【명세서】

【발명의 명칭】

이중 특이성 단백질 및 이의 제조 방법

【기술분야】

본 발명은 이종 이합체 형성률이 높은 이중 특이성 단백질 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

【배경기술】

아중 특이성 항체 (Bispecific antibodies; BsAbs)는 상이한 표적 항원을 인식하는 두 개 항원 결합 부위를 가진 항체로서， 상기 상이한 표적 항원에 동시에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 총칭한다. 이러한 특성은 통상적인 단일클론 항체로는 불가능한 치료 전략을 수립할 수 있게 한다. 이중특이성 항체는 자연적으로 생성되는 경우는 드물고， 두 개의 다른 생물학적 표적에 동시 결합하도록 인위적으로 제조되는 것이 많다. 이러한 BsAb의이중 표적화 능력은 단일특이성 항체 (Monospecific antibodies; MsAbs)로는 적용할 수 없는 새로운 적용 분야를 제공할 수 있다. 치료적 목적의 측면에서， (1) 면역 세포를 표적 세포의 근접부로 확실하게 도입하는 것， (2) 표적 세포에서 떨어져서 각각 별개로 존재하는 두 개의 신호 전달 경로를 동시에 억제하거나 활성화시켜서 상승 효과를 일으키는 것， (3) 표적 세포로 치료 물질， 방사활성 물질， 의약， 독소 등을 특이적이고 조절가능하게 전달하는 것 등이 중요한 관심 사항으로 대두되고 있다.

다양한 (45개의 다른 포맷) 이중 특이성 항체관련 기술이 개발 되었다. 이들 기술은 구조를 기초로 하여 4개의 카테고리로 분류될 수 있다. 첫째로， 노브-인투-홀 (Knob-into-Hole) 또는 간략히 KiH로 알려진 구조적 상보적 상태， 전하 극성 보완 (전기적 스티어링 효과; electrostatic steering effect), 또는 CH3 도메인 서플링 (SEEDbody™ 으로 불리움)를 포함하는 다양한 방법을 통해 중쇄를 이종성 이중화 시키는 기술; 둘째로， Diabody™, BiTE™ 및 DART™ (Diabody: dimeric antibody fragments; BiTE ： Bi— specific T—cell engagers; DART ： dual affinity retargeting bispecific antibody)과 같은 여러 가지 항체 분절 포맷， 셋째로, Modular Antibody™, Zybody™, dAbs™ 및 DVI)-IG ^TM (dAbs ： Single domain antibodies; DVD-Ig ： dual—var i able—domain immunoglobul in) 과 같은 하나 또는 그 이상의 기능적 도메인을 사용하는 기술이 온전한 항체에 접합되는 기술; 및 넷째로， Duobody™ (Fab-Arm Exchange) , CrossMab™, Azymetr i c™, 및 kl body™ 같은 전장 길이의 IgG-유사 설계를 채용한 기술들이 개발 되었다.

예컨대, Zymeworks는 미국 특허출원 2013-892198호를 통하여， Fc 영역에서 돌연변이를 가진 면역글로블린 사슬의 이종성 다량체 (heteropolymer ) 구조체에 대해 기재하며， 구체적으로 이황화결합을 하는 시스테인 부분을 전하를 가진 아미노산으로 변형하여 전기적 상호작용에 의해서 이종성 다량체 구조의 항체를 만들 수 있다는 점을 개시하고 있다.

