Biorreactor y procedimiento de producción de cultivos celulares adherentes que emplea el biorreactor.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un biorreactor (también denominado termentador), de especial aplicación en procesos bioquímicos en los que se emplean sistemas microbianos o celulares para la producción de productos biológicos. También se refiere a un procedimiento de producción de cultivos celulares adherentes, en especial para la formación de tejidos y carne cultivada, que emplea dicho biorreactor. Antecedentes de la invención

Los biorreactores tienen múltiples aplicaciones, como las industrias de la alimentación y fermentación, el tratamiento de residuos y muchas instalaciones biomédicas.

Un termentador es un tanque dentro del cual se llevan a cabo reacciones orgánicas, proporcionando un ambiente adecuado para varios microorganismos bajo las condiciones requeridas. Debe permitir controlar la temperatura por calor o frío, controlar el pH, rangos de aireación, contenido de nutrientes, etc.

Los biorreactores comunes son en general recipientes o sistemas que mantienen un ambiente biológicamente activo. En algunos casos, un biorreactor es un recipiente en el que se lleva a cabo un proceso químico que involucra organismos o sustancias bioquímicamente activas derivadas de dichos organismos. Este proceso puede ser aeróbico o anaeróbico. Estos biorreactores son comúnmente cilindricos, variando en tamaño desde algunos mililitros hasta metros cúbicos, y son usualmente fabricados en acero inoxidable.

Un biorreactor puede ser también un dispositivo o sistema empleado para hacer crecer células o tejidos en operaciones de cultivo celular. Estos dispositivos se encuentran en desarrollo para su uso en ingeniería de tejidos. En términos generales, un biorreactor busca mantener ciertas condiciones ambientales propicias (pH, temperatura, concentración de oxígeno, etcétera) para el organismo o sustancia química que se cultiva.

Los termentadores industriales a gran escala se construyen con acero inoxidable. Un termentador de este tipo es un cilindro cerrado por arriba y por abajo, en el que se han adaptado varios tubos y válvulas. También se utilizan otros materiales, y existe una tendencia a utilizar plásticos de un solo uso; sin embargo, los altos costes en consumibles sólo se justifican si el producto obtenido tiene un alto valor en el mercado (por ejemplo: anticuerpos, vacunas, proteínas terapéuticas, etc. obtenidas mediante el cultivo de células de mamíferos e insectos).

Para un buen diseño de termentador se debe cumplir con dos requisitos fundamentales: mantener un medio homogéneo sin zonas muertas y a la vez transferir oxígeno al medio empleando el mínimo de energía posible.

En el diseño de un termentador se deben considerar los siguientes aspectos: mezclado y patrones de flujo

configuración geométrica y tipo de reactor

transferencia de oxígeno a lo largo de todo el tanque

mínimo consumo de energía.

Los tipos de termentadores disponibles en el mercado presentan una serie de componentes y características comunes: el tanque debe diseñarse para que funcione asépticamente durante muchos días consumo mínimo de energía

contar con un sistema de control de pH

sistema de toma de muestra

sistema adecuado de aireación y agitación para cubrir necesidades metabólicas de microorganismos

control de temperatura

evaporación mínima

debe ser versátil (diversas aplicaciones o procesos)

superficies del tanque internas deben ser lisas

materiales económicos

servicio adecuado de repuestos para el termentador tipo de antiespumante.

El uso de biorreactores está ampliamente extendido para el cultivo de microorganismos (bacterias, hongos, células, etc.), tanto a escala de laboratorio como a escala industrial. Su diseño, normalmente es de tanque agitado mediante dispositivos mecánicos ya sea mediante palas giratorias o mediante burbujeo columna. Y se realizan los cultivos de microrganismos en suspensión. Las suspensiones celulares consisten en células libres y agregados celulares distribuidos en un medio en movimiento.

Esto supone un problema cuando las células que se quieren crecer son células denominadas como“adherentes”. Estas células, como lo son las células musculares o epiteliales, necesitan de una superficie para poder crecer y proliferar, con lo que las soluciones que aportan los biorreactores que mantienen las células en suspensión no son adecuadas para ellas. En los biorreactores solo es posible crecer microorganismos que sean capaces de proliferar en suspensión.

