La présente invention concerne de nouveaux agents de solubilisation de biomolecules telles que des protéines, utilisables pour solubiliser ou maintenir en solution des biomolecules au cours de processus tels que les procèdes de purification, de séparation et d'analyse des biomolecules, par exemple par des techniques d' electrophorese ou de chromatographie .

Lors de la purification ou de la séparation des protéines, on se heurte fréquemment a des problèmes de solubilisation. Ceci est dû au fait que la purification est toujours effectuée en phase liquide, alors que le matériel de départ est souvent sous forme insoluble car les protéines y sont associées entre elles ou a d'autres composes. Or, pour obtenir un bon rendement de purification, il est important d'assurer une bonne mise en solution des protéines et de les maintenir ensuite en solution maigre les variations de conditions expérimentales telles que le pH et la force ionique, qui pourraient entraîner une précipitation des protéines .

L'utilisation d'agents de solubilisation des protéines est donc nécessaire dans le cas ou les protéines sont présentes au départ sous une forme insoluble et dans les cas ou on fait varier certaines conditions expérimentales ayant un effet sur leur précipitation. Les agents de solubilisation utilises jusqu'à présent pour parvenir a ce résultat sont les détergents, les sels et l'uree, mais ils présentent tous des inconvénients.

L'utilisation dans ce but de détergents est décrite par exemple par Navarrete et al dans Biochimica

et Biophysica Acta, 728, 1983, p. 403-408. Les détergents mentionnes par ces auteurs tels que le doαecylsufate de sodium, le Triton X-100, les octylglucosides et les zwittergents sont efficaces car ils ont pour la plupart un fort pouvoir de solubilisation des protéines mais celui-ci est généralement accompagne d'un fort effet dénaturant dû a la destruction des liaisons de type hydrophobe qui conduisent a 1 ' aggregation des protéines entre elles mais sont également responsables de la conformation des protéines, nécessaire pour leurs propriétés biologiques. De plus, outre leur prix élevé, les détergents présentent l'inconvénient de former des micelles qui sont souvent d'un diamètre important, ce qui limite leur emploi dans les cas où l'on utilise des processus de dialyse, des gels et certaines colonnes de chromatographie.

Les sels peuvent être utilisés comme agents de solubilisation des protéines, lorsque l'agrégation de celles-ci est due a la formation de liaisons de type ionique entre les molécules de protéines. Toutefois, l'emploi des sels est impossible dans tous les cas où une augmentation de la conductivité de la solution est préjudiciable, par exemple dans les procédés électrophorétiques et les procédés de chromatographie par échange d'ions.

L'urée peut être également utilisée comme agent de solubilisation des protéines car elle présente un fort pouvoir chaotropique, et assure la rupture des liaisons de type hydrogène et de celles mettant en eu des dipôles. Cependant, l'urée présente deux inconvénients majeurs qui sont respectivement son effet dénaturant, et les risques de carbamylation des aminés libres des protéines par les groupes cyanates formes par la décomposition spontanée de l'urée.

Aussi, des recherches ont été poursuivies pour trouver de meilleurs agents de solubilisation de biomolecules, présentant en particulier les propriétés suivantes : - ne pas entraîner une dénaturation des biomolecules par modification de leur conformation,

- pouvoir être éliminés facilement en fin d'opération pour permettre l'obtention de biomolécules pures et leur lyophilisation, - ne pas former de micelles difficiles à éliminer,

- ne pas interférer avec la force ionique des solutions auxquelles ils sont ajoutés, et

- être faciles à fabriquer et peu coûteux. La présente invention a précisément pour objet de nouveaux agents de solubilisation de biomolécules telles que les protéines, qui présentent ces propriétés avantageuses.

Selon l'invention l'agent de solubilisation de biomolécules est constitué par un zwitterion non détergent répondant à l'une des formules suivantes : RI

R2 LX+ B - (I) ou R ^X+ B Y- (I

dans lesquelles : - X représente N ou P,

-B représente une chaîne hydrocarbonée saturée de 1 à 6 atomes de carbone comportant éventuellement dans sa chaîne un ou plusieurs atomes d'oxygène et/ou de soufre, pouvant comporter de plus un ou plusieurs substituants constitués par des groupes OH,

- R-, R2 et R^, qui peuvent être identiques ou différents, représentent des groupes hydrocarbonés, aliphatiques, linéaires ou ramifiés, cycliques ou aromatiques, ayant au plus 7 atomes de carbone, comprenant ou non un ou plusieurs groupes -0-, -S- et/ou -OH, R ¹ et R ² pouvant aussi former ensemble une chaîne hydrocarbonée saturée de 4 à 8 atomes de carbone, comportant éventuellement un ou plusieurs subεtitutants OH et/ou un ou plusieurs atomes d'oxygène et/ou de soufre,

