФ N 2216547 (Б.И.П.М. N 32, 20.11.2003). International Аррliсаtiоп РСТ/RU 01/004204, WO 03/033539), которая позволяет получать микрочипы, содержащие иммобилизованные ДНК, белки и другие соединения. Связывание лиганда с гидрогелевой матрицей возможно как напрямую при его

иммобилизации в процессе формирования геля, так и опосредованно. В качестве примеров опосредованного связывания лиганда с гидрогелевой матрицей может служить иммобилизация через образование специфических комплексов типа авидин (стрептавидин) - биотин, например, образование связи между иммобилизованным на гидрогелевой матрице авидином и биотинилированным антителом, или иммобилизация через образование специфических комплексов типа металл - хелатор, например, образование связи между иммобилизованной на гидрогелевой матрице нитрилотриуксусной кислотой со связанным с ней координационными связями атомом никеля и рекомбинантным белком, содержащим полигистидиновый фрагмент, и др.

В качестве лигандов, иммобилизованных в гелевых ячейках, могут выступать соединения белковой и небелковой природы, такие как иммуноглобулины любого типа (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE), моноклональные антитела, поликлональные антитела, рекомбинантные антитела, различные типы мини антител, в том числе Fаb-фрагменты и одноцепочечные антитела (sсFv и другие), аптамеры, антигены различной природы (белки, гликопротеины, полисахариды и др.), низкомолекулярные вещества. Тип используемых в анализе лигандов определяется рядом факторов, например, аффинностью антител по отношению к данному антигену, стабильностью, возможностью иммобилизации антител и введения в них метки (флуоресцентной метки, ферментной метки путем получения конъюгатов и др.), а также способом проведения анализа (прямой, конкурентный, сэндвич-анализ и др.).

Биологический микрочип допускает последовательное проведение реакций различного типа. Например, первой реакцией может быть взаимодействие антигена с антителом с образованием двойного комплекса антиген-антитело или тройного комплекса антитело-антиген-антитело для антигенов белковой природы (иммунологическая реакция). Затем, если антитело или антиген содержит ферментную метку, проводится ферментативная реакция, например, окисление люминола перекисью водорода в присутствии усилителей, катализируемое пероксидазой хрена, в результате которой происходит излучение света (хемилюминесценция). В случае, если антитело или антиген является конъюгатом с олигонуклеотидом, после проведения иммунологической реакции молено проводить полимеразную цепную реакцию (TTT IP) непосредственно на микрочипе.

Следующей реакцией является образование специфического комплекса между олигонуклеотидами, полученными в результате ГШР, с комплементарными олигонуклеотидами, иммобилизованными в других ячейках того же микрочипа.

В качестве анализируемых объектов для количественного иммунологического анализа способом по изобретению предпочтительно предлагаются: опухолеассоциированные антигены, являющиеся маркерами онкологических заболеваний, например: α-фетопротеин (АФП) - маркер рака печени; простата-специфический антиген (ПСА), общий и свободный - маркер рака простаты; раковоэмбриональный антиген (РЭА) — маркер рака желудочно- кишечного тракта; раковый антиген 125 (CA 125) - маркер рака яичника, тела матки; раковый антиген 19-9 (CA 19-9) 015 - маркер рака поджелудочной железы; раковый антиген 15-3 (CA 15-3) - маркер рака молочной железы; общий иммуноглобулин E человека; специфические антитела против аллергенов; антитела против полисахаридов, в частности, против трисахаридов А и В - агглютиногенов эритроцитов крови, определяющих группу крови человека; полисахариды.

Иммуноанализ опухолеассоциированных антигенов проводят с использованием биологических микрочипов, содержащих иммобилизованные антитела против указанных опухолеассоциированных антигенов или иммобилизованные опухолеассоциированные антигены. При иммунологическом определении общего иммуноглобулина E человека в качестве иммобилизованных лигандов биологического микрочипа используют антитела против иммуноглобулинов E человека или иммуноглобулины E человека. Для иммуноанализа специфических антител против различных аллергенов иммобилизованными лигандами биологического микрочипа являются аллергены. Иммуноанализ специфических антител к полисахаридам и полисахаридов проводят с использованием биологического микрочипа с иммобилизованными полисахаридами и антителами против полисахаридов.

Общая процедура проведения иммуноанализа с использованием биологических микрочипов описана в примере 1. Для иммуноанализа

опухолеассоциированных антигенов - маркеров онкологических заболеваний в качестве иммобилизованных лигандов биологического микрочипа использовали антитела к указанным опухолеассоциированным антигенам или сами опухолеассоциированные антигены (примеры 2, 4, 5). В примере 6 описан биологический микрочип для иммуноанализа общего иммуноглобулина E человека с использованием антител против иммуноглобулинов E в качестве иммобилизованных лигандов. В примере 7 описан биологический микрочип для иммуноанализа специфических антител против аллергена тимофеевки с использованием иммобилизованных аллергенов (тимофеевка). Для иммуноанализа специфических антител к полисахаридам (определение группы крови человека) использовали биологический микрочип с иммобилизованными трисахаридами А и В (пример 8).

Настоящим изобретением также обеспечивается способ проведения иммуноанализа на биологическом микрочипе, предусматривающий а) инкубацию биологического микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу соединения, для образования иммунных комплексов с иммобилизованными на микрочипе лигандами, которую при необходимости проводят в условиях перемешивания; б) детекцию образовавшегося комплекса; в) при необходимости, количественное определение анализируемого соединения.

В качестве реакционной среды при проведении анализа используют буферные растворы, которые обычно применяются в иммуноанализе, например, фосфатный буфер, трис-НСl и др. Для уменьшения неспецифических взаимодействий в реакционную среду добавляют поливиниловый спирт, бычий сывороточный альбумин, сахарозу, белки сухого молока и др. (так называемые "блокировочные растворы", хорошо известные специалистам в данной области). При проведении сэндвич-анализа возможен вариант, когда реакционная среда на стадии а) дополнительно содержит анализируемое соединение и проявляющие антитела. При этом сокращается время анализа, так как инкубация микрочипа с анализируемым соединением и проявление происходят одновременно.

Регистрацию результатов иммуноанализа проводят по интенсивности флуоресценции, хеми- или биолюминесценции, с использованием масс- спекрометрии непосредственно с гелевых ячеек микрочипа, а также путем проведения иммуно-ПЦР с последующей регистрацией результатов ПНР на том же микрочипе. При флуоресцентной регистрации результатов используют антигены и антитела, меченные флуоресцентными красителями, например Техасским красным, флуоресцеином, цианиновым 3 и 5 (СуЗ, Cy5), но не ограничиваясь ими. Регистрацию флуоресцентных сигналов с ячеек микрочипа проводят с помощью флуоресцентных микроскопов или сканирующих микроскопов различных типов, позволяющих регистрировать сигнал с используемой флуоресцентной метки (Примеры 2, 4-9). При регистрации результатов по интенсивности хеми- или биолюминесценции используют конъюгаты антител или авидина с пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой, β- галактозидазой, люциферазой или другими ферментами, дающими хеми- или биолюминесцентные сигналы в результате ферментативных реакций, например, катализируемого пероксидазой окисления люминола перекисью водорода в присутствии усилителя (Пример 3). Хеми- или био люминесцентные сигналы регистрируют с помощью ССD-камер или других регистрирующих устройств.

При использовании метода масс-спектрометрии после взаимодействия биологического микрочипа с образцом и образования комплекса "иммобилизованный лиганд - анализируемое соединение" идентификацию анализируемого соединения проводят непосредственно на гидрогелевом элементе микрочипа по результатам прямого масс-спектрального анализа связавшегося с лигандом соединения. Процедура регистрации результатов анализа в этом случае следующая: после отмывки микрочипа от неспецифически сорбированных белков проводят элюирование в условиях, разрушающих комплекс, образованный исследуемым соединением и иммобилизованным лигандом, прямой масс- спектральный анализ с каждого гелевого элемента и идентифицируют соединение по его молекулярной массе и способности связываться с определенным лигандом (Пример 11).

