Bioreaktor, Anordnung aus Bioreaktoren, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Die Erfindung betrifft einen Bioreaktor für die Kultivierung von Zellen, insbesondere für ihre Langzeitkultivierung, eine Anordnung aus derartigen Bioreaktoren, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung .

Gängige Bioreaktoren sind aus mehreren Teilen zusammengesetzt, wobei die Zellkultursubstrate nicht mit dem Bioreaktor verbunden sind, sondern getrennt eingesetzt werden. Darüber hinaus bestehen diese Teile üblicherweise aus verschiedenen Materialien, die zumeist getrennte Herstellungsverfahren erfordern.

Aus der DE 41 32 379 C2 ist ein Substrat für Zellkulturen bekannt, das aus einem plattenförmigen Körper besteht, der mit einer Vielzahl von durch Stege voneinander getrennten Mikrocontainern zur Aufnahme von Zellen oder Zellaggregaten versehen ist.

Die DE 10 2004 035 267 B3 offenbart einen Formkörper aus einer Folie, in die mindestens eine Hohlstruktur und eine Vielzahl von Poren eingebracht sind, sowie dessen Verwendung zur Kultivierung von Zellen und als Bioreaktor.

Die 20 2006 012 978 Ul beschreibt einen Bioreaktor, der aus einer Basisplatte besteht, die eine Aussparung zur Aufnahme einer Poren aufweisenden Trägerstruktur für Zellkulturen, eine obere und eine untere transparente Deckelfolie sowie Kanäle zur Versorgung der sich auf der Trägerstruktur befindlichen Zellkulturen aufweist .

Insbesondere im Nahrungsmittelbereich, werden thermogeformte Klappschachteln auf vielfältige Art und Weise eingesetzt. Dabei sind zwei Halbschalen, so genannte Trays, eine Unter- und eine Oberschale oder eine Unterschale und ein zugehöriger Deckel über ein Foliengelenk

miteinander verbunden. Typischerweise werden diese Teile in dieselbe

Folie geformt. Beim Foliengelenk wird durch eine geeignete Formgebung ähnlich einer Sicke die definierte Biegung bzw. Knickung entlang einer geraden Linie in der anfänglichen Folienebene angestrebt. Die wiederverschließbare Verbindung der zusammengeklappten Teile wird z.B. dadurch verwirklicht, dass ein umlaufender Steg in der einen Schale in einer dann umlaufenden Nut bzw. Sicke in der anderen klemmt oder dass in einer Unterschale ein in die gleiche Richtung, jedoch flacher ausgeformter Deckel klemmt. Schräge Seitenwände dienen hierbei der Zentrierung als auch der (Selbst-) Hinderung gegen selbsttätiges Wiederöffnen.

Ausgehend hiervon ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Bioreaktor vorzuschlagen, der einfach herstellbar und einfach handhabbar ist. Insbesondere soll sich ein solcher Bioreaktor auch als Einmalteil eignen und daher nach Gebrauch nicht gereinigt und sterilisiert werden müssen.

Diese Aufgabe wird im Hinblick auf den Biorektor durch die Merkmale des Anspruchs 1, im Hinblick auf eine Anordnung aus Bioreaktoren durch das Merkmal des Anspruchs 16, im Hinblick auf Verfahren zu ihrer Herstellung durch die Merkmale des Anspruchs 17 und im Hinblick auf deren Verwendung durch den Anspruch 20 gelöst. Die Unteransprüche beschreiben jeweils vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.

Ein erfindungsgemäßer Bioreaktor in Form einer Klappschachtel besteht aus einem Gehäuse aus einer unteren Gehäusehälfte und einer oberen Gehäusehälfte, die mittels eines Foliengelenks an jeweils einer Seite miteinander verbunden sind, und mindestens einem Trägerelement für mindestens ein Zellkultursubstrat, wobei an mindestens einer der beiden Gehäusehälften Mittel zum Austausch von Fluiden vorgesehen sind.

