DESCRIPCIÓN

SECTOR DE LA TÉCNICA El área científica al que corresponde la Invención es la biotecnología, ya que se trata de la optimización de un proceso biotecnológico para producir un compuesto con uso potencial como herbicida, insecticida, funguicida y/o bactericida. Por ello, el sector industrial de aplicación es el sector agroquimico que dirige sus esfuerzos hacia la búsqueda de nuevos compuestos fitoquimicos más selectivos y activos y que, además sean respetuosos con el medio ambiente.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La invención para la producción biotecnológica de D-DIBOA, un compuesto con potencial aplicación como herbicida, insecticida, fungicida y/o bactericida utilizando una cepa modificada genéticamente de la bacteria Escheríchia cotí, es un proceso que unifica por un lado la síntesis de un compuesto biológicamente activo que no presenta impactos negativos sobre el medio ambiente y, por otro, el uso de esta cepa modificada genéticamente para llevar a cabo el proceso biológico con elevados rendimientos.

Los herbicidas han sido tradicionalmente utilizados para aumentar la producción agrícola con un incremento de los rendimientos y de la seguridad alimentaria. Actualmente, el uso de herbicidas sintéticos es la estrategia más eficaz para reducir y controlar tanto el crecimiento como la propagación de las malas hierbas. Sin embargo, su uso indiscriminado ha provocado un fuerte impacto ambiental y ecológico (Cordeau et al., 2016). Asi, problemas como la contaminación, la bioacumuladón y la aparición de fenómenos de resistencia han sido atribuidos al efecto de los herbicidas. Este hecho ha promovido la investigación enfocada a encontrar nuevas fórmulas que sean, principalmente, más respetuosas con el medio ambiente y que, además, presenten nuevos modos de acción para los que no hayan sido descritos, por tanto, fenómenos de resistencia. Para reducir la dependencia del control químico y mitigar los impactos negativos que los herbicidas tienen sobre el medio ambiente, la estrategia de utilizar productos naturales con propiedades análogas tiene cada vez mayor aceptación en el sector agrícola (Muzell Trezzi et al., 2016). Una de las alternativas más interesantes a estos herbicidas sintéticos es el uso de aleloquímicos de plantas. Éstos son productos que sintetizan las plantas de manera natural y que afectan a la supervivencia o el crecimiento de otros organismos, ya sean plantas, insectos, microorganismos u hongos (Rimando y Duke, 2006). Debido a su diversidad estructural, modo de acción especifico y degradabilidad en el suelo, los aleloquímicos han sido propuestos como nuevos modelos de herbicidas efectivos para controlar el manejo de plagas en los cultivos agrícolas (Maclas et al., 2009).

Dentro de estos compuestos los alcaloides, metabolitos secundarios sintetizados a partir de aminoácidos, han despertado especial interés por haber sido identificados como compuestos básicos farmacológicamente activos (Tiwari y Rana, 2015). Entre ellos, los ácidos hidroxámicos destacan por ser emitidos por diversos cultivos de gran importancia desde el punto de vista agrolimentario. Asi, las especies de la familia Poaceae (gramíneas) como Zea mays L. (maíz), el Triticum aestivum L. (trigo) y Hordeum vulgare L. (cebada) presentan numerosos antecedentes como plantas con actividad alelopátlca, la cual ha sido atribuida a la exudación e incorporación al suelo de estos ácidos hidroxámicos.

Los ácidos hidroxámicos cíclicos, conocidos como ácidos benzohidroxámicos (Figura 1), actúan aportando protección a multitud de especies de la familia Poaceae, Incluyendo cultivos agrícolas tan importantes como el maíz, el trigo o el centeno (Seca/e cereale L.) (Frey et al., 2009). En concreto, el DIBOA (2,4-dihidroxi-(2H)-1 ,4- benzoxacin-3(4H)-ona) (Figura 2) es el ácido benzohidroxámico que mayor interés ha suscitado debido a su alta fitotoxiddad, alta especificidad y alta degradabilidad en el suelo. Éste se aisló por primera vez de las raíces de centeno en 1959. La actividad fitotóxica del DIBOA y de los productos relacionados con su degradación en el suelo, ha sido testada tanto en especies modelo de estudios fitotóxicos como en especies que causan problemas en cultivos agrícolas (malas hierbas), comprobándose que éste compuesto no sólo es comparable con el de algunos herbicidas sintéticos comerciales, sino que incluso en algunos casos los mejora (Maclas et al , 2006b, 2005). A pesar del éxito que supuso el aislamiento del DIBOA a partir de plantas, su síntesis está condicionada por factores externos y. además, se ve limitada a pequeñas cantidades que no hacen viable una extracción, producción y aplicación a mayor escala. Por lo tanto, muchos estudios han estado enfocados a la síntesis química de estos compuestos.

La síntesis química de un gran número de compuestos con un esqueleto (2H)-1 ,4- benzoxacin-3(4H)-ona (I) ha sido llevada a cabo mediante una metodología de delación reductiva reportada Inicialmente por Coutts (1963) (Atkinson et al , 1991 ). Posteriormente, se utilizó esta reacción para patentar un proceso de síntesis química del DIBOA (II), y otros ácidos benzohidroxámicos, a partir del 2-nitrofenol o derivados (Jernow y Rosen, 1975) (Figura 3). En una primera reacción el 2-nitrofenóxido (III) sufre una sustitución nucleofllica en el C-2 dando lugar a un compuesto 2-nitrofenoxi-acetato de metilo (IV). Posteriormente, la dcladón reductiva de este compuesto intermedio produce el correspondiente ácido benzohidroxámico (V), sin embargo, este compuesto aún tiene que ser sometido a diferentes modificaciones en sus radicales para, finalmente, obtener el DIBOA.