R représente avec X un hétérocycle insaturé à un ou plusieurs noyaux contenant au plus 9 atomes de carbone et un ou plusieurs hétéroato es choisis parmi 0, S, N et P, et comportant éventuellement un ou plusieurs substituants OH, et

- Y représente SO3 ^" , OSO3 ^" ou C00~' à condition que R , R ² et R ³ ne représentent pas CH3 lorsque X représente N, B représente CH2 et Y représente C00~. Lorsque R ¹ , R ² et/ou R ³ représentent un groupe aliphatique linéaire, celui-ci a de préférence au plus 5 atomes de carbone.

Les zwitterions utilisés dans l'invention sont différents des zwitterions détergents décrits par Navarrete et al dans Biochimica et Biophysica Acta, 728, 1983, p. 403-408. En effet, contrairement aux zwitterions détergents qui comprennent des groupes alkyle ayant au moins 8 atomes de carbone, les zwitterions non détergents de l'invention n'ont pas de longues chaînes hydrophobes ; de ce fait, ils ont un très faible effet dénaturant et ils ne forment pas de micelles difficiles à supprimer. Par ailleurs, ils peuvent être facilement éliminés en fin d'opération pour donner des biomolécules pures et ils n'interfèrent

pas avec la force ionique des solutions. Enfin, ils sont faciles à synthétiser et peu coûteux.

Certains zwitterions non détergents du même type que ceux de l'invention ont été décrits dans EP-A-0494686 Cependant, dans ce cas, ils ne sont pas utilisés pour favoriser la solubilisation de biomolécules, mais jouent le rôle d'agents modificateurs de surface dans un procédé de séparation par électrophorèse dans des capillaires, en vue d'éviter les interactions entre la surface interne chargée des capillaires et les biomolécules à séparer.

Des zwitterions dérivés de méthacrylamide ont également été utilisés pour fabriquer des gels d ¹ électrophorèse portant des groupes sulfobétaïne, destinés à la séparation des protéines, comme il est décrit par Hjelmeland et al dans Electrophoresis 1981, 2, p. 82-90. Dans ce cas, d'une part, il ne s'agit pas de zwitterions du même type que ceux de l'invention, et d'autre part, ceux-ci n'ont pas pour fonction de solubiliser des biomolécules.

Selon l'invention, dans les formules I et II précitées, B peut représenter une chaîne hydrocarbonée saturée, ayant de 1 à 6 atomes de carbone, comportant éventuellement dans sa chaîne un ou plusieurs atomes d'oxygène et/ou de soufre et éventuellement un ou plusieurs substituants constitués par des groupes OH.

A titre d'exemples de telles chaînes hydrocarbonées, on peut citer les groupes répondant aux formules suivantes :

- ( CH ₂ ) _m -0- ( CH ₂ ) _n - avec 1 < m < 5 , l < n < 5 et 2 < m + n

< 6 ,

- ( CH ₂ )m-S- ( CH ₂ ) _n , ou

-(CH ₂ ) _m -CHOH-(CH ₂ ) _n -, avec m et n ayant les significations données ci-dessus.

De préférence, B représente le groupe -(CH ₂ )ι~ avec 1 étant égal à 3 ou 4. Dans les formules I et II précitées, les groupes hydrocarbonés aliphatiques, cycliques ou aromatiques utilisés pour R ¹ , R ² et R ³ peuvent être en particulier des groupes alkyle alcoxyalkyle, alkylthioalkyle, linéaires ou ramifiés de 1 à 7 atomes de carbone, des groupes cycloalkyle de 5 à 7 atomes de carbone et des groupes aryle de 5 à 7 atomes de carbone. Tous ces groupes peuvent de plus comporter un ou plusieurs substituants OH.

A titre d'exemples de tels groupes, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, propyles, butyles, hydroxyéthyle, cyclohexyle et phényle.

Selon l'invention, lorsque R ¹ et R ² forment ensemble une chaîne hydrocarbonée saturée comprenant éventuellement un ou plusieurs substituants OH et/ou un ou plusieurs atomes d'oxygène et/ou de soufre dans la chaîne, R ¹ et R ² forment avec X un hétérocycle qui peut comprendre d'autres hétéroatomes. A titre d'exemples de tels hétérocycles, on peut citer les noyaus pipéridine, pipérazine et morpholine. Dans ce cas, R ³ est de préférence un groupe alkyle, par exemple le groupe méthyle.

Dans le cas du zwitterion de formule II, où R forme avec X un hétérocycle insaturé à un ou plusieurs noyaux, il peut s'agir, par exemple du noyau pyridine, oxazole, thiazole, benzothiazole ou benzoxazole.