Идентификацию соединения белковой природы, связавшегося с иммобилизованным лигандом, проводят также после протеолитического гидролиза белковых комплексов в гелевых ячейках. Для этого микрочип

обрабатывают раствором протеазы (трипсина, химотрипсина, пепсина, папаина, субтилизина, протеиназы К, Аsр-N-эндопептидазы и др., но не ограничиваясь ими), и каждый элемент микрочипа далее анализируют с помощью масс- спектр ометрии. В случае если иммобилизованный в геле лиганд небелковой природы, то полученная смесь пептидов соответствует одному белку, который образовал комплекс с данным лигандом. Молекулярные массы пептидов, полученные в результате масс-спектрометрического анализа (пептидная карта), сравнивают с пептидными картами известных белков из базы данных и идентифицируют неизвестный белок.

Если иммобилизованный в геле лиганд белковой природы, то он сам подвергается воздействию протеазы, поэтому параллельно проводят контрольный эксперимент по протеолитическому расщеплению белка, иммобилизованного в гелевой ячейке, с последующим анализом методом масс-спектрометрии и определяют молекулярные массы пептидов, образовавшихся в результате гидролиза иммобилизованного белка. После протеолитического гидролиза комплекса белковый лиганд - неизвестный белок и масс-спектрометрического анализа получают набор пептидов, соответствующих смеси двух белков. Путем вычитания находят набор пептидов, образовавшихся после гидролиза неизвестного белка, и идентифицируют неизвестный белок с помощью базы данных по пептидным картам известных белков (Пример 12).

Еще один из способов детекции результатов иммуноанализа на биологическом микрочипе предусматривает проведение реакции иммуно-ПЦР и регистрации результатов этой реакции на одном и том же микрочипе. В этом случае биологический микрочип одновременно содержит в разных гелевых элементах иммобилизованные лиганды (антитела или антигены) и иммобилизованные о лигонуклеотиды (Пример 10). Например, биологический микрочип содержит иммобилизованные антитела против анализируемого соединения. На микрочип наносят исследуемый образец, происходит специфическое связывание антиген-антитело, и в качестве проявляющих антител (вариант сэндвич-анализа) используют конъюгат антитела с олигонуклеотидом. Следующая стадия — проведение ГШР: на этот же микрочип наносят смесь реагентов для ПЦР и проводят необходимое количество циклов реакции; затем меняют условия (температуру и т.д.) таким образом, что наработанный

флуоресцентно-меченный ПЦР -продукт образует специфический комплекс с комплементарными олигонуклеотидами, иммобилизованными в других ячейках микрочипа. Ячейки микрочипа, содержащие иммобилизованные антитела и иммобилизованные некомплементарные олигонуклеотиды, выступают в качестве отрицательного контроля. После отмывки микрочипа регистрируют флуоресцентный сигнал.

При использовании данного метода происходит как минимум тысячекратное увеличение сигнала за счет того, что в ходе ПЦР нарабатывается на несколько порядков большее количество флуоресцентно-меченного олигонуклеотида, комплементарного олигонуклеотиду, входящему в состав коньюгата с антителом, и это количество флуоресцентно меченного продукта и определяет конечную величину регистрируемого сигнала (Пример 10).

Иммуноанализ, проводимый на гидрогелевых микрочипах, может быть осуществлен в виде анализа любого типа: прямого, непрямого, конкурентного, сэндвич-варианта и др. (Пример 1).

Для прямого иммуноанализа биологический микрочип содержит иммобилизованные антитела против анализируемого соединения, а реакционная среда на стадии а) содержит анализируемое соединение, которое образует специфический иммунный комплекс с иммобилизованными антителами. Сигнал, регистрируемый с соответствующих гелевых ячеек микрочипа, пропорционален концентрации анализируемого соединения.

Биологический микрочип для конкурентного анализа содержит иммобилизованные антитела либо иммобилизованные антигены. В первом случае в реакционную среду на стадии а) дополнительно добавляют меченое анализируемое соединение, и происходит конкуренция между специально добавленным меченым соединением и присутствующим в анализируемом образце немеченым соединением за связывание с иммобилизованными антителами. В варианте конкурентного анализа с использованием микрочипа с иммобилизованными антигенами в реакционную среду на стадии а) дополнительно добавляют меченые антитела против анализируемого соединения, и наблюдается конкуренция меченых антител за связывание с анализируемым соединением в растворе и соединением, иммобилизованным на микрочипе. В случае конкурентного анализа чем выше сигнал, регистрируемый с

соответствующих гелевых ячеек микрочипа, тем меньше концентрация анализируемого соединения в образце.

Биологический микрочип для сэндвич-иммуноанализа содержит иммобилизованные антитела против анализируемого соединения, а реакционная среда на стадии а) содержит анализируемое соединение. После образования специфического комплекса антиген - иммобилизованное антитело микрочип проявляют мечеными антителами, специфичными к другому эпитопу анализируемого соединения. Сигнал, регистрируемый с соответствующих гелевых ячеек микрочипа, пропорционален концентрации анализируемого соединения. Для сэндвич-иммуноанализа возможен также вариант, когда реакционная среда на стадии а) кроме анализируемого соединения дополнительно содержит проявляющие антитела, что сокращает время проведения анализа, так как инкубация микрочипа с анализируемым соединением и проявление происходят одновременно.

Прямой и конкурентный анализы на микрочипах можно проводить как для низкомолекулярных соединений, так и для соединений белковой природы. Сэндвич-вариант иммуноанализа возможен только для соединений белковой природы, для которых существуют антитела, специфичные к разным эпитопам белковой молекулы: связывающее антитело и проявляющее антитело.

Количественное обнаружение соединений на биологическом микрочипе для всех вариантов анализа осуществляют путем проведения стадий а) - б) с известными концентрациями анализируемого соединения в стандартном (эталонном) растворе и построения калибровочной зависимости сигнал - концентрация анализируемого соединения, по которой определяют неизвестную концентрацию соединения в образце.

Калибровочную зависимость для количественного определения антигена можно также получить с использованием микрочипа, содержащего иммобилизованные лиганды. Например, микрочип содержит гелевые элементы с иммобилизованными антителами против анализируемого антигена и гелевые элементы, с иммобилизованным антигеном в разных концентрациях. После проведения сэндвич-иммуноанализа, то есть после инкубации микрочипа с образцом и мечеными проявляющими антителами, сигналы, получаемые от гелевых элементов с известными концентрациями иммобилизованного антигена,

служат для построения калибровочной кривой, по которой определяют неизвестную концентрацию антигена в образце.

Предел обнаружения анализируемого соединения определяют как концентрацию, соответствующую интенсивности флуоресцентного/хемилюминесцен� �ного сигнала, в 3 раза превышающего разброс фонового сигнала.

Предлагаемый способ количественного иммуноанализа с использованием биологических микрочипов характеризуется высокой чувствительностью (Таблица 1) и воспроизводимостью (коэффициент вариации 10% (Пример 2)).

Применение микрочипов позволяет проводить множественный, количественный, параллельный анализ образцов по многим параметрам, что резко увеличивает эффективность анализа и значительно снижает количество исследуемого материала: для анализа достаточно 20 мкл исследуемого образца. Биологический микрочип для параллельного множественного анализа содержит иммобилизованные антитела против нескольких соединений и/или несколько иммобилизованных антигенов. В случае прямого иммуноанализа реакционная среда содержит образец, включающий один или несколько анализируемых соединений, и после инкубации микрочипа с образцом регистрируют сигналы ячеек микрочипа, содержащих соответствующие иммобилизованные антитела. Для конкурентного анализа реакционная среда на стадии а) дополнительно содержит смесь меченых антител ко всем анализируемым соединениям или смесь всех анализируемых меченых соединений. В случае сэндвич-иммуноанализа проявление микрочипа после инкубации в реакционной среде, содержащей образец, осуществляют смесью меченых антител против всех анализируемых соединений. В Примере 5 продемонстрирован одновременный параллельный анализа нескольких антигенов, например, опухолеассоциированных маркеров, на одном микрочипе без потери чувствительности метода.