En ese mismo año, un proceso alternativo de síntesis química de DIBOA mediante quelantes de zinc fue patentado (Tipton y Tsao, 1975) (Figura 4), con un fundamento similar al anterior. En este caso la invención se basa de manera concreta en la sintesis química de DIBOA a partir del 2-nitrofenol (VI), el cual reacciona con un cloro tluoro- acetato de alquilo (Vil) bajo condiciones ambientales para dar lugar al compuesto intermedio 2-nitrofenoxi-fluor-acetato de alquilo (VIII). La reacción de delación reductiva se origina al hacer reaedonar este compuesto intermedio en solución acuosa con zinc y clorura de amonio para producir el quelato de zinc DIBOA (IX). Si este complejo se hace reaccionar con EDTA en exceso se asegura la completa conversión del quelato de zinc hada un DIBOA libre.

Redentemente. se ha conseguido sintetizar de manera química las formas desoxi de las 2,4-dihidroxibenzoxacinonas utilizando el mismo fundamento de síntesis que en los casos anteriores, obteniéndose en este caso 4-hidroxibenzoxacinonas y, en particular, el 4-hidroxh(2H)-1 ,4-benzoxacin-3-(4H)-ona (D-DIBOA) (X) (Figura 5). Maclas y colaboradores patentaron (2008) (WO 2008/012385 Al) un conjunto de métodos químicos para sintetizar varios derivados halogenados del D-DIBOA, entre ellos destacan el 6-CI-4-hidroxK2H)-1 ,4-benzoxadn-3-(4H)-ona (6-CI-D-DIBOA) (XI) (Figura 5) y el 8-CI-4-h¡drox¡-(2H)-1 ,4-benzoxadn-3-(4H)-ona (8-CI-D-DIBOA) (XII) (Figura 5) que se caracterizan por presentar una mayor actividad fitotóxica y una alta selectividad, respectivamente. Previamente, habían reportado la síntesis del D-DIBOA en dos etapas análogas a las anteriormente descritas. En este caso concreto, la primera etapa, emplea como material de partida el 2-nitrofenol (VI) y bromoacetato de etilo, obteniéndose el compuesto intermedio 2-(2 ^' -nitrofenoxi)-acetato de etilo (XII) (de aquí en adelante denominado precursor) con un rendimiento del 99%. En la segunda etapa, la ddación reductiva de este compuesto da lugar al D-DIBOA (X) con un rendimiento del 70% (Maclas et al., 2006a, 2006c) (Figura 6)

Estudios de fitotoxidad demostraron que la forma D-DIBOA presenta mayor actividad biológica que su análogo DIBOA (Macias et al., 2005), por lo que la sintesis del D- DIBOA adquirió mayor relevancia en el ámbito de la industria agroquimica

Sin embargo, hay dos problemas a resolver para lograr la producción a escala industrial de D-DIBOA, ambos relacionados con la segunda etapa de la síntesis química. El primero es que se trata de una reacción de catálisis heterogénea exotérmica con desprendimiento de hidrógeno, lo que lleva asociado un elevado riesgo de explosión. Estas condiciones de reacción hacen que el proceso sea caro y peligroso. El segundo de los problemas es el rendimiento relativamente bajo de esta segunda etapa, que provoca la pérdida de un 30% del precursor.

Uno de los mayores retos de la industria química actual es el de trabajar con procesos en los que se maximicen los productos deseados, se minimicen los subproductos, se simplifiquen las rutas de síntesis y, además, se utilicen disolventes poco contaminantes. En base a este planteamiento surgió el término "Química Verde" (Anastas y Warner, 1998), cuyo objetivo es el de fomentar el uso de procesos químicos que sean ambiental y ecológicamente poco dañinos (Tucker y Faul, 2016).

Los biocatalizadores se plantean como una alternativa interesante a la síntesis química desde el punto de vista de la química verde. El uso de enzimas como biocatalizadores destacan por su capacidad selectiva para para convertir unos compuestos, en principio poco costosos, en moléculas complejas, todo ello en un medio acouso y en condiciones de reacción más suaves que las reacciones químicas (Hammer et al.. 2017). El uso de las enzimas como catalizadores en procesos de síntesis química tiene una creciente aceptación, ya que la biocatálisis da lugar a velocidades de reacción extremadamente altas que van más allá de las obtenidas en la catálisis química y con una especificidad de unión a sustrato mucho mayor que los catalizadores químicos (Koeller y Wong, 2001 ). Lo cual se debe al desarrollo de la tecnología de producción de proteínas recombinantes, que permite la producción de biocatalizadores de una forma rápida y económica mediante la sobreexpresión de la enzima de interés. Una vez sobreexpresadas, las enzimas pueden ser utilizados dentro de la célula, funcionando ésta como catalizador (biocatalizador celular o whole-cell-biocatalyst) o pueden ser purificados para su utilización in vitro (de Carvalho. 2011 ; Wachtmeister y Rother, 2016).

La posibilidad de la producción de D-DIBOA mediante una biocatálisis celular del precursor, a partir de las especies bacternias Escherichia coli y Senratia marcescens, fue explorada por Valle y col. (2011). Este trabajo supuso un gran avance en el ámbito biotecnológico, puesto que demostró que E coli es capaz de biotransformar el precursor en D-DIBOA utilizando un medio de cultivo complejo (medio LB). Sin embargo, el rendimiento de este proceso era muy bajo alcanzándose un máximo del 20%.