Les zwitterions non détergents utilisés dans l'invention peuvent être préparés par des procédés classiques, à partir des sultones, les lactones, des

ω-chloroacides ou des chloroalcools correspondants par réaction avec les aminés ou phosphines de formule :

Dans le cas où Y représente Sθ3 ^~ , on fait habituellement réagir la sultone correspondante sur l'aminé ou la phosphine, ce qui correspond à l'un des schémas suivants :

dans lesquels B, X, R, R ¹ , R ² et R ³ ont les significations données ci-dessus.

Dans le cas où Y représente C00 ^~ , on peut faire réagir un ra-chloroacide, une lactone ou l'acide acrylique sur l'aminé ou la phosphine correspondantes.

Dans le cas où Y représente OSO3-, on obtient habituellement le zwitterion en effectuant les étapes suivantes :

1. réaction d'un chloroalcool de formule C1B0H sur l'aminé ou la phosphine de formule :

2. réaction du produit obtenu dans la première étape avec l'acide chlorosulfonique HSO3CI.

Les agents de solubilisation de biomolécules de l'invention peuvent être utilisés dans différents procédés mettant en jeu des biomolécules comme les procédés de solubilisation, d'extraction et de purification de biomolécules, et les procédés de

séparation de biomolecules par des techniques d'électrophorèse ou de chromatographie, par exemple les séparations par isoélectrofocalisation, chromatofocalisation et par chromatographie par échange d'ions. Ces agents de solubilisation peuvent être utilisés seuls ou en mélange, et éventuellement en association avec d'autres agents de solubilisation connus comme les détergents faiblement dénaturants, par exemple le produit commercialisé sous la dénomination TRITON X 100 soit le (tert-octylphényl- (oligoéthylène oxyde), l'octyl glucopyranoside et le 3 [3- cholamidopropyl] diméthylamonio propane sulfonate. Les agents de solubilisation de l'invention peuvent être aussi utilisés pour la renaturation de certaines biomolécules comme les enzymes, après que celles-ci aient été dénaturées, par exemple par un agent de solubilisation fortement dénaturant

Lorsque ces agents de solubilisation sont utilisés dans des procédés de séparation ou de purification de biomolécules par électrophorèse, on peut les ajouter à la solution de biomolecules à séparer ou à purifier, et/ou au milieu de séparation. Ainsi, dans le cas des procédés d'électrophorèse sur gel, on peut les ajouter à la solution de confection et/ou à la solution de réhydratation du gel. Dans le cas des procédés d'électrophorèse en veine liquide, on peut les ajouter aux solutions conductrices.

Dans le cas où ces agents de solubilisation sont utilisés dans des procédés de séparation ou de purification par chromatographie, on peut les ajouter à la solution de biomolécules à séparer ou à purifier et/ou aux solutions de conditionnement et/ou d'élution.

Dans le cas où ces agents de solubilisation sont utilisés pour la renaturation de biomolecules

dénaturées, on peut les ajouter aux solutions utilisées dans le processus de renaturation.

Les biomolecules auxquelles s'appliquent les agents de solubilisation de l'invention peuvent être constituées par toute molécule biologique, par exemple les acides nucléiques, les glucides, les lipides, les coenzymes et en particulier les protéines.

Les protéines peuvent être constituées notamment par des enzymes, des protéines plasmatiques, des protéines nucléaires, des protéines membranaires, des anticorps et des protéines de structure.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants, donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif en référence aux figures 1 à 10 annexées.

La figure 1 est un diagramme représentant l'efficacité d'extraction en protéines microsomales obtenues dans les exemples 9 à 15. La figure 2 est un diagramme représentant les rendements de maintien en solution de protéines nucléaires dans des solutions de dialyse après extraction saline.

La figure 3 est une photographie illustrant les résultats obtenus lors de 1 ' électrophorèse sur gel à une dimension (isoélectrofocalisation) d'une protéine en présence d'un agent de solubilisation de

1 ' invention.

Les figures 4 et 5 sont des photographies illustrant les résultats obtenus lors de la séparation par électrophorèse sur gel à deux dimensions d'un mélange complexe de protéines en présence et en l'absence d'agent de solubilisation conforme à 1 ' invention.

La figure 6 est un diagramme illustrant l'activité enzymatique de la β-galactosidase en présence de divers agents de solubilisation conformes à 1' invention. La figure 7 est un diagramme illustrant l'activité enzymatique de la β-galactosidase en fonction de la concentration en composé n° 2 du milieu de dilution.

La figure 8 est un diagramme illustrant le pourcentage d'activité enzymatique récupérée en présence du composé n° 2 après dénaturation de la β -galactosidase par l'urée.