In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das mindestens eine Trägerelement derart zwischen die untere Gehäusehälfte und die obere Gehäu-

sehälfte eingefügt, dass es im zusammengeklappten Zustand zwischen den beiden Gehäuseteilen liegt.

In einer alternativen Ausgestaltung ist das mindestens eine Trägerelement derart in die untere Gehäusehälfte oder in die obere Gehäusehälfte eingefügt, dass es selbst Bestandteil der betreffenden Gehäusehälfte ist oder fest mit ihr verbunden ist.

In einer besonderen Ausgestaltung umfasst der Bioreaktor zwei Trägerelemente, von denen ein Trägerelement Bestandteil einer der beiden Gehäusehälfte ist, während das andere Trägerelement zwischen den beiden Gehäusehälften eingefügt ist. Diese Ausgestaltung ermöglicht z.B. die Kultivierung von Co-Kulturen.

Vorzugsweise sind die untere Gehäusehälfte und die obere Gehäuse- hälfte fluiddicht, d.h. flüssigkeits- oder gasdicht, zueinander angeordnet. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist hierbei das mindestens eine Trägerelement fluiddicht zu einer der beiden Gehäusehälften oder zwischen beiden Gehäusehälften angeordnet. Hierzu besitzt das mindestens eine Trägerelement z.B. eine zur betreffenden Gehäusehälfte und ggf. zu weiteren Trägerelementen umlaufende Dichtstruktur. Alternativ wird die Funktion des Verbindens der Teile und des Abdichtens der Teile gegeneinander durch getrennte Funktionselemente verwirklicht.

In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung sind die beiden Gehäusehälften und das mindestens eine Trägerelement vor dem Zusammenklappen in einer Reihe oder über Eck angeordnet. Mit der Anzahl der Trägerelemente nimmt jedoch die Anzahl der Dichtungsschnittstellen zu, wodurch diese praktisch auf einige wenige beschränkt ist.

In einer bevorzugten Ausgestaltung ist der erfindungsgemäße Bioreaktor wie eine Flusszelle aufgebaut. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist hierzu zumindest eine der beiden Gehäusehälften mit einem, zwei oder ggf. mehreren fluidischen Anschlüssen versehen, die die fluidische Versorgung der in dem mindestens einen Zellkultursub-

strat verankerten (adhärenten) Zellen mit gelösten Nährstoffen und

Gasen und die fluidische Entsorgung der Stoffwechselprodukte der Zellen in Form einer Perfusion, einer ein- oder beidseitigen Superfusion oder einer Mischform hiervon über ein Kulturmedium ermöglichen. Dadurch lassen sich auch physikalische bzw. chemische Gradienten im Bioreaktor über das Zellkultursubstrat einstellen. Die fluidischen Anschlüsse befinden sich nur oben bzw. unten oder lateral, vorzugsweise nicht lateral im Bereich von fluiddichten Verbindungen.

In einer alternativen Ausgestaltung ist mindestens eine der beiden Gehäusehälften mit einer permeablen oder semipermeablen Membran oder einem porösen Bereich versehen, die jeweils zum Austausch von Fluiden durch Perfusion oder Osmose dienen.

Kernstück des erfindungsgemäßen Bioreaktors ist das mindestens eine Zellkultursubstrat, das sich vorzugsweise für eine dreidimensionale Kultivierung von Zellen in Form einer Anordnung aus Mikrocontainern, wie z.B. aus der DE 41 32 379 C2 oder der DE 10 2004 03 5267 B3 , eignet. Alternativ ist das mindestens eine Zellkultursubstrat für eine zweidimensionale Kultur in Form eines planaren Substrats geeignet.

In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das mindestens eine Zellkultursubstrat für einen verbesserten passiven oder aktiven Stofftransport perforiert. Grundsätzlich denkbar sind auch mikro- oder na- nostrukturierte Substrate. Das Zellkultursubstrat kann implizit (statistisch) oder explizit (regulär) mikro- oder nanostrukturiert sein.

