STABILITE METABOLIQUE AMELIOREE

La présente invention concerne des nouveaux oligo- et polysacchandes de synthèse présentant au moins une liaison covalente avec la biotine ou un dérivé de la biotine et possédant les activités pharmacologiques anticoagulante et antithrombotique de l'héparine.

La demande de brevet WO 02/24754 décrit des polysacchandes de synthèse qui présentent une liaison covalente avec la biotine (acide hexahydro-2-oxo-7H-thiéno[3,4- d]imidazole-4-pentanoïque) ou avec un dérivé de la biotine. De tels polysacchandes ont une activité antithrombotique qui les rend utilisables en tant qu'agents anticoagulants et possèdent, en outre, l'avantage de pouvoir être rapidement neutralisés par un antidote spécifique, en situation d'urgence. Cet antidote spécifique est l'avidine (The Merck Index, Twelfth édition, 1996, M.N. 920, pages 151-152) ou la streptavidine, deux protéines tétramériques de masses respectives égale à environ 66 000 et 60 000 Da, qui possèdent une très forte affinité pour la biotine.

La demande de brevet WO 02/24754 décrit en particulier le composé suivant, connu sous le nom d'idrabiotaparinux :

Dans l'organisme des mammifères, l'idrabiotaparinux est métabolisé en partie au niveau de la liaison amide adjacente au groupe biotine, produisant ainsi un composé pentasaccharidique portant une chaîne aminé -NH-CO-(CH ₂ )5-NH ₂ sur la première unité glucosamine, comme décrit dans la demande de brevet WO 2010/023374. Il peut être souhaitable, notamment dans le cadre de développements cliniques de molécules d'intérêt pharmaceutique, de limiter, voire prévenir la métabolisation de ce type de composés. On a maintenant identifié de nouveaux polysaccharides de structures analogues à certains de ceux décrits dans la demande de brevet WO 02/24754, qui possèdent des propriétés antithrombotiques et une capacité de neutralisation, par exemple par l'avidine, comparables à ceux décrits dans cette demande de brevet, mais qui présentent en outre une stabilité métabolique améliorée.

D'une manière générale, l'invention concerne donc des polysaccharides synthétiques à activité antithrombotique présentant au moins une liaison covalente avec la biotine ou un dérivé de la biotine, caractérisés en ce que ladite liaison covalente est résistante au clivage métabolique et comprend un enchaînement X choisi parmi -O-, -N(R)-, -N(R)-CO- et -N(R')-CO-N(R")-, dans lesquels R représente un groupe alkyle et R' et R", identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre des atomes d'hydrogène ou des groupes alkyles.

Au sens de la présente invention, et sauf mention différente dans le texte, on entend par "alkyle" un groupe aliphatique saturé, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, avantageusement un groupe méthyle.

La biotine, ou acide hexahydro-2-oxo-7H-thiéno[3,4-d]imidazole-4-pentanoïque, est le composé de formule suivante:

A titre de dérivés de la biotine, on peut citer ceux indiqués dans le catalogue Pierce 1999-2000, pages 62 à 81 , ou dans la demande de brevet WO 02/24754.

Plus particulièrement, l'invention concerne des polysaccharides synthétiques à activité antithrombotique présentant au moins une liaison covalente avec la biotine ou un dérivé de la biotine, caractérisés en ce que ladite liaison covalente représente enchaînement de formule T ci-après: dans laquelle j est un nombre entier pouvant prendre toute valeur de 1 à 10 et X est choisi parmi les enchaînements -O-, -N(R)-, -N(R)-CO- et -N(R')-CO-N(R")-, où R représente un groupe alkyle et R' et R", identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre des atomes d'hydrogène ou des groupes alkyles. Encore plus particulièrement, l'invention concerne des polysaccharides synthétiques à activité antithrombotique présentant au moins une liaison covalente avec la biotine ou un dérivé de la biotine, caractérisés en ce que ladite liaison covalente avec la biotine ou le dérivé de biotine répond à la formule suivante :

dans laquelle j est un nombre entier pouvant prendre toute valeur de 1 à 10, k est un nombre entier pouvant prendre toute valeur de 4 à 10, et X est choisi parmi les enchaînements -O-, -N(R)-, -N(R)-CO- et -N(R')-CO-N(R")-, où R représente un groupe alkyle et R' et R", identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre des atomes d'hydrogène ou des groupes alkyles.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdits polysaccharides ont une longueur de 5 sucres, c'est-à-dire qu'il s'agit de pentasaccharides.

De façon générale, la présente invention a pour objet les polysaccharides de formule

(I) : dans laquelle :

- le trait ondulé, désigne une liaison située soit au-dessous soit au-dessus du plan du cycle pyranosique,

- la formule :

désigne un polysaccharide contenant n unités monosaccharidiques identiques différentes, lié par son carbone anomère à Pe,

- la formule : est une représentation schématique d'une unité monosaccharidique à structure pyranosique choisie parmi les hexoses, les pentoses et les sucres desoxy correspondants, cette unité étant liée par son carbone anomère à une autre unité monosaccharidique, et les groupes hydroxy de cette unité étant substitués par des groupes Ri identiques ou différents, étant tel que défini ci-dessous,

- Pe représente un pentasaccharide de structure :

- h est égal à 1 ou 2,

- n est un entier et peut prendre toute valeur de 0 à 25,

- Ri représente l'enchaînement -T-Biot, un groupe (C C ₆ )alcoxy ou un groupe -OS0 ₃ ^" , - R ₂ représente l'enchaînement -T-Biot, un groupe (CrC ₆ )alcoxy ou un groupe -OS0 ₃ ^" ,

- R ₃ représente l'enchaînement -T-Biot ou un groupe (d-C ₆ )alcoxy,

- R, représente l'enchaînement -T-Biot, un groupe (C CeJalcoxy ou un groupe -OS0 ₃ ^" ou bien R4 constitue un pont -0-CH ₂ -, le groupe -CH ₂ - étant lié à l'atome de carbone porteur de la fonction carboxylique sur le même cycle ;

étant entendu que l'un au moins des substituants R^ R ₂ , R ₃ ou R ₄ représente l'enchaînement -T-Biot,

- W représente un atome d'oxygène ou un groupe méthylène,

- T représente l'enchaînement : dans lequel j est un nombre entier pouvant prendre toute valeur de 1 à 10 et X est choisi parmi les enchaînements -O-, -N(R)-, -N(R)-CO- et -N(R')-CO-N(R")-, dans lesquels R représente un groupe alkyle et R' et R", identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre des atomes d'hydrogène ou des groupes alkyles ;

- Biot représente le groupe :

dans lequel k est un nombre entier pouvant prendre toute valeur de 4 à 10 ; ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.

De tels polysaccharides selon la présente invention présentent une stabilité métabolique améliorée par rapport aux polysaccharides dans lesquels T représente l'enchaînement -NH-CO-(CH ₂ ) _r NH-CO-, où j est un nombre entier pouvant prendre toute valeur de 1 à 10, tels que ceux décrits dans la demande de brevet WO 02/24754.

