MEMORIA DESCRIPTIVA

CAMPO TÉCNICO

La invención apunta al control de fitopatógenos bacterianos en agricultura. Específicamente a un método para obtener un bioproducto bacteriano de la cepa Marinobacter sp VQP4AL (RGM 3374), a dicho bioproducto y su uso para la inhibición selectiva de fenotipos de virulencia (nado bacteriano, proteólisis y biopelículas) asociados al sistema de comunicación celular (quorum sensing bacteriano) de bacterias fitopatógenas como Pseudomonas syríngae. Los fenotipos de virulencia permiten al patógeno, colonizar (formación de biopelículas), diseminarse (nado bacteriano) y producir daño enzimático en tejidos o biomoléculas en el hospedero.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La agricultura es una de las actividades económicas de mayor relevancia a nivel mundial, debido a que es la principal fuente de alimentos para la población humana, la cual podría alcanzar los nueve mil millones de habitantes en 2050. En Chile, los cultivos frutícolas se han visto incrementados en 25 % en los últimos diez años (2006-2016), donde el cultivo de arándanos, avellano europeo, cerezos, mandarinas y nogales ha presentado un aumento mayor o igual al 100 % en el período antes mencionado.

No obstante, muchas veces la producción de estos alimentos se ve afectada por microorganismos fitopatógenos que afectan de forma masiva a las plantaciones, disminuyendo su productividad, o a los frutos cosechados, produciendo una pérdida económica para el 'productor, y en una pérdida de alimentos disponibles para la comunidad.

Uno de los principales problemas que presenta la agronomía se relaciona con las infecciones en las especies de cultivo y las estrategias de control utilizadas actualmente. Asimismo, el cambio climático, escasez de agua y crecimiento urbano están generando condiciones favorables para la aparición y propagación de patógenos que afectan especies de cultivo de valor para la población. Actualmente, las infecciones bacterianas (y brotes asociados) son consideradas una de las principales amenazas para la industria agrícola. En Nueva Zelanda un brote infeccioso de Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en cultivos de kiwi generó pérdidas estimadas en US$650 millones en 2010 [2], Esto ha llevado a un aumento de los tratamientos antimicrobianos basados en antibióticos y agentes químicos efectivos pero que no discriminan en su efecto. Lamentablemente, el resultado ha sido un aumento de la resistencia bacteriana a tos agentes antibióticos, lo que ha llevado a que organizaciones internacionales como la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Food and Agricultural Organization (FAO) estén estableciendo recomendaciones enfocadas al uso restringido de agentes antimicrobianos y, potenciando el desarrollo de una industria sustentadle.

En la actualidad, se estima que las infecciones bacterianas representan el 18% del total de patologías infecciosas que afectan a las especies vegetales, sin embargo, su impacto productivo es significativo a nivel global. En Chile, al igual que en el resto del mundo, las infecciones bacterianas son una de las principales amenazas para tos cultivos agrícolas, afectando severamente a cultivos frutícolas que constituyen el mayor porcentaje de exportación en esta área. Entre las infecciones bacterianas de mayor relevancia a nivel nacional destacan el cáncer bacterial en cerezos, producido por Pseudomonas syringae pv. syringae, que genera pérdidas productivas que pueden alcanzar el 80%.

Otro patovar de esta especie bacteriana fitopatógena, Pseudomonas syringae pv tomato, es responsable de la peca bacteriana, mancha del halo o chancro en tomates. Esta es una enfermedad difícil de manejar, pudiendo producir pérdidas significativas en almacigueras. Esta bacteria fitopatógena sobrevive de una temporada a otra en el suelo, en restos de plantas enfermas y en semillas, en las cuales puede permanecer y diseminarse durante muchos años.

