Domaine technique de l'invention

L'invention concerne le domaine de l'immunologie, à savoir le domaine de l'interaction entre un antigène et un anticorps. Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation d'un antigène de synthèse (TCSP), dérivé d'une protéine du parasite unicellulaire Trypanosoma Cruzi, qui est la cause de la maladie de Chagas, pour la détection d'anticorps non reliés à la maladie de Chagas, qui permettent de diagnostiquer certaines maladies auto-immunes dans un patient humain.

Etat de la technique

On sait que les agents infectieux peuvent échapper au système immunitaire d'un hôte en interférant avec la maturation normale d'une réponse immunitaire humorale effective, et en dirigeant des anticorps induits contre des autoantigènes. De plus, dû à des similitudes structurelles entre certains antigènes infectieux et antigènes du soi (« self antigens » en anglais), on pense que certains agents infectieux sont capables de déclencher une réponse auto-immunitaire dans des hôtes qui présentent une prédisposition génétique.

La maladie de Chagas est endémique en Amérique Latine et Amérique du Sud, et représente une cause importante de morbidité et mortalité dans les pays où elle sévit. Elle est pratiquement absente sur les autres continents. Environ 16 à 18 millions de personnes sont infectées, et environ 50 000 patients en meurent chaque année. C'est l'infection par le parasite unicellulaire Trypanosoma Cruzi (T. cruzi), membre de l'ordre des Kinetoplastida et de la famille des Trypanosomatidae, qui induit la maladie de Chagas chez l'être humain ; ce parasite protozoaire est transmis par plusieurs espèces d'insectes hématophages, et notamment par les Triatominae (punaises hémato- phages). La transmission a lieu lorsque les formes infectieuses du parasite sont déposées lors de la piqûre de l'insecte, lorsque des déjections de l'insecte vecteur entrent en contact avec le sang ou les muqueuses de l'hôte. L'insecte vecteur libère ainsi les formes trypomastigotes métacycliques infectieuses qui, par la voie de la circulation sanguine, vont coloniser de nombreux types cellulaires. Le cycle de vie complexe du parasite lui permet d'échapper à la réponse immunitaire de l'hôte, sans conduire à la mort de l'hôte. Le parasite passe par une étape épimastigote dans l'insecte vecteur, une étape trypomastigote dans le sang du mammifère hôte, et une étape amastigote intracellulaire : pendant cette dernière étape, le parasite se multiplie par division binaire. Une autre voie de contamination est la transfusion sanguine avec du sang contaminé ; plusieurs procédés de dépistage ont été développés (voir par exemple les brevets EP 0 976 763 et US 6,458,922).

On sait que T. cruzi infecte les cellules musculaires cardiaques et squelettiques, les cellules gliales et les cellules du système phagocytaire mononucléé. Après pénétration passive dans la cellule hôte, la forme trimastogite du parasite se différencie en forme amastigote ; elle se divise activement, puis les formes trypomastigotes sont libérées, provoquant ainsi une nouvelle invasion cellulaire. Environ 30% des patients atteints par cette maladie développent de sévères symptômes cliniques cardiaques de type cardiomyopathies (voir l'article de K. Karratolios et al., "Inflammatory Cardiomyopathy", paru en 2006 dans la revue Hellenic Journal of Cardiology, vol. 47, P. 54-65, et l'article de J. Burian et al., « Myocarditis : the immunologist's view on pathogenesis and treatment », paru en 2005 dans la revue Swiss Médical Weakly, vol. 135, p. 359-364) ; ces cardiomyopathies peuvent être aiguës ou chroniques.

Des atteintes cardiaques comparables peuvent être observées chez des patients infectés par le virus d'immunodéficience humaine (VIH) ou d'autres agents infectieux en dehors de tout contexte de la maladie de Chagas. Des atteintes cardiaques comparables peuvent également exister avec moins de fréquence chez des sujets apparemment sains ; on sait (voir l'article de F. Kierszenbaum, « Views on the autoimmunity hypothesis for Chagas disease pathogenesis », paru en 2003 dans la revue "FEMS Immunology and Médical Microbiology, vol. 1545, p. 1 - 11 , et l'article de R. Jahns et al., « Pathological autoantibodies in cardiomyopathy », paru en septembre 2008 dans la revue Autoimmunity, vol 41(6), p. 454 - 461 ) que ces atteintes résultent de mécanismes auto-immunitaires d'origine indéterminée. En effet, des réactions auto- immunes peuvent être observées chez les patients atteints de cardiomyopathies sans que l'on ne connaisse précisément l'origine, ni la spécificité des anticorps impliqués, ni à fortiori celle des immunogènes. Aucun document ne fait état d'une structure antigénique définie, responsable de cette auto-immunité et plus particulièrement d'un antigène de T. cruzi (TCSP). Des anticorps ont été décrits contre des récepteurs (adrénergiques ou cholinergiques) sans pour autant définir leur spécificité vis-à-vis du peptide TCSP et d'aucune façon l'implication d'un antigène du parasite T. cruzi en dehors de son contexte naturel de la maladie de Chagas. On sait que chaque étape du cycle de vie du parasite T. cruzi exprime des protéines antigènes spécifiques, comme décrit par exemple dans l'article de Hoft et al. (« Trypanosama cruzi Expresses Diverse Répétitive Protein Antigens »), paru en juillet 1989 dans la revue Infection and Immunity, vol. 57 (7), p. 1959-1967). Dans les études décrites dans cette publication, les auteurs ont criblé une banque d'expression de T. cruzi avec des anti-sérums humains et ont trouvé des cDNA qui codent des polypeptides contenant des unités répétitives comprenant de 6 à 34 acides aminés. La séquence d'acides aminés de TCR70 (qui est identique à TCR 69) a été fortement conservée, avec seulement quelques substitutions occasionnelles. Leur apparition fréquente dans toutes les fractions isolées et la diversité de ces unités répétitives suggère qu'ils sont impliqués dans le contoumement du rôle destructif du système immunitaire. Puisque ces unités répétitives sont des modulateurs efficaces du système immunitaire, on peut penser que d'autres agents infectieux utilisent des stratégies similaires, voire même les mêmes unités répétitives.