Comme indiqué précédemment, on notera que de façon générale dans la présente description un trait ondulé désigne une liaison située soit au-dessous, soit au-dessus du plan du cycle pyranosique.

Les monosaccharides contenus dans Po peuvent être identiques ou différents les uns des autres, les liaisons interglycosidiques peuvent être du type a ou β.

Ces monosaccharides sont avantageusement choisis parmi les hexoses D ou L alose, altrose, glucose, mannose, galose, idose, galactose, talose (dans ce cas h = 2) ou parmi les pentoses D ou L ribose, arabinose, xylose, lyxose (dans ce cas h = 2).

D'autres monosaccharides tels que par exemple les sucres désoxy peuvent également être utilisés (h = 1 et/ou -CH ₂ Ri = CH ₃ ).

La partie polysaccharidique Po peut être constituée de 0 à 25 unités monosaccharidiques alkylées et di- ou trisulfatées.

La partie polysaccharidique Po peut être également constituée de 0 à 25 unités monosaccharidiques alkylées et mono- ou disulfatées.

La partie polysaccharidique Po peut être constituée de 0 à 25 unités monosaccharidiques alkylées non chargées et/ou partiellement chargées et/ou totalement chargées.

Les unités chargées ou non chargées peuvent être dispersées tout au long de la chaîne ou elles peuvent au contraire être groupées en domaines saccharidiques chargés ou non chargés.

Les liaisons entre les unités peuvent être 1 ,2 ; 1 ,3 ; 1 ,4 ; 1 ,5 ; 1 ,6 ; et du type a ou β.

Dans la présente description, il a été choisi de représenter les conformations C ₄ pour l'acide-L-iduronique, ⁴ Ci pour l'acide D-glucuronique, mais il est notoire que, d'une façon générale, la conformation en solution des unités monosaccharides est fluctuante. Ainsi, l'acide L-iduronique peut être de conformation ¹ C ₄ ² S ₀ ou ⁴ d. Selon un de ses aspects, l'invention concerne les polysaccharides de formule (1.1) :

désigne une famille particulière de polysaccharides Po, liés par leur carbone anomère à Pe tel que défini pour (I),

- la formule :

est telle que définie pour (I),

- les groupes sont tels que définis pour (I) et, pour un même monosaccharide, peuvent être identiques ou différents,

- le monosaccharide contenu dans [ ] _m est répété m fois, le monosaccharide contenu dans [ ] _t est répété t fois, le monosaccharide contenu dans [ ] _p est répété p fois,

- m est un entier variant de 1 à 5, t est un entier variant de 0 à 24 et p est un entier variant de 0 à 24 étant entendu que 1 < m + t + p < 25,

ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables. Parmi ces polysaccharides de formule (1.1), les polysaccharides dans lesquels un seul des substituants R ₂ , R3 ou R représente l'enchaînement T-Biot avec T et Biot étant tels que définis pour la formule (I), ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, constituent un sous-groupe de l'invention.

Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne les pentasaccharides de formule (1.2) :

dans lesquels Ri, R ₂ , R3, R4 et W sont tels que définis pour la formule (I), ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.

Parmi ces pentasaccharides de formule (1.2), les pentasaccharides dans lesquels un seul des substituants R^ R ₂ , R ₃ ou R ₄ représente un enchaînement T-Biot, avec T et Biot étant tels que définis pour la formule (I), ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, constituent un autre sous-groupe de l'invention.

Parmi ces pentasaccharides de formule (1.2), l'invention a également pour objet les pentasaccharides de formule (1.3) :

Biot

dans laquelle :

- T et Biot sont tels que définis précédemment,

- R _! représente un groupe (Ci-C ₆ )alcoxy ou un groupe -OS0 ₃ ^" ,

- R ₂ représente un groupe (CVCeJalcoxy ou un groupe -OS0 ₃ ^" , g

- R ₃ représente un groupe (CrC ₆ )alcoxy,

- R ₄ représente un groupe (C^CeJalcoxy ou un groupe -OS0 ₃ ^" , ou bien R ₄ constitue un pont -O-CH2-, le groupe -CH ₂ - étant lié à l'atome de carbone porteur de la fonction carboxylique sur le même cycle,

- W représente un atome d'oxygène ou un groupe méthylène,

ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.

Parmi les composés de l'invention, un sous-groupe de composés est tel que l'indice j (présent dans l'enchaînement T) est égal à 4 ou 5.

Un autre sous-groupe de composés est tel que l'indice k (présent dans le groupe Biot) est égal à 4 ou 5.

L'invention a plus particulièrement pour objet les composés précédemment définis dans lesquels X est choisi parmi les enchaînements -O-, -N(R)- et -N(R')-CO-N(R")-, dans lesquels R représente un groupe alkyle et R' et R", identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre des atomes d'hydrogène ou des groupes alkyles. La structure de tels composés est particulièrement originale en ce qu'elle ne comprend plus de groupe biotine en tant que tel. En effet, le groupe carbonyle naturellement présent au niveau du bras alkylène de la biotine native (extrémité acide pentanoïque), groupe présent dans le composé idrabiotaparinux au niveau du lien amide assurant la liaison entre la biotine et le pentasaccharide, via le linker alkylène, est absent dans ces composés selon l'invention. Malgré cette dénaturation structurale, les composés selon l'invention conservent néanmoins la capacité d'être neutralisés par l'avidine, comme cela sera démontré dans ce qui suit.

Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne les pentasaccharides suivants : - Méthyl (2-désoxy-3,4-di-0-méthyl-2-{[6-({5-[(3aS,4S,6af?)-2-oxohe xahydro-1H- thiéno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentyl}oxy)hexanoyl]amino}-6-0-s ulfonato-a-D- glucopyranosyl)-(1→4)-(2,3-di-0-méthyl-p-D-glucopyranosyl uronate)-(1→-4)-(2,3,6-tri- 0-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1->4)-(2,3-di-0-méthyl- a-L-idopyranosyluronate)- (1- 4)-2,3,6-tri-0-sulfonato-a-D-glucopyranoside, sel de sodium (composé n° 1); - Méthyl (2-οΙέ8θχγ-3,4-(.ί-0-ΓηέίΓΐγΙ-2-{[6-(Γηέί ήνΙ{5-[(338,48,63/?)-2-οχοΓΐβχ3Μγ(_Γθ-·/Η- thiéno[3,4-c ]imidazol-4-yl]pentyl}amino)hexanoyl]amino}-6-0-sulfonato- - glucopyranosyl)-(1→4)-(2,3-di-0-méthyl- -D-glucopyranosyluronate)-(1→4)-(2,3,6-tri- 0-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(2,3-di-0-méthyl-a- L-idopyranosyluronate)- (1→4)-2,3,6-tri-0-sulfonato-a-D-glucopyranoside, sel de sodium (composé n° 2);

- Méthyl (2-désoxy-3,4-di-0-méthyl-2-{[6-(méthyl{5-[(3aS,4S,6af?)- 2-oxohexahydro-1 /-/- thiéno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoyl}amino)hexanoyl]amino}- 6-0-sulfonato-a-D- glucopyranosyl)-(1->4)-(2,3-di-0-méthyl-p-D-glucopyranos yluronate)-(1->4)-(2,3,6-tri- 0-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(2,3-di-0-méthyl-a- L-idopyranosyluronate)- (1→4)-2,3,6-tri-0-sulfonato-a-D-glucopyranoside, sel de sodium (composé n° 3);

- Méthyl (2-désoxy-3,4-di-0-méthyl-2-({5-[({4-[(3aS,4S,6af?)-2-oxoh exahydro-1 H- thiéno[3,4-cf]imidazol-4-yl]butyl}carbamoyl)amino]pentanoyl }amino)-6-0-sulfonato-a-D- glucopyranosyl)-(1- 4)-(2,3-di-0-méthyl- -D-glucopyranosyluronate)-(1→4)-(2,3,6-tri- 0-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1 - 4)-(2,3-di-0-méthyl-a-L-idopyranosyluronate)- (1→4)-2,3,6-tri-0-sulfonato-a-D-glucopyranoside, sel de sodium (composé n° 4).