En este contexto, se hace necesaria la búsqueda de nuevas estrategias de prevención y tratamiento de fitopatógenos bacterianos, que permita reducir las pérdidas asociadas a estas infecciones, que no produzcan resistencia y que no generen fitotoxicidad. Adicionalmente, se hace fundamental el desarrollo de nuevos productos que sean altamente específicos, no tóxicos, ambientalmente amigables y que puedan implementarse tanto en la agricultura tradicional y orgánica. Actualmente existen tres estrategias principales para control de fitopatógenos bacterianos en agricultura: utilización de agentes antibióticos, la aplicación de sales de cobre y la utilización de agentes biológicos. En relación con los antibióticos, al igual que en salud humana y animal, el desarrollo y diseminación de resistencia a estos compuestos ha hecho que estos tratamientos pierdan efectividad y sean cuestionados desde la perspectiva “una salud” (One Health). En cuanto a las sales de cobre, que es la estrategia más utilizada en la actualidad éstas son usadas como potentes inhibidores del crecimiento de fitopatógenos bacterianos, sin embargo, su uso ha sido cuestionado dado a que han sido asociadas al desarrollo de resistencia (de metales y antibióticos), inespecificidad e impacto medioambiental en suelos y especies vegetales. Finalmente, otra de las estrategias disponibles comercialmente en la actualidad es la aplicación de microorganismos vivos beneficiosos que controlan el crecimiento de fitopatógenos, a través de la síntesis de moléculas antimicrobiana y/o por competencia por los nutrientes. Si bien esta estrategia es efectiva bajo condiciones controladas de cultivos, su utilización en campo no presenta los mismos resultados.

A pesar de que en el mercado existen diversas estrategias para el tratamiento y control de patologías infecciosas en la agricultura, las pérdidas productivas y económicas pueden llegar hasta un 80 % de la producción. Esto puede ser explicado en parte por el aumento de la resistencia a las terapias antimicrobianas. En este contexto, se hace necesaria la búsqueda de nuevas estrategias de prevención y tratamiento que permita reducir las pérdidas asociadas a estas infecciones, que no produzcan resistencia, no generen fitotoxicidad. Adicionalmente, deben ser ambientalmente amigables y poder implementarse en la agricultura tradicional y orgánica.

En este escenario, la invención aporta con una nueva solución para el control de fitopatógenos bacterianos a través de un producto de origen biológico, producido por la bacteria Marinobacter sp. VQP4AL (RGM 3374), que posee propiedades físico-químicas (tensoactivas) y biológicas. El bioproducto está caracterizado químicamente como un extracto tensoactivo que posee moléculas orgánicas con grupos funcionales asociados a la familia de homo serina lactonas, y que es generado bajo condiciones controladas por la bacteria Marinobacter sp. VQP4AL (RGM 3374) durante su crecimiento, y en cuando el bioproducto está en soluciones acuosas, inhibe los sistemas de comunicación de bacterias patógenas de especies vegetales. El nuevo bioproducto de la invención permite inhibir la colonización y virulencia de bacterias fitopatógenas, con una alta especificidad y eficacia en la prevención y tratamiento de fitopatógenos bacterianos, siendo efectivo, no produce resistencia, no es tóxicos para las plantas, es ambientalmente amigable y puede emplearse en la agricultura tradicional y orgánica.

Para desarrollar el bioproducto de la invención, los inventores aislaron diferentes cepas de bacterias origen marino, las que se seleccionaron primero por su capacidad de producir compuestos biosurfactantes o tensoactivos (Figura 1), y posteriormente evaluaron la capacidad de dichos biosurfactantes de inhibir la colonización de las bacterias fitopatógenas tales como Pseudomonas syringae. De todas las cepas analizadas, la cepa de la invención destacó positivamente en los parámetros buscados siendo capaz de crecer usando hidrocarburos alifáticos insolubles en agua y reducir la tensión superficial del agua, por lo que los inventores continuaron la investigación específicamente con la cepa Marínobacter sp RGM 3374.

Arte previo

Como indicamos, las enfermedades producidas por los patógenos Pseudomonas syringae, producen importantes pérdidas agronómicas, y específicamente los patovares P. syringae pv tomato y P. syringae pv syringae, afectan la producción de tomates y cerezas, principalmente. Por lo que en el estado del arte existen numerosas publicaciones y productos que estudian y proponen nuevas soluciones para su manejo, en reemplazo del tradicional y aún muy extendido uso compuestos antimicrobianos basados en cobre (CABC), tales como sulfato de cobre u oxicloruro de cobre, compuestos que son tóxicos y tienen un impacto ambiental negativo.

Por ejemplo, la solicitud de patente sur coreana KR20190081185A emplea un extracto metanólico de Echinacea purpurea para combatir la úlcera de kiwi, producida por los fitopatógenos Pseudomonas syringae y Ciavibacter michiganensis. Aunque la solicitud no lo especifica, dado las características del extracto, es probable que el componente activo tenga una actividad biocida clásica, es decir que mata a las bacterias fitopatógenas.

En otro enfoque, la solicitud CN113736808A explora el desarrollo de plantas de tomate transgénicas resistentes a Pseudomonas syringae. Por otra parte, la solicitud US2021380931 A1 utiliza una cepa aislada de levadura Aureobasidíum pullulans (YE3CA5) como agente de control biológico contra bacterias y hongos en plantas, en especial contra las bacterias P, syríngae.