Les méthodes de dépistage des anticorps dirigés contre T. cruzi, qui sont utilisées dans les banques de sang (notamment au Brésil où ce dépistage est obligatoire), comprennent l'immunofluorescence indirecte (IFA), l'hémagglutination indirecte (IHA), et le dosage par des techniques immunoenzymatiques (ELISA). La plupart de ces kits de dosage, qui sont commercialement disponibles, utilisent des extraits bruts de parasites ou des fractions subcellulaires comme préparations d'antigènes. Il a été trouvé que les extraits de parasites réagissent, avec des sérums de patients qui présentent d'autres maladies, telles que la leishmaniose, l'infection Trypanosoma rangeli, la syphilis ou la fièvre rhumatoïde. Par conséquent, l'utilisation d'unités répétitives similaires par différents organismes pathogènes complique le diagnostic et le traitement. D'autre part, une réponse faussement positive lors du dépistage de la maladie de Chagas peut conduire à un diagnostic erroné qui sera suivi d'un traitement superflu et / ou inefficace.

Par conséquent, il y a un besoin urgent de pouvoir détecter des unités répétitives qui peuvent être utilisés par différents organismes pathogènes. Cependant, dans l'état de la technique, il n'existe pas de document qui montre ou suggère que les motifs polypeptidiques TCR 70 qui sont identifiés chez T. cruzi existent dans d'autres maladies sans rapport avec la maladie de Chagas, ou entraînent des désordres auto- immunitaires. Il n'a pas non plus été démontré ou suggéré dans l'état de la technique que ces unités répétitives peuvent permettre le développement d'outils fiables pour le diagnostic et le traitement ou la prévention efficace de pathologies cardiaques ou de désordres auto-immunitaires liées ou non à la maladie de Chagas. Il y a donc également un besoin de disposer de méthodes immunodiagnostiques, de préférence rapides ou utilisables sous la forme de kits, pour détecter des anticorps pathogènes capables de se lier de manière spécifique aux antigènes exprimés par T. cruzi. Et finalement, on manque de méthodes pour pouvoir réduire le taux de ces anticorps pathogènes dans le sang.

Objets de l'invention

Selon l'invention, les problèmes posés sont résolus par l'utilisation d'anticorps qui se lient de manière spécifique à un peptide comportant la séquence

Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Thr-A la-Ala-Ala-Pro-Val

(SEQ ID N ⁰ I ), et qui ne sont pas induits dans un hôte suite à son infection par T. cruzi. Ces anticorps en tant que tels représentent le premier objet de la présente invention.

Un deuxième objet de l'invention est un antigène qui se lie de manière spécifique à l'anticorps selon le premier objet, à l'exception des antigènes qui se lient aussi à des anticorps induits par T. cruzi et qui sont codés génétiquement par le parasite T. cruzi, c'est-à-dire à l'exception des antigènes comportant la séquence SEQ ID N° 1.

Un troisième objet est l'utilisation d'un peptide ou d'une protéine comportant la séquence

Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala (SEQ ID N°2), et de préférence la séquence

Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala (SEQ ID N°3), et encore plus préférentiellement la séquence SEQ ID N° 1 , pour la détection et/ou la précipitation des anticorps selon le premier objet, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps. En particulier, ledit peptide ou ladite protéine peut être un peptide TCSP ou un variant du peptide

TCSP, pour autant que ledit variant présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon le premier objet de l'invention.

Lesdits anticorps peuvent se lier à des antigènes d'un agent infectieux, d'un allergène et/ou d'un auto-antigène ; ledit agent infectieux peut être un agent pathogène, et la présence desdits anticorps est alors lié à une maladie infectieuse ou auto-immune.

Ledit agent pathogène peut aussi être sélectionné dans le groupe formé par les prions, les virus, les procaryotes, des eucaryotes unicellulaires ou multicellulaires. Ladite maladie infectieuse ou auto-immune peut être sélectionnée dans le groupe formé par la cardiomyopathie, la myocardite, le lupus érythémateux systémique.