L'invention englobe les polysaccharides sous leur forme acide ou sous la forme de l'un quelconque de leurs sels pharmaceutiquement acceptables. Dans la forme acide, les fonctions -COO ^" et -S0 ₃ ^" sont respectivement sous forme -COOH et -S0 ₃ H.

On entend par sel pharmaceutiquement acceptable des polysaccharides de l'invention, un polysaccharide dans lequel une ou plusieurs des fonctions -COO ^" ou/et -S0 ₃ ^" sont liées de façon ionique à un cation pharmaceutiquement acceptable. Les sels préférés selon l'invention sont ceux dont le cation est choisi parmi les cations des métaux alcalins et plus préférablement encore ceux dont le cation est Na ⁺ ou K ⁺ .

Dans son principe le procédé de préparation des composés selon l'invention utilise des synthons de base di- ou oligosaccharidiques préparés comme précédemment rapporté dans la littérature. On se référera notamment aux brevets ou demandes de brevet EP 0 300 099, EP 0 529 715, EP 0 621 282 et EP 0 649 854 ainsi qu'aux documents C. van Boeckel, M. Petitou, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1993, 32, 1671-1690. Ces synthons sont ensuite couplés les uns aux autres de façon à fournir un équivalent entièrement protégé d'un polysaccharide selon l'invention. Cet équivalent protégé est ensuite transformé en un composé selon l'invention. L'un des synthons de base évoqués ci-dessus contient une fonction protégée particulière permettant l'introduction ultérieure de la biotine ou du dérivé de biotine, par exemple une fonction aminé latente sous forme de groupe azido ou protégée sous forme de N-phtalimido.

Dans les réactions de couplage évoquées ci-dessus, un di- ou oligosaccharide "donneur", activé sur son carbone anomère, réagit avec un di- ou oligosaccharide "accepteur", possédant un hydroxyle libre. La présente invention concerne un procédé pour la préparation des composés de formule (I) caractérisé en ce que : dans une première étape, un équivalent complètement protégé du polysaccharide (I) désiré, contenant un précurseur protégé du domaine Pe prolongé à son extrémité non réductrice par un précurseur protégé du polysaccharide sulfaté Po est synthétisé, l'un de ces précurseurs contenant notamment une fonction aminé convenablement protégée pour l'introduction ultérieure de la biotine ou du dérivé de biotine; dans une seconde étape, les groupes chargés négativement sont introduits et/ou démasqués ; dans une troisième étape, on déprotège la fonction aminé sur le polysaccharide puis on introduit la biotine ou le dérivé de biotine.

La synthèse de Pe est réalisée selon les méthodes décrites en particulier dans les demandes de brevet publiées sous les numéros WO 98/03554 et WO 99/36443, ainsi que dans la littérature sur les polysaccharides.

La synthèse de la partie polysaccharidique précurseur de Po est réalisée selon des réactions bien connues de l'homme de l'art, en utilisant les méthodes de la synthèse d'oligosaccharides (G.J. Boons, Tetrahedron, 1996, 52, 1095-1121 , WO 98/03554 et WO 99/36443). Typiquement, un oligosaccharide donneur de liaison glycosidique est couplé avec un oligosaccharide accepteur de liaison glycosidique pour conduire à un autre oligosaccharide dont la taille est égale à la somme des tailles des deux espèces réactives. Cette séquence est répétée jusqu'à l'obtention du composé de formule (I) désiré. La nature et le profil de la charge du composé final désiré déterminent la nature des entités chimiques utilisées dans les différentes étapes de la synthèse, selon les règles bien connues de l'homme de l'art. On pourra se référer par exemple à C. van Boeckel, M. Petitou, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1993, 32, 1671-1690 ou encore à H. Paulsen, "Advances in sélective chemical synthèses of complex oligosaccharides" Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 21 , 155-173 (1982).

Les composés de l'invention sont obtenus à partir de leurs précurseurs polysaccharidiques complètement protégés en utilisant l'enchaînement suivant de réactions :

- les fonctions alcool devant être transformées en un groupe O-suIfo et les acides carboxyliques sont déprotégés par l'élimination des groupes protecteurs utilisés durant l'élaboration du squelette,

- les groupes sulfo sont ensuite introduits,

- la fonction aminé du polysaccharide permettant d'introduire la biotine ou le dérivé de biotine est déprotégée,

- la biotine ou le dérivé de biotine est introduit par une réaction classique de couplage amino/acide.

Les composés de l'invention peuvent naturellement être préparés en utilisant différentes stratégies connues par l'homme de l'art de la synthèse des oligosaccharides.

Le procédé décrit ci-dessus est le procédé préféré de l'invention. Toutefois, les composés de formule (I) peuvent être préparés par d'autres méthodes bien connues de la chimie des sucres décrites par exemple dans "Monosaccharides, Their chemistry and their rôles in natural products", P.M. Collins et R.J. Ferrier, J. Wiley & Sons, 1995 et dans G.J. Boons, Tetrahedron, 1996, 52, 1095-1 121.

Les pentasaccharides Pe peuvent donc être obtenus à partir de synthons disaccharidiques de la façon décrite dans la publication de C. van Boeckel, M. Petitou, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1993, 32, 1671-1690.

D'une façon générale, les groupes protecteurs utilisés dans le procédé de préparation des composés (I) sont ceux couramment utilisés dans la chimie des sucres, tels que décrits par exemple dans Protective Groups in Organic Synthesis, TW Greene, John Wiley & sons, New- York, 1981. Les groupes protecteurs sont avantageusement choisis, par exemple parmi les groupes acétyles, halogénométhyles, benzoyles, lévulinyles, benzyles, benzyles substitués, trityles éventuellement substitués, tétrahydropyranyles, allyles, pentenyles, te/Y-butyldiméthylsilyles (tBDMS) ou triméthylsilyléthyles. Les groupes activateurs sont ceux classiquement utilisés en chimie des sucres selon par exemple G.J. Boons, Tetrahedron, 1996, 52, 1095-1121. Ces groupes activateurs sont choisis par exemple parmi les imidates, les thioglycosides, les penténylglycosides, les xanthates, les phosphites ou les halogénures.