기존의 이중 특이성 항체를 제조하는 데에는 다음과 같은 문제점이 있었다 ^■

첫번째로는 원하지 않은 중쇄의 결합의 생성을 들 수 있다. 상이한 에피토프를 갖는 2 개의 항체로부터 각각 기원하는 중쇄 (A 및 B) 간의 결합이 무작위적으로 이루어지는 경우， 2개의 동일기원의 중쇄 간의 결합 (AA 및 BB)과 1개의 이종 기원 중쇄 간의 결합 (AB 또는 BA)이 형성된다. 이중 특이성 항체를 제조하는데 있어서， 동일 기원의 중쇄 간 결합은 원하지 않는 불순물이 되어서， 이중 특이성 항체의 순도를 떨어뜨리고, 이를 제거하는 공정이 수반되어야 하므로 항체의 분리 정제에 어려움을 유발하며， 원하지 않는 면역반웅 또는 신호전달을 야기해서 부작용을 유발하는 등의 불리한 효과를 일으킬 수 있다. 따라서 순수하게 이종기원의 중쇄 간 결합만을 형성하면서， 동일기원의 중쇄 간 결합이 형성이 되지 않거나 적어도 상당 수준의 이하로만 형성되도록 하는 기술이 필요하다.

둘째로는 경쇄와 중쇄의 결합에 있어서 동일 기원의 중쇄와 경쇄와 결합이 특이적으로 형성되어야 하는데， 이종 기원의 중쇄와 경쇄가 결합하는 경우가 발생하는 문제점을 들 수 있다. 이중 특이성 항체는 2종의 에피토프를 가지고 있다. 각각의 에피토프는 이를 인식하는 각각의 항체로부터 유래하는 동종 기원의 경쇄와 중쇄가 결합하는 경우에 인식 가능한데, 이종 기원의 중쇄와 경쇄가 결합하게 되면， 의도한 2종의 에피토프 이외의 새로운 에피토프를 인식하는 항체가 형성되어， 불순물로 작용하여 항체의 분리정제에 어려움을 유발하며， 부작용을 일으키는 원인이 될 수 있다. 따라서， 이중특이성 항체 생산에 있어서 정확히 2종류의 특이성 항체가 만들어지도록 제대로 된 짝으로만 중쇄와 경쇄의. 결합이 일어나야 하고， 비특이적인 중쇄와 경쇄의 결합이 생성되지 않거나 미미한 수준으로 생성되어야 한다.

상기에서 살펴본 바와 같은 이중특이성 항체를 제공하는데 있어서의 문제점을 고려하여 이중특이성 항체 제작에 필요한 요건을 요약하면 , 서로 다른 2 개의 에피토프를 인식하는 2종의 항체로부터 유래하는 중쇄와 경쇄의 결합에 있어서， 도 1에 보여자는 바와 같이 총 10개 형태의 결합이 형성될 수 있는데， 이 중에서 (1) 중쇄 간 결합은 서로 다른 항체로부터 유래하는 중쇄 간에 형성되고， (2) 중쇄와 경쇄의 결합은 동일한 항체로부터 유래하는 중쇄와 경쇄 간 형성되어야 하며， 이러한 조합 형태는 도 1에서 점선 원으로 표시된 것이며， 이 외의 9가지 조합은 생성되지 않거나 최소한으로 생성되어야 한다.

본 발명자의 이전 특허인 W02014142591호 "소수성 상호작용 부위내에 전기적 상호작용이 도입된 단백질 및 이의 제조방법 ¹ '이 공개되어 있다. 상기 특허에는 단백질의 소수성 상호작용을 하는 부위내에서 선택된 한쌍의 소수성 아미노산에서， 하나의 소수성 아미노산이 포지티브 전하를 가진 물질로， 다른 소수성 아미노산이 네가티브 전하를 가진 물질로 변형되어 상기 포지티브 전하와 상기 네가티브 전하에 의해 단백질의 소수성 상호작용 부위내에 전기적 상호작용이 도입된 단백질 또는 항체가 개시되어 있다. 본 발명자들은 상기 특허에서 고려되지 않았던 소수성 상호작용을 하지 않은 부분의 정전기적 상호작용을 이용하여서도 이중특이성 항체를 형성할 수 있음을 발견하였고， 상기 정전기적 상호작용 이외에 사이즈 의존 결합 및 /또는 결합 쌍 간 아미노산 교환 (스와핑) 방법에 의해서도 이중 특이성 항체를 고효율로 형성할 수 있음을 밝혀서 본 발명을 완성하였다. 【선행기술문헌】

【특허문헌】

(특허문헌 1) 한국특허공개 제 10-2014— 0019385호 (2014.02. 14공개)

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

상기한 문제를 해결하고자 본 발명은 순도가 높은 이종 특이성 항체 및 이의 제조 방법을 제공한다.