При необходимости стадию инкубации микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу соединения (стадия а) проводят в условиях перемешивания, которое значительно уменьшает время проведения анализа за счет ускорения диффузии, смещения динамического равновесия в сторону образования специфического комплекса антиген-антитело (Пример 9). Перемешивание можно осуществлять, например, путем

переключения направления потока реакционного раствора с прямого на обратное с помощью насосов различного типа, ультразвуком, электрофорезом, но не ограничиваясь указанными способами.

Настоящее изобретение обеспечивает способ множественного параллельного иммуноанализа онкомаркеров на биологическом микрочипе, содержащем иммобилизованные антитела против онкомаркеров и/или иммобилизованные онкомаркеры. На первой стадии иммуноанализа (стадия а) проводят инкубацию биологического микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу онкомаркеры, для образования иммунного комплекса с иммобилизованными на микрочипе лигандами, которую при необходимости проводят в условиях перемешивания. Детекцию образовавшегося комплекса (стадия б) осуществляют флуориметрически, хемилюминометрически, масс-спектрометрически или путем проведения иммуно-ПЦР с последующей регистрацией результатов ПЦР на том же микрочипе. Для количественного определения (стадия в) проводят стадии α) - б) с известными концентрациями анализируемого онкомаркера и строят калибровочную зависимость, по которой определяют содержание анализируемого онкомаркера в образце.

Анализ опухолеассоциированных маркеров на микрочипах можно осуществлять в виде иммуноанализа любого типа (прямой, непрямой, конкурентный, сэндвич-анализ и др.). Прямой анализ онкомаркеров проводят с использованием биологических микрочипов с иммобилизованными антителами против онкомаркеров. Например, прямой анализ α-фетопротеина (АФП) (Пример 2) проводили с использованием микрочипов с иммобилизованными антителами против АФП, а АФП содержал флуоресцентную метку СуЗ. Регистрируемый сигнал с ячеек микрочипа с иммобилизованными антителами пропорционален концентрации антигена (Фиг. IA).

При проведении конкурентного анализа используют микрочипы с иммобилизованными антителами против онкомаркеров или иммобилизованными онкомаркерами. В первом варианте реакционная среда на стадии а) дополнительно содержит специально добавленный меченый онкомаркер, и происходит конкуренция между меченым и немеченым онкомаркером за связывание с иммобилизованными антителами. В случае конкурентного анализа с

использованием биологических микрочипов с иммобилизованными онкомаркерами реакционная среда на стадии а) дополнительно содержит специально добавленные меченые антитела против анализируемого онкомаркера и происходит конкуренция меченых антител за связывание с соединением в растворе и соединением (онкомаркером), иммобилизованным на микрочипе. Например, при конкурентном анализе АФП, описанном в Примере 2, микрочип содержал гелевые элементы с иммобилизованным АФП, а реакционная среда на стадии а) дополнительно содержала меченные СуЗ антитела к АФП. Для конкурентного анализа регистрируемый сигнал ячеек микрочипа тем выше, чем меньше концентрация анализируемого соединения в образце (Фиг. 1Б).

В случае сэндвич-иммуноанализа микрочип содержит иммобилизованные антитела против анализируемых онкомаркеров, а реакционная среда на стадии а) содержит анализируемое соединение. После образования комплекса "антиген- антитело" микрочип проявляют мечеными антителами, специфичными к другому эпитопу данного онкомаркера. В примере 2 описан сэндвич-анализ АФП на микрочипе с иммобилизованными антителами против АФП при проявлении вторыми антителами против АФП, содержащими флуоресцентную метку СуЗ. Регистрируемый сигнал ячеек микрочипа с иммобилизованными антителами пропорционален концентрации АФП (Фиг. IB). Для сэндвич-иммуноанализа возможно также, что реакционная среда на стадии а) одновременно с анализируемым соединением дополнительно содержит проявляющие антитела, и, таким образом, инкубация микрочипа с анализируемым соединением и проявление происходят одновременно. В примере 9 осуществляли иммуноанализ ПСА при инкубации микрочипов в реакционной среде, одновременно содержащей ПСА и моноклональные антитела против другого эпитопа ПСА, меченные СуЗ .

Возможен также вариант, когда микрочип одновременно с иммобилизованными антителами против онкомаркеров содержит гелевые элементы с иммобилизованными онкомаркерами в разных концентрациях для построения калибровочной зависимости В этом случае проводят инкубацию микрочипа с образцом, содержащим онкомаркер в неизвестной концентрации, и мечеными антителами против анализируемого онкомаркера (сэндвич- иммуноанализ), и от гелевых элементов с известной концентрацией

иммобилизованного онкомаркера получают зависимость сигнала от концентрации онкомаркера. Данную зависимость (калибровочную кривую) используют для определения неизвестной концентрации онкомаркера в образце. Изображение микрочипа для сэндвич-иммуноанализа простата-специфического антигена (ПСА) с использованием микрочипа, содержащего гелевые элементы с иммобилизованным антигеном для построения калибровочного графика, приведено на Фиг. 4. Микрочип содержал иммобилизованные антитела против ПСА и иммобилизованный ПСА для построения калибровочного графика в концентрациях, соответствующих рабочему диапазону калибровочной кривой.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ множественного параллельного иммуноанализа общего иммуноглобулина E человека на биологическом микрочипе, содержащем иммобилизованные антитела против иммуноглобулинов E человека (анти-IgЕ) и/или иммобилизованные иммуноглобулины E человека (IgE). На первой стадии (стадия а) проводят инкубацию биологического микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу иммуноглобулины E, для образования иммунного комплекса с иммобилизованными на микрочипе лигандами, которую при необходимости проводят в условиях перемешивания. Детекцию образовавшегося комплекса (стадия б) осуществляют флуориметрически, хемилюминометрически, масс-спектрометрически или путем проведения иммуно- ПЦР с последующей регистрацией результатов ПЦР на том же микрочипе. Для количественного определения (стадия в) проводят стадии а) - б) с известными концентрациями анализируемого иммуноглобулина E и строят калибровочную зависимость, по которой определяют содержание анализируемого иммуноглобулина E в образце (сыворотке крови человека).

Анализ человеческого иммуноглобулина E на микрочипах можно осуществлять в виде иммуноанализа любого типа (прямой, непрямой, конкурентный, сэндвич-анализ и др.). Для прямого анализа используют микрочипы с иммобилизованными антителами против иммуноглобулина E. Реакционная среда содержит меченый анализируемый иммуноглобулин E при флуоресцентной или хемилюминесцентной детекции или немеченый иммуноглобулин E при масс-спектральной детекции.

При проведении конкурентного анализа используют микрочипы с иммобилизованным иммуноглобулином E или с иммобилизованными антителами против иммуноглобулина E. В первом варианте реакционная среда на стадии а) дополнительно содержит специально добавленный меченый иммуноглобулин E и происходит конкуренция между меченым и немеченым иммуноглобулином E за связывание с иммобилизованными антителами. В другом варианте (микрочип с иммобилизованным иммуноглобулином E) реакционная среда на стадии а) дополнительно содержит специально добавленные меченые антитела против иммуноглобулина E и происходит конкуренция меченых антител за связывание с иммуноглобулином E в растворе и иммуноглобулином E, иммобилизованным на микрочипе.