Para poder crecer estas células adherentes, se han propuesto y comercializado varias propuestas:

Biorreactores de cama fija, en los que la superficie disponible para que estas células puedan proliferar colonizando el área disponible en el fondo del vaso es muy limitada.

Frascos de cultivo estáticos dentro de una estufa de C02; de la misma manera siguen siendo poco productivos y limitados por la superficie bidimensional disponible.

El avance más significativo para crecer células adherentes ha sido la propuesta de utilizar micro-esferas suspendidas en la solución de los fermentadores/biorreactores tradicionales, de tal manera que se consiga aumentar la superficie especifica que estas células pueden encontrar dentro de la suspensión y donde pueden anclarse para crecer y proliferar.

Otro ejemplo es el biorreactor iCELLis®, un sistema de cama fija para el crecimiento de células adherentes.

Sumario de la invención El objeto de la presente invención es, por tanto, proporcionar un biorreactor que permita poder crecer células adherentes de manera sencilla y eficaz, de tal modo que sea productivo a gran escala, en especial para la producción de tejidos y de carne cultivada.

La invención proporciona un biorreactor, que comprende un recipiente con una tapa, y que comprende adicionalmente en su interior un soporte del que sobresale al menos una bandeja que soporta un elemento tridimensional de base polimérica situado sobre ella, de tal modo que cuando el biorreactor es llenado con un medio de cultivo la al menos una bandeja y el elemento tridimensional de base polimérica están rodeados por el medio de cultivo.

La invención también proporciona un procedimiento de producción de cultivos celulares adherentes, que emplea dicho biorreactor, y que comprende los siguientes pasos:

- el soporte con la al menos una bandeja del biorreactor con un elemento tridimensional de base polimérica se sumerge en el medio de cultivo,

- desde el exterior del biorreactor se inoculan las células que se desea sembrar sobre el elemento tridimensional de base polimérica, y - se deja el cultivo en el biorreactor de modo que se produce la proliferación celular.

La configuración del biorreactor permite que las células adherentes proliferadas consigan realizar sus funciones de crecimiento de matriz extracelular y formación de tejidos de una manera más similar a los procesos realizados in vivo, y que el procedimiento correspondiente resulte más productivo. De esta manera los tejidos formados tienen alto valor proteínico.

Otras realizaciones ventajosas de la invención se exponen en las reivindicaciones dependientes.

Breve descripción de las figuras

A continuación, se describirá una realización ilustrativa, y en ningún sentido limitativa, del objeto de la presente invención, haciendo referencia a los dibujos que se acompañan, en los cuales: La figura 1 muestra una vista de un biorreactor de la invención que muestra el soporte y las bandejas.

La figura 2 muestra el conjunto formado por el soporte, las bandejas, los anillos y los elementos tridimensionales de base polimérica del biorreactor de la invención.

La figura 3 muestra el conjunto de la figura 2, al que se le han añadido generadores de burbujas de aire debajo de cada bandeja.

Descripción detallada de la invención

La figura 1 muestra una vista de un biorreactor 1 de la invención obtenido a partir de un biorreactor comercial o tradicional. El biorreactor convencional comprende un recipiente 2 con una tapa 3. En el biorreactor 1 de la invención se ha incluido adicionalmente en su interior un soporte 4 en el que se pueden colocar unas bandejas 5. En la realización de las figuras 1 , 2 y 3, el biorreactor 1 tiene tres bandejas 5, que pueden realizarse en acero inoxidable. El número de bandejas 5 puede aumentar o disminuir en función de las necesidades y el tamaño del biorreactor 1. En las figuras 2 y 3 se observa que en el biorreactor 1 de la invención cada bandeja 5 soporta un elemento tridimensional 6 de base polimérica situado sobre ella, es decir, estas bandejas 5 suponen lugares de soporte para elementos tridimensionales 6 (matrices tridimensionales) que actúan como“andamios” de crecimiento para las células adherentes.