En ce qui concerne la façon dont la biotine est liée à l'oligosaccharide ainsi que la nature du dérivé de biotine, la littérature chimique offre d'autres possibilités qu'il est possible de mettre en œuvre par des jeux de groupes protecteurs bien connus de l'homme de l'art. On utilisera de préférence une fonction aminé, ou encore une fonction thiol, ou encore une fonction acide carboxylique ou encore une fonction aldéhyde que l'on fera réagir avec un dérivé de biotine comportant un groupe réactif du type ester activé, maléimide, iodoacétyl ou aminé primaire, la réaction se faisant selon les conditions décrites dans la littérature (cf. Savage et al., Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook; Pierce Chemical Company, 1992).

Le procédé décrit ci-dessus permet d'obtenir les composés de l'invention sous forme de sels. Pour obtenir les acides correspondants, les composés de l'invention sous forme de sels sont mis en contact avec une résine échangeuse de cations sous forme acide. Les composés de l'invention sous forme d'acides peuvent être ensuite neutralisés par une base pour obtenir le sel souhaité. Pour la préparation des sels des composés de formule (I), on peut utiliser toute base minérale ou organique, donnant avec les composés de formule (I), des sels pharmaceutiquement acceptables. On utilise de manière préférentielle comme base l'hydroxyde de sodium, de potassium, de calcium ou de magnésium. Les sels de sodium et de calcium des composés de formule (I) sont les sels préférés.

L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples détaillés qui suivent, relatifs à la préparation de composés selon l'invention. Ces exemples ne sont pas limitatifs et ne font qu'illustrer la présente invention.

Les composés de départ et les réactifs, quand leur mode de préparation n'est pas expressément décrit, sont disponibles dans le commerce ou décrits dans la littérature, ou bien peuvent être préparés selon des méthodes qui y sont décrites ou qui sont connues de l'Homme du métier. Les abréviations suivantes sont utilisées : [ ] _D : pouvoir rotatoire

ESI : Electron Spray Ionisation

h : heure

LC-MS : chromatographie liquide, couplée à la spectrométrie de masse

Me : méthyle

min : minutes

mL : millilitre

TFA : acide trifluoroacétique

T _R : temps de rétention mesuré par LC-MS

Les LC-MS sont effectuées sur un appareil ZQ4000 de marque Waters. La colonne utilisée est une Symetry C18 3.5μιη (2.1x50 mm). L'éluant A est constitué d'H ₂ 0 + TFA 0.005% pH 3.15. L'éluant B est constitué d'acétonitrile + TFA 0.005%. Le gradient varie de 0 à 90% d'éluant B en 10 (ou 30) min + 5 min à 90% d'éluant B. Le débit est de 0.4 mlJmin.

Schéma 1 : préparation du composé 13

Préparation du méthyl 5-r(3aS,4S,6aR)-1 ,3-bis(4-méthoxybenzyl)-2-oxohexahvdro-1 -/- thiénor3,4-dimidazol-4-yllpentanoate (6)

A une solution d'ester de méthyle de D(+)-Biotine ou 5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro- 1 H-thiéno[3,4-d]imidazol-4-yl] pentanoate de méthyle 5 (1 ,80 g, 6,97 mmol) (préparé selon la méthode décrite dans Tetrahedron Letters 1989, 30, 3089-3092) dans le N,N- diméthylformamide (42 mL) sont ajoutés successivement, à 0°C, de l'hydrure de sodium (0,613 g, 15,3 mmol) puis du chlorure de p-méthoxybenzyle (2,9 mL, 20,9 mmol). Après 4 h d'agitation à 0°C, du méthanol (1 ,5 mL) est ajouté. Après 30 min d'agitation, le milieu réactionnel est dilué avec de l'acétate d'éthyle (400 mL). La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium, filtrée puis évaporée à sec. Le résidu ainsi obtenu est engagé directement dans la réaction suivante.

LC-MS m/z 499,2 [(M + H) ⁺ ]. T _R = 9.157 min

Préparation du (3aS,4S,6aR)-4-(5-hydroxypentyl)-1 ,3-bis(4-méthoxybenzyl)tetrahvdro- 1 H-thiénof3,4-d1imidazol-2(3H)-one (7)

Le composé brut 6 (6,97 mmol) est dissous dans le tétrahydrofurane (140 mL) puis à 0°C, une solution 1 M de Li ^' AIH ₄ dans le tétrahydrofurane (7 mL) est ajoutée. Après 1 h30 d'agitation, l'excès de LiAIH ₄ est détruit par addition, à 0°C, de tétrahydrofurane contenant 5% d'eau (30 mL) puis de fe/f-butanol (30 mL) et le complexe est décomposé avec une solution aqueuse saturée de sulfate de sodium (25 mL). Le solvant est évaporé puis le résidu obtenu est dilué avec du dichlorométhane (400 mL). La phase organique est lavée avec de l'eau, séchée sur sulfate de sodium, filtrée puis évaporée à sec. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie flash sur colonne de gel de silice (toluène/acétone 66/34) pour donner le composé 7 (3,05 g, 93% sur les 2 étapes).

LC-MS m/z 471 ,2 [(M + H) ⁺ ]. T _R = 8.251 min

Préparation du (3aS,4S,6aR)-1 ,3-bis(4-méthoxybenzyl)-4-r5-(prop-2-en-1- yloxy)pentyl1tetrahvdro-1 H-thiénoi3,4-d1imidazol-2(3H)-one (8)

A une solution du composé 7 (3,05 g, 6,48 mmol) sont ajoutés successivement, à 0°C, de l'hydrure de sodium (1 ,30 g, 32,4 mmol) et du 3-iodopropène (2,4 mL, 26 mmol).

Après 5 h d'agitation à 0°C, du méthanol (2,7 mL) est ajouté. Après 30 min d'agitation, le milieu réactionnel est concentré à sec puis repris avec de l'acétate d'éthyle (450 mL). La phase organique est lavée avec de l'eau, séchée sur sulfate de sodium, filtrée puis évaporée à sec. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie flash sur colonne de gel de silice (toluène/acétone 85/15) pour donner le composé 8 (3,02 g,

91 %).

LC-MS m/z 51 1 ,3 [(M + H) ⁺ ]. T _R = 1.670 min Préparation du méthyl (4E,Z)-6- 5-r(3aS.4S.6aR)-1.3-bis(4-méthoxybenzyl)-2- oxohexahvdro-1 H-thiénof3,4-dlimidazol-4-vnpentyl)oxy)hex-4-enoate (9)

Une solution du composé 8 (2,16 g, 4,23 mmol), de méthyl-4-pentanoate (1 ,05 mL, 8,47 mmol) et du catalyseur de Grubbs (177 mg, 0,21 mmol) dans le dichlorométhane (42 mL) est chauffée à 45°C pendant 16 h. Après concentration du milieu réactionnel, le résidu obtenu est purifié par chromatographie flash sur colonne de gel de silice (toluène/acétate d'éthyle 36/64) pour donner le composé 9 (675 mg, 27%).