La figure 9 est une photographie illustrant les résultats d'analyse, par électrophorèse sur gel des fractions issues d'une colonne de chromatographie en présence et en l'absence du composé n° 2.

Exemple 1 : Triméthylammonio méthane carboxylate

(composé n° 1) .

Ce composé a été acheté chez Sigma, sa formule est donnée dans le tableau 1 annexé.

Exemple 2 : Préparation du pyridinium propane sulfonate (composé n° 2) .

Le produit commercial acheté chez Fluka a ensuite été purifié par passage en solution aqueuse sur des résines échangeuses d'ions mixtes.

On obtient ainsi le composé n° 2 répondant à la formule donnée dans le tableau 1 annexé. Exemples 3 à 8.

Dans ces exemples, on fait réagir 0,1 mole de propanesultone au butane sultone avec 1 mole de l'aminé appropriée dans 100 ml d'un mélange éthanol-eau (50/50 en vol) . Après 18 h de réaction à la température ambiante, on purifie le produit obtenu par triple solubilisation dans l'eau et cristallisation dans l'acétone.

On obtient ainsi les composés n° 3 à 8 répondant aux formules données dans le tableau annexé. Exemples 9 à 15 : solubilisation des protéines microsomales . Dans ces exemples, on utilise différents composés pour solubiliser des protéines microsomales.

On prépare par culture des cellules de plasmocytome sécréteur de souris P3-X63-Ag8 et on marque les protéines par incorporation d'acides aminés marqués au soufre 35. On récupère les cellules, on les lave dans une solution saline et on les lyse par lyse osmotique pendant 30min, à 0°C dans la solution suivante : acide hydroxyéthyl pipérazine éthane sulfonique (HEPES) : à lOmmol/l,

- hydroxyde de sodium (NaOH) : 5mmol/l,

- dithiothréitol (DTT) : 2mmol/l,

- chlorure de magnésium : l,5mmol/l, et fluorure de phénylméthyl sulfonyle (PMSF) : 0,5mmol/l.

On élimine les noyaux et débris cellulaires par centrifugation (1000g) pendant 5min. On récupère le surnageant, on le répartit en portions aliquotes et on prépare les microsomes par centrifugation (150000g) pendant lh. On extrait les culots de microsomes (750 à 800μg par culot) en utilisant dans chaque exemple 0,5ml d'une solution d'extraction dont la composition est donnée dans le tableau 2.

A l'exception de l'exemple 9 où l'extraction est effectuée à 20°C, on effectue dans tous les cas l'extraction pendant lh à 0°C, puis on élimine les protéines non solubilisées par centrifugation (200 000g, lh) . On récupère les liquides surnageants qui contiennent les protéines solubilisées.

Le rendement d'extraction est calculé en comparant les quantités de protéines solubilisées par les solutions des exemples 10 à 15 à celle solubilisée par la solution de l'exemple 9 pris comme référence d'extraction, car elle contient un agent de solubilisation très efficace mais fortement dénaturant, le dodécylsulfate de sodium (SDS) .

Les rendements d'extraction obtenus, exprimés en pourcentages de la quantité de protéines solubilisée dans l'exemple 9, sont présentés sur la figure 1 annexée.

Au vu de cette figure, on remarque que l'addition du composé n° 2 au Triton X 100 permet d'atteindre un rendement d'extraction pratiquement égal à celui obtenu avec le dodécylsulfate de sodium ; dans le cas de 1 'octylglucopyranoside (Octyl G) , l'addition du composé n° 2 permet d'augmenter de façon importante le rendement d'extraction mais les résultats restent inférieurs à ceux que l'on obtient avec le dodécylsulfate de sodium.

Dans le cas du composé n° 3, on obtient également un effet de synergie avec l 'octylglucopyranoside, mais il n'en est pas de même avec le triton X100. On peut donc obtenir avec les composés de l'invention des rendements d'extraction de protéines équivalents à ceux que l'on obtient avec un agent de solubilisation des protéines très efficace mais fortement dénaturant tel que le dodécylsulfate de sodium.

Exemples 16 à 18 : maintien en solution de protéines nucléaires après extraction saline.

Dans ces exemples, on utilise différents agents de solubilisation pour maintenir des protéines nucléaires en solution.

Des cellules de lymphome urin BASC 6-C2 sont mises en culture et leurs protéines sont marquées comme précédemment par incorporation d'acides aminés au soufre ³⁵ S. Après lavage dans une solution saline, les cellules sont lysées (20min, 0°C) par 20 volumes de la solution ayant la composition suivante :

- HEPES : lOmmol/1,

- NaOH : 5mmol/l,

- DTT : 2mmol/l, - spermidine : 0,75mmol/l,

- spermine : 0,15mmol/l,

- acide éthylène diamine tétracétique (EDTA) : lmmol/1,

- triton X100 : l,25ml/l,

- PMSF : 0,5mmol/l, et - saccharose : 116g/l.