Un estudio posterior del mismo grupo identificó las enzimas responsables del proceso de biotransformación en E. cotí, concluyendo que las nitrorreductasas insensibles al oxígeno de tipo I, NfsA y NfsB son las que realizan la catálisis enzimática que da lugar a la sintesis de D-DIBOA ya que la mutación de los genes que expresan dichas proteínas anulaba la síntesis de D-DIBOA (Valle et al., 2012). Además, la clonación de los genes nfsA o nfsB (que expresan las enzimas NfsA y NfsB, respectivamente) en el vector de expresión inducible pBAD, provocó que estos mulantes, no sólo recuperasen el rendimiento del 20% de la cepa silvestre sino que dieron lugar a un incremento considerable. De entre los fenotipos analizados en este trabajo, se identificó la cepa de E coli nfsBVpBAD-NfsB, la cual presentaba la deleción del gen nfsB y su posterior complementación con el vector pBAD-NfsB, como la que mejor rendimiento molar alcanzó en el proceso de biotransformación, con un 60% de conversión del precursor en D-DIBOA Las condiciones en las que se lleva a cabo la etapa biológica son más suaves y respetuosas con el medio ambiente que la etapa química, lo que facilita el escalamiento de la síntesis. Sin embargo, la biotransformación con esta cepa de E. coli no solucionaba el segundo problema para abordar el escalado de la producción de D- DI BOA, esto es, no sólo no mejoraba el rendimiento del proceso químico (70%) sino que era inferior (60%). Es por tanto el aumento del rendimiento el reto que serla necesario abordar para que la síntesis de este interesante compuesto pueda ser producido a gran escala. Referencia* bibliográfica*:

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En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una cepa bacteriana perteneciente a la especie E. cotí caracterizada porque dicha cepa presenta el gen lapA y/o el gen fíiQ inactivado/s funcionalmente o completamente o parcialmente eliminados, porque dicha cepa sobreexpresa el gen de la enzima NfsB, y porque dicha cepa es capaz de producir D-DIBOA. 6-CI-D-DIBOA u 8-CI-D-DlBOA, respectivamente, a partir de su precursor 2-(2'-nitrofenoxi)-acetato de etilo, 4 Cl 2-(2 -nitrofenoxi)-acetato de etilo, o 6 CI-2-(2 -nitrofenoxi) acetato de etilo. Preferiblemente, dicha cepa es la cepa BW25113. Más preferiblemente, dicha cepa presenta el gen lapA y el gen fíiQ inactivados funcionalmente o completamente o parcialmente eliminados. Aún más preferiblemente, dicha cepa se corresponde con la cepa depositada ante la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) en fecha 13/12/2018, con número de acceso CECT 9760.

Un segundo aspecto de la invención, se refiere al uso in vitm de la cepa bacteriana tal y como se ha definido en el primer aspecto de la invención, para la producción de D- DIBOA a partir de su precursor 2-(2’-nitrofenoxi)-acetato de etilo. Preferiblemente, dicha producción se realiza en el medio mínimo de cultivo que comprende: MgSQ ₄ ; CaCU; Na ₂ HP0 ₄ ; KH;P0 ₄ ; NaCI; NH ₄ CI; y glucosa. Más preferiblemente, dicha producción se realiza en el medio mínimo de cultivo que comprende: 0,24 g/L MgS0 ₄ ; 0,01 g/L CaCI ₂ ; 11.18 g/L Na2HP0 ₄ ; 3 g/L KH ₂ P04; 0,5 g/L NaCI; 1 g/L NH ₄ CI; 4 g/L glucosa. Aún más preferiblemente, dicha producción se realiza según el método descrito en el ejemplo 1 o 2.

Un tercer aspecto de la invención, se refiere al uso in vitm de la cepa bacteriana tal y como se ha definido en el primer aspecto de la invención, para la producción de 6-CI-D- DIBOA a partir de su precursor 4-CI-2-(2 ^' -nitrofenoxi)-acetato de etilo Un cuarto aspecto de la invención, se refiere al uso in vitm de la cepa bacteriana tal y como se ha definido en el primer aspecto de la invención, para la producción de 8-CI-D- DI BOA a partir de su precursor 6-CI-2-(2 ^* -nitrofenoxi)-acetato de etilo. Un quinto aspecto de la invención, se refiere a un medio cultivo que comprende: 0,24 g/L MgS0 ₄ ; 0,01 g/L CaCl ₂ ; 1 1 ,18 g/L Na ₂ HP0 ₄ ; 3 g/L KH ₂ P0 ₄ ; 0,5 g/L NaCI; 1 g/L NKiCI; 4 g/L glucosa Preferiblemente, dicho medio de cultivo del quinto aspecto de la invención, se utiliza para la producción de D-DIBOA a partir de su precursor 2-(2'- nitrofenoxi)-acetato de etilo. Más preferiblemente, dicho medio de cultivo se utiliza para la producción con una cepa bacteriana perteneciente a la especie E. cotí caracterizada porque dicha cepa sobreexpresa el gen de la enzima NfsB. Aún más preferiblemente, dicha cepa bacteriana está caracterizada porque dicha cepa presenta el gen lapA y el gen ff/Q inactivados funcionalmente o completamente o parcialmente eliminados, y porque dicha cepa sobreexpresa el gen de la enzima NfsB.

Un sexto aspecto de la invención se refiere al procedimiento de síntesis biológica del D- DIBOA utilizando como biocatalizador la cepa de E. coli según cualquiera de las reividicaciones 1 a 4. empleando como precursor 2-(2 -nitrofénoxij-acetato de etilo, donde dicho procedimiento comprende las siguientes etapas; a. Cultivar la cepa de E. coli en el medio de cultivo definido en cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7; b. Inducir a la bacteria para la expresión de la proteina NfsB; c. Adicionar el precursor 2-(2 ^' -nitrofenoxi)-acetato de etilo; d. Opcionalmente, adicionar nuevos lotes de sustrato en el medio de cultivo en distintos tiempos de biotransfbrmadón para obtener mayores rendimientos y/o concentraciones del producto.