일 예는 항체의 계 1 CH3 도메인 및 제 2 CH3 도메인을 포함하는 이합체에 있어서， 상기 제 1 CH3 도메인과 제 2 CH3 도메인 간 아미노산- 아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍이 다음 중 하나 이상의 변이에 의하여 변이된 변이 CH3 도메인 또는 상기 변이 CH3 도메인을 포함하는 변이 Fc 영역을 포함하는 이합체를 제공한다:

( 1) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고， 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환된 변이;

(2) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍의 아미노산이 서로 교환된 변이 ; 및

(3) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 크기가 큰 소수성 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 크기가 작은 소수성 아미노산으로 치환된 변이 .

상기 제 1 CH3 도메인과 제 2 CH3 도메인은 서로 같거나 다른 종류의 항체 (면역글로불린)로부터 유래한 것일 수 있다.

다른 예는 상기 변이 CH3 도메인 또는 이를 포함하는 변이 Fc 영역을 암호화하는 핵산 분자， 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 백터， 및 상기 재조합 백터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.

본 명세서에 사용된 바로서, "하나 이상의 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산. . 다른 하나의 아미노산. . "은 하나 이상의 아미노산 쌍 중 각각의 아미노산 쌍을 이루는 2 개의 아미노산중 어느 하나와 다른 하나의 아미노산을 지칭하기 위하여 사용된다 (이하 동일함) .

다른 예는 제 1 CH3 도메인 또는 이를 포함하는 제 1 Fc 영역， 및 제 2

CH3 도메인 또는 이를 포함하는 제 2 Fc 영역을 포함하고，

상기 계 1 CH3 도메인과 게 2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍이 다음 중 하나 이상의 변이에 의하여 변이된 변이 CH3 도메인 또는 상기 변이 CH3 도메인을 포함하는 변이 Fc 영역을 포함하는， 서로 다른 2종의 표적을 표적화하는 이중 특이성 단백질을 제공한다:

( 1) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환된 변이 ; (2) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산이 서로 교환된 변이 ; 및

(3) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 크기가 큰 아미노산으로 치환되고， 다른 하나의 아미노산은 크기가 작은 아미노산으로 치환된 변이.

상기 단계 ( 1)의 서로 다른 전하를 갖는 아미노산으로 치환되는 아미노산 쌍은 소수성 상호작용을 하는 아미노산 쌍 및 /또는 소수성 상호작용을 하지 않는 아미노산 쌍일 수 있으며， 일 예에서， 아미노산 쌍을 이루는 2 개의 아미노산 중 적어도 하나 이상이 소수성 아미노산이 아닌 아미노산 (예컨대 _. ， 친수성 아미노산)일 수 있다. 상기 단계 ( 1)의 서로 다른 전하를 갖는 아미노산으로 치환시키는 단계에 의하여 정전기적 상호작용이 도입되어 Fc 영역 간 이종 이합체 형성률을 증진시키는데 기여할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바로서， 이종 이합체 (heterodimer )는 서로 다른 두 개의 단백질이 ^' 결합된 것을 의미하는 것으로, 예컨대， 서로 다른 표적을 표적화하는 두 개의 단백질이 결합하여 형성된 이중 특이성 단백질 (예컨대， 이중 특이성 항체) 등을을 의미할 수 있다.