Un autre objet de l'invention est un procédé pour la détection d'anticorps selon le premier objet dans un échantillon liquide, ce procédé comprenant les étapes suivantes :

(a) Mettre un échantillon biologique, de préférence un échantillon de fluide corporel et/ou de liquide surnageant d'une culture cellulaire (« échantillon liquide »), en contact avec un peptide ou une protéine comportant la séquence SEQ ID N°1, SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou avec un peptide TCSP ou un variant du peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon la revendication 1 ; (b) Déterminer la liaison dudit anticorps selon la revendication 1 dans ledit échantillon liquide avec ledit peptide ou ladite protéine à l'aide d'un ou plusieurs marqueurs appropriés, aptes à déterminer le complexe formé entre ledit peptide ou protéine et l'anticorps selon la revendication 1. Ledit marqueur peut être sélectionné dans le groupe constitué par les marqueurs de chemoluminescence, les marqueurs d'agglutination, les marqueurs de membranes, les marqueurs immunoenzymatiques, les marqueurs radioactifs.

Encore un autre objet de l'invention est un kit ou dispositif pour mettre en oeuvre le procédé selon l'objet précédent, comprenant : (a) une quantité déterminée d'un ou plusieurs peptides et/ou protéines comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, et/ou d'un peptide TCSP ou d'un variant du peptide TCSP, pour autant que lesdits peptides ou lesdites protéines présentent une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon le premier objet de l'invention ; (b) un ou plusieurs marqueurs appropriés, aptes à déterminer le complexe formé entre ledit peptide ou protéine et l'anticorps selon le premier objet de l'invention ; (c) optionnellement, un support solide, de préférence imprégné par ledit peptide ou ladite protéine. Ledit marqueur peut être sélectionné dans le groupe constitué par les marqueurs de chemoluminescence, les marqueurs d'agglutination, les marqueurs de membranes, les marqueurs immunoenzymatique, les marqueurs radioactifs. Encore un autre objet est une méthode d'immunodiagnostic comportant une étape de détection qualitative ou quantitative des anticorps selon le premier objet par l'utilisation d'un peptide ou d'une protéine comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou avec un peptide TCSP ou un variant du peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon le premier objet.

Encore un autre objet est une méthode pour réduire le taux d'anticorps selon le premier objet dans un échantillon de fluide biologique, tel qu'un échantillon sanguin, ou dans un flux de fluide biologique, tel qu'un fluide sanguin, comportant une étape de précipitation desdits anticorps à l'aide d'un peptide ou d'une protéine comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou avec un peptide TCSP ou un variant du peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon le premier objet.

On peut également utiliser le peptide TCSP ou ses variants pour l'obtention d'anticorps ou fragments d'anticorps ayant une activité de liaison équivalente au NCRA (Non- Cruzi-Related Antibody, i.e. un anticorps non induit par T. cruzi) ; cela constitue encore un autre objet de l'invention.

Les peptides ou protéines comportant l'une des séquences peptidiques (SEQ ID N ^C 1 , SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3) peuvent être utilisés pour identifier voire isoler les immunogènes qui induisent les anticorps NCRA. Des méthodes informatiques de recherches d'homologies de séquences utilisant des algorithmes élaborés peuvent servir d'outils pour l'identification de candidats immunogènes. Lesdits candidats immunogènes peuvent être synthétisés puis testés pour leurs réactivités avec des échantillons biologiques suspectés de contenir des NCRA. L'utilisation d'un peptide ou d'une protéine comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou d'un peptide TCSP ou d'un variant du peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon le premier objet de l'invention, pour identifier ou isoler un agent pathogène qui se lie spécifiquement aux NCRA ou qui est reconnu spécifiquement par NCRA, forme un autre objet de la présente invention. Cette interaction découle d'une homologie entre l'agent pathogène et le TCSP ou du variant de ce dernier. Encore un autre objet de l'invention est représenté par l'utilisation d'un peptide ou d'une protéine comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou d'un peptide TCSP ou d'un variant d'un peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon le premier objet de l'invention, pour l'obtention d'anticorps ou fragments d'anticorps ayant une activité de liaison équivalente au NCRA.

Un dernier objet de l'invention est une préparation pharmaceutique comprenant des anticorps ou fragments d'anticorps ayant une activité de liaison équivalente au NCRA, une solution injectable pharmaceutiquement acceptable et éventuellement un ou plusieurs excipients (tels que du polysorbate et/ou de la saccharose) ou additifs, lesdits anticorps ou fragments d'anticorps ayant été obtenus soit par une utilisation selon le troisième objet dans un organisme vivant, conduisant à l'immunisation dudit organisme contre le peptide TCSP, soit par criblage en utilisant le TCSP sur une banque de bactériophages qui expriment des anticorps spécifiques.