Les noyaux sont collectés par centrifugation à basse vitesse (1000g, 5min) et lavés par remise en suspension dans la solution ayant la composition donnée ci-dessus et recentrifugation. On répète cette opération deux fois. On extrait ensuite les protéines nucléaires pendant lh à 0°C par la solution suivante :

- HEPES : lOmmol/1,

- NaOH : 5mmol/l, - DTT : 2mmol/l,

- EDTA : lmmol/1,

- KC1 : 0,8mol/l, et

- PMSF : 0,5mmol/l.

On élimine les acides nucléiques et les protéines non solubilisées après extraction, par centrifugation (200 000g, lh) . On dialyse ensuite les protéines solubilisées contre les solutions ayant les compositions données dans le tableau 3, en utilisant dans chaque cas un volume de solution égal à 100 fois le volume de l'extrait de protéines solubilisées.

On détermine le rendement de maintien en solution des protéines en comparant la quantité de protéines en solution obtenue après dialyse à celle obtenue avant dialyse. Les résultats obtenus, exprimés en % de la quantité de protéines solubilisées avant dialyse, sont donnés sur la figure 2 annexée.

Au vu de cette figure, on remarque que le rendement de maintien en solution des protéines est beaucoup plus important lorsque la solution de dialyse contient le composé n° 2 ou le composé n° 3 (exemples

17 et 18) .

Exemples 19 à 21 : maintien en solution de protéines nucléaires après extraction saline. Dans ces exemples, on suit le même mode opératoire que dans les exemples 16 à 18, mais on utilise pour l'extraction des protéines nucléaires une solution ayant la composition suivante :

- HEPES : lOmmol/1, - NaOH : 5mmol/l,

- DTT : 2mmol/l,

- EDTA : lmmol/1,

- KC1 : 0,8mol/l,

- PMSF : 0,5mmol/l, et - 3 [3-cholamidopropyl]diméthylammonio propane sulfonate (CHAPS) : 5g/l.

Après élimination des protéines et des acides nucléiques non solubilisés, par centrifugation dans les mêmes conditions que celles décrites dans les exemples 16 à 18, on dialyse les protéines solubilisées contre les solutions ayant les compositions données dans le tableau 3 en utilisant dans chaque cas un volume de solution correspondant à 100 fois le volume d'extrait. Les résultats obtenus, exprimés comme dans le cas des exemples 16 à 18 en % de la quantité de

protéines solubilisées avant dialyse, sont donnés sur la figure 2.

Au vu de cette figure, on remarque que l'addition du composé n° 2 ou du composé n° 3 à la solution de dialyse permet d'augmenter fortement le rendement de maintien en solution des protéines.

Exemple 22 : Séparation d'une protéine par isoélectrofocalisation sur gel.

Dans les séparations par isoélectrofocalisation, les protéines sont amenées à leur point isoélectrique par l'action d'un champ électrique sur un gradient de pH.

L' isoélectrofocalisation présente un redoutable problème de solubilité car les protéines sont amenées à leur point isoélectrique où leur solubilité est minimale, en l'absence de sels, ce qui contribue encore à augmenter la précipitation. Habituellement, on réalise 1 ' isoélectrofocalisation en présence de 8mol/l d'urée (condition fortement dénaturante) . Dans cet exemple, on utilise à la place d'urée un agent de solubilisation de protéines conforme à l'invention constitué par le composé n° 2.

On réalise la séparation isoélectrophorétique sur gradient de pH en utilisant des gels immobilisés (Immobilines II de Pharmacia

Uppsala Suède) et préparés au laboratoire suivant les recommandations du fournisseur.

Les gels sont lavés, séchés en présence de

1,5% de glycérol, et coupés en bandes de 4mm de large. Ils sont ensuite réhydratés dans de l'eau distillée avec ou non 1 mol/1 du composé n° 2 de l'exemple 2.

L'échantillon de protéine à séparer qui, dans ce cas, est constitué par une protéine fragment de

110 kDa de la fibronectine, est chargé à la surface du gel et la focalisation est effectuée avec un champ de

3V/cm pendant 3h, lOV/cm pendant 3h, lOOV/c pendant 18h et 200V/cm pendant lh.

Dans cet exemple, on utilise un gel à une dimension que l'on colore au bleu de Coomassie comme il est décrit par Neuhoff et al dans Electrophoresis, 1988, 9, p. 255-262.