LC-MS m/z 597,5 [(M + H) ⁺ ]. T _R = 1.654 min Préparation du méthyl 6-(f5-r(3aS,4S,6aR)-1 ,3-bis(4-méthoxybenzyl)-2-oxohexahvdro- 1H-thiéno[3.4-dlimidazol-4-yllpentyl)oxy)hexanoate (10)

Une solution du composé 9 (915 mg, 1 ,53 mmol) dans un mélange de dichlorométhane (77 mL) et de terf-butanol (77 mL) est agité sous atmosphère d'hydrogène (5 bars) en présence de Pd/C 10% (2,3 g) pendant 4 h. Après filtration, le milieu est concentré à sec. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie flash sur colonne de gel de silice (toluène/acétate d'éthyle 3/2) pour donner le composé 10 (756,8 mg, 82%).

LC-MS m/z 599.4 [(M + H) ⁺ ]. T _R = 1.71 min Préparation du méthyl 6-((5-r(3aS.4S.6aR)-2-oxohexahvdro-1H-thiénof3,4-dlimidazol - 4-yllpentyl)oxy)hexanoate (11)

Le composé 10 (358 mg, 0,6 mmol) est dissous dans l'acide trifluoroacétique (15 mL, 25 mL/mmol). Après 16 h d'agitation à température ambiante, le milieu réactionnel est co-distillé avec du toluène (3 x 50 mL) puis concentré à sec. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie flash sur colonne de gel de silice (dichlorométhane/méthanol 9/1) pour donner le composé 11 (176 mg, 82%).

LC-MS m/z 359,2 [(M + H) ⁺ ]. T _R = 1.085 min

Préparation du 6-({5-r(3aS.4S,6aR)-2-oxohexahydro-1 H-thiénof3.4-d1imidazol-4- vnpentyl)oxy)hexanoic acid (12)

Une solution du composé 11 (170 mg, 0,47 mmol) dans le dioxane (6 mL, 12 mL/mmol) est chauffée à 95°C en présence d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 M (6 mL, 12 mUmmol) pendant 16 h. Le mélange réactionnel est concentré à sec puis co-distillé avec du toluène (3 x 10 mL). Le résidu ainsi obtenu est engagé directement dans la réaction suivante.

LC-MS m/z 345,2 [(M + H) ⁺ ]. T _R = 0.904 min

Préparation du 1-(r6-((5-r(3aS.4S.6aR)-2-oxohexahvdro-1 H-thiénor3.4-dlimidazol-4- vnpentyl)oxy)hexanovnoxy pyrrolidine-2,5-dione (13) A une suspension du composé 12 (60 mg, 0,17 mmol) dans du N,N- diméthylformamide (3,5 ml_) sont ajoutés successivement, à 0°C, de la triéthylamine (147 μΙ_, 1 ,05 mmol) et du chloroformiate d'éthyle (99,5 μΙ_, 1 ,05 mmol). Après 1 h d'agitation à 0°C, le /V-hydroxysuccinimide (120 mg, 1 ,05 mmol) est ajouté. Après 16 h d'agitation à température ambiante, le milieu réactionnel est concentré. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie flash sur colonne de gel de silice (dichlorométhane/méthanol 6/1 ) pour donner le composé 13 (66,7 mg, 86%).

LC-MS m/z 442,2 [(M + H) ⁺ ]. T _R = 6,904 min

Schéma 2 : préparation du composé 21

Préparation du méthyl 6- tert-butoxycarbonvnaminolhexanoate (15)

A une solution de méthyl-6-aminocaproate 14 (20,0 g, 1 10 mmol), dans le dichlorométhane (50 mL) est ajouté de la triméthylamine (30,6 mL, 220 mmol) puis à 0°C est ajoutée en 45 min une solution de dicarbonate de di-terf-butyle (26,4 g, 121 ,1 mmol) dans le dichlorométhane (50 mL). Après 2 h à 0°C, le mélange réactionnel est lavé avec de l'eau puis la phase organique est séchée (Na ₂ S0 ₄ ), filtrée et concentrée. Le résidu ainsi obtenu (27 g) est engagé dans l'étape suivante sans purification.

[M+H ⁺ ] = 246,3

Préparation du méthyl 6-f(te/^butoxycarbonyl)(méthyl)amino1hexanoate (16)

A une suspension d'hydrure de sodium (2,2 g à 60%, 53,8 mmol) dans le tétrahydrofurane (60 mL) est ajoutée goutte à goutte en 5 min à température ambiante une solution du composé 15 brut (12,0 g) dans le tétrahydrofurane (60 mL) puis de l'iodométhane (9,15 mL, 146,7 mmol). Après 1 h à 50°C, une nouvelle quantité d'iodométhane (3,05 mL, 48,9 mmol) est ajoutée. Cette opération est encore répétée deux fois. Après avoir refroidi, le mélange réactionnel est lavé avec de l'eau (240 mL) puis la phase organique est séchée (Na ₂ S0 ₄ ), filtrée et concentrée. Le résidu ainsi obtenu (1 1 ,5 g) est engagé dans l'étape suivante sans purification.

[M+H ⁺ ] = 260,4

Préparation du méthyl 6-(méthylamino)hexanoate (17)

A une solution du composé 16 brut (12,0 g) dans le dioxane (120 mL) est ajoutée une solution 2M d'acide chlorhydrique dans de l'éther diéthylique (463 mL). Le mélange réactionnel est agité pendant 5 h à température ambiante puis est concentré à sec. Le résidu ainsi obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (dichlorométhane/méthanol 95/5 → 80/20 en 40 min) pour donner le composé 17

(3,91 g).

[M+H ⁺ ] = 196,7

Préparation du méthyl 6-(méthyl(5-r(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahvdro-1 H-thiénof3,4- dlimidazol-4-yllpentanoyl)amino)hexanoate (19)

A une solution de D-biotine ou acide 5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1 H-thiéno[3,4- d]imidazol-4-yl]pentanoique 18 (4,9 g, 20 mmol) dans du Λ/,/V-diméthylformamide (39 mL) est ajouté, à -5°C, successivement de la triéthylamine (3.3 mL, 23.7 mmoles) et du chloroformiate d'éthyle (2.3 mL, 24 mmoles). Après 1 h30, au mélange réactionnel est ajoutée une solution du composé 17 (3,9 g, 20 mmol) dans du N,N- diméthylformamide (20 mL). Après 3.5 h, le milieu réactionnel est dilué avec du dichlorométhane, lavé avec une solution aqueuse 0,1 N d'acide chlorhydrique puis avec une solution aqueuse d'hydrogénocarbonate de sodium à 0,5%, avec de l'eau, séché (Na ₂ S0 ₄ ), filtré et concentré. Le résidu ainsi obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (acétone/éthanol 3/2) pour donner le composé 19 (7,68 g). [M+H ⁺ ] = 386,5

Préparation du méthyl 6-(méthyl(5-r(3aS,4S,6af?)-2-oxohexahvdro-1H-thiénor3.4- cnimidazol-4-vnpentyl)amino)hexanoate (20)

Le composé 19 (2,5 g, 6,48 mmol) est mis en solution dans du tétrahydrofurane (125 mL). Puis est additionnée une solution 2M de borane diméthylsulfure dans du tétrahydrofurane (13 mL). Le mélange réactionnel est porté au reflux pendant 16 h. Après avoir ajouté de méthanol (125 mL), le milieu réactionnel est porté au reflux pendant 2 h puis concentré à sec. Le résidu ainsi obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice C18 (eau/acétonitrile 1/0→ 0/1 en 45 min) pour donner le composé 20 (55 mg).