Como hemos adelantado, la invención aborda el problema de evitar las enfermedades provocadas por estos fitopatógenos desde otra perspectiva, que es la de inhibir el sistema del quorum sensing (QS). Esto permite desarrollar productos altamente selectivos y que no presentan toxicidad para microbiotas naturales beneficiosas ni tampoco para las especies vegetales de interés. Específicamente los inventores se han enfocado en encontrar biomoléculas y extractos de estas que además del efecto biológico de interés (inhibición del sistema de QS), también exhiban propiedades fisicoquímicas que los clasifica en el grupo de tensoactivos o biosurfactantes. Esto presenta ventajas tecnológicas que permiten diversificar los productos finales a desarrollar dado que es posible formular bases oleosas, de base seca para reconstitución, adsorbidas en materiales inorgánicos, entre otros.

Como será evidente para el experto en la materia, aplicar un compuesto tensoactivo que inhibe un patógeno determinado, como el caso de la invención, es ventajoso respecto a la aplicación de un microorganismo vivo antagonista, sea este levadura, bacteria u hongo, ya que el microorganismo antagonista, primero debe ser inoculado en el vegetal o ecosistema a proteger, en condiciones viables para su propia conservación, y de ahí debe competir y desplazar al fitopatógeno problema. Es decir, es un sistema más complejo de implementar que la aplicación de un compuesto que directamente inhibe a dicho fitopatógeno.

Una ventaja adicional del enfoque de la invención es que, dado que afecta el sistema del quorum sensing, sin “matar” directamente a la bacteria, sino que, inhibiendo su capacidad infectiva, la bacteria patógena no desarrolla resistencia a este ataque, como ocurre habitualmente con compuestos antibióticos, incluso con tos compuestos como las sales de cobre ya indicadas.

De igual forma, una ventaja importante de la presente invención es que a diferencia de compuestos biocidas inorgánicos inespecíficos, y que impactan en las microbiotas del suelo y de los vegetales a tratar, el producto desarrollado no es biocida y no es tóxico.

De este modo, los inventores han desarrollado un producto, de múltiples aplicaciones que inhibe específicamente las enfermedades causadas por Pseudomonas syringae inocuo para las plantas, el medio ambiente, los microorganismos benéficos, y el ser humano, consumidor final de los frutos. Específicamente, el producto es un extracto conformado por moléculas orgánicas con grupos funcionales caracterizados y que se obtiene bajo condiciones controladas desde la cepa Marinobacter sp, VQP4AL aislada desde el ambiente marino con el registro de depósito RGM 3374 en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM).

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Estudio de tensión superficial de las cepas aisladas desde la Bahía de Quinteros Ventanas Puchuncaví.

Figura 2. Evaluación del efecto de las formulaciones del biosurfactante sobre la formación de biopelículas de la cepa fitopatógena Pseudomonas syringae pv, syringae (Pss ATCC 19310), expuesta a diferentes concentraciones (v/v o mg/ml) del sobrenadante de la Marinobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 (SNBA), cultivo de la Marinobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 (CBA) o biosurfactante de la Marinobacter sp, VQP4AL depósito RGM 33742 secado por spray dryer (EBA) (* p≤ 0.05; ** p<0.01 ; “* p≤ 0.001).

Figura 3. Evaluación del efecto de las formulaciones del biosurfactante sobre la formación de biopelículas de la cepa fitopatógena Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst ATCC BAA- 871 DC3000), expuesta a diferentes concentraciones (v/v o mg/ml) del sobrenadante de la Marinobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 (SNBA), cultivo de la Marinobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 (CBA) o biosurfactante de la Marinobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 secado por spray dryer (EBA) (* p≤ 0.05; ** p<0.01 ; *** p≤ 0.001).

Figura 4. Evaluación del efecto de las formulaciones biosurfactantes sobre la motilidad por swarming de la cepa fitopatógena Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss ATCC 19310), expuesta a diferentes concentraciones (v/v o mg/ml) del sobrenadante de la Marinobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 (SNBA), cultivo de la Marinobacter sp, depósito RGM 3374 (CBA) o biosurfactante de la Marinobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 secado por spray dryer (EBA) (* p≤ 0.05; ** p<0.01; *** p≤ 0.001). Figura 5. Evaluación del efecto de las formulaciones biosurfactantes sobre la motilidad por swarming de la cepa fitopatógena Pseudomonas syríngae pv. tomato (Pst ATCC BAA-871 DC3000), expuesta a diferentes concentraciones (v/v o mg/ml) del sobrenadante de la Marinobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 (SNBA), cultivo de la Marinobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 (CBA) o biosurfactante de la Marinobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 secado por spray dryer (EBA) (* p≤ 0.05; ** p<0.01 ; *** p≤ 0.001).