Un séptimo aspecto de la Invención se refiere al procedimiento de síntesis del D- DIBOA mediante una estrategia alternativa de biocatálisís usando la enzima NfsB purificada en una reacción química, preferiblemente con un medio tamponado con fosfato y artadiendo el cofactor de reducción NADH, más preferiblemente utilizando un procedimiento como el descrito en el ejemplo 4.

Un octavo aspecto de la invención se refiere al procedimiento de síntesis del 6-CI-D- DIBOA mediante una estrategia alternativa de biocatálisís usando la enzima NfsB purificada en una reacción química, preferiblemente con un medio tamponado con fosfato y añadiendo el cofactor de reducción NADH, más preferiblemente utilizando como procedimiento el descrito en el ejemplo 5

Un noveno aspecto de la invención se refiere al procedimiento de síntesis del 8-CI- D-DIBOA mediante una estrategia alternativa de blocatállsis usando la enzima NfsB purificada en una reacción química, preferiblemente con un medio tamponado con fosfato y añadiendo el cofactor de reducción NADH, más preferiblemente utilizando como procedimiento el descrito en el ejemplo 6

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Teniendo en cuenta el estado del arte, la necesidad de encontrar nuevas cepas, metodologías y/o condiciones de cultivo que mejoren el rendimiento de la biotransfbrmación es de especial interés para la producción biotecnológica del D- DIBOA.

En esta invención se describe la metodología de optimización de la síntesis biológica del D-DIBOA a partir de su precursor químico, 2-(2'-nitrofenoxi)-acetato de etilo. Para ello, se describen dos metodologías biocatallticas: la primera de ellas consiste en una biocatálisis celular, en la que se emplean como catalizadores células vivas de E. cotí con un fondo genético apropiado en las que se sobreexpresa la enzima NfsB y que actúan como fábricas celulares productoras de D-DIBOA La segunda, es una biocatálisis mediante enzima purificada, en la que se emplea la enzima NfeB producida mediante la tecnología del ADN recombinante en E. coli, es un proceso en el que es necesario el cofactor de oxidorreducción NADH y una solución tamponada con fosfato de sodio. En este caso el uso de la forma reducida del cofactor NADH encarece el proceso, pero se consigue que la biotransformadón sea más rápida que en la biocatálisis celular.

A) BIOCATÁLISIS CELULAR. En este apartado se describe la metodología para el uso de biocatalizadores celulares, empleando para ello una cepa de E. cotí modificada genéticamente para alcanzar rendimientos de hasta el 100% (frente al 70% de la síntesis química y el 60% de la síntesis biológica previamente reportada) y un aumento en la concentración de D-DIBOA en el medio de cultivo de hasta un 379% respecto a lo descrito en la literatura en los procesos de biotransformación. Además, esta producción se obtiene en un medio de cultivo definido, frente al uso de medios de cultivo complejos reportados anteriormente, lo que facilitará la futura purificación del producto. Todo ello se lleva a cabo bajo unas condiciones suaves y respetuosas con el medio ambiente, ya que el proceso se realiza en un medio acuoso y se minimiza el uso de solventes orgánicos. El rendimiento de la reacción, la concentración de producto alcanzada y las condiciones en que se realiza hacen que la producción de D-DIBOA mediante esta metodología sea potencialmente escalable, pudiéndose producir cantidades adecuadas para su explotación comercial. El proceso de biotransformación de D-DIBOA a partir del precursor se realiza en un sistema discontinuo, en matraces Erienmeyer de 250 mL. Bajo unas condiciones especificas, la cepa es utilizada como un biocatalizador capaz de transformar biológicamente el precursor (siendo éste el sustrato de la reacción) y convertirlo en D- DIBOA. Como se ha descrito en el estado del arte, este concepto ya fue reportado por Valle y col. (2012), sin embargo, la presente invención ha llevado a cabo la modificación de los siguientes parámetros para la optimización el proceso. i. Cepa de E. cali empleada en el bioproceso ii Medio de cultivo iii Temperatura de crecimiento del cultivo microbiano iv. Fase de inducción de la expresión de la enzima v Inoculación del medio de cultivo vi. Fase de adición del precursor al medio de cultivo vii.Modo de alimentación

(I) La cepa de E. cotí AlapA&fliQ:: kan/pBAD-NfsB (n° de registro: CECT 9760) es utilizada para llevar a cabo el proceso de la presente invención. Esta cepa fue construida a partir del mulante simple lapA (expresa la proteina LapA implicada en el ensamblaje del lipopolisacárido de la pared celular), adquirida de la colección de The Col! Genetic Stock Center (CGSC). En esta cepa se deledonó el gen fliQ (expresa la proteina FIIQ implicada en la bioslntesis del flagelo) usando la metodología de mutagénesis dirigida mediante recombinación homóloga (Datsenko y Wanner, 2000). La elección de estas dos mutaciones para la construcción del doble mulante fue fruto de un trabajo previo de selección sobre los 3985 mulantes simples de los que constan la Keio Collection de NAIST (Nara Institute of Science and Technology. Kyoto) (Baba et al., 2006), en base a un diserto racional en el que se seleccionaron muíanles que pudiesen potencialmente aportar mayor disponibilidad de los cofactores NADH, NADPH o mayor disponibilidad de recursos metabólicos (energía) al proceso de biotransfbrmación. Se consideró este criterio debido a que la enzima NfsB requiere dos moléculas de los cofactores NADH o NADPH en su forma reducida para poder llevar a cabo la reducción del grupo nitro del precursor. Estos cofactores pasan entonces a su forma oxidada (NAD* o NADP*). siendo su regeneración un factor limitante en el proceso (Figura 7). En concreto, se preseleccionaron aquellos genes que pudieran estar relacionados con rutas metabólicas que requieran la reducción de éstos u otros cofactores, como pueden ser ciertas rutas de bioslntesis de macromoléculas, utilización de carbono, intermediarios del metabolismo central, del metabolismo energético o de producción de energía o transporte a través de la membrana.