[M+H ⁺ ] = 372,6

Préparation du 6-(méthyl(5-r(3aS,4S.6a )-2-oxohexahvdro-1 H-thiénor3,4-dlimidazol-4- vnpentyl)amino)hexanoique acide (21)

A une solution du composé 20 (80 mg, 0.21 mmoles) dans un mélange tétrahydrofurane/eau (1/1 , 1 ,6 mL) est ajoutée à 20°C une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 35% (88.6 μί, 1.07mmoles). Après 1 h d'agitation à 20 °C, le mélange réactionnel est neutralisé avec de l'acide acétique (49,3 μί, 0,86 mmol) puis concentré à sec. Le résidu ainsi obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice C18 (eau/acétonitrile 1/0→ 3/2 en 20 min) pour donner le composé 21 (88 mg).

[M+H ⁺ ] = 358.5

Schéma 3 : préparation du composé 26

26 Préparation du terf-butyl 5-f«4-r(3aS.4S,6aR)-2-oxohexahvdro-1 H-thiénof3.4- dlimidazol-4-yllbutyl|carbamoyl)aminolpentanoate (24)

Une solution du tert-butyl 5-aminopentanoate (22) (640 mg, 3,06 mmol) et de triéthylamine (458 μΙ_, 3,3 mmol) dans un mélange 4:3 de W,A/-diméthylformamide et d'acétonitrile (3,5 ml_) est ajoutée à 0°C à l'isocyanate (3aS,4S,6aR)-4-(4- isocyanatobutyl)tétrahydro-1 H-thiéno[3,4-d]imidazol-2(3H)-one (23) (2,04 mmol) (Murakami, Nobutoshi; Kawanishi, Motoyuki; Itagaki, Sawako; Horii, Toshihiro; Kobayashi, Motomasa; Bioorganic Médicinal Chemistry Letters; 14; 13; 2004; 3513 - 3516). La température du mélange est laissée revenir à température ambiante et l'agitation est maintenue pendant 16 h. Le mélange réactionnel est dilué par de l'eau et de l'acétate d'éthyle et après extraction de la phase aqueuse, le rassemblement des phases organiques est séché (Na ₂ S0 ₄ ), filtré et concentré pour conduire au composé 24 (405 mg). Le résidu obtenu est engagé dans l'étape suivante sans purification. LC-MS m/z 415.4 [(M + H) ⁺ ]. T _R = 6,497 min Préparation du 5-f 4-r(3aS.4S.6aR)-2-oxohexahvdro-1 H-thiénor3.4-d1imidazol-4- vnbutvDcarbamovDaminolpentanoic acid (25)

Une solution du composé brut 24 (396 mg) dans de l'acide formique (1 1 ,5 mL) est maintenue sous agitation magnétique vigoureuse à température ambiante pendant 5,5 h. Le mélange réactionnel est alors concentré sous vide poussé puis co-distillé avec du toluène puis avec de l'acétone jusqu'à obtention d'un solide correspondant au composé 25 (395 mg). Le résidu obtenu est engagé dans l'étape suivante sans purification.

LC-MS m/z 359.1 [(M + H) ⁺ ]. T _R = 4,848 min

Préparation du 1-f5-f(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy1-5-oxopentyl)-3- -i(3aS,4S.6aR)-2- oxohexahvdro-1 H-thiénof3,4-d1imidazol-4-yllbutyl)urea (26)

A une solution du composé brut 25 (150 mg) dans du /V,/V-diméthylformamide (4,2 mL) sont ajoutés, à 0°C, de triéthylamine (70 pL, 0,502 mmol) et du chloroformiate d'éthyle (48 pL, 0.502 mmol). Après 1 h d'agitation magnétique à 0°C, de la N- hydroxysuccinimide (58 mg, 0,502 mmol) est additionnée à 0°C, puis après agitation 1 h à cette température, le mélange réactionnel est laissé remonter à température ambiante pendant 1 h. Le précipité est alors filtré (millipore LS 5 μηι), le filtrat concentré sous vide poussé, puis le résidu est repris par de l'eau, et filtré (millipore LS 5 pm) pour conduire au composé souhaité 26 (8,1 mg).

LC-MS m/z 456.1 [(M + H) ⁺ ]. T _R = 5,355 min

Schéma 4 : préparation de l'exemple 1

EXEMPLE 1 : Méthyl (2-désoxy-3.4-di-0-méthyl-2-(f6-((5-r(3aS.4S.6affl-2- oxohexahvdro-1 - -thiénor3,4-c/limidazol-4-vnpentyl>oxy)hexanovnaminoV6-0 - sulfonato- -D-glucopyranosvn-(1→4)-(2,3-di-0-méthyl-B-D-glucopyranos yluronate)- (I^^^.S.e-tri-O-sulfonato- -D-glucopyranosylHI^ ^.S-di-O-méthyl- -L- idopyranosyluronate)-(1→4)-2,3,6-tri-Q-sulfonato-a-D-gluco pyranoside, sel de sodium (composé n° 1)

A une solution du composé 27 (52 mg, 0,03 mmol) dans une solution aqueuse d'hydrogénocarbonate de sodium à 0,5% (607 μΙ_) est ajoutée, à 0°C, une solution du composé 13 (40,2 mg, 0,091 mmol) dans du /V,/V-diméthylformamide (607 μί). Après 16 h d'agitation à température ambiante, on dépose le mélange réactionnel sur une colonne de Sephadex G-25 fine (90 x 3 cm) éluée par une solution aqueuse de NaCI 0,2 M. les fractions contenant le composé attendu sont réunies et déposées sur une colonne de Sephadex G-25 fine (90 x 3 cm) éluée par de l'eau. Après concentration des fractions contenant le composé attendu et lyophilisation, on obtient 47,8 mg du composé 1. Déplacements chimiques des protons anomériques (600 MHz, D ₂ 0) δ 5,48 Glc , 5,31 Glc ^v , 5.21 Glc', 5,18 IdoUA", 4,73 GlcUA ^l

[ ] _D 60° (c 0,99 ; H ₂ Q)

Schéma 5 : préparation de l'exem

EXEMPLE 2 : Méthyl (2-désoxy-3.4-di-Q-méthyl-2-fr6-(méthyl(5-r(3aS.4S.6a ?)-2- oxohexahvdro-'/H-thiénor3,4-cflimidazol-4-yllpentyl>amin o)hexanoyl1amino -6-0- sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1-»4)-(2,3-di-0-méthyl-B-D- glucopyranosyluronate)- (1→-4H2,3,6-tri-0-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1→4)-(2 ,3-di-Q-méthyl- -L- idopyranosyluronate)-(1- 4)-2,3,6-tri-Q-sulfonato-a-D-glucopyranoside, sel de sodium (composé n° 2)