Figura 6. Evaluación del efecto de las formulaciones biosurfactantes sobre la proteólisis de la cepa fitopatógena de Pseudomonas syríngae pv. syríngae (Pss ATCC 19310), expuesta a diferentes concentraciones (v/v o mg/ml) del sobrenadante de la Marinobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 (SNBA), cultivo de la Marinobacter sp, depósito RGM 3374 (CBA) o biosurfactante de la Marinobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 secado por spray dryer (EBA) (* p≤ 0.05; ** p≤0.01; p≤ 0.001).

Figura 7. Evaluación del efecto de las formulaciones biosurfactantes sobre la proteólisis de la cepa fitopatógena Pseudomonas syríngae pv. tomato (Pst ATCC BAA-871 DC3000), expuesta a diferentes concentraciones (v/v o mg/ml) del sobrenadante de la Marinobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 (SNBA), cultivo de la Marinobacter sp, depósito RGM 3374 (CBA) o biosurfactante de la Marinobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 secado por spray dryer (EBA) (* p≤ 0.05; ** p≤0.01 ; p≤ 0.001).

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención apunta a un método para obtener un bioproducto bacteriano producido por la bacteria marina Marinobacter sp. VQP4AL (RGM 3374) que evita ia formación de biopelículas, por inhibición dei sistema de quorum sensing.

En un segundo aspecto, ia invención se refiere a dicho bioproducto, sus distintas formas, y a su uso para la inhibición selectiva de fenotipos de virulencia (tales como formación de biopelículas, nado bacteriano o enzimas líticas) asociados al sistema de comunicación celular (quorum sensing bacteriano) de bacterias fitopatógenas, especialmente de la especie Pseudomonas syringae, y sus patovares.

El método de la invención se basa en el cultivo de una bacteria aislada por los inventores e identificada por su 16S rDNA como del género Marinobacter sin una especie asignada. Esta bacteria fue aislada desde un ambiente marino. Esta cepa particular denominada como cepa VQP4AL, Marinobacter sp VQP4AL tiene el número de Depósito RGM 3374, en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM), de fecha 24 de agosto de 2022.

El componente activo del extracto o bioproducto de la cepa de la invención corresponde a compuestos orgánicos de características antipáticas en donde sus estructuras presentan cadena alifática con centros de insaturación y grupos carbonilos propios de la familia de compuestos del tipo homo serina lactona derivados o similares, y que poseen propiedades tensoactivas o biosurfactantes que la bacteria libera al medio extracelular cuando en el medio se adicionan moléculas orgánicas insolubles en agua y que pueden ser usadas como sustratos de crecimiento. Presumiblemente, en el medio de origen de la bacteria de la presente invención, ésta emplea dichas moléculas para degradar solubilizar al medio acuoso hidrocarburos aromáticos complejos, y obtener así moléculas que puedan ser metabolizadas como fuente de carbono. Dado que el destino del bioproducto es ser aplicado en agricultura y en especial en campos, cultivos o plantas, para protegerlas de fitopatógenos, de la especie Pseudomonas syringae, el bioproducto de la invención es cualquiera que contenga el sobrenadante de la cepa de la invención, el que puede ser aspersado sobre los campos, cultivos o plantas a proteger. De este modo, el bioproducto de la Invención corresponde:

- en una primera realización al cultivo completo estéril bioactivo con bacterias inactivadas (CBA), es decir con la biomasa de la cepa de la invención inactivada, por ejemplo, por radiación UV, o un golpe de calor o shock térmico, o cualquier técnica disponible y/o

- en una segunda realización, al sobrenadante bioactivo (SNBA), o sobrenadante filtrado, sin la biomasa, o el extracto específico del sobrenadante que comprende las sustancias tensoactivas o surfactantes, esterilizado por bioseguridad; y/o

- en una tercera realización, al extracto bioactivo (EBA), o el sobrenadante filtrado, sin la biomasa, o el extracto específico del sobrenadante que comprende las sustancias tensoactivas o surfactantes, esterilizado por bioseguridad, y concentradas por deshidratado.