Figures

La figure 1 montre la distribution de l'intensité d'un signal lié à la présence d'anticorps qui se lient de manière spécifique au peptide TCSP, et qui ne sont pas nécessairement liés à une infection par T. cruzi (ces anticorps étant appelés NCRA, Non-Cruzi-Related Antibodies). Ces données proviennent d'un essai épidémiologique impliquant un nombre N de patients appartenant à quatre groupes :

DS = Donneurs sains (i.e. des donneurs de sang surveillés et sélectionnés, qui ont donc un état de santé meilleur que la moyenne de la population générale)

VIH Afrique : Patients africains qui réagissent positifs à un dépistage du virus

VIH. VIH Occidentaux : Patients occidentaux qui réagissent positifs à un dépistage du virus VIH. Chagas : Patients infectés par T. cruzi.

Les données contenues dans ce tableau proviennent de dosages de type ELISA. Elles sont représentées numériquement dans les tableaux 1 et 2.

La figure 2 montre les résultats d'une étude épidémiologique sur 79 patients, à savoir le taux de NRCA en fonction du temps (en années) depuis l'inclusion des patients dans l'étude. Description

1. Définitions

Dans le cadre de la présente invention, les termes suivants prennent un sens particulier :

L'expression « maladie de Chagas » désigne un état pathologique causé par l'infection avec le parasite Trypanosoma Cruzi, par voie parentérale ou non. L'expression « maladie autre que Chagas » désigne tout état pathologique non causé par le parasite Trypanosoma Cruzi, et qui entraîne une réactivité accrue des anticorps contre un antigène nouveau, appelé ici TCSP, défini ci-dessous.

Nous entendons par « acide aminé » les acides aminés naturels et les acides aminés non naturels. Les acides aminés « naturels » comprennent la forme L des acides aminés qui peuvent être trouvés dans des protéines d'origine naturelle, c'est-à-dire : alanine (A), arginine (R), asparagine (N), acide aspartique (D), cystéine (C), glutamine (Q), acide glutamique (E), glycine (G), histidine (H), isoleucine (I), leucine (L), lysine (K), méthionine (M), phénylalanine (F), proline (P), serine (S), thréonine (T), tryptophane (W), tyrosine (Y) et valine (V).

Les acides aminés « non naturels » comprennent la forme D des acides aminés naturels, les formes homo de certains acides aminés naturels (tels que : arginine, lysine, phénylalanine et serine), et les formes nor de la leucine et de la valine. Ils comprennent aussi d'autres acides aminés synthétiques.

Les « composés peptidigues » comprennent notamment les peptides et les polypeptides, y compris des dérivés obtenus par exemple par glycosylation, acétylation, phosphorylation, réaction avec des acides gras. Ce terme inclut également des protéines et peptides d'origine naturelle.

Le terme « anticorps » comprend les anticorps polyclonaux et monoclonaux. Le terme « anticorps monoclonal » désigne une composition d'anticorps présentant une population homogène, quel que soit l'espèce, l'origine et le procédé d'obtention de cet anticorps. Par ailleurs, le terme « anticorps » inclut les anticorps humains dans lesquels au moins une partie des domaines de l'immunoglobuline est présente, tels que les fragments d'anticorps et les domaines dits VHVL (Variable Heavy and Variable Light Chains), et les mini-anticorps.

L'expression « NCRA » ou « anticorps NCRA » (Non-Cruzi-Related Antibodies) désigne des anticorps qui se lient de manière spécifique à l'antigène TCSP, et qui ne sont pas induits dans un hôte suite à son infection par T. cruzi.

Les expressions « TCSP » (Trypanosoma Cruzi Synthetic Peptide), « antigène TCSP », « peptide TCSP » ou « protéine TCSP » signifient toutes un nouveau peptide tel que défini par l'invention, qui comporte une séquence d'acides aminés que l'on trouve également dans les protéines TCR70 et TCR69, à savoir SEQ ID N° 1 , définie ci-dessous, qui peuvent être isolés dans T. cruzi, et qui agit comme un antigène avec NCRA, ainsi que toutes les variantes et équivalents fonctionnels, tels que ses épitopes linéaires ou non-linéaires reconnus par NCRA comme défini ci-dessus. La structure minimale de l'épitope correspond à la SEQ ID N ⁰ 2, définie ci-dessous. Le terme « auto-antigène » se réfère à un épitope présent dans une molécule endogène de l'hôte, et qui peut être reconnu par le système immunitaire dudit hôte, pour éventuellement déclencher une réponse immunitaire. Ce mécanisme peut conduire à une « maladie auto-immune ». définie ici comme un état pathologique causé par une réponse immunitaire non souhaitée d'un hôte contre un auto-antigène (appelé aussi auto-épitope).

Le terme « agent infectieux » se réfère ici à tout agent, vivant ou non, capable de déclencher une réponse immunitaire. Plus particulièrement, il se réfère aux agents pathogènes, aux allergènes et haptènes. Les agents . pathogènes comprennent notamment les prions, les virus, les procaryotes, les eucaryotes, isolés ou non. Les allergènes comprennent toutes substances ou molécules capables de provoquer spontanément une réponse immunitaire dans un hôte lorsque ledit hôte est exposé auxdites substances ou molécules. Le terme « fluide biologigue » se réfère au liguide corporel d'un organisme vivant, tel qu'un patient humain, c'est-à-dire tout liquide prélevé sur un patient, tel que le sérum, le plasma, le sang total, l'urine, le liquide céphalo-rachidien, la salive, ou encore au liquide surnageant d'une culture cellulaire.