A une solution du composé 21 (76 mg, 170 mmol) dans du Λ/,/V-diméthylformamide (1 ,8 mL) est ajouté, à -5°C, successivement de la triéthylamine (23,7 μΐ, 170 mmoles) et du chloroformiate d'éthyle (16,3 μί, 170 mmol). Après 1 h, au mélange réactionnel est ajoutée une solution du composé 27 (180 mg, 85,2 mmol) dans du N,N- diméthylformamide (1 ,8 mL). Après 2 h d'agitation à -5°C, le milieu réactionnel est concentré à sec. Le résidu ainsi obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de gel Carbopac PA 00 avec un gradient partant d'un éluant A (70%) vers un éluant B (53%), l'éluant A étant constitué d'un mélange eau/acétonitrile (89/11), et l'éluant B d'un mélange d'une solution de chlorure de sodium 2N et d'acétonitrile (89/11). Les fractions contenant le composé attendu sont réunies et déposées sur une colonne de gel Sephadex G-25 médium éluée par de l'eau. Après concentration des fractions contenant le composé attendu, on obtient 32,6 mg du composé 2.

Déplacements chimiques des protons anomériques (500 MHz, D ₂ 0) δ 5,42 Glc" ¹ , 5,29 Glc ^v , 5.16 Glc', 5,08 IdoUA", 4,71 GlcUA ^lv

Méthode "ESI", mode négatif : ion multichargé détecté m/z 1002.09 [M-2Na] ^2" .

Schéma 6 : préparation de l'exemple 3

EXEMPLE 3 : Méthyl (2-désoxy-3.4-di-0-méthyl-2 i6-(méth^ oxohexahvdrc)-1H-thiénoi3.4-Gnimida

sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1-»4)-(2,3-di-0-méthyl-B -D-glucopyranosyluronate)- (1→4)-(2,3,6-tri-0-sulfonato-a-D-glucopyranosyl)-(1-»4)-( 2,3-di-0-méthyl-a-L- idopyranosyluronate)-(1→4)-2,3.6-tri-0-sulfonato-a-D-gluco pyranoside, sel de sodium (composé n° 3)

A une solution de l'acide 6-(méthyl{5-[(3aR,4R,6aS)-2-oxohexahydro-1H-thiéno[3,4- climidazol-4-yl]pentanoyl}amino)hexanoique 28 (105,4 mg, 283,8 mmol ; décrit dans la demande de brevet WO 97/46098) dans du A/,A/-diméthylformamide (3 ml_) est ajouté, à -5°C, successivement de la triéthylamine (39,5 μΙ_, 283,8 mmol) et du chloroformiate d'éthyle (21 ,7 μΙ_, 283,8 mmol). Après 1 h, au mélange réactionnel est ajoutée une solution du composé 27 (300 mg, 142 mmol) dans du /V,A/-diméthylformamide (3,0 ml_). Après 2 h d'agitation à -5°C, le milieu réactionnel est concentré à sec. Le résidu ainsi obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de gel Carbopac PA100 avec un gradient partant d'un éluant A (55%) vers un éluant B (66%), l'éluant A étant constitué d'un mélange eau/acétonitrile (89/11), et l'éluant B d'un mélange d'une solution de chlorure de sodium 2N et d'acétonitrile (89/11). Les fractions contenant le composé attendu sont réunies et déposées sur une colonne de gel Sephadex G-25 médium éluée par de l'eau. Après concentration des fractions contenant le composé attendu, on obtient 22,0 mg du composé 3.

Déplacements chimiques des protons anomériques (500 MHz, D ₂ 0) δ 5,44 Glc'", 5,26 Glc ^v , 5.17 Glc', 5,23 IdoUA", 4,71 GlcUA ^lv

Méthode "ESI", mode négatif : ion multichargé détecté m/z 1009.0 [M-2Na] ^2" .

Schéma 7 : préparation de l'exemple 4

EXEMPLE 4 : éthyl (2-désoxy-3.4-di-Q-méthyl-2-(f5-f((4-r(3aS.4S.6affl-2- oxohexahvdro-1H-thiénof3,4-o1imidazol-4-yllbutyl)carbamoyl) amino1pentanoyl)amino)- 6-0-sulfonato-a-D-glucopyranosylV(1->4)-(2,3-di-0-méthyl -B-D- qlucopyranosyluronate)-(1→4)-(2,3 _t 6-tri-0-sulfonato- -D-glucopyranosyl)-(1->4)-(2,3- di-0-méthyl- -L-idopyranosyluronate)-(1-→-4)-2,3,6-tri-Q-sulfonato-a-D- glucopyranoside, sel de sodium (composé n° 4)

A une solution aqueuse à 0,5% de chlorure de sodium (0.5 mL) du composé 27 (44 mg, 20 μιτιοΙ) est additionnée goutte à goutte une solution du composé 26 (11 ,2 mg, 20 μιτιοΙ) dans du Λ/,/V-diméthylformamide (0,5 mL). Après 10 min d'agitation, 0.25 mL d'eau ainsi que 0,25 mL de Λ/,/V-diméthylformamide sont rajoutés. Après 16 h d'agitation vigoureuse à température ambiante, le milieu réactionnel est déposé au sommet d'une colonne de Sephadex ^® G-25 éluée par une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,2 M. On concentre les fractions contenant le produit et on dessale en utilisant la même colonne éluée par l'eau. Les fractions contenant le produit sont alors concentrées sous vide poussé. Le résidu obtenu est ensuite purifié par chromatographie d'échange d'ions en utilisant une colonne Dionex CarboPac ^® PA100 semi-préparative (9 x 250 mm) avec un gradient partant d'un éluant A vers un éluant B, l'éluant A étant constitué d'un mélange eau/acétonitrile (4/1) + 0,01% de diméthylsulfoxyde, et l'éluant B d'un mélange d'une solution de chlorure de sodium 2N et d'acétonitrile (4/1). On concentre alors les fractions contenant le produit et on dessale en utilisant une colonne de Sephadex ^® G-25 éluée à l'eau. Les fractions contenant le produit sont alors concentrées sous vide poussé pour conduire au composé désiré 4 (18,5 mg, 37%).

Déplacements chimiques des protons anomériques (600 MHz, D ₂ 0) δ 5,48 Glc'", 5,32 Glc ^v , 5.22 Glc ¹ , 5,11 IdoUA", 4,74 GlcUA ^,v

Méthode "ESI", mode négatif : ion multichargé détecté m/z 462,2941 [M-4H] ^4" (forme acide).

Pharmacologie :

Les composés selon l'invention ont fait l'objet d'études biochimiques et pharmacologiques, démontrant leur intérêt en tant que composés d'intérêt pharmaceutique.

- Activité anti-Xa

L'activité des composés selon l'invention a été étudiée dans un modèle in vitro d'inhibition du facteur Xa de la coagulation, en présence d'antithrombine (activité anti- facteur Xa dépendante de la présence d'antithrombine), tel que décrit par J.-M. Herbert et al., Blood, 1998, 91, 4197-4205. Dans ce modèle, on confirme les propriétés antithrombotiques des composés selon l'invention : les CI50 (doses permettant une inhibition de 50%) des composés n° 1 , 2, 3 et 4 sont respectivement de 18.4, 18.4, 17.8 et 17.1 ng/ml.