Los bioproductos de la invención también pueden combinarse con otros portadores, oleosos, inorgánicos u orgánicos no reactivos, disponibles en el estado de la técnica.

En términos generales, para obtener el cultivo de la invención la bacteria, Marinobacler sp. VQP4AL, la cepa debe ser cultivada en medios para bacterias marinas. Preferentemente, el medio de cultivo empleado es un medio adecuado para bacterias marinas heterótrofas degradadoras de hidrocarburos, que conteniendo agua de mar esterilizada en un rango de 25-100 % (vol/ vol) o agua bidestilada conteniendo NaCI entre 1 ,5-8 % p/vol), y una fuente de carbono escogida entre azúcares, ácidos orgánicos y/o péptido en una concentración entre 0,5 a 5 % p/v.

Adicionalmente, se agrega una fuente de compuestos orgánico hidrófobo del tipo aceites en una proporción entre el 0,01-10 % (p/vol) para inducir la producción de moléculas y extracto con las propiedades físicas, químicas y biológicas deseadas en la presente invención. Convenientemente, la fuente de compuestos hidrofóbicos puede ser del tipo aceites derivados de material reciclado de uso alimentario u otro.

El medio de cultivo también debe contener sales inorgánicas tales como sulfato de magnesio; de cloruro de calcio; fosfato de monopotasio; fosfato de di-amonio hidrógeno; nitrato de potasio y de cloruro férrico, las que se encuentran naturalmente en el agua de mar. En el caso de no usar agua de mar, preferentemente, el medio comprende 0,2 g/L de sulfato de magnesio; 0,02 g/L de cloruro de calcio; 1 g/L de fosfato de monopotasio; 1 g/L de fosfato de diamonio hidrógeno; 1 g/L de nitrato de potasio y 0,05 g/L de cloruro férrico, todas estas concentraciones pueden variar en un 20%.

Las condiciones de producción de los bioproductos de la invención consideran un bioproceso con una temperatura de incubación entre 10-30 °C, una agitación de entre 50- 400 rpm, pH 6-9, un tiempo de incubación entre 24 y 120 horas, y saturación de oxígeno entre 10-21 %.

Los bioproductos preferidos de la invención, para ser aplicados a los cultivos, son el cultivo bioactivo (CBA), correspondiente al cultivo completo esterilizado; sobrenadante bioactivo (SNBA), correspondiente sólo al sobrenadante del cultivo de la cepa de la invención, sin la biomasa, el que por bioseguridad también se esteriliza; y el extracto bioactivo (EBA) que corresponde al SNBA deshidratado.

Para obtener el cultivo bioactivo (CBA), el cultivo, licor o caldo obtenido mediante las condiciones de producción antes detalladas, es filtrado a través de una membrana de filtración con un tamaño de poro de entre 20 a 40 pm y posteriormente es esterilizado, por cualquier medio físico disponible en la técnica. Es importante que la esterilización se realice por medios físicos, tales como radiación, o shock térmico, ya que medios químicos pueden inactivar las moléculas tensoactivas, reaccionando con ellas. Una realización especialmente preferida es la esterilización por calor húmedo y presión.

Para obtener el sobrenadante bioactivo (SNBA) el cultivo, licor o caldo obtenido mediante las condiciones de producción antes detalladas, es filtrado por una membrana de filtración con un tamaño de poro 20-40 pm y luego centrifugado a 2000-10000 g y 4-20°C por 10-45 min. Tras la centrifugación, la fase líquida (sobrenadante) es recuperada y esterilizada por cualquier medio físico disponible en la técnica. Es importante que la esterilización se realice por medios físicos, tales como radiación, o shock térmico, ya que medios químicos pueden inactivar las moléculas tensoactivas, reaccionando con ellas. Una realización especialmente preferida es la esterilización por calor húmedo y presión, preferentemente a 121 °C a 1 ,5 atm de presión por 20 minutos. Para obtener el extracto bioactivo EBA el sobrenadante libre de células bacterianas obtenido (SNBA) es deshidratado por cualquier medio disponible en la técnica, en una realización preferida, la deshidratación se realiza mediante secado por atomización, bajo las siguientes condiciones: temperatura de entrada 90-130 °C, temperatura de salida 60- 100 °C, aspiración de 70-100 % y 5-25 % flujo de alimentación.

El extracto bioactivo EBA, se deshidrata para facilitar su preservación y transporte, pero para su aplicación debe ser resuspendido en agua.