상기 단계 (2)의 아미노산 교환 (스와핑)은 Fc 영역 또는 CH3 도메인에서 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 모든 아미노산 쌍에서 수행될 수 있으며， 예컨대， 정전기적 상호작용， 소수성 상호작용， 및 아미노산 크기 차이에 의한 상호작용 이외의 상호작용에 의하여 결합된 모든 아미노산 쌍 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍일 수 있다. 이와 같이 서로 상호작용 (예컨대 결합)하는 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 잔기 (즉， 상호작용 하는 아미노산 쌍에 있어서， 게 1 CH3 도메인 중의 하나의 아미노산 잔기 및 제 2 CH3 도메인 중의 하나의 아미노산 잔기)를 서로 교환하면, 동종 유래의 CH3 도메인 간에 (즉 제 1 CH3 도메인 간， 또는 제 2 CH3 도메인 간)는 상기 아미노산 상호작용하는 파트너 위치에 동일한 아미노산이 존재하므로 이들 간 결합이 어렵게 함으로써， 동종 간 이합체 형성률을 낮추고 이종 이합체 형성를을 증진시키는데 기여할 수 있다 (예컨대， S364와 K370 아미노산 쌍의 경우， 제 1 CH3 도메인에 S364K 변이， 제 2 CH3 도메인에 K370S 변이가 도입된 경우, 제 1 CH3에서는 잔기 364와 370이 모두 라이신 (K)이고， 게 2 CH3 도메인에서는 잔기 364와 370이 모두 세린 (S)이므로， 동일 CH3 도메인 간에는 상호작용이 일어날 수 없어지므로 동종 이합체는 형성되지 않고， 이종 CH3 도메인간에만상호작용이 일어나므로 이종 이합체만 형성됨) .

상기 단계 (3)의 크기가 상이한 아미노산으로 치환하는 단계는 크기가 큰 아미노산과 크기가 작은 아미노산 간 구조적 교합 적합성을 증진시킴으로써 (즉， 크기가 큰 아미노산이 크기가 작은 아미노산에 의하여 생성된 여분에 공간에 끼워짐으로써 결합 효율이 증가됨 )ᅳ 이종 이합체 형성를을 증진시키는데 기여할 수 있다. 특히， 서로 상호작용하는 아미노산 쌍의 한쪽 아미노산은 크기가 큰 소수성 아미노산으로, 나머지 한쪽 아미노산은 크기가 작은 소수성 아미노산으로 돌연변이화함으로써， 크기가 큰 아미노산끼리 또는 크기가 작은 아미노산끼리 결합이 잘 이루어지지 않도록 하여 동종 이합체 형성률을 최소화 시키는 한편 (양쪽 chain에 크기가 큰 아미노산이 존재하는 경우， 아미노산의 크기 때문에 두 chain 사이의 거리가 멀어지게 되어 이합체 형성 (dimer i zat i on)에 방해를 받고, 양쪽 chain 모두에 크기가 작은 아미노산이 존재하게 되면 두 아미노산 사이의 거리가 멀어져서 상호작용 확를이 낮아지고 상호작용 자체가 어려워짐)， 한쪽 CH3 도메인 또는 Fc의 크기가 큰 소수성 아미노산과 다른 쪽 CH3 도메인 또는 Fc의 크기가 작은 소수성 아미노산은 돌연변이 전과 비교하여 가까운 거리에서 소수성 상호작용을 할 수 있기 때문에 이종 이합체가 형성되기 좋은 조건이 된다. 따라서， 상기 크기가 상이한 아미노산으로 치환하는 단계에 있어서， 치환되는 크기가 큰 아미노산 및 크기가 작은 아미노산은 모두 소수성 아미노산 중에서 선택된 것일 수 있다. 예컨대， 상기 크기가 큰 아미노산은 소수성 아미노산인 트립토판 및 페닐알라닌으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 또한， 상기 크기가 작은 아미노산은 소수성 아미노산인 알라닌， 글라이신， 및 발린으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일수 있다.