Ainsi, l'activité anti-Xa des composés selon l'invention est équivalente à celle du composé idrabiotaparinux, pour lequel NC50 est de 17.6 ng/ml. - Neutralisation par l'avidine

Pour démontrer que les composés selon l'invention se lient bien à l'avidine, les produits sont dilués, en concentrations croissantes, avec des billes présentant des molécules d'avidine à leur surface. Le mélange ainsi obtenu est centrifugé et l'activité anti-facteur Xa est dosée dans le surnageant. Comme cela ressort du tableau ci-dessous, la faible activité dans le surnageant démontre bien que les composés biotinylés se sont liés à l'avidine et ont été éliminés par centrifugation avec les billes.

Ecart-type non calculé

Ainsi, plus de 90% des composés selon l'invention sont éliminés du surnageant par l'avidine liée aux billes, de façon similaire à ce qui est observé pour le composé idrabiotaparinux.

- Stabilité métabolique en milieu plasma à pH 6.0

La stabilité métabolique des composés selon l'invention vis-à-vis de l'activité de la biotinidase a été étudiée sur plasma humain prélevés sur citrate de sodium comme anticoagulant. Dix lots individuels de plasma humain provenant de 5 hommes et 5 femmes, constituant la matrice d'évaluation, ont été utilisés et mis en commun afin d'évaluer la stabilité métabolique des composés. Le plasma humain a été incubé dans les conditions suivantes :

- milieu d'incubation (fraîchement préparé) : 740 [il de 54 mM de tampon phosphate de sodium, pH 6.0, contenant 1.08 mM d'EDTA di-sodique et 4.3mM de chlorhydrate de cystéamine,

- plasma humain : 40 μί

- concentrations des composés à étudier : 1 μΜ

- temps d'incubation : 24 heures température d'incubation

La réaction est initiée par addition du composé à étudier, après une période de pré- incubation du plasma et du milieu d'incubation de 10 minutes. A la fin de la période d'incubation (24 heures), la réaction est stoppée.

La quantification des composés selon l'invention est réalisée selon une méthode spécifique en LC/MS-MS.

La métabolisation de chaque composé étudié est mesurée en suivant la disparition du produit inchangé, les concentrations étant déterminées pour chaque échantillon d'incubation au temps 0 heures et au temps 24 heures, et le pourcentage de métabolisation calculé suivant la formule suivante :

[composé à T 24H]

% de métabolisation = 1 - x 100

[composé à T OH]

Les termes [composé à T 24H] et [composé à Τ0Η] correspondent à la concentration du composé à étudier dans le milieu réactif après 24 heures et avant le début de la réaction, respectivement.

Les résultats sont exprimés en pourcentages des composés métabolisés après 24h d'exposition au milieu. On mesure ainsi des pourcentages de métabolisation de 1.7, -3.3, 0.8 et 5.3 %, respectivement, pour les composés n° 1 , 2, 3 et 4 selon l'invention, en comparaison avec un pourcentage de métabolisation de 15.9% pour le composé idrabiotaparinux.

Ceci démontre la stabilité métabolique des composés selon l'invention dans ce milieu in vitro : ils ne se dégradent pas ou en quantité extrêmement faible en présence de biotinidase, contrairement à l'idrabiotaparinux.

Grâce à leur profil pharmacologique, les oligosaccharides de la présente invention constituent des médicaments très intéressants. Leur toxicité est parfaitement compatible avec cette utilisation. Leur stabilité métabolique vis-à-vis de la biotinidase les rend particulièrement appropriés pour constituer le principe actif de spécialités pharmaceutiques. Ils peuvent être utilisés dans diverses pathologies consécutives à une modification de l'homéostasie du système de la coagulation apparaissant en particulier lors des troubles du système cardio-vasculaire et cérébro-vasculaire comme les troubles thromboemboliques associés à l'arthérosclérose et au diabète tels que l'angine instable, l'attaque cérébrale, la resténose après angioplastie, l'endartérectomie, la pose de prothèses endovasculaires ; ou les troubles thromboemboliques associés à la rethrombose après thrombolyse, à l'infarctus, à la démence d'origine ischémique, aux maladies artérielles périphériques, à l'hémodialyse, aux fibrillations auriculaires ou encore lors de l'utilisation de prothèses vasculaires de pontages aorto-coronariens. Ces produits peuvent par ailleurs être utilisés pour le traitement ou la prévention de pathologies thromboemboliques d'origine veineuse, telles que les embolies pulmonaires et la thrombose veineuse profonde. Ils peuvent être utilisés ou pour prévenir ou pour traiter les complications thrombotiques observés par exemple à la suite d'opérations chirurgicales, de développements tumoraux ou de dérèglements de la coagulation, induits par des activateurs bactériens, viraux, ou enzymatiques. Dans le cas de leur utilisation lors de la pose de prothèses, les composés de la présente invention peuvent recouvrir des prothèses et les rendre ainsi hémocompatibles. En particulier, ils peuvent être fixés à des prothèses intravasculaires (stents). Dans ce cas, ils peuvent éventuellement être modifiés chimiquement par introduction à l'extrémité non réductrice ou réductrice d'un bras approprié, comme décrit selon EP 649854. Les composés de la présente invention peuvent également être utilisés comme adjuvants lors d'endartérectomie réalisée avec des ballonnets poreux.

Les composés selon l'invention peuvent être utilisés pour le traitement ou la prévention des maladies ci-dessus.

Selon un autre de ses aspects, la présente invention a donc pour objet une composition pharmaceutique contenant, en tant que principe actif, un polysaccharide de synthèse selon l'invention ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, éventuellement en association avec un ou plusieurs excipients inertes et appropriés. Lesdits excipients sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaités : orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, transmuqueux, locale ou rectale. Le principe actif peut être également présenté sous forme de complexe avec une cyclodextrine, par exemple α, β ou γ cyclodextrine, 2-hydroxypropyl-p-cyclodextrine ou méthyl-p-cyclodextrine.

Le principe actif peut également être libéré par un ballonnet le contenant ou par un extenseur endovasculaire introduit dans les vaisseaux sanguins. L'efficacité pharmacologique du principe actif n'est ainsi pas affectée.

Dans chaque unité de dosage, le principe actif est présent dans les quantités adaptées afin d'obtenir l'effet prophylactique ou thérapeutique désiré. Chaque unité de dosage peut contenir de 0,1 à 100 mg de principe actif, de préférence 0,5 à 50 mg, de façon encore préférée de 2.5 à 3.0 mg.

Les composés selon l'invention peuvent également être utilisés en association avec un ou plusieurs autres principes actifs utiles pour la thérapeutique souhaitée tels que par exemple des antithrombotiques, des anticoagulants, des antiagrégants plaquettaires tels que par exemple le dipyridamoie, l'aspirine, la ticlopidine, le clopidogrel ou des antagonistes du complexe de la glycoprotéine Ilb/IIIa.