Los bioproductos de la invención se deben aplicar, por ejemplo por aspersado o rociado, sobre los cultivos o plantas que se quieren proteger de los fitopatógenos Pseudomonas syringae, y sus patovares, por ejemplo P. syringae pv tomato o P, syringae pv syringae.

Como se demostrará más adelante en los ejemplos, la aplicación de todos los bioproductos de la invención, CBA, SNBA y EBA, son eficientes en el control y prevención de las enfermedades causadas por los fitopatógenos de esta especie. Donde, cuando se evalúa la aplicación de EBA, esta corresponde al producto rehidratado, que es la forma de su administración.

De este modo la invención se refiere a un bioproducto biosurfactante para proteger cultivos y plantas de bacterias fitopatógenas que comprende sobrenadante estéril del cultivo de la bacteria marina Marínobacter sp. VQP4AL Depósito RGM 3374. Este bioproducto adicionalmente puede comprender la biomasa de la cepa Marínobacter sp. Depósito RGM 3374, esterilizada. Alternativamente, el sobrenadante estéril puede estar deshidratado, el que puede comprender adicionalmente un portador y/o auxiliares de formulación.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método de obtención del bioproducto de acuerdo con la reivindicación 1 el que comprende las siguientes etapas: a. cultivar la cepa Marínobacter sp. VQP4AL Depósito RGM 3374 en un medio de cultivo para bacterias marinas heterótrofas, con una fuente de carbono escogida entre azúcares, ácidos orgánicos y/o péptido en una concentración entre 0,5 a 5 % p/v; b. inducción de la producción del bioproducto suplementando el medio de cultivo con una fuente de compuestos orgánico hidrófobo del tipo ácidos grasos en una proporción entre el 0,01-10 % (p/vol); c. incubar entre 24 a 120 horas a una temperatura de entre 10 a 30 °C, con agitación de entre 50 a 400 rpm, a pH 6 a 9, y a saturación de oxígeno entre 10 a 21 %; d. someter a esterilización por medios físicos.

Donde en la etapa a, el medio de cultivo comprende 25-100 % agua de mar estéril o de agua bidestilada conteniendo NaCI entre 1 ,5-8 % p/vol y sales inorgánicas. Dichas sales inorgánicas son: 0,2 g/L de sulfato de magnesio; 0,02 g/L de cloruro de calcio; 1 g/L de fosfato de monopotasio; 1 g/L de fosfato de diamonlo hidrógeno; 1 g/L de nitrato de potasio y 0,05 g/L de cloruro férrico, donde las concentraciones pueden variar hasta en un 20%.

Convenientemente en la etapa b, se emplea aceite reciclado de uso alimentario. Y la esterilización de la etapa d, se realiza por calor húmedo y presión

En una realización preferida, se separa la biomasa del medio de cultivo por centrifugación entre 2000 a 5000 RPM o por filtración por tamizado en filtros menores a 0,22 micrómetros, generando un sobrenadante libre de bacterias. De manera opcional, este sobrenadante se deshidrata, preferentemente utilizando un sistema de secado sin estrés termal por spry- drying

En un tercer aspecto la invención se refiere al bioproducto y su uso en cualquiera de sus formulaciones porque permite inhibir el desarrollo de bacterias fitopátogenas por inhibición del sistema de quorum sensing. El bioproducto se encuentra caracterizado químicamente mediante los métodos de Espectroscopia Infrarroja por Transformada de Fourier (FT-IR) y Espectroscopia por Resonancia Magnética Nuclear (RMN mono y bidimensional), indicando que el extracto producido por la bacteria de la presente invención, posee características apolares en donde sus estructuras presentan al menos una cadena alifática con centros de insaturación tipo alquenos, mostrando adicionalmente la presencia de grupos carbonilos que permiten establecer que en el extracto existen moléculas de la familia de homoserillactonas o similares con caracterizado el extracto además por grupos lactona y cadenas de ácidos grasos con enlaces doble C=C, grupos C-H en alquenos y alquiles con grupos carbonilos de éster con doble enlace. De manera preferente el extracto inhibe fitopatógenos de la especie Pseudomonas syríngae, y de manera aún más preferente a sus patovares Pseudomonas syríngae pv tomato y/o Pseudomonas syríngae pv syringae. El uso del bioproducto en cualquiera de sus formulaciones permite controlar o prevenir enfermedades causadas por bacterias fitopatógenas en plantas. Y se aplica por aspersión sobre cultivos o plantas a proteger de los fitopatógenos.