En base a los criterios expuestos, se seleccionaron 34 cepas mulantes simples, que fueron modificadas para que sobreexpresasen de forma inducible la nitrorreductasa NfsB. La sobreexpresión se controla mediante la adicción al medio de cultivo del compuesto L-arabinosa, ya que este gen fue clonado en el vector de expresión inducible pBAD (vector pBAD-NfsB), previamente construido por los inventores. A continuación, se testó la capacidad de cada cepa construida para biotransformar el precursor en D- DIBOA (Figura 8). Para cuantificar los rendimientos de biotransfbrmación, las células fueron retiradas mediante centrifugación y el medio de cultivo fue analizado mediante HPLC con una columna C18 según metodología previamente desarrollada por el grupo (Valle et al , 2011 ).

A partir de este estudio se seleccionaron sólo aquellos fondos mulantes que mejoraban el rendimiento de la cepa silvestre (40%) por encima de un 20%, con la intención de realizar mulantes múltiples que permitiesen incrementar los rendimientos obtenidos en los mulantes simples. El objetivo era obtener una cepa mulante múltiple que fuese capaz de biotransformar el precursor en D-DIBOA con rendimientos superiores al 60% reportado para la biotransfbrmación y el 70% reportado en la síntesis química. En el extenso screening realizado, 19 cepas mulantes mejoraron la producción de D-DIBOA respecto a la cepa de referencia, de las cuales sólo 4 incrementaron en un 20% los valores de la misma. Por el contrario, los 15 fondos genéticos restantes no solo no mejoraron los rendimientos, sino que presentaron una producción inferior a la cepa de referencia (figura 8). De las 4 cepas que aumentaron notablemente el rendimiento de la reacción, el mulante sencillo ,MapA fue el que alcanzó incrementos más altos, con valores que superan los previamente reportados en biocatálisis y alcanzando rendimientos próximos al proceso químico (68%). Los otros tres mulantes que aumentaron también de forma significativa, aunque en menor medida, el rendimiento de ¡a reacción fueron: Afl/Q, &nuoG y AfadR (Figura 9). No obstante, el mulante AfliQ mostraba una característica interesante y distintiva, ya que fue capaz de alcanzar altos niveles de biotransformación en menor tiempo que cualquier otro de los mulantes ensayados Dado que ambos mulantes no estaban metabólicamente relacionados, se razonó que una cepa que careciese de actividad para ambos genes podría mejorar las favorables características de biotransformación de ambas cepas, por lo que se optó por construir el doble mulante AlapAAfíiQ. Para ello, se generó un doble mulante a partir del mulante simple MapA mediante la metodología descrita por Datsenko y Wanner (2000), descrita en el ejemplo 4.

La cepa construida A lapA&fliQ resultó ser un fondo genético óptimo para la síntesis de D-DIBOA mediante la sobreexpresión del enzima NfsB, alcanzándose rendimientos del 76% (Figura 10), lo que superaba el rendimiento de la reacción química

Posteriormente, se procedió a la optimización de las condiciones de cultivo comenzando por el aumento de la temperatura de incubación desde los 30 °C, previamente reportados en la literatura, hasta los 37 °C, lo cual permitió incrementar el rendimiento hasta el 90% (ver punto (iii) de la presente invención (Figura 11 )).

Además, tal y como se expone en los ejemplos de invención con esta cepa se ha logrado alcanzar rendimientos del 100%, algo no conseguido hasta ahora ni en la síntesis química ni en procesos biotecnológicos. Adicionalmente, se ha incrementado la concentración en el medio de cultivo hasta 375% respecto a lo previamente reportado en procesos de biotransformación. (¡i) se sustituyó el medio complejo Luria Bertani (LB) por un medio mínimo definido debido a la mayor estabilidad que presenta el precursor en este medio frente al LB Tomando como base el medio mínimo mineral M9 con glucosa (Green y Sambrook, 2001), se diseñó un medio de cultivo más sencillo que facilitará el proceso de purificación del D DIBOA, compuesto de:

El medio de cultivo LB es utilizado solamente para crecer la bacteria en las etapas previas a la biotransformación. (iii) La temperatura de cultivo durante la biotransformación es de 37 °C en lugar de los 30 °C reportados previamente.

(iv) La inducción de la expresión de la protelna NfsB se realiza mediante la adición de 0,02% de L-arabinosa en el pre-inóculo y manteniendo esta concentración en todo el proceso, en lugar de añadirlo en cultivo en crecimiento a una densidad óptica medida a 600 nm de longitud de onda (OD$oonm) de 0,6.

(v) El pellet resultante de la centrifugación de 10 mL de bacteria crecida e inducida durante 12 h en medio M9 modificado es resuspendido en 100 mL del mismo medio fresco.

(vi) El precursor es añadido al medio, a una concentración de 2,2 mM, cuando el cultivo alcanza una ODeoonm de 0,6 desde la inoculación (considerado como tiempo=0). (vii) La presente invención considera distintos momentos de alimentación del precursor al sistema. Este factor da lugar al desarrollo de dos nuevas estrategias de producción de D-DIBOA:

Estrategia 1 : en esta estrategia se plantea un cultivo alimentado en dos lotes de carga (añadiendo 0,22 mmoles de precursor en cada uno de ellos), uno a tiempo inicial y otro a las 8 horas. El aumento de la cantidad de precursor tratada y las condiciones de cultivo y de operación, se traducen en un incremento de la concentración de D- DIBOA hasta 0,80 g/L, acompañado de un rendimiento del 100% en la biotransformación. Estrategia 2: en la que se plantea un cultivo alimentado en tres lotes (añadiendo 0,22 mmoles de precursor en cada uno de ellos), uno a tiempo inicial, a las 4 y a las 8 horas. En este caso se logra alcanzar una concentración máxima de 0,91 g/L, sin embargo, el rendimiento, aunque mejora el alcanzado hasta ahora (76,2%), implica una pérdida del precursor del 23,8%, respecto a la estrategia 1.