Биологический микрочип для сэндвич-иммуноанализа иммуноглобулина E человека содержит иммобилизованные антитела против иммуноглобулина E (анти-IgЕ), а реакционная среда на стадии а) содержит анализируемый иммуноглобулин E человека (сыворотка крови). После образования комплекса "антиген-антитело" микрочип проявляют вторыми мечеными антителами против иммуноглобулина E человека. В примере б описан сэндвич-анализ IgE на микрочипе с иммобилизованными анти-IgЕ при проявлении флуоресцентно- меченными анти-IgЕ. Регистрируемый сигнал ячеек микрочипа с иммобилизованными анти-IgЕ пропорционален концентрации IgE в растворе или сыворотке крови человека (Фиг. 5). Для сэндвич-иммуноанализа иммуноглобулина E возможен вариант, когда реакционная среда на стадии а) кроме анализируемого соединения дополнительно содержит другие меченые анти-IgЕ, и, таким образом, инкубация микрочипа с анализируемым соединением и проявление происходят одновременно.

Калибровочную зависимость для определения общего иммуноглобулина E можно также получить непосредственно на микрочипе, если использовать микрочип, содержащий гелевые элементы с иммобилизованным IgE в разных концентрациях. Микрочипа инкубируют с образцом (сывороткой крови), содержащим IgE в неизвестной концентрации, и вторыми мечеными антителами против IgE (сэндвич-иммуноанализ), и от гелевых элементов с иммобилизованным IgE получают зависимость сигнала от концентрации IgE,

которую используют как калибровочную кривую для определения неизвестной концентрации IgE в сыворотке крови.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ множественного параллельного иммуноанализа аллергенспецифических иммуноглобулинов E на биологическом микрочипе, содержащем иммобилизованные специфические аллергены. Первой стадией анализа (стадия α) является инкубация биологического микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу аллергенспецифические иммуноглобулины E, для образования иммунного комплекса с иммобилизованными на микрочипе аллергенами, которую, при необходимости, проводят в условиях перемешивания. Детекцию образовавшегося комплекса (стадия б) осуществляют флуориметрически, хемилюминометрически, масс-спектр ометрически или путем проведения иммуно-ПЦР с последующей регистрацией результатов ПНР на том же микрочипе. Для количественного определения (стадия в) проводят стадии α) - б) с известными концентрациями анализируемого аллергенспецифического иммуноглобулина E и строят калибровочную зависимость, по которой определяют содержание анализируемого аллергенспецифического иммуноглобулина E в образце (сыворотке крови человека).

Анализ аллергенспецифического иммуноглобулина E на микрочипах можно осуществлять в виде иммуноанализа любого типа (прямой, непрямой, конкурентный, сэндвич-анализ и др.). В прямом анализе реакционная среда на стадии а) содержит меченый анализируемый аллергенспецифический иммуноглобулин E при флуоресцентной или хемилюминесцентной детекции или немеченый аллергенспецифический иммуноглобулин E при масс-спектральной детекции.

При проведении конкурентного анализа на микрочипах с иммобилизованными аллергенами реакционная среда на стадии а) дополнительно содержит специально добавленные меченые антитела против иммуноглобулинов E человека и происходит конкуренция между мечеными и немечеными антителами за связывание с иммобилизованными на микрочипе аллергенами.

При проведении сэндвич-иммуноанализа аллергенспецифических иммуноглобулинов E реакционная среда на стадии а) содержит анализируемый аллергенспецифический иммуноглобулин E человека. После образования

комплекса "иммобилизованный аллерген-антитело" микрочип проводят проявление мечеными антителами против иммуноглобулинов E человека. В этом случае можно использовать те же проявляющие антитела, что и для анализа общего иммуноглобулина E человека, и, соответственно, можно изготовить микрочип для одновременного анализа общих и аллергенспецифических иммуноглобулинов в сыворотке крови человека. Сэндвич-анализ специфического IgE (аллерген тимофеевки) в сыворотке крови при проявлении микрочипа флуоресцентно-меченными анти-IgЕ описан в примере 7. Для сэндвич- иммуноанализа специфических IgE возможен также вариант, когда реакционная среда на стадии а) кроме анализируемого соединения дополнительно содержит меченые антитела против иммуноглобулинов E человека, и, таким образом, одновременно происходит инкубация микрочипа с анализируемым соединением и проявление.

Для количественного анализа аллергенспецифического IgE используют также микрочип, который одновременно с иммобилизованными аллергенами содержит гелевые элементы с иммобилизованными аллергенспецифическими IgE в разных концентрациях для получения калибровочной зависимости на этом же микрочипе. Микрочип инкубируют с образцом, содержащим аллергенспецифический IgE в неизвестной концентрации, и мечеными антителами против иммуноглобулинов человека (сэндвич-иммуноанализ), и от гелевых элементов с иммобилизованными аллергенспецифическими IgE в известных концентрациях получают зависимость сигнала от концентрации анализируемого антигена, которую используют для определения неизвестной концентрации аллергенспецифического IgE в образце.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ множественного параллельного иммуноанализа антител против полисахаридов на биологическом микрочипе, содержащем иммобилизованные полисахариды или антитела против полисахаридов. На первой стадии (стадия а) проводят инкубацию биологического микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу антитела против полисахаридов, для образования иммунного комплекса "полисахарид-антитело", которую при необходимости проводят в условиях перемешивания. Детекцию образовавшегося комплекса (стадия б) осуществляют флуориметрически, хемилюминометрически, масс-спектрометрически или путем

проведения иммуно-ПЦР с последующей регистрацией результатов ПЦР на том же микрочипе. Для количественного определения (стадия в) проводят стадии а) - б) с известными концентрациями анализируемых антител против полисахаридов и строят калибровочную зависимость, по которой определяют содержание анализируемого соединения в образце.

Анализ антител против полисахаридов на микрочипах можно осуществлять в виде иммуноанализа любого типа (прямой, непрямой, конкурентный, сэндвич- анализ и др.). Для прямого анализа используют ^' микрочипы с иммобилизованными полисахаридами. Реакционная среда на стадии а) содержит меченые анализируемые антитела против полисахаридов при флуоресцентной или хемилюминесцентной детекции или немеченые антитела против полисахаридов при масс-спектральной детекции.

При проведении конкурентного анализа антител против полисахаридов можно использовать как микрочипы с иммобилизованными антителами против полисахаридов, так и с иммобилизованными полисахаридами. В первом варианте реакционная среда на стадии а) дополнительно содержит специально добавленный меченый полисахарид, и происходит конкуренция между антителами в растворе и антителами, иммобилизованными на микрочипе, за связывание с меченым полисахаридом. Для конкурентного анализа антител против полисахаридов с использованием биологических микрочипов с иммобилизованными полисахаридами реакционная среда на стадии а) дополнительно содержит специально добавленные меченые антитела против анализируемого полисахарида и происходит конкуренция между мечеными и немечеными антителами за связывание с иммобилизованным на микрочипе полисахаридом.

Для сэндвич-иммуноанализа антител против полисахаридов используют микрочипы с иммобилизованными полисахаридами. Реакционная среда на стадии а) содержит анализируемые антитела, и происходит образование комплекса "полисахарид-антитело". Далее микрочип проявляют вторыми антителами, содержащими флуоресцентную метку. Например, анализ моноклональных антител против трисахаридов А и В — агглютиногенов эритроцитов крови, определяющие группу крови человека, осуществляли на микрочипах с иммобилизованными трисахаридами А и В (Пример 8). После инкубации

микрочипа с сывороткой крови человека проводили проявление мьшiиными антителами IgM против человеческих антител, меченными Cy5.

Для сэндвич-иммуноанализа антител против полисахаридов возможно также, что реакционная среда на стадии а) кроме анализируемого соединения дополнительно содержит меченые антивидовые антитела, и, таким образом, инкубация микрочипа с анализируемым соединением и проявление происходят одновременно.