2. Description détaillée

Selon l'invention, le problème est résolu par l'utilisation d'un nouvel anticorps qui réagit avec un nouvel antigène (TCSP), dérivé d'une protéine d'un parasite unicellulaire cause de la maladie de Chagas, le Trypanosome Cruzi (T. cruzi). La particularité de cette invention réside dans la reconnaissance spécifique de l'antigène TCSP par des anticorps non reliés au parasite T. cruzi (appelés anticorps NCRA), donc n'ayant pas été induits par le dit antigène. Ce phénomène de reconnaissance hétérologue s'explique par le mimétisme structural de l'antigène TCSP avec un autre immunogène, endogène ou exogène, ayant immunisé l'individu et induit les NCRA. La séquence peptidique de l'antigène TCSP est dérivée d'une protéine connue et présente dans les bases de données Swissprot, Uniprot et TrEMBL (Accession Q7M3W1 ). Cette protéine est connue sous le nom de TCR69 ; elle est similaire à la protéine TCR70. Selon l'invention, la séquence peptidique de la protéine utilisée pour définir l'anticorps NCRA ₁ exprimée en codes acides-aminés à trois lettres, est :

Ala-Ata-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Thr-A la-Ala-Ala-Pro-Val

(SEQ ID N ⁰ I ).

Les variants immunoréactifs de ce peptide sont également retenus dans le cadre de la présente invention, pour autant qu'ils montrent les mêmes propriétés antigéniques. Les variants d'une séquence peptidique peuvent être obtenus par exemple par substitution d'un ou plusieurs acides aminés par d'autres entités chimiques, à condition de conserver la bioactivité de la séquence d'origine ; ils peuvent être obtenus aussi par addition de composés chimiques tels que la biotine ou de polymères naturels ou synthétiques, tels que la polylysine ou le polysaccharide. Tous ces variants qui conservent la bioactivité des séquences d'origine sont couverts par la présente invention.

Ces variants peuvent notamment être constitués par la séquence

Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala (SEQ ID N°2) et de préférence la séquence

Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala (SEQ ID N°3). Cette séquence peut être répétée une ou plusieurs fois, et lors de cette répétition, l'unité terminale (au sens « C-terminale ») d'alanine peut être substituée par une unité de thréonine, comme dans SEQ ID N° 1. Les peptides constitués par ces séquences montrent également cette même bioactivité et peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention.

Le TCSP peut être obtenu par purification à partir d'extrait de protéines du parasite T. cruzi, conduisant typiquement aux protéines TCR69 ou TCR70 (voir la publication de Hoft et al., citée ci-dessus), qui présentent les séquences SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3. Le TCSP et ses variantes peuvent aussi être issus d'une synthèse chimique (par exemple selon la méthode de Merrifield, bien connue de l'homme du métier). Ils peuvent également être obtenus par une technologie de clonage moléculaire, tel que I ¹ ADN recombinant, impliquant l'expression protéique dans des systèmes d'expression microbiens après insertion d'une séquence nucléotidique codant pour la séquence du peptide, suivie d'une culture, extraction et purification du peptide d'intérêt. Les antigènes TCSP et ses variantes ne sont pas utilisables pour le dépistage de la maladie de Chagas car ils conduisent à des réactions faussement positives. Les inventeurs ont découvert que le TCSP interagit d'une manière spécifique avec le NCRA. Cela veut dire que le TCSP comporte une séquence peptidique spécifique, qui est capable de se lier au NCRA. Cette liaison peut être détectée par toute méthode connue, telle que la chemiluminescence, les méthodes d'agglutination, les méthodes immunoenzymatiques ou radioactives.

L'anticorps biomarqueur est présent dans les fluides biologiques, et sa présence corrélée à des symptômes cliniques chez des patients atteints de cardiomyopathie, par exemple, les sujets infectés par le VIH ayant développé des complications cardiaques.

La présente invention concerne la séquence peptidique du TCSP ainsi que tout analogue structural capable de se lier au même anticorps biomarqueur et qui ne sont pas nécessairement induits par le parasite T. cruzi (NCRA). L'invention concerne également une méthode de dosage immunologique, pour la détection et la surveillance des myocardites et des cardiomyopathies chez des patients suite une infection ou une inflammation auto-immune.

Un mode de réalisation de l'invention est une méthode pour déterminer, de manière qualitative ou quantitative, le taux de NCRA dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) Obtention d'un échantillon biologique, tel que le sérum, le plasma, le sang total, l'urine, le liquide céphalo-rachidien, la salive, un échantillon de biopsie, ou encore le liquide surnageant d'une culture cellulaire ; b) Détermination du taux de NCRA dans cet échantillon biologique.

L'échantillon biologique peut se présenter sous une forme liquide, gel, ou solide. Il peut provenir d'un patient ou de cultures in vitro.