Ambos procesos tienen en común las primeras etapas del procedimiento. Asi, en primer lugar, se utiliza el medio de cultivo LB para crecer un inóculo de la bacteria. Una vez crecido el inóculo, el medio LB se retira mediante centrifugación y es sustituido por el medio mínimo mineral M9 modificado, en el cual se llevará a cabo el proceso de biotransformación. Los reactivos que son necesarios añadir al medio de cultivo para la síntesis de D-DIBOA son los siguientes:

• Antibióticos. La cepa A/apAA/WQ/pBAD-NfsB presenta resistencia a los antibióticos kanamicina y ampicilina, por lo que, para descartar posibles contaminaciones y para evitar la pérdida del plásmido pBAD-NfsB, todos los medios de cultivo utilizados son suplementados con ambos antibióticos a una concentración final de 50 y 100 pg/mL, respectivamente.

• L-arabinosa: para la inducción de la expresión de la proteína NfsB se añade un 0,02% de L-arabinosa al medio de cultivo.

• Precursor: solución de precursor en metanol. En los ensayos realizados se utilizó una solución de 50 mg/mL (222 mM).

B) BIOCATÁLISIS MEDIANTE LA ENZIMA NfsB PURIFICADA. Como alternativa a esta biocatálisis celular, en esta invención se propone la producción de D-DIBOA y sus derivados clorados. 6-CI-D-DIBOA y 8-CI-D-DIBOA. mediante una reacción biocatalizada por la enzima NfsB de E. cofi. Esta estrategia requiere la purificación del enzima, la optimización de la solución de reacción y la selección del compuesto tamponante, pH y cofactor de oxidorreducción más adecuados para llevar a cabo el proceso. Estas tareas han sido llevadas a cabo por los inventores, tal como se describe en los ejemplos 4, 5 y 6, Utilizando este procedimiento se alcanzan rendimientos del 63% en la producción de D-DIBOA y para ello son necesarios tan sólo 210 min de reacción frente a las 24 ó 26 horas requeridas para las estrategias con célula viva. La biocatálisis mediante la enzima NfsB purificada presentó mayores rendimientos de transformación para la producción de los derivados dorados, alcanzado valores del 81 % para el 6-CI-D-DIBOA (precursor 4-CI-2-(2 ^' -n¡trofenoxi) acetato de etilo) y del 97% para el 8-CI-D-DIBOA (precursor 6-CI-2-(2‘-nitrofenoxi)-acetato de etilo) (Figuras 15 y 16). Además, los tiempos en alcanzar estos rendimientos disminuyeron hasta 150 min en ambos casos. Para ello se utiliza esta enzima producida mediante tecnología del ADN recombinante y purificada mediante cromatografía de afinidad según se describe a continuadón.

Para la obtención de la enzima NfsB, el gen nfsB fue donado en el vector de expresión pBiEx™ (Novagen) mediante las enzimas de restricción Hiad III (5 ) y SamHI (3 ), de modo que expresa el gen nfsB fusionado a una secuencia de polihistidinas. El plásmído resultante, pBiEx-NfcB fue transformado en la cepa de E. coli BL21 Star (Novagen) para la producción de la proteina mediante la inducción de expresión con IPTG (1 mM) durante 4 horas a partir de células crecidas en cultivo exponencial. La obtención del extracto proteico se llevó a cabo mediante sonicación de la biomasa de bacterias inducidas y previamente centrifugadas en un tampón fosfato 50 mM (pH 7,5), comprobándose mediante westem-blot, con un anticuerpo anti-histidina, que la proteina se encontraba en la fracción soluble. De dicha fracción se purificó la enzima NfsB mediante cromatografía de afinidad aprovechando la cola de poli-histidinas y utilizando una columna de afinidad con iones de níquel inmovilizados (columna Ni-NTA, GE- Healthcare). La enzima fue eluída de la columna con una solución 0,5 M de imidazol. El imidazol fue posteriormente eliminado mediante diálisis frente al buffer de reacción.

La enzima purificada fue utilizada como biocatalizador para la producción de D-DIBOA, 6-CI-D-DIBOA y 8-CI-D-DIBOA a partir del sus correspondientes precursores, 2-(2 - nitrofenoxi)-acetato de etilo, 4-CI-2-(2 -nitrofenoxi)-acetato de etilo y 6-CI-2-(2 ^* - nitrofenoxi)-acetato de etilo, tal como se indica en los ejemplos 4, 5 y 6. respectivamente.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Fórmula general del esqueleto (2H)-1 ,4-benzoxacin-3(4H)-ona.

Figura 2. Fórmula del DIBOA. Figura 3. Esquema de la síntesis de 2H-1 ,4-benzoxacin-3(4H)-ona patentada por Jernow y col.. 1975.

Figura 4. Esquema de la síntesis de los quelantes de zinc de DIBOA, patentada por Tipton, 1975. Figura 5. Fórmulas de los compuestos sintetizados en la presente invención: D-DIBOA (X), 6-CI-D-DIBOA (XI) y 8-CI-D-DIBOA (XII).