Калибровочную зависимость для определения антител против полисахаридов можно получить непосредственно на микрочипе, если использовать микрочип, содержащий гелевые ячейки с иммобилизованными антителами против данных полисахаридов в разных концентрациях. Микрочип инкубируют с образцом, содержащим антитела против полисахаридов в неизвестной концентрации, и мечеными проявляющими антителами (сэндвич- иммуноанализ), и от гелевых элементов, содержащих иммобилизованные антитела против данных полисахаридов в известных концентрациях получают зависимость сигнала от концентрации, которую используют как калибровочную кривую для определения неизвестной концентрации антител против полисахаридов.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ множественного параллельного иммуноанализа полисахаридов на биологическом микрочипе, содержащем иммобилизованные полисахариды или антитела против полисахаридов. На первой стадии (стадия а) проводят инкубацию биологического микрочипа в реакционной среде, включающей образец, содержащий подлежащие анализу полисахариды, для образования иммунного комплекса "полисахарид- антитело", которую при необходимости проводят в условиях перемешивания. Детекцию образовавшегося комплекса (стадия б) осуществляют флуориметрически, хемилюминометрически, масс-спектрометрически или путем проведения иммуно-ПЦР с последующей регистрацией результатов TTTTP на том же микрочипё. Для количественного определения (стадия в) проводят стадии а) - б) с известными концентрациями анализируемых полисахаридов и строят калибровочную зависимость, по которой определяют содержание анализируемого соединения в образце.

Анализ полисахаридов на микрочипах можно осуществлять в виде иммуноанализа любого типа (прямой, непрямой, конкурентный, сэндвич-анализ и др.). Для прямого анализа используют микрочипы с иммобилизованными антителами против полисахаридов. Реакционная среда на стадии а) содержит меченые анализируемые полисахариды при флуоресцентной или хемилюминесцентной детекции или немеченые полисахариды при масс- спектральной детекции.

При проведении конкурентного анализа полисахаридов, так же как и для анализа антител против полисахаридов, можно использовать микрочипы с иммобилизованными антителами против полисахаридов и с иммобилизованными полисахаридами. В первом варианте реакционная среда на стадии а) дополнительно содержит специально добавленный меченый полисахарид и наблюдается конкуренция между меченым и немеченым полисахаридом за связывание с иммобилизованными антителами. В другом варианте (микрочип с иммобилизованными полисахаридами) реакционная среда на стадии а) дополнительно содержит специально добавленные меченые антитела против анализируемого полисахарида и происходит конкуренция меченых антител за связывание с полисахаридом в растворе и полисахаридом, иммобилизованным на микрочипе.

Биологический микрочип для сэндвич-иммуноанализа полисахаридов содержит иммобилизованные антитела против анализируемых полисахаридов, а реакционная среда на стадии а) содержит анализируемый полисахарид. После образования комплекса "полисахарид-антитело" микрочип проявляют вторыми мечеными антителами против данного полисахарида. Для сэндвич-иммуноанализа возможен также вариант, когда реакционная среда на стадии а кроме анализируемых полисахаридов дополнительно содержит вторые меченые антитела против анализируемых полисахаридов, и, таким образом, инкубация микрочипа с анализируемым соединением и проявление происходят одновременно.

Калибровочную зависимость для определения полисахаридов также можно получить непосредственно на микрочипе, если использовать микрочип, содержащий гелевые ячейки с иммобилизованными полисахаридами в разных концентрациях. Микрочип инкубируют с образцом, содержащим анализируемые

полисахариды в неизвестной концентрации, и мечеными проявляющими антителами (сэндвич-иммуноанализ), и от гелевых элементов, содержащих иммобилизованные полисахариды в известных концентрациях, получают зависимость сигнала от концентрации, которую используют как калибровочную кривую для определения неизвестной концентрации полисахаридов.

Приводимые ниже примеры предназначены не для ограничения притязаний, а исключительно для иллюстрации отдельных воплощений настоящего изобретения.

Пример 1. Количественный иммуноанализ с использованием гидрогелевых микрочипов

Для количественного иммуноанализа были изготовлены гидрогелевые микрочипы, содержащие элементы с иммобилизованными белками (антителами и/или антигенами). Для уменьшения неспецифических взаимодействий во всех вариантах анализа микрочипы предварительно инкубировали в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,15 M NaCl, 1 % поливинилового спирта (ПBC-50) или в том же буфере, содержащем 3 % бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 4 % сахарозы ("блокировочный буфер"), 2 час при комн. температуре. Перед проведением анализа растворы антигена (образца) разбавляли 0,01 M фосфатным буфером, рН 7,2, содержащим 0,15 M NaCl, 0,15 % ПBC-50 и 0,15 % поливинилпирролидона 360.

Прямой иммуноанализ. К микрочипам, содержащим гелевые элементы с иммобилизованными моноклональными антителами к определяемому антигену и к другим антигенам для контроля перекрестных взаимодействий, добавляли по 20 мкл растворов флуоресцентно-меченного антигена (например, онкомаркера) и выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч. После отмывки микрочипов в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, 0,15 M NaCl, 0,1 % Tвин-20 (15 мин, комн. температура) измеряли интенсивность флуоресцентных сигналов гелевых элементов микрочипов.

Для конкурентного анализа использовали микрочип с иммобилизованным антигеном. Раствор, содержащий определяемый антиген, инкубировали с раствором флуоресцентно-меченных моноклональных антител (0,3 мкг/мл) или

конъюгатов антител с пероксидазой в течение 2-х ч. Смесь (20 мкл) после инкубации наносили на микрочип и выдерживали 2 ч. при 37°. После отмывки в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, 0,15 M NaCl, 0,1 % Tвин-20 (15 мин, комн. температура) измеряли интенсивность флуоресцентных или хемилюминесцентных сигналов.

В сэндвич-варианте иммуноанализа к иммобилизованным на микрочипе антителам добавляли 20 мкл раствора антигена, и микрочипы инкубировали при комнатной температуре в течение ночи. После кратковременной (15 мин) отмывки в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, 0,15 M NaCl, 0,1 % Tвин-20, микрочипы проявляли флуоресцентно-меченными антителами (или конъюгатами антител с пероксидазой), специфичными к другому эпитопу антигена (40 мин, комнатная температура). После отмывки (0,01 M фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,15 M NaCl, 0,1 % Tвин-20, 15 мин, комн. температура) измеряли интенсивность флуоресцентных или хемилюминесцентных сигналов.

Для сэндвич-иммуноанализа использовали также вариант, когда микрочипы инкубировали при комнатной температуре в реакционной среде, содержащей антиген в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, 0,15 M NaCl, в которую добавляли флуоресцентно-меченные антитела (или конъюгаты антител с пероксидазой), специфичные к другому эпитопу антигена. После отмывки измеряли интенсивность флуоресцентных или хемилюминесцентных сигналов.

В некоторых случаях в качестве проявляющих антител использовали конъюгаты антител с биотином, и после инкубации с биотинилированными антителами микрочип проявляли СуЗ-меченным авидином или конъюгатом авидина с пероксидазой с последующей обработкой хемилюминесцентными субстратами пероксидазы.

Антитела, авидин и антигены белковой природы, меченные флуоресцентными метками Cy 3 и Cy 5, а также конъюгаты антител и авидина с пероксидазой получали по известным методикам (например, описанным в G.Т. Негmапsоп, Вiосопjugаtе Тесhпiquеs, Асаdеmiс Рrеss, Sап Diеgо, 1996).

Для измерения флуоресцентных сигналов использовали флуоресцентный микроскоп, снабженный CCD камерой и компьютерными программами для визуализации изображения и обработки полученных данных, разработанный в лаборатории биочипов ИМБ РАН (V. Ваrskу, А. Реrоv, S. Тоkаlоv, А. Сhudiпоv, E.

Кrеiпdliп, А. Shаrопоv, E. Коtоvа, А. Мirzаbеkоv, Fluоrеsсепсе dаtа апаlуsis on gеl- bаsеd biосhiрs, J. Вiоmоl. Sсrеепiпg, 2002, 7, 247-257). Микроскоп позволяет одновременно анализировать данные со всех элементов микрочипа и получать двумерное и трехмерное изображения флуоресцентного сигнала с гелевых элементов.