La présente invention se rapporte également à la surveillance du traitement des cardiomyopathies, par la détermination du taux de NCRA. En effet, la méthode décrite ci-dessus peut s'appliquer également ^ l'estimation de la probabilité de mort foetale causée par un arrêt cardiaque in-utéro, en raison de la présence des NCRA chez les femmes enceintes. En effet, le passage trans-placentaire de ces anticorps peut endommager les cellules cardiaques au cours de l'embryogenèse. Leurs effets sont d'autant plus significatifs que le tissu cardiaque est encore primitif. Dans cette méthode, on obtient un échantillon d'un liquide biologique du patient, qui est une femme enceinte, et on détermine le taux de NCRA dans cet échantillon. En outre, le dosage des NCRA peut conduire à une stratégie thérapeutique chez des patients atteints de cardiomyopathies ou au développement d'un vaccin contre cette maladie. A l'heure actuelle, la nature de l'immunogène induisant les anticorps biomarqueurs n'est pas connue ; toutefois la séquence de TCSP divulguée dans la présente invention peut conduire à la caractérisation de l'étiologie de la maladie, à l'isolement d'un agent infectieux ou non infectieux induisant les dits NCRA chez les sujets humains n'ayant pas été en contact avec le parasite T. cruzi, et contribuer ainsi à l'élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques. A titre d'exemple, des anticorps ou fragments d'anticorps anti-TCSP peuvent être conçus de façon à empêcher, par compétition, la liaison des NCRA à leur site cible biologique et inhiber ainsi leurs effets pathogènes. La conception de tels anticorps compétiteurs est rendue possible par cette découverte.

D'autre part, la mesure des NCRA de façon longitudinale (chez le même patient au cours du temps), peut indiquer une évolution de la cardiomyopathie et l'efficacité de son éventuel traitement. La soustraction de ces mêmes NCRA à la circulation sanguine, e.g. par des techniques d'immunoadsorption, peut réduire voire supprimer totalement leurs effets pathogènes.

L'invention est basée sur la découverte surprenante des propriétés antigéniques d'une protéine isolée à partir du parasite T. cruzi chez des sujets qui n'ont jamais été en contact avec ce parasite. En effet, l'antigène TCSP montre une activité « hétérospécifique » exceptionnelle avec des NCRA qui sont répandus chez des sujets humains vivants en dehors des régions endémiques du parasite. Il s'agit clairement d'un mécanisme de mimétisme peptidique ; ces anticorps induisent des réactions faussement positives lors d'un test de dépistage de la maladie de Chagas.

Ce mécanisme permet au peptide TCSP de se lier spécifiquement aux NCRA dirigés contre des auto-antigènes ou contre des agents infectieux autres que T. cruzi. Par conséquent, un mode de réalisation de la présente invention a pour objet d'employer le polypeptide TCSP ou ses variants immunoréactifs, pour la détection de NCRA. Ces anticorps NCRA peuvent également se lier à des auto-antigènes, ou à des antigènes d'organismes infectieux avec plus ou moins d'affinité et de spécificité que celles de la liaison au TCSP.

Plus spécifiquement, la présente invention fournit un polypeptide comme décrit ci- dessus, pour l'identification ou l'isolement d'un agent infectieux ou non infectieux induisant des anticorps qui à leur tour peuvent causer une maladie auto-immune. La présente invention fournit également un polypeptide comme décrit ci-dessus, où ledit agent infectieux est un virus ou un microbe relativement répandu parmi les sujets humains apparemment en bonne santé et largement répandu notamment chez des sujets infectés par VIH, tels que les mycoplasmes ou d'autres agent d'infections opportunistes. La présente invention permet également d'employer un polypeptide comme décrit ci-dessus, où la dite maladie auto-immune est choisie parmi celles décrites dans des pathologies cardiaques telles que des cardiomyopathies et la myocardite. En outre, la présente invention fournit une méthode pour la détection des anticorps contre le polypeptide TCSP, en mettant en contact le TCSP, ou un variant, avec les NCRA présents dans un échantillon de fluide biologique, la détection de la liaison des NCRA dans le dit échantillon biologique par des méthodes connues par l'homme du métier

En outre, la présente invention fournit une méthode d'analyse pour la détection des anticorps contre le polypeptide TCSP, comportant des réactifs ou outils permettant de déceler la liaison antigène-anticorps à l'aide de méthodes connues par les scientifiques du métier de l'immunoanalyse. Dans encore un autre mode de réalisation de la présente invention, on emploie le polypeptide TCSP ou ses variants, pour autant que ces derniers présentent une activité spécifique vis-à-vis des NCRA ₁ pour améliorer la spécificité des analyses de dépistage sérologique de la maladie de Chagas. Il ressort clairement des résultats montrés sur la figure 1 que les NCRA, décelés lors des tests de dépistage, peuvent être d'une origine autre que celle d'une infection par le parasite T. cruzi. Par conséquent, l'inhibition de ces anticorps par l'antigène TCSP peut améliorer la spécificité des tests de diagnostic de la maladie de Chagas. Les tests d'immunoréactivité dans la présente invention ont été réalisés par une technique ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), connue de l'homme du métier ; cependant toute autre technique permettant de détecter ou mesurer la liaison antigène-anticorps peut également s'appliquer à la présente invention, notamment pour mettre en œuvre la nouvelle méthode d'immunodiagnostic qui forme un des objets de l'invention.