Figura 6. Esquema de la síntesis de D-DIBOA optimizada por Maclas y col. (2006) 2-nitrofenol (IV); Precursor, 2-(2 ^' -nitrofenoxi)-acetato de etilo (XIII); D-DIBOA (X).

Figura 7. Esquema de la reacción catalizada por la enzima NfsB. Para la síntesis de D- DIBOA. En la síntesis de una molécula de D-DIBOA se consumen dos NAD(P)H. La regeneración de este cofactor (*) es un factor limitante del proceso.

Figura 8. Resultados del screening en los 34 mulantes de la colección Keio seleccionados. En el eje X se muestran rendimientos de biotransformadón de los mulantes simples estandarizados respecto a las cepa de referencia. Las barras en negro muestran los 4 mulantes que mayor incremento de rendimiento en la producción de D- DIBOA presentaron ( AlapA , AfíiQ, AnuoG y AfadR).

Figura 9. Concentración de D-DIBOA producida por la cepa de referencia y los 4 mulantes simples que mayor producción de D-DIBOA biotransfdrman

Figura 10. Concentración de D-DIBOA alcanzada por los mulantes simples ¡JapA y AfíiQ y por el mulante doble AlapAAfíiQ.

Figura 11. Efecto del incremento de temperatura en la producción de D-DIBOA por el doble mulante AiapAAfíiQ.

Figura 12. Ejemplo 1. Producción de D-DIBOA utilizando la cepa AiapAAfíiQ mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 1. Figura 13. Ejemplo 2 Producción de D-DIBOA utilizando la cepa AiapAAfíiQ mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 2 Figura 14. Ejemplo 4 Cinética de la producción de D-DIBOA a partir de su precursor empleando la enzima NfsB aislada como biocatallzador.

Figura 15. Ejemplo 5. Cinética de la producción de 6-Cl-D-DIBOA a partir de su precursor 4-CI-2-(2 ^' -nitrofenoxi)-acetato de etilo empleando la enzima NfsB aislada como biocatallzador.

Figura 16. Ejemplo 6. Cinética de la producción de 8-CI-D-DIBOA a partir de su precursor 6-Cl-2-(2 ^' -nitrofénoxiy-acetato de etilo empleando la enzima NfsB aislada como biocatallzador.

EJEMPLO DE REALIZACIÓN CONCRETA DE LA INVENCIÓN

EJEMPLO 1.

Método para obtener un 100% en el rendimiento de biotransformación de D-DIBOA a partir del precursor.

A continuación, se describe el método de producción de D-DIBOA para la estrategia 1 , cultivo alimentado en dos lotes que se realiza en los siguientes 7 pasos:

1. Sembrar 1 colonia de la cepa £. coH ¿x/apAaflrQ/pBAD-NfSB previamente crecida en placa Petri en medio LB-agar en 5 mL de medio LB. Incubar 8-10 horas a 37 °C y 200 rpm.

2 Centrifugar el cultivo durante 10 minutos, 3.000 xg. Descartar el sobrenadante.

3. Resuspender la biomasa en 100 mL de medio mínimo M9 modificado. Inducir con L-arabmosa (0,02%) e Incubar durante 8-10 h a 37 °C y 200 rpm.

4. Centrifugar 10 mL. del cultivo durante 10 minutos, 3.000 x g. Descartar el sobrenadante y resuspender la biomasa en 100 mL de medio mínimo M9 modificado suplementario con i.-arabinosa (0,02%) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL.

5 Incubar a 37 °C y 200 rpm hasta que la ODeocnm del cultivo sea 0,6 Añadir 1 mL del stock precursor, que contiene 0,22 mmol.

6. Incubar a 37 °C y 200 rpm durante 8 horas y volver a añadir 1 mL del stock precursor, que contiene 0,22 mmol.

7. Incubar a 37 °C y 200 rpm durante 14 horas más. Al finalizar este procedimiento se obtiene un volumen de cultivo de 100 mL, en el que se ha añadido un total de 4,4 mM de precursor. Siendo el rendimiento de biotransformación del 100%, y puesto que la relación molar precursorD-DIBOA es 1 :1 , se obtienen 4,4 mM D-DIBOA (0.8 g/L) (Figura 12).

EJEMPLO 2.

Método para obtener una concentración de D-DIBOA de 379% respecto a lo recortado en el estado del arte.

El procedimiento de la estrategia 2 es similar al anterior, pero con una alimentación en tres lotes, se compone de 8 pasos de los cuales los 5 primeros coinciden con los de pasos 1-5 de la estrategia 1 :

1 . Sembrar 1 colonia de la cepa E. coli MapA&fliQIpBAD-Ní&B crecida en placa Petri en medio LB-agar en 5 mL de medio LB. Incubar 8-10 horas a 37 °C y 200 rpm.

2. Centrifugar el cultivo durante 10 minutos, 3.000 xg. Descartar el sobrenadante.

3. Resuspender la biomasa en 100 mL del medio mínimo M9 modificado. Inducir con L-arabinosa e incubar 8-10 horas a 37 °C y 200 rpm.

4 Centrifugar 10 mL del cultivo durante 10 minutos, 3.000 xg. Descartar el sobrenadante y resuspender la biomasa en 100 mL de medio mínimo M9 modificado suplementado con L-arabinosa en un matraz Erlenmeyer de 250 mL.

5. Incubar a 37 °C y 200 rpm hasta que la ODeocnm del cultivo sea 0,6. Añadir 1 mL del stock precursor, que contiene 0,22 mmol.