Для измерения хемилюминесцентных сигналов использовали тот же флуоресцентный микроскоп с выключенным источником возбуждения.

Для всех вариантов анализа строили график зависимости интенсивности флуоресценции или хемилюминесценции от концентрации антигена в растворе. Наименьшую определяемую концентрацию антигена рассчитывали как концентрацию, соответствующую интенсивности сигнала, в 3 раза превышающего разброс фонового сигнала.

Пример 2. Иммуноанализ α-фетопротеина

Количественное определение АФП необходимо при диагностике и лечении ряда раковых заболеваний, а также для выявления патологий беременности. На примере α-фетопротеина (АФП) нами иллюстрируются различные варианты иммуноанализа с использованием белковых гидрогелевых микрочипов — прямой, конкурентный, сэндвич-иммуноанализы с флуоресцентной детекцией (Фиг. 1).

Для прямого анализа были изготовлены микрочипы с иммобилизованными моноклональными антителами против АФП. После обработки микрочипов флуоресцентно-меченным АФП наблюдали зависимость интенсивности флуоресценции гелевых ячеек микрочипа от концентрации антигена в диапазоне концентраций от 0,5 до 1000 нг/мл (Фиг. IA), минимально определяемая концентрация АФП составила 0,5 нг/мл.

Для конкурентного анализа использовали микрочип с иммобилизованным АФП. Раствор АФП предварительно инкубировали с СуЗ -мечеными моноклональными антителами против АФП, и после инкубации раствор наносили на микрочип. В этом случае интенсивность флуоресценции была обратно пропорциональна концентрации антигена в растворе (Фиг. 1Б). Уменьшение флуоресцентного сигнала гелевых ячеек микрочипа, содержащих иммобилизованный АФП, наблюдали при изменении концентрации АФП в растворе от 2 до 2000 нг/мл

В случае сэндвич-иммуноанализа была выбрана пара моноклональных антител, связывающихся с различными эпитопами АФП. Были изготовлены микрочипы с иммобилизованными антителами. Проявляющие антитела были помечены СуЗ. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации АФП для сэндвич-иммуноанализа на чипах показана на Фиг. IB. Зависимость флуоресцентных сигналов от концентрации АФП наблюдалась в диапазоне от 2 до 500 нг/мл. Минимально определяемая концентрация АФП — 2 нг/мл.

При данных условиях проведения анализа, в частности, при используемых нами процедурах блокировки и отмывки микрочипов, неспецифические сигналы, т.е. сигналы от ячеек микрочипа, содержащих антитела к другим антигенам (например, другим онкомаркерам) практически не отличались от фоновых или от сигналов пустых гелевых элементов. Иммуноанализ с использованием микрочипов характеризуется высокой чувствительностью (Таблица 1) и воспроизводимостью: коэффициент вариации измерений концентрации антигена в образце для всех типов анализа составлял не более 10%.

Таблица 1. Результаты количественного иммуноанализа маркеров злокачественных новообразований на микрочипе

Пример 3. Хемилюминесцентная регистрация сигнала при проведении иммуноанализа с использованием микрочипов

Были изготовлены микрочипы с иммобилизованными моноклональными антителами против пероксидазы хрена. На микрочипы наносили по 20 мкл раствора пероксидазы в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,15 M NaCl, различной концентрации, выдерживали 2 час. при комнатной температуре, а затем наносили 20 мкл смеси хемилюминесцентных субстратов (SuреrSigпаl ELISA Рiсо Stаblе Реrохidе, Luminol Enhancer фирмы Рiеrсе, США), содержащей люминол, перекись водорода и усилитель. При окислении люминола, катализируемом пероксидазой, наблюдается хемилюминесценция с максимумом при 425 нм. Для регистрации сигналов использовали флуоресцентный микроскоп с выключенной лампой возбуждающего света, выдержка 60 сек. Измеренная интенсивность хемилюминесценции гелевых ячеек, содержащих иммобилизованные антитела к пероксидазе, была прямо пропорциональна как концентрации иммобилизованных антител, так и концентрации пероксидазы в растворе в диапазоне 0,5-500 нг/мл (Фиг. 2). Таким образом, показано, что хемилюминесцентную детекцию можно использовать для регистрации результатов иммуноанализа на микрочипах, причем чувствительность детекции не уступает детекции с использованием флуоресцентной метки.

Пример 4. Иммуноанализ маркеров онкологических заболеваний с использованием микрочипов

В Таблице 1 и на Фиг. 3 приведены результаты количественного иммуноанализа маркеров онкологических заболеваний на гелевых микрочипах. Кроме иммуноанализа α-фетопротеина, описанного в Примере 1, был проведен анализ простата-специфического антигена (общая и свободная формы), раковозмбринального антигена (РЭА), раковых антигенов CA 125, CA 15-3 и CA 19-9. Прямой, конкурентный и сэндвич-иммуноанализ с флуоресцентной и хемилюминесцентной регистрацией проводили по методикам, описанным в Примере 1. На Фигуре 4 показан микрочип для сэндвич-иммуноанализа простата- специфического антигена (ПСА), содержащий гелевые элементы с иммобилизованным ПСА для построения калибровочного графика.

Пример 5. Одновременный анализ нескольких антигенов на одном микрочипе

Были изготовлены микрочипы с иммобилизованными антителами ко всем исследуемым маркерам онкологических заболеваний (α-фетопротеин (АФП), простата-специфический антиген (ПСА, общая и свободная формы), раковоэмбриональный антиген (РЭА), раковые антигены CA 125, CA 19-9, CA 15- 3 (Фиг. 3). После инкубации микрочипа с раствором или сывороткой крови, содержащими определяемый антиген, микрочип проявляли смесью флуоресцентно-меченых антител ко всем онкомаркерам. Как видно из Фиг. 3, яркие сигналы наблюдались только в гелевых ячейках, содержащих специфические антитела. Пределы обнаружения онкомаркеров в случае их параллельного анализа оказались такие же, как и при определении каждого маркера в отдельности (Таблица 1).

Пример 6. Иммуноанализ общего иммуноглобулина E сыворотке крови на микрочипе

Микрочип для иммуноанализа общего IgE содержал иммобилизованные антитела к иммуноглобулинам E человека (анти-IgЕ). После инкубации с сывороткой крови микрочип проявляли вторыми флуоресцентно-меченными анти-IgЕ антителами. На Фиг. 5 показан калибровочный график для определения общего IgE в диапазоне 25-400 МЕ/мл в двойных логарифмических координатах.

Пример 7. Иммуноанализ специфического иммуноглобулина E (аллерген тимофеевка) в сыворотке крови на микрочипе

Для анализа специфического IgE микрочип содержал иммобилизованный аллерген (очищенная белковая фракция аллергена из тимофеевки). После инкубации с сывороткой крови больного микрочип проявляли флуоресцентно- меченными анти-IgЕ, как и в случае определения общего IgE. На Фиг. 6 показаны флуоресцентные изображения микрочипа после взаимодействия с сывороткой крови больного с высоким содержанием специфических IgE (+ + + + по анализу кожной пробы), средним содержанием специфических IgE (+ + по анализу кожной пробы) и сывороткой крови здорового донора (нет специфических IgE).

Пример 8. Иммуноанализ моноклональных антител против трисахаридов А и В

Микрочипы содержали трисахариды А и В (агглютиногены эритроцитов крови, определяющие группу крови человека), иммобилизованные в гелевых элементах. Концентрация трисахаридов в геле составляла 1 мг/мл. Микрочипы инкубировали с растворами человеческой сыворотки III группы крови (содержит антитела только против трисахарида А) и человеческой сыворотки II группы крови (содержит антитела только против трисахарида В) в различных разведениях в течение ночи при +4 ⁰ C. Олигосахаридные микрочипы промывали в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, 0,15 M NaCl, 20 мин, далее обрабатывали раствором мышиных антител IgM против человеческих антител, 0,01 мг/мл, в течение ночи при +4 ⁰ C, промывали тем же буферным раствором 20 мин, затем обрабатывали раствором козьих антител против мьшiиных IgM, окрашенных Cy5, 0,01 мг/мл, в течение ночи при +4 ⁰ C. После отмывки в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, 0,15 M NaCl, 0, 1 % Tвин-20, 20 мин, измеряли флуоресцентные сигналы гелевых ячеек с помощью флуоресцентного микроскопа. Строили зависимость интенсивности флуоресценции от разведения сыворотки крови, содержащей антитела против трисахаридов А и В (Фиг. 7). Гелевые олигосахаридные микрочипы позволили регистрировать наличие антител к трисахаридам А и В при разведении сыворотки крови до 1 : 10000 (стандартный метод анализа ELISA - при разведении до 1:500).