Pour effectuer la coloration au bleu de

Coomassie, on réalise une fixation pendant lh dans

H3PO4 à 2%, éthanol 40%, suivie de trois rinçages de 20min dans H3PO4 à 2%, d'une incubation pendant lh dans

(NH-j) S04 à 15% et on ajoute le bleu de Coomassie G 250 en poudre dans ce bain.

Sur la figure 3, on a représenté les pistes de migration de la protéine fragment de HOkDa de la fibronectine en l'absence et en présence du composé n° 2 dans un gradient linéaire allant d'un pH de 7 à un pH de 4. Sur la piste du haut qui correspond à la migration de la protéine en l'absence du composé n° 2, on observe une précipitation de la protéine avant qu'elle n'atteigne son point isoélectrique, ce qui se traduit par une trainée. En revanche, sur la piste du bas qui correspond à la migration de la protéine en présence de 1 mol/1 du composé n° 2, on voit que la protéine migre jusqu'à son point isoélectrique et on observe la séparation des isoformes en bandes nettes, ce qui montre que la protéine reste soluble dans ces conditions. Exemple 23 : Séparation de protéines plasmatiques .

On suit le même mode opératoire que dans l'exemple 22 pour séparer des protéines plasmatiques par isoélectrofocalisation, soit sur un gradient linéaire de pH 3,5 à pH 5, en ajoutant ou non à la solution de réhydratation des gels 1 mol/1 du composé n° 2.

Dans tous les cas, on utilise des gels à deux dimensions, et la migration est suivie par une incubation des bandes pendant 10mm dans une solution ayant la composition suivante : - urée : 6 mol/1,

- glycérol : 30%,

- Bis-tris : 0,2mol/l,

- HC1 : 0, lmol/1,

- dodécyl sulfate de sodium : 2%, et - dithiothréitol : 1%, puis pendant 10min dans une solution à 6mol/l d'urée, 30% de glycérol, 0,2mol/l de Bis-tris, 0,lmol/l de HC1, 2% de dodécylsulfate de sodium et 4% d' iodoacétamide.

Le transfert sur gel de polyacrylamide est réalisé ensuite par scellement du gel d' isoélectrofocalisation avec de l'agarose 1% dans une solution à 0,2mol/l de Bis-tris, 0,lmol/l de HCl, 0,2% de dodécylsulfate de sodium et 0,002% de bleu de bromophénol. Les protéines sont séparées par électrophorèse (40 mA par gel de 160 mm X 200 mm X 1,5 mm) puis colorées au bleu de Coomassie comme dans l'exemple 22.

Les figures 4 et 5 illustrent les résultats obtenus lors de la migration de pH5 à pH3,5, en l'absence de composé n° 2 (figure 4) et en présence de composé n° 2 (figure 5) .

Sur la figure 5, on voit que la migration de pH 5 à pH 3,5 conduit à l'apparition de spots bien définis, alors qu'en l'absence du composé n° 2, (figure 4) la focalisation en première dimension est faible, on n'observe que très peu de spots et un grand nombre de traînées.

Ainsi, en présence du composé n° 2, il y a une réduction du nombre de traînées, ceci prouve que

les protéines insolubles sont rendues solubles par le composé n° 2.

Exemple 24 : Conservation de l'activité enzymatique de la β-galactosidase. Dans cet exemple, on vérifie que les agents de solubilisation de l'invention n'ont pas d'effet dénaturant sur la β-galactosidase puisque celle-ci conserve son activité enzymatique lorsqu'elle est en présence des agents de solubilisation de l'invention. Dans ce but, on utilise une suspension commerciale (760 unités par ml) de β-galactosidase que l'on dilue 250 fois dans un tampon : HEPES-NaOH (pH 7,8) 50mmol/l, NaCl 200mmol/l, DTT lmmol/1, Mg Cl ₂ lmmol/1 contenant lmol/1 du composé n° 1 de l'exemple 1 comme agent de solubilisation. On laisse incuber la solution pendant 15h à 8°C, on la dilue ensuite 25 fois, puis on mesure son activité enzymatique, à 37°C, par détection de l'hydrolyse de 1'o-nitrophényl β-D- galactopyranoside (ONPG) (2mmol/l) , qui se traduit par une augmentation de la densité optique à 405nm.

A titre comparatif, on effectue les mêmes mesures 1) en utilisant un tampon ne contenant pas l'agent de solubilisation de l'invention (témoin l)et 2) en déterminant l'activité enzymatique d'une suspension commerciale de β-galactosidase diluée directement sans incubation (témoin 2) .