6. Incubar a 37 °C y 200 rpm durante 4 horas y volver a añadir 1 mL del stock precursor, que contiene 0,22 mmol.

7. Incubar a 37 ^e C y 200 rpm durante las 4 horas siguientes y añadir 1 mL del stock precursor, que contiene 0,22 mmol

8 Incubar a 37 °C y 200 rpm durante 14 horas más.

En este caso, al finalizar el procedimiento se obtiene un volumen de cultivo de 100 mL, en el que se ha añadido un total de 6,6 mM de precursor, y dado que el rendimiento es del 76,2%, resulta una concentración final de D-DIBOA de 5,05 mM (0,91 g/L) de D- DIBOA, siendo la concentración más alta alcanzada (Figura 13).

EJEMPLO 3. Construcción de la cepa doble mulante ¿ JapAAfíiQ

La metodología de mutagénesis mediante recombinación homóloga descrita por Datsenko y Wanner (2000) fue la empleada para la construcción del doble muíante En un primer paso, se eliminó el casseffeAnarcador de kanamlcina insertado en el muíante simple AlapA (AlapA kan) mediante la transformación con el plásmido pCP20 (que tiene la resistencia al doranfenicol y ampicilina como marcadores de selección) que permite la expresión de la enzima flipasa (FLP) que recombina las secuencias FRT que flanquean el gen de resistencia a la kanamicina, eliminándolo del genoma de la bacteria Este plásmido fue suprimido mediante la incubación a 42 °C, ya que es termosensible, y los clones fueron seleccionados mediante replica plating en placas de L.B agar suplementarias en kanamincina o doranfenicol, obteniéndose de este modo la cepa AlapA.

Para eliminar el gen fl/Q de la cepa AlapA, en primer lugar, se amplificó mediante PCR el casette de resistenda a la kanamidna a partir del plásmido molde pKD13 utilizando oligonudeótidos que en el extremo 3 ^' contenían secuencias complementarias al plásmido y en el extremo 5 ^" secuencias homólogas flanqueantes al gen fliQ (Tabla 1 ). De esta forma se generó un fragmento de ADN que contenía el gen de resistenda al antibiótico flanqueado por las secuencias de FRT y secuencias homólogas al gen diana en cada extremo. El producto generado mediante PCR fue introducido por electroporación en el mutane AlapA, previamente transformado con el vector pKD46, que es codificante para el sistema de recombinadón Red.

EJEMPLO 4,

Método para obtener D-DIBOA a partir del precursor utilizando la enzima NfsB aislada como catalizador.

Se trata de un procedimiento distinto a tos anteriores ya que, en este caso, se trabaja con la enzima NfsB producida mediante la tecnología del ADN recombinante y purificada mediante cromatog rafia de afinidad. Los ensayos realizados se llevan a cabo en tubos de 5 mL, con un volumen de reacción de 4 mL. Para evitar la inactivación de la enzima, durante la preparación de la reacción enzimática se mantiene la temperatura de los reactivos a 4 °C. Las condiciones de reacción son las siguientes: 50 mM de tampón fosfato (NaHzP0 ₄ + K2HPO4) a pH 7; 1 mM de precursor; 1 pg de enzima NfsB purificada y 5 mM de NADH. La reacción se lleva a cabo a 30 °C durante 210 min Para detener la reacción se añade 1 M de hidrocloruro de guanidina y la concentración de D-DIBOA se analiza mediante HPLC con columna C18.

En este caso se alcanza un rendimiento de un 65%, lo que implica una producción de D-DIBOA de 0,65 mM (Figure 14).

EJEMPLO 5,

Método para obtener 6-CI-D-OIBOA a partir de su precursor utilizando la enzima NfsB aislada como catalizador. Se trata de un proceso similar al anterior, ya que se utiliza la enzima NfsB purificada como biocatalizador, aunque en este caso el compuesto empleado como precursor y el buffer de reacción en los que se lleva a cabo la reacción son diferentes. Los ensayos realizados se llevan a cabo en tubos de 5 mL, con un volumen de reacción de 4 mL Para evitar la inactivación de la enzima, durante la preparación de la reacción enzimática se mantiene la temperatura de los reactivos a 4 °C. Las condiciones de reacción son las siguientes: 50 mM de tampón fosfato (NahhPO* + K2HPO*) a pH 5,75; 1 mM de precursor (4-CI-2-(2 -nitrofenoxi)-acetato de etilo); 1 pg de enzima NfsB purificada y 5 mM de NADH. La reacción se lleva a cabo a 30 °C durante 150 min Para detener la reacción se añade 1 M de hidrocloruro de guanidina y la concentración de 6-CI-D-DIBOA y su precursor se analiza mediante HPLC con una columna C18 En este caso se alcanza un rendimiento de un 61%, lo que implica una producción de D DI BOA de 0,81 mM (Figura 15).

EJEMPLO 6.

Método cara

aislada como catalizador.

De la misma manera que los ejemplos anteriores, se trata de una biocatálisis en las que se utiliza la enzima NfsB purificada como biocatalizador, empleando un precusor diferente y un buffer de reacción distinto. Los ensayos realizados se llevan a cabo en tubos de 5 mL, con un volumen de reacción de 4 mL. Para evitar la inactivación de la enzima, durante la preparación de la reacción enzimática se mantiene la temperatura de los reactivos a 4 "C. Las condiciones de reacción son las siguientes. 50 mM de tampón fosfato (NaH ₂ P04 + K2HPO4) a pH 6; 1 mM de precursor (6-CI-2-(2 ^' -n¡trofenoxi)- acetato de etilo); 1 pg de enzima NfsB purificada y 5 mM de NADH. La reacción se lleva a cabo a 30 °C durante 150 min. Para detener la reacción se añade 1 M de hldrocloruro de guanidina y la concentración de 6-CI-D-DIBOA y su precursor se analiza mediante HPLC con una columna C18.

En este caso se alcanza un rendimiento de un 97%, lo que implica una producción de D-DIBOA de 0,97 mM (Figura 16).