Пример 9. Ускорение иммуноанализа при использовании перемешивания образца

Сэндвич-иммуноанализ простата-специфического антигена (ПСА) проводили на микрочипах с иммобилизованными моноклональными антителами против ПСА, 0,1 мг/мл. Микрочипы инкубировали в реакционной среде, содержащей одновременно ПСА и моноклональные антитела против другого эпитопа ПСА, меченные СуЗ (20 мкг/мл) в течение 2 час при комнатной температуре при перемешивании и без перемешивания. Перемешивание осуществляли с помощью перистальтического насоса. Для этого микрочип помещали в проточную камеру объемом 50 мкл, снабженную трубками для подачи образца. Камеру присоединяли к перистальтическому насосу Мiшрuls 2 (Gϊlsоп), и в систему помещали 70 мкл анализируемого образца, содержащего

ПСА. Образец перемешивали, переключая направление потока с прямого направления на обратное каждые 2 сек; скорость потока была 2 мл/мин. Одновременно проводили анализ с перемешиванием на 6 микрочипах, т.е. измерение 6 образцов с различными концентрациями ПСА. На Фиг. 8 показаны калибровочные графики для определения ПСА в случае сэндвич-иммуноанализа при перемешивании образца (кривая 1) и без перемешивания (кривая 2). Через 2 час перемешивания интенсивность сигнала флуоресценции гелевых элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные антитела, была выше, чем без перемешивания для всех концентраций ПСА в растворе: для ПСА в растворе 15— 125 нг/мл происходило увеличение сигнала в 5 и более раз, для ПСА в растворе 250 нг/мл и более - в 4 раза. Интенсивность фоновых сигналов (пустые гелевые элементы) не менялась. ^•

Пример 10. Иммуно-ПЦР на гелевых микрочипах

Иммуно-ПЦР на гелевых микрочипах проводили с использованием в качестве проявляющего антитела конъюгат антитела с олигонуклеотидом. Был синтезирован конъюгат моноклональных антител против пероксидазы хрена с олигонуклеотидом, имеющим следующую последовательность: Ab-S-(C6)-CAG CTT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAC CGT CAG TGC GCG ATT AAT- OH-3'. Синтез конъюгата проводили по методике, описанной в G.Т. Неrmапsоп, Вiосопjugаtе Тесhшquеs, Асаdеmiс Рrеss, Sап Diеgо, 1996, с использованием 3- сульфо-N-гидрокисукцинимидного эфира 4-(N-мaлeимидoмeтил)~циклoгeкcaн-l- карбоновой кислоты (сульфо-SМСС).

Были изготовлены микрочипы, каждый из которых содержал гелевые элементы с иммобилизованной пероксидазой, элементы с олигонуклеотидами, полностью комлементарными к нарабатывающемуся в результате ПЦР флуоресцентно меченному продукту, некомплементарными олигонуклеотидами и пустыми гелями (Фиг. 9A).

Комлементарный олигонуклеотид - 5'-NH ₂ -(C ₆ ) СТА TAG GGA CCG TCA-OH- 3'* Некомлементарный олигонуклеотид - 5'-NH ₂ -(C ₆ ) GAT GCT GAC TAA CGC- oн-з\

Концентрация иммобилизованных олигонуклеотидов на микрочипе составляла

200 пикомоль/мкл геля, концентрация иммобилизованной в геле пероксидазы - ОД мг/мл. Микрочипы промывали 20 мин в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,15 M NaCl, 0,1 % Tвин-20. Микрочипы обрабатывали блокировочным раствором (0,01 M фосфатным буфер, рН 7,2, 0,15 M NaCl, 0,01% ПВС) в течение 1 час и затем инкубировали с конъюгатом антител с олигонуклеотидом в разных концентрациях (1-1000 нг/мл в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, 0,15 M NaCl, 0,15 % ПВС и 0,15 % ПВП) в течение 2,5 час при комнатной температуре. После инкубации микрочипы промывали 20 мин в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, 0,15 M NaCl, 0,1 % Tвин-20, на чип наносили 20 мкл смеси для ПЦР в камере объемом 25 мкл (Еррепdоrf In situ Frаmе), и чип помещали в прибор для проведения ПЦР (ТGrаdiепt Тhеrmосусlеr, фирма Вiоmеtrа). Проводили асимметричный ПЦР на микрочипе с праймерами Праймер 1 - 5'-CAG CTT AAT ACG ACT CA-OH-3' и флуоресцентно-меченный Праймер 2 - 3'-TC ACG CGC TAA ТТА-Техаs Red-5'.

В состав смеси для ПЦР (все реагенты из набора «aмплификaния ДEЖ» фирмы «Cилeкc M», Россия) входили:

1. Стерильная вода 9,6 мкл;

2. Реакционный буфер (х 10) 4 мкл;

3. MgCl ₂ (25 мМ) 2 мкл;

4. смесь dNТР (1,5 мМ) 2 мкл;

5. Праймер 1 (0,2 мкМ) 1 мкл;

6. Праймер 2 (10 мкМ) 1 мкл;

7. Таq-полимераза 0,4 мкл.

Конечные концентрации праймеров в смеси были 0,01 мкМ (Праймер 1) и 0,5 мкМ (Праймер 2), соотношение Праймер 1 : Праймер 2 = 1 : 50. Режим проведения ПЦР:

30 циклов T=10°.

В результате IЩР нарабатывается флуоресцентно-меченный олигонуклеотид, комплементарный исходной матрице. После окончания ПНР чипы промывали 5 мин 0,01 M фосфатным буфером, рН 7,2, 0,15 M NaCl, 0,1 % Tвин-20, и проводили измерения на флуоресцентном микроскопе.

Параллельно на микрочипах проводили гибридизацию флуоресцентно- меченного олигонуклеотида, комплементарного матрице (Праймер 2), с олигонуклеотидом, иммобилизованным на микрочипе, при обычных условиях: на микрочип после инкубации с конъюгатом антитело-олигонуклеотид наносили раствор Праймера 2 в концентрации 0,5 мкМ в 0,05 M фосфатном буфере, рН 7,2, 0,15 M NaCl, и инкубировали 1,5 час при комнатной температуре. Микрочип промывали 5 мин 0,01 M фосфатным буфером, рН 7,2, 0,15 M NaCl, 0,1 % Твин- 20, и проводили измерения на флуоресцентном микроскопе.

На Фиг. 9Б показано флуоресцентное изображение микрочипа после иммуно-ПЦР с раствором, содержащим 1 нг/мл конъюгата. Наблюдали яркие сигналы от ячеек с иммобилизованными комплементарными олигонуклеотидами. При обычной гибридизации микрочипа с комплементарным матрице олигонуклеотидом, меченным флуоресцентным красителем Техасский красный (Праймер 2) при концентрации конъюгата 1 нг/мл флуоресцентных сигналов не наблюдалось (Фиг. 9В). Флуоресцентный сигнал при обычной гибридизации наблюдали только при инкубации микрочипа с раствором конъюгата антитело- олигонуклеотид с концентрацией 500 нг/мл, и интенсивность флуоресценции в этом случае была ниже, чем в случае проведения иммуно-ПЦР с конъюгатом в концентрации 1 нг/мл.