Für den erfindungsgemäßen Bioreaktor besteht bezüglich seiner Gestaltung eine große Anzahl an Möglichkeiten im Hinblick auf die Auswahl des Folienmaterials, dessen Form und Größe, die Anzahl der jeweils mit einem oder mehreren Zellkultursubstraten bestückten Trägerelemente, die Anordnung der oberen Gehäusehälfte, der unteren Gehäusehälfte und des Trägerelements oder der Trägerelemente, die Ausführung der Foliengelenke, der Mittel zum Austausch von Fluiden sowie Größe, Anzahl und Form der Zellkultursubstrate.

Das warmumformbare thermoplastische oder thermoelastische Folienmaterial für den Bioreaktor wird insbesondere nach den Gesichtspunkten Biokompatibilität, physikochemischer Beständigkeit, Transparenz und niedriger Eigenfluoreszenz ausgewählt.

Bevorzugt besteht der Bioreaktor aus Polymethylmethacrylat (PMMA) , Polycarbonat (PC) , Polyethylenterephthalat (PET) , Polystyrol (PS) , Polyimid (PI) , Polyethylen (PE) , Polypropylen (PP) , Polyvinylfluorid (PVF) , Polyvinylidenfluorid (PVDF) , Polyvinylchlorid (PVC) , Polyviny- lidenchlorid (PVDF) , Polyetherimid (PEI) , Polyetheretherketon (PEEK) , Polysulfon (PSU) , Polyurethan (PU) , Cycloolefincopolymer (COC) oder Cycloolefinpolymer (COP) .

Alternativ besteht der Bioreaktor aus Polymilchsäure (PLA) , aus Po- Iy (ε-Caprolacton) , aus einem Polyhydroxyalkanoat (PHA) oder einem anderen biologisch abbaubaren Polymer.

Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin eine Anordnung aus zusammenhängenden Einheiten von zwei oder mehreren bis hin zu einer Vielzahl von Bioreaktoren, die zu einem Stück zusammengefügt sind.

Ein erfindungsgemäßer Bioreaktor wird, bevorzugt einschließlich des Zellkultursubstrats, in Form einer Klappschachtel spritzgegossen oder als ein einziges Teil aus einem einzigen Stück Folienmaterial warmumgeformt, insbesondere thermogeformt , wobei die Gelenke und die flüssigkeitsdichten Verschlüsse mitangeformt werden.

Je nach Art und Dicke des Folienmaterials bzw. des Folienhalbzeugs für den Bioreaktor und der Ausformung des mindestens einen Trägerelements wird in einer bevorzugten Ausgestaltung das mindestens eine Zellkultursubstrat in dasselbe Halbzeug und im gleichen Formvorgang wie dem für die untere Gehäusehälfte und die obere Gehäusehälfte direkt in das über ein Foliengelenk mit diesen verbundene Trägerelement eingeformt .

In einer alternativen Ausgestaltung wird das mindestens eine Zellkultursubstrat in ein separates Halbzeug eingeformt und dieses dann zwischen die untere Gehäusehälfte und die obere Gehäusehälfte eingesetzt. Dabei bildet das mindestens eine Zellkultursubstrat mit den beiden Gehäusehälften eine flüssigkeitsdichte Verbindung.

In einer weiteren Ausgestaltung wird das gelenkig mittels eines weiteren Foliengelenks mit der unteren Gehäusehälfte, der oberen Gehäusehälfte oder ggf. einem weiteren Trägerelement verbundene Trägerelement als Rahmen ausgebildet, in den dann mindestens ein ZeIl- kultursubstrat eingesetzt wird.

Ist das Trägerelement mit der unteren Gehäusehälfte oder der oberen Gehäusehälfte gelenkig verbunden, lässt sich dieses zur Weiterverarbeitung durch Schneiden oder Stanzen der Folie bzw. durch Reißen der Folie entlang einer Perforationslinie vom verbleibenden Bioreaktor abtrennen.