A continuación, se describe un modo preferente de realización de la invención propuesta, sin que ello limite las variantes técnicas que un experto en la materia pueda incorporar o modificar, y que quedan dentro del alcance del concepto inventivo que reivindicamos en esta solicitud.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Obtención de un cultiva de la cepa Mannabacter sp, cepa VQP4AL depósito RGM 3374

Un inoculo de la cepa de la invención Marínobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 se cultivó en un biorreactor de 3 L.

Como medio de cultivo se empleó agua de mar esterilizada complementada con 5 %p/v de glucosa y un 10% de aceite de comer usado, como fuente de ácidos grasos.

El biorreactor se mantuvo en las condiciones de producción, con una temperatura de incubación de 25 °C, agitación contante de 200 rpm, a pH 6,8; y saturación de oxigeno de 15 %. El cultivo se mantuvo hasta alcanzar la fase estacionaria, que se alcanzó a las 96 horas.

Ejemplo 2. Obtención de los distintos bioproductos de la invención

El cultivo obtenido en el ejemplo un se dividió en 3 partes de 1 L, y con cada parte se prepararon los distintos bioproductos a evaluar CBA, SNBA y EBA.

2.1 Para obtener el cultivo bioactivo (CBA), el licor obtenido en el ejemplo 1 se filtró empleando una membra de filtración con un tamaño de poro de 40 pm.

Posteriormente el cultivo libre de impurezas fue esterilizado por calor húmedo a una temperatura entre 121 °C y presión de 1 ,5 atm, por 20 minutos.

2.2 Para obtener el sobrenadante bioactivo (SNBA) el licor obtenido en el ejemplo 1 primero se filtró empleando una membra de filtración con un tamaño de poro de 40 pm y luego se centrifugó a 5000 g a 20°C por 30 min. Tras la centrifugación, la fase liquida (sobrenadante) fue recuperada y esterilizada por por calor húmedo a una temperatura entre 121 °C y presión de 1 ,5 atm, por 20 minutos.

2.3 Para obtener el EBA, el licor obtenido en el ejemplo 1 se trató igual que en punto 2.2. Luego el sobrenadante libre de células bacterianas esterilizado fue deshidratado mediante secado por atomización, bajo las siguientes condiciones: temperatura de entrada 110 °C, temperatura de salida 80 °C, aspiración de 70-100 % y 5-25 % flujo de alimentación.

2.4. Para la aplicación de EBA en los siguientes experimentos el producto deshidratado se rehidrata en agua destilada hasta el volumen inicial, en este caso 1 L, con agitación suave.

Ejemplo 3. Efectividad de los bioproductos de la invención

Dado que los patovares P. syríngae pv tomato o P. syríngae pv syringae, son muy importantes en nuestro país se usaron como modelo para evaluar la efectividad de la invención, de los 3 bioproductos obtenidos en el ejemplo 2.

3.1. Evaluación del efecto del sobrenadante estéril libre de células SIMBA, cultivo estéril CBA y sobrenadante libre de células en polvo EBA de la invención, en la formación de biopelículas de cepas fitopatógenas modelo ATCC.

Al evaluar el efecto de diferentes concentraciones (v/v o mg/ml) del cultivo o sobrenadante de la cepa Marinobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 en la formación de biopelículas de cepas fitopatógenas de referencia, se determinó una inhibición significativa en la formación de biopelícula, del 60.1%, 21.4%, 49.6% y 49.9% al exponer la cepa Pseudomonas syríngae pv syríngae ATCC 19310 a 1 , 5, 10 y 20 % de SNBA, respectivamente. Además, también se registró inhibición del 54,8% en la formación de biopelículas de esta cepa al aplicar 10% de CBA, y del 60,1 % y 100%, al exponer a 40 mg/ml y 80 mg/ml de EBA, respectivamente. Los resultados se muestran en la Figura 2.

Al evaluar el efecto de SNBA en la formación de biopelículas de la cepa fitopatógena Pseudomonas syríngae pv tomato ATCC BAA-871 DC3000 se determinó que todas las concentraciones ensayadas generaron inhibición estadísticamente significativa en la formación de biopelículas, de 51.4%, 81.3 %, 80.7% y 83% al usar 1 , 5, 10 y 20% de SNBA, respectivamente. Además, también se registró inhibición en la formación de biopelículas al aplicar CBA, de 47.3%, 72.1 % y 64.5% al 5, 10 y 20% de CBA. Al evaluar el efecto de diferentes concentraciones del EBA en la cepa, se observa una inhibición en la formación de biopelículas del 77.3% y 100% al exponer a 40 mg/ml y 80 mg/ml, respectivamente. Los resultados se muestran en la Figura 3.