Les résultats obtenus, soit l'activité enzymatique exprimée en U/mg d'enzyme sont donnés sur la figure 6. Sur cette figure, on remarque que l'addition du composé n° 1 (exemple 24) ne diminue que très faiblement l'activité enzymatique de la bêta- galactosidase puisqu'elle est proche de celle du témoin n° 1 sans additif et du témoin n° 2, sans incubation. Exemples 25 à 27 : Conservation de l'activité enzymatique de la β-galactosidase.

Dans ces exemples, on suit le même mode opératoire que dans l'exemple 24 pour étudier l'activité enzymatique de la β-galactosidase, mais en utilisant comme agent de solubilisation lmol/1 du composé n° 5 (exemple 25) , lmol/1 du composé n° 2

(exemple 26), et lmol/1 du composé n° 4 (exemple 27) .

Les résultats obtenus sont donnés également sur la figure 6.

Sur cette figure, on remarque que les composés n° 2 et 5 (exemples 26 et 25) n'ont pas d'effet dénaturant mais ont au contraire un effet bénéfique sur l'activité enzymatique de la β- galactosidase.

Exemple 28 : Effets des concentrations en composé n° 2 sur l'activité de la β-galactosidase.

Dans cet exemple, on étudie l'effet de concentration croissantes du composé n° 2 sur l'activité de la β-galactosidase.

Pour cette étude, on dilue une suspension commerciale de β-galactosidase (760 unités/ml) 250 fois dans un tampon : HEPES-NaOH (ph 7,8) 50 mmol/1, NaCl

200 mmol/1, DTT 1 mmol/1, MgCl ₂ 1 mmol/1. On incube chaque solution pendant 15 h à 8°C.

On dilue ensuite les solutions 25 fois, puis on détermine l'activité enzymatique de la β- galactosidase comme dans l'exemple 24, en présence des concentrations du composé n° 2 allant de 0 à lmol/1.

Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 7 qui illustre l'activité de la β- galactosidase (en μmol de substrat hydrolyse (ONPG) par mg d'enzyme) en fonction de la concentration en composé n° 2 (en mol/1) du milieu de détermination de l'activité enzymatique.

Ces résultats montrent le peu d'influence de fortes concentrations du compose n° 2 sur l'activité de l'enzyme. Exemple 29 : Effets des concentrations en compose n° 2 sur l'activité de la phosphatase alcaline.

Dans cet exemple, on étudie l'effet de concentrations croissantes du composé n° 2 sur l'activité de la phosphatase alcaline.

Pour cette étude, on dilue une suspension commerciale de phosphatase alcaline 250 fois dans un tampon tris-HCl (pH 8,8) 50mmol/l, NaCl 200mmol/l, ZnCl ₂ 0,lmmol/l, MgCl ₂ 0,5mmol/l contenant 0, 0,2 ou lmol/1 du composé n° 2. On incube ces solutions pendant 15h à 8°C, puis on les dilue et on mesure leur activité à 37°C, en présence de concentrations croissantes en composé n° 2, par détection de l'hydrolyse du phosphate de p-nitrophényle (PNP) à l,3mmol/l, qui se traduit par une augmentation de la densité optique à 405nm.

Les résultats obtenus montrent là encore le peu d'influence du composé n° 2 sur l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline en fonction de la concentration (en mol/1) en composé n° 2 du milieu de mesure. Exemple 30 : Renaturation de la β-galatosidase . Dans cet exemple, on étudie la possibilité de renaturer la β-galactosidase après qu'elle ait été dénaturée par un agent de solubilisation des protéines fortement dénaturant constitué par de l'urée.

On dilue 250 fois une suspension commerciale de β-galactosidase dans une solution contenant 8mol/l d'urée, 50mmol/l de dithiothréitol, lmmol/1 de MgCl ₂ et 50mmol/l de tris- hydroxyméthylam ométhane-HCl (pH 7,8) . On laisse la solution pendant 30mm à 20°C, puis on la dialyse pendant 18h contre une solution a lmmol/1 de MgCl ₂ et

50mmol/l de tris-hydroxyméthylaminométhane-HCl (pH 7,8) en présence de lmol/1 de composé n° 2 ou en l'absence de ce composé.

On détermine ensuite l'activité enzymatique comme dans l'exemple 24.

Les résultats obtenus (exprimés en pourcentage de l'activité de l'enzyme diluée dans le même tampon de dialyse sans adjonction d'urée (témoin 1 et témoin 2) , sont donnés sur la figure 8. Sur cette figure on a représenté également l'activité obtenue après dialyse lorsqu'on réalise la dilution avant dialyse avec la même solution sans urée, puis la dialyse avec la solution de MgCl et de trishydroxyméthyl amino méthane-HCl sans composé n° 2 (témoin 1) et avec lmol/1 du composé n° 2 (témoin 2) .