Таким образом, при проведении иммуно-ПЦР на микрочипе происходит усиление сигнала примерно в 1000 раз. Еще одним важным и неожиданным преимуществом проведения ПЦР непосредственно на микрочипе является то, что конъюгат антитело-олигонуклеотид после его синтеза может быть использован без дополнительной очистки. При проведении иммуно-ПЦР на иммунологических планшетах (Б.R. Непdriсksоп, Т.М. Тгаbу, R.D. Jоеrgеr, W.R. Маrjаriап, R.С. Бbеrsоlе, Нigh sепsitivitу multiапаlуtе immшюаssау usiпg соvаlепt DNА-lаbеlеd апtibоdiеs апd роlуmеrаsе сhаiп rеасtiоп, Nисlеiс Асids Rеs., 1995, 23, 522-529) полученные конъюгаты подвергали многостадийной очистке с использованием различных хроматографических методов. Микрочип в данном случае работает как

аффинная колонка, на которой происходит только специфическое связывание, а посторонние вещества удаляются в процессе промывок.

Пример 11. Идентификация соединений на гелевом элементе микрочипа путем прямого масс-спектрального анализа

Были изготовлены микрочипы, содержащие в гелевых ячейках иммобилизованные моноклональные антитела против инсулина и лизоцима (0,1 мкг антител/ячейка геля). После полимеризации микрочип промывали 0,01 M фосфатным буфером, 0,15 M NaCl, 0,1 % Tвин-20, при перемешивании в течение 1 час (2O ⁰ C). Микрочип инкубировали с раствором, содержащим инсулин или лизоцим в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,2, 0,15 M NaCl (20 час, 2O ⁰ C), и далее отмывали сначала 0,01 M фосфатным буфером, рН 7,2, 0,15 M NaCl, 0,1 % Твин- 20 (2 часа при перемешивании, 2O ⁰ C), затем водой. Перед проведением масс- спектрального анализа разрушали комплекс антиген-антитело и элюировали антиген на поверхность геля добавлением в каждую ячейку микрочипа 1 мкл насыщенного раствора матрицы для MALDI мониторинга (синапиновая кислота) в растворе 10% муравьиной кислоты в 30%-нoм водном ацетонитриле. Микрочип выдерживали 20 мин при комнатной температуре во влажной камере, затем слайд высушивали на нагревательном столике при 4O ⁰ C и проводили масс- спектрометрические измерения. Для контроля параллельно проводили флуоресцентные измерения с использованием инсулина, меченного флуоресцентным красителем Воdiру: перед проведением масс-спектрального анализа получали сигнал с данной ячейки микрочипа с помощью флуоресцентного микроскопа. В случае биотинилированного инсулина для флуоресцентного измерения биочип обрабатывали раствором флуоресцентно- меченного авидина.

Масс-спектры, полученные непосредственно с гелевых элементов микрочипа, после взаимодействия с растворами инсулина-Воdiру и биотинилированного лизоцима показаны на Фиг. 10. Спектры содержали пики, соответствующие молекулярным массам данных соединений. Масс-спектры с гелевых ячеек, не содержащих антитела против этих инсулина и лизоцима, но инкубированных с раствором этих соединений, не содержали вышеупомянутых

пиков. При параллельных флуоресцентных измерениях также получали только специфические сигналы.

Пример 12. Протеолитический гидролиз в гелевых элементах микрочипа

Был изготовлен микрочип по примеру 1 с объемом гелевых ячеек 0,2 мкл, содержащий ячейки с иммобилизованным лизоцимом (0,5 мкг лизопима/ячейка геля). После полимеризации чип промывали 0,01 M фосфатным буфером, 0,15 M NaCl, 0,1 % Tвин-20, при перемешивании в течение 2 час и водой. Для денатурации и разрыва S-S-связей белков в геле к каждой ячейке микрочипа добавляли по 1 мкл денатурирующего буфера (50 мМ трис-НСl, рН 8,0, 5 мМ дитиотреитол, 6 M гуанидинхлорид) и инкубировали микрочип во влажной камере при 65 ⁰ C в течение 4-х час. После этого микрочип быстро промывали 0,2 M бикарбонатом аммония, нагретым до 65 ⁰ C. Чип высушивали досуха при 37 ⁰ C на нагревательном столике, и к сухим гелевым ячейкам постепенно добавляли раствор трипсина в 0,2 M бикарбонате аммония (25 нг трипсина в 1 мкл бикарбонатного буфера, соотношение протеаза : иммобилизованный белок 1 : 20). Микрочип инкубировали во влажной камере при 37 ⁰ C в течение 20-24 час. Реакцию останавливали, добавляя 0,1% водный раствор трифторуксусной кислоты (ТФУ) в каждую ячейку геля. Микрочип высушивали досуха при 37 ⁰ C.

Для анализа методом MALDI MS в каждую ячейку геля добавляли по 1 мкл 35% раствора ацетонитрила в 0,1% ТФУ, микрочип высушивали на нагревательном столике при 4O ⁰ C и получали масс-спектры непосредственно с гелевых ячеек микрочипа (Фиг. 11). Параллельно проводили масс-спектр альный анализ с ячеек микрочипа, не содержащих иммобилизованный белок, в которые было добавлено то же количество трипсина. Из масс-спектров трипсиновых гидролизатов белка (лизоцима) в геле вычитали масс-спектры гидролизованного трипсина. Результаты масс-спектрального анализа трипсинового гидролизата лизоцима непосредственно с гелевой ячейки микрочипа за вычетом гидролизата самого трипсина приведены в Таблице 2.

Таблица 2. Масс-спектр триптического гидролизата лизоцима, полученный с гелевого элемента микрочипа на масс-спектрометре COMPACT MALDI 4 (Кrаtоs апаlуtiсаl)

* ⁾ Пептиды, образовавшиеся при неполном гидролизе лизоцима трипсином (1 пропущенный сайт); ** ⁾ нeидeнтифициpoвaнный пик.

Аминокислотная последовательность лизоцима состоит из 128 остатков с

NN 19-147 (остатки с NN 1-18 принадлежат сигнальной последовательности). Полный гидролиз лизоцима трипсином приводит к образованию 18 пептидов, из них шесть состоят из одного или двух остатков с массами менее 300, которые не регистрируются масс-спектрально в данных условиях. Теоретически рассчитанные молекулярные массы пептидов после гидролиза лизоцима трипсином, полученные из базы данных по белкам SWISS-PROT (http:/cn.expasy.org/cgi-bin/peptide-mass/pl) также показаны в Таблице 2. Масс- спектр лизоцима, гидролизованного трипсином в гелевой ячейке микрочипа, содержал 14 пиков, 10 из которых соответствуют пептидам, образовавшимся при полном гидролизе, 3 пика, соответствующих пептидам неполного гидролиза с одним пропущенным сайтом. Пик с молекулярной массой 520,3 может соответствовать как пептиду 87-91 с молекулярной массой 516,5 для полного гидролиза трипсином, так и пептиду 131-134 с молекулярной массой 519,6, образовавшемуся при гидролизе с одним пропущенным сайтом. Пик с молекулярной массой 727,6 не был идентифицирован.

Полученные масс-спектральные данные были введены в программу Рерtldепt из базы данных SWISS-PROT для анализа "пептидных отпечатков пальцев". Поиск проводился среди белков с молекулярной массой в диапазоне 12880-15750, для случая гидролиза трипсином, точность определения масс ± 5 Да, остатки цистеина в восстановленной форме. Результат: по приведенным молекулярным массам триптического гидролизата с точностью 75 % идентифицирован лизоцим куриный, Gаllus gаllus с молекулярной массой 14313 Да.

Все упомянутые в описании публикации и патентные документы включены путем отсылки в их полном объеме. Специалисту в данной области понятно, что могут быть осуществлены различные изменения и модификации, которые при этом не будут выходить за рамки данного изобретения, определяемые следующей формулой изобретения.