3.2. Evaluación del efecto del sobrenadante estéril libre de células SIMBA, cultivo estéril CBA y sobrenadante libre de células en polvo EBA de la Marínobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 en la motilidad por swarming (nado bacteriano) de cepas fitopatógenas modelo ATCC.

Al evaluar el efecto de las diferentes concentraciones (v/v o mg/ml) del cultivo o sobrenadante de la Marínobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 en la disminución de la motilidad por swarming (nado) de las cepas fitopatógenas, se determinó una disminución significativa del 44.3% de la motilidad al exponer la cepa fitopatógena Pseudomonas syríngae pv syríngae ATCC 19310 a 20% de SNBA durante 72 h de incubación, del 62.7% y 65.6% de motilidad al exponer la cepa a 20% de CBA por 48 y 72 h de incubación. Además, se observa una disminución significativa de la motilidad, de un 64.4% y 70% al exponer la cepa a 20 mg/ml de EBA por 48 y 72 h de incubación; de 56%, 85% y 89% al exponer a 40 mg/ml de EBA por 24, 48 y 72 h, y del 100% de la motilidad al exponer a 80 mg/ml de EBA por 24, 48 y 72 h de incubación. Los resultados se muestran en la Figura 4.

Las diferentes concentraciones (v/v) de SNBA y CBA evaluadas no disminuyeron la motilidad por swarming de la cepa fitopatógena Pseudomonas syríngae pv tomato ATCC BAA-871 DC3000. Al evaluar el efecto de EBA se observa una disminución significativa en la motilidad de la cepa, de un 22.9% y 35% al exponer la cepa a 20 mg/ml por 48 y 72h, y del 100% de la motilidad al exponer la cepa a 40 y 80 mg/ml por 24, 48 y 72h de incubación. Los resultados se muestran en la Figura 5.

3.3. Evaluación del efecto del sobrenadante estéril libre de células SNBA, cultivo estéril CBA y sobrenadante libre de células en polvo EBA de la Marínobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 en la proteólisis de cepas fitopatógenas modelo ATCC. Al evaluar el efecto de las diferentes concentraciones (v/v o mg/ml) del cultivo o sobrenadante de la Marínobacter sp, VQP4AL depósito RGM 3374 en la proteólisis de las cepas fitopatógenas, se determinó la disminución significativa del 34,8% de la proteólisis al exponer la cepa fitopatógena Pseudomonas syríngae pv syríngae ATCC 19310 a 10% (v/v) de SNBA a 72 h de incubación, y del 100% al exponer la cepa a 20% de SNBA per 24, 48 y 72 h de incubación. Además, se registró una disminución significativa de la proteólisis al exponer la cepa a diferentes concentraciones (v/v) de CBA, siendo esta de 38.6% al exponer la cepa al 1 % de CBA por 72 h, de 36.6% y 40% al exponer al 5% de CBA por 48 y 72 h, de 100%, 58.5% y 62.9% al exponer al 10% CBA a 24, 48 y 72 h, y de 100%, 36.6% y 52.9% al exponer al 20% de CBA por 24, 48 y 72 h. Así también, se registró una disminución significativa de la proteólisis al exponer la cepa a diferentes concentraciones (mg/ml) de EBA, siendo del 100% al exponer la cepa a 20, 40 y 80 mg/ml de EBA por 24, 48 y 72 h de incubación. Los resultados se muestran en la Figura 6.

Al evaluar el efecto en la proteólisis de la cepa Pseudomonas syringae pv tomato ATCC BAA-871 DC3000 se determinó la disminución significativa del 100% de la proteólisis al exponer la cepa a 5% de SNBA luego de 24 y 48 h de incubación, y del 100% al exponer la cepa al 10 y 20% de SNBA luego de 24, 48 y 72 h de incubación. Además, también se observa una disminución significativa del 100% de la proteólisis de la cepa al exponer a 5%, 10% y 20% de CBA por 24, 48 y 72 h. Así también, se registró una disminución significativa de la proteólisis al exponer la cepa a diferentes concentraciones (mg/ml) de EBA, siendo del 100% al exponer la cepa a 20, 40 y 80 mg/ml de EBA por 24, 48 y 72 h de incubación. Los resultados se muestran en la Figura 7.