Der hier vorliegende Warmumformprozess umfasst auch das in der Regel abschließende so genannte Trimmen, d. h. das Heraustrennen des geformten Teils durch Stanzen, Laserschneiden, Wasserstrahlschneiden o.a. aus dem verbleibenden Folienmaterial.

In einer besonderen Ausgestaltung lassen sich sowohl Außen- als auch Innenkonturen auf diese Art trenntechnisch erzeugen. über angeformte und freigestanzte oder an ausgestanzten öffnungen angeschraubte fluidische Anschlüsse in den beiden Gehäusehälften kann, ähnlich wie in der DE 20 2006 012 978 Ul, eine Per- oder Superfusion des Zellkultursubstrats mit Kulturmediums oder eine Kombination der beiden Modi erfolgen.

Der erfindungsgemäße Bioreaktor und die erfindungsgemäße Anordnung sind aus wenigen Teilen, insbesondere aus einem einzigen Teil aufgebaut. Durch diesen einfachen Aufbau aus, wie für thermogeformte, ver-

gleichsweise dünnwandige Produkte typisch, relativ kleinen Mengen, vorzugsweise aus nur einem einzigen Material sind der erfindungsgemä- ße Bioreaktor und die erfindungsgemäße Anordnung aus ökologischer und ökonomischer Sicht als Einwegteil geeignet.

Der erfindungsgemäße Bioreaktor und die erfindungsgemäße Anordnung ermöglichen eine sterile Kultivierung von Zellen oder dienen als Implantat in den menschlichen bzw. tierischen Körper.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen und den Figuren näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 Perspektivische Darstellung eines Bioreaktors mit einem einzigen Trägerelement in (a) ausgeklappter Form, (b) teilweise zugeklappter Form und (c) vollständig zugeklappter Form.

Fig. 2 Perspektivische Darstellung eines Bioreaktors mit drei Trägerelementen in ausgeklappter Form.

Fig. 1 zeigt in perspektivischer Darstellung einen erfindungsgemäßen Bioreaktor aus einer unteren Gehäusehälfte 1 und einer oberen Gehäusehälfte 2, die mittels eines Foliengelenks 5 jeweils an einer Seite miteinander verbunden sind, und einem Trägerelement 3, in das ein Zellkultursubstrat 4 eingefügt ist. Die gebogenen Pfeile geben die Richtung des Klappens und Dichtens an. Der gestrichelt gebogene Pfeil gibt eine alternative Weise für das Klappen an, nach der der Bioreaktor noch auf dem Kopf steht, was ein zusätzliches Umdrehen erfordert.

Das über ein weiteres Foliengelenk 5' mit der der oberen Gehäuse- hälfte 2 verbundene Trägerelement weist eine sowohl zur unteren Gehäusehälfte 1 als auch zur oberen Gehäusehälfte 2 passende, umlaufende Dichtstruktur 6 auf.

Die untere Gehäusehälfte 1 ist mit zwei fluidischen Anschlüssen 7, 7'' (wobei der Anschluss 7'' aufgrund der Perspektive nicht sichtbar ist) und die obere Gehäusehälfte 2 mit zwei fluidischen Anschlüssen

T ₁ η ^{> • •} versehen. Die geraden Pfeile geben die Richtung des Durch- strömens im Superfusions- , im Perfusions- oder im gemischten Modus an.

Fig. 2 zeigt in perspektivischer Darstellung einen erfindungsgemäßen Bioreaktors mit drei Trägerelementen 3, 3', 3'' und vier Foliengelenken 5, 5', 5'', 5' ' ' . Die Anordnung der Gehäusehälften 1, 2 und der Trägerelemente 3, 3', 3'' wurde so gewählt, dass sich das Werkzeug möglichst einfach ausführen ließ. Die Reihenfolge des Zusammenklappens des Bioreaktors ist durch die gebogenen Pfeile a, b, c, d angegeben.