Estos“andamios” pueden ser estructuras tridimensionales 6 de base polimérica de tipo hidrogel, sobre el que las células pueden ser sembradas mediante una inoculación desde el exterior del biorreactor 1 con una aguja y dejar en cultivo hasta que la proliferación conseguida sea la deseada.

Cuando el biorreactor 1 es llenado con un medio de cultivo las bandejas 5 y los elementos tridimensionales 6 de base polimérica se encuentran rodeados por el medio de cultivo. El soporte 4 puede encontrarse suspendido de la tapa 3 del biorreactor 1 , de tal manera que una vez que se cierra el biorreactor 1 las bandejas 5 y los elementos tridimensionales 6 de base polimérica se encuentran sumergidos en el medio de cultivo. En una realización, el soporte 4 puede sobresalir perpendicularmente de la tapa 3.

El soporte 4 también puede apoyarse sobre la base del biorreactor 1 independiente de la tapa

3.

Las bandejas 5 pueden estar horadadas mediante una serie de orificios pasantes, para permitir un flujo mejor de líquido a lo largo de todo el biorreactor 1.

En las figuras 2 y 3 se observa que el biorreactor 1 puede incluir anillos 7 de sujeción de los elementos tridimensionales 6 de base polimérica (“andamios”), que sobresalen asimismo del soporte 4 en una posición paralela con respecto a una bandeja 5 correspondiente, de modo que el elemento tridimensional 6 de base polimérica se encuentra situado entre la bandeja 5 correspondiente y el anillo 7 correspondiente.

El soporte 4 puede incluir varios perfiles o vástagos de apoyo sobre los que se apoyan las bandejas 5 y los anillos 7. Sobre estos perfiles es posible incluir unos contactos eléctricos 8 susceptibles de ser alimentados con corriente continua o alterna. Esta corriente continua o alterna, que puede ser del orden de microamperios, facilita y aumenta la proliferación celular

Esta proliferación celular aumentada es debida a que, en superficies y ambientes polarizados, las proteínas se concentran más por atracción electrostática y las células tienen más nutrientes disponibles para sus actividades metabólicas. Las pruebas realizadas han permitido obtener incrementos en dicha proliferación de 7 veces con respecto al sistema sin el estímulo de la corriente continua.

El biorreactor 1 también puede incluir adicionalmente un generador 9 de burbujas de aire debajo de cada bandeja 5. La capacidad de modificar el tamaño y la frecuencia de burbujeo de aire mediante la introducción de generadores 9 de burbujas (“spargers”) debajo de cada bandeja 5, ejerce un estímulo mecánico en los“andamios” con la presión de estas pequeñas burbujas. Esta modificación está orientada a simular los movimientos de contracción/extensión de los musculares para así favorecer las similitudes con la proliferación in vivo. El procedimiento de producción de cultivos celulares, que emplea un biorreactor 1 comprende los siguientes pasos:

- el soporte 4 con la al menos una bandeja 5 del biorreactor 1 con el elemento tridimensional 6 de base polimérica se sumerge en el medio de cultivo, - desde el exterior del biorreactor 1 se inoculan las células que se desea sembrar sobre el elemento tridimensional 6 de base polimérica, y

- se deja el cultivo en el biorreactor 1 de modo que se produce la proliferación celular.

Dicho procedimiento puede comprender adicionalmente una etapa de estimulación de la proliferación celular consistente en alimentar con corriente continua o alterna los contactos eléctricos 8 del soporte 4 del biorreactor 1.

Asimismo, dicho procedimiento puede comprender adicionalmente una etapa de estimulación de la proliferación celular consistente en producir burbujas de aire debajo de cada bandeja 5 mediante los generadores 9 de burbujas de aire.

La invención es de especial aplicación al cultivo de células de músculo animales para la producción de carne cultivada, pero no solo está limitada a esta aplicación ni a este tipo de células adherentes.

Aunque se han descrito y representado unas realizaciones del invento, es evidente que pueden introducirse en ellas modificaciones comprendidas dentro del alcance del mismo, no debiendo considerarse limitado éste a dichas realizaciones, sino únicamente al contenido de las reivindicaciones siguientes.