Un autre aspect de l'invention est l'utilisation thérapeutique du peptide TCSP ou de ses variants pour l'obtention d'anticorps ou fragments d'anticorps ayant une activité de liaison équivalente au NCRA. Dans cette utilisation, on prépare d'abord des anticorps ou fragments d'anticorps par inmmunisation d'un organisme vivant (par exemple d'animaux) contre le peptide TCSP. Ensuite, on prépare une préparation pharmaceutique comprenant ces anticorps ou fragments d'anticorps, une solution injectable pharmaceutiquement acceptable et éventuellement des adjuvants (tels que du polysorbate, du saccharose). Ensuite, cette préparation pharmaceutique est administrée (par exemple injectée) à un patient pour entrer en compétition avec les NCRA pathogènes. Ainsi le taux de NCRA pathogène est diminué, et les symptômes cliniques du patient s'améliorent.

Encore un autre aspect de l'invention est une méthode pour réduire le taux d'anticorps selon l'invention dans un échantillon de fluide biologique, et notamment d'un échantillon sanguin ou dans un flux sanguin, comportant une étape de rétention desdits anticorps à l'aide d'un peptide ou d'une protéine comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou avec un peptide TCSP ou un variant du peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon l'invention. Cette méthode peut être mise en œuvre dans un but de diagnostic, dans un but de traitement d'une quantité de fluide biologique ou à des fins thérapeutiques par plasmaphérèse. Elle peut être mise en oeuvre de manière statique ou dans un flux dudit liquide biologique. De préférence, elle est mise en oeuvre comme une méthode d'immunoadsorption. Dans un mode de réalisation typique, le fluide biologique entre en contact avec un support solide sur lequel est fixé ledit peptide ou ladite protéine ou ladite protéine comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou ledit peptide TCSP ou un variant dudit peptide TCSP. Les anticorps, s'ils sont présents, précipitent alors sur ce support solide et sont retirés du fluide biologique.

Un autre aspect de l'invention est une préparation pharmaceutique comprenant des anticorps ou fragments d'anticorps ayant une activité de liaison équivalente au NCRA, une solution injectable pharmaceutiquement acceptable et éventuellement un ou plusieurs adjuvants (tels que du polysorbate et/ou du saccharose). Ces anticorps ou fragments d'anticorps peuvent être obtenus de différentes manières. Dans un mode de réalisation, ils peuvent être obtenus par criblage en utilisant le TCSP sur une banque de bactériophages qui expriment des anticorps spécifiques. Dans un autre mode de réalisation, ils peuvent être obtenus dans un organisme vivant, en utilisant un peptide ou protéine comportant la séquence SEQ ID N ⁰ 1 , SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 3 pour la détection des anticorps qui se lient de manière spécifique à un peptide comportant la séquence SEQ ID N ^C 1 et qui ne sont pas induits dans un hôte suite à son infection par T. cruzi, ladite utilisation conduisant à l'immunisation dudit organisme contre le peptide TCSP.

Encore un autre aspect de l'invention est l'utilisation du TCSP, et notamment du TCSP comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2 ou SEQ ID N° 3, dans une composition de vaccin, permettant d'immuniser un humain au moins partiellement contre une maladie autre que la maladie de Chagas, et notamment contre la cardiomyopathie auto-immune, la myocardite et le lupus érythémateux systémique. Cette vaccination peut se faire par injection d'une dose unique ou d'une pluralité de doses. Dans ces compositions, le TCSP peut être utilisé tel quel, en tant que peptide, ou bien sous forme biotinylée et / ou liée à un dérivé de l'avidine, et notamment à un dérivé de l'avidine obtenu par modification chimique et enzymatique connu sous le nom NeutraLite Avidin. Ladite composition peut comporter des solvants, additifs, tampons et porteurs pharmacologiquement acceptables, ainsi que, le cas échéant, d'autres principes actifs.

Selon un autre aspect de l'invention, on utilise un peptide ou d'une protéine comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou un peptide TCSP ou un variant du peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon l'invention, pour identifier ou isoler un agent pathogène qui se lie spécifiquement aux NCRA ou qui est reconnu spécifiquement par NCRA. Cette nouvelle méthode permet d'identifier les agents pathogènes susceptibles d'induire des maladies, autres que la maladie de Chagas, qui induisent la formation de NCRA. Dans certaines des utilisations du TCSP selon l'invention, il peut être avantageux de marquer le TCSP, par exemple à l'aide d'un chromophore ou d'un fluophore, ou d'une autre entité chimique facilement détectable (enzyme, isotope radioactif, biotine, haptène, etc.).

Exemples :

Les exemples qui suivent illustrent certains aspects de l'invention, sans la limiter.