Sur cette figure, on remarque que 5,4% de l'activité enzymatique sont récupérés en l'absence du composé n° 2 et que 11,8% de l'activité enzymatique sont récupérés en présence de lmol/1 du composé n° 2. Exemple 31 : Séparation par chromatographie échangeuse d'ions de protéines.

Dans cet exemple, on réalise une chromatographie échangeuse d'ions sur une colonne MonoQHR5/5 (Pharmacia Uppsala, Suède) . Le tampon de départ (tampon A) contient 20mmol/l de HEPES-NaOH (pH 7,4), lmmol/1 d'éthylène diamine tétracétate. Le tampon limite (tampon B) comprend 20mmol/l de HEPES-NaOH (pH 7,4) , lmmol/1 d'éthylène diamine tétracétate et lmol/1 de NaCl. Le débit de tampon est de lml/min. On équilibre la colonne avec 10ml du tampon A, puis on charge 0,5ml d'un échantillon produit par digestion de fibronectine (0,5mg/ml) par la thermolysine comme il est décrit par Sekiguchi et al dans Journal of Biological Chemistry, vol 260, n° 8, 1985, p. 5105-

5114. On effectue l'élution, soit par gradient complexe de 0 à 100% du tampon B dans A en 20mm, soit par gradient complexe de 0 à 100% de tampon B dans le tampon A en 20 min, les deux tampons contenant de plus chacun lmol/1 du composé n° 2.

On contrôle les fractions issues de la colonne par analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium.

La figure 9 illustre les résultats obtenus lors de cette analyse. La partie gauche de cette figure se réfère aux fractions obtenues en l'absence de composé n° 2, alors que la partie droite se réfère aux fractions obtenues en présence de composé n° 2.

Sur cette figure, on voit que les fractions sont identiques, ce qui confirme l'absence de perturbations en présence du composé n° 2.

TABLEAU 1

TABLEAU 2

SOLUTION D'EXTRACTION

EX HEPES NaOH DTT PMSF SDS Triton Octyl Composé n° 2 Composé n° 3 X-100 G

9 10 mmol/l 5 mmol/l 2 mmol/l 0,5 mmol/l «0 g/1 - - - -

10 10 mmol/l 5 mmol/l 2 mmol/l 0,5 mmol/l - 5 ml l - - -

11 10 mmol/l 5 mmol/l 2 mmol/l 0,5 mmol/l - ^* 5 ml/1 - 200 g/1 -

12 10 mmol/l 5 mmol/l 2 mmol/l 0,5 mmol/l - 5 ml/1 - - 210 g/1

13 10 mmol/l 5 mmol/l 2 mmol/l 0,5 mmol/l - - 10 g/1 - -

14 10 mmol/l 5 mmol/l 2 mmol/l 0,5 mmol/l - - 10 g/1 200 g l -

15 10 mmol/l 5 mmol/l 2 mmol/l 0,5 mmol/l - - 10 g/1 - 210 g/1

HEPES = acide hydroxyéthyl pipérazine éthane sulfonique DTT = dithiothréitol PMSF = fluorure de phénylméthyl sulfonyle SDS = dodécylsulfate de sodium

Triton X- 100 = tert-octylphényl-(oligo éthylène oxyde) Octyle = octyl glucopyranoside

TABLEAU 3

SOLUTION DE DIALYSE

EX HEPES NaOH DTT EDTA KCI PMSF Composé Composé n° 3 CHAPS n° 2

16 10 mmol/l 5 mmol/l 2 mmol/l 1 mmol/l 25 mmol/l 0,5 mmol/l - - -

17 10 mmol/l 5 mmol/l 2 mmol/l 1 mmol/l 25 mmol/l 0,5 mmol/l 200 g/1 - -

18 10 mmol l 5 mmol/l 2 mmol/l 1 mmol/l 25 mmol/l 0,5 mmol/l - 210 g 1 -

19 10 mmol/l 5 mmol/l 2 mmol/l 1 mmol/l 25 mmol/l 0,5 mmol/l - - 5 g/1

20 10 mmol/l 5 mmol/l 2 mmol/l 1 mmol/l 25 mmol/l -0,5 mmol/l 200 g/1 - 5 g l

(V)

21 10 mmol/l 5 mmol/l 2 mmol/l 1 mmol/l 25 mmol/l 0,5 mmol/l - 210 g 1 5 g 1 (-n

HEPES = acide hydroxyéthyl pipérazine éthane sulfonique DTT = dithiothréitol EDTA = acide éthylène diamine tétracétique PMSF = fluorure de phénylméthyl sulfonyle CHAPS = 3(3cholamidopropyl) diméthyl ammonio propane sulfonate