1) Exemples d'études de groupe

Exemple 1 : Ces exemples correspondent à des essais de dépistage effectué sur un nombre N de plusieurs populations d'humains. Les tableaux 1 et 2 ainsi que la figure 1 montrent des résultats de ces essais de dépistage. Nous décrivons ici la technique de diagnostique ELISA employée pour ces essais, ainsi que les étapes successives des essais

Technique ELISA :

Le peptide TCSP, représenté par un peptide synthétique de séquence SEQ ID N° 1 , a été adsorbé sur des microplaques en polystyrène à une concentration de 1 μg/ml. Les sites de fixations libres ont ensuite été saturés par des protéines immunologiquement neutres (en l'occurrence l'albumine). Les microplaques ont ensuite été rincées par un tampon de lavage, puis séchées pour être prêtes à l'emploi. Les échantillons à tester ont été incubés dans les puits après dilution au 1/20 ^eme dans un tampon de dilution ; les anticorps non fixés sur la surface antigénique ont été éliminés par trois cycles de lavage. Les anticorps spécifiques du TCSP fixés sur les microplaques ont été décelés par un anticorps dirigé contre les IgG humaines et marqués par un traceur enzymatique. Un substrat chromogène de l'enzyme employé a servi à révéler la fixation de l'anti-TCSP par mesure de la densité optique correspondante à l'absorption du chromogène dans une gamme adéquate de longueurs d'ondes, et notamment à une longueur d'onde d'environ 450 nm.

1. Réaction du peptide TCSP avec les NCRA présents dans des sérums issus de patients infectés par le VIH : Les échantillons sériques de patients infectés par le VIH ont été testés pour la présence de NCRA, pour deux populations : patients africains et patients occidentaux (sources européennes et américaines).

2. Réaction du peptide TCSP avec des sérums issus de donneurs de sang « sains », i.e. négatifs pour les anticorps anti-VIH, anti-VHC, anti-VHB, Syphilis.

Pour évaluer la prévalence des anticorps contre TCSP, sur la base de l'hypothèse que ces anticorps n'ont pas été induits par une infection avec T. cruzi, des échantillons de sérum européens ont été utilisés. Ces sérums ont été obtenus par des donneurs de sang sains, comme indiqué ci-dessus ; ces donneurs sont donc dans un meilleur état de santé que la moyenne de la population dont ils sont issus.

Afin d'être parfaitement certain quant à l'origine de ces anticorps contre TCSP, tous les échantillons ont été testés dans un ordre aléatoire à l'aide de kits commercialement disponibles permettant de détecter une infection par T. cruzi ; aucun échantillon positif n'a été trouvé. En revanche, et de manière totalement inattendue, il a été trouvé qu'un pourcentage significatif de ces échantillons contenait néanmoins des anticorps contre TCSP. On en déduit que T. cruzi utilise un motif hautement immunogène qui pourrait être utilisé également par d'autres pathogènes, et/ou qui pourrait donner lieu à des anticorps auto-immuns.

3. Réaction du peptide TCSP avec les NCRA présents dans des sérums de patients : par une mise en interaction des échantillons de sérums et des surfaces solides sur lesquelles le TCSP a été préalablement adsorbé. 4. Réaction du TCSP avec les sérums de patients infectés par le parasite T. cruzi : Etant donné que l'antigène TCSP est dérivé d'une protéine du parasite T. cruzi, il est difficile, par des techniques classiques, de distinguer les anticorps induits par l'infection par T. cruzi de ceux induits par le mécanisme d'autoimmunité (NCRA). Dans un test ELISA employant le TCSP comme antigène, on a trouvé que les deux catégories d'anticorps sont confondues ; le résultat EIA n'est pas discriminant.

Les résultats sont documentés dans les Tableaux 1 et 2 ainsi que sur la figure 1. Cette figure montre pour chaque population de N patients la distribution de la réactivité 0 (exprimée en densité optique) de NCRA avec le peptide TCSP utilisé pour l'essai. Sont représenté pour chacune des populations la distribution des points individuels ; les rectangles (boîtes) représentent les intervalles semi-interquartiles (en anglais « interquartile ranges »). Les traits horizontaux pleins représentent la moyenne arithmétique de chacune des populations, et les traits horizontaux en pointillé 5 délimitent 95% de la distribution.

Tableau 1

0 Exemple 2 :

Dans une autre étude de groupe de N = 79 patients infectés par le VIH, on a constaté

(voir la figure 3) une nette relation entre l'augmentation des mesures de NCRA et l'évolution chronologique de ces patients sur une échelle de temps allant au-delà de deux ans.

Cette étude démontre que la surveillance des taux de NCRA peut permettre le pronostic de l'évolution de l'infection par le VIH et ses conséquences en terme de complications cardiaques.

2) Exemples de cas individuels (essais cliniques)

Dans des études transversales, on a mesuré le taux de NCRA chez des patients de sexe masculin infectés par le VIH, et on a pu étudier leur condition cardiaque. Le tableau 3 illustre ces résultats. A titre d'exemple, on note pour le patient PAT_001 la présence d'un titre fort en NCRA (à savoir : 8,19 ) dans un échantillon de sang prélevé antérieurement à son événement cardiaque.

Ces exemples montrent, d'une part, la relation entre les titres mesurés de NCRA et des événements cardiaques ultérieurs (voir PAT_001 , PAT_004, PAT_005), et d'autre part la possibilité qu'un événement cardiaque sub-clinique puisse induire l'apparition de NCRA à forte dose (voir PAT_009).

Tableau 3