상기 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인을 포함하는 이중 특이성 단백질은 서로 다른 2종의 표적을 표적화 (예컨대, 특이적으로 인식 및 /또는 결합)하는 모든 형태의 단백질 중 선택될 수 있다. 표적화를 위하여, 상기 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인을 포함하는 이중 특이성 단백질은 서로 다른 2종의 표적을 표적화 (특이적 인식 및 /또는 결합) 가능한 표적화 도메인 (예컨대， 게 1 표적을 표적화하는 제 1 표적화 도메인 및 게 2 표적을 표적화하는 제 2 표적화 도메인)을 포함할 수 있으며， 상기 각각의 표적화 도메인은 각각 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인에 공유적 또는 비공유적으로 직접 또는 간접 (예컨대， 링커 등을 통하여) 연결 (융합)된 것일 수 있다. 예컨대， 상기 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인을 포함하는 이중 특이성 단백질은 서로 다른 2종의 표적을 동시에 표적화하는ᅳ 이중 특이성 항체， 이중 특이성 항체의 항원 결합 단편 (예컨대， (scFv-Fc)2 등)， 이중 특이성 항체 유사체 (예컨대, 나노바디 (nanobody)， 펩티바디 (pept ibody)， 펩타이드 (pept ide) , 앱타이드 (apt ide) 등) , 표적 특이적 결합 폴리펩타이드와 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인의 융합 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 표적 특이적 결합 폴리펩타이드는 표적 생체 물질 (생체에 존재하는 단백질, 핵산 등을 포함하는 모든 화합물)에 특이적으로 결합하는 모든 폴리펩타이드들 중에서 선택될 수 있으며， 예컨대， 항원결합부위 (예컨대 중쇄 및 /또는 경쇄의 CDR 또는 가변영역)， scFv (s ing chain Fv) , 막 단백질 (예컨대， 각종 수용체 등)， 막 단백질의 액토도메인 (ectodomain) , 리간드 (예컨대， 각종 성장인자， 사이토카인 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 폴리펩타이드일 수 있다. 일 예에서， 상기 표적 특이적 결합 폴리펩타이드와 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인의 융합 단백질은， 막 단백질과 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인의 융합 단백질, 막 단백질의 액토도메인과 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인의 융합 단백질， 리간드와 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인의 융합 단백질, scFv와 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인의 융합 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인을 포함하는 이중 특이성 단백질이 항체， 항체의 항원 결합 단편， 또는 항체 유사체인 경우ᅳ 상기 표적화 도메인은 항원결합부위 (예컨대 중쇄 및 /또는 경쇄의 CDR 또는 가변영역)일 수 있고， 앞서 설명한 융합 단백질의 경우, 상기 표적 특이적 결합 폴리펩타이드는 막 단백질 (예컨대， 각종 수용체) , 막 단백질의 액토도메인， 리간드 (예컨대， 각종 성장인자， 사이토카인 등)， 항원결합부위 (예컨대 중쇄 및 /또는 경쇄의 CDR 또는 가변영역) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 서로 다른 2종의 표적은 서로 다른 2종의 생체 물질 (예컨대, 단백질) 또는 동일한 생체 물질 (예컨대， 단백질) 내의 서로 다른 영역을 의미할 수 있다. 상기 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인을 포함하는 이중 특이성 단백질은 비변이 (야생형) Fc 영역 또는 CH3 도메인을 포함하는 경우와 비교하여 증가된 이종 이합체 (heterodimer ) 형성률， 감소된 동종 이합체 (homodimer ) 형성률， 및 /또는 안정성을 갖는 것을 특징으로 한다. 다른 예는 제 1 에피토프를 인식하는 항체의 중쇄 유래의 제 1 CH1 도메인 및 경쇄 유래의 제 1 α (경쇄불변영역) 도메인， 및 제 2 에피토프를 인식하는 항체 유래의 제 2 CH1 도메인 및 경쇄 유래의 게 2 CL 도메인을 포함하고， 다음의 변이 중 하나 이상을 포함하는 변이 CH1 도메인 및 변이 CL 도메인을 포함하는 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:

거 U CH1 도메인 및 게 1 CL 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 계 1 아미노산 쌍 중의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고， 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환; 및

게 2 CH1 도메인 및 제 2 CL 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 제 2 아미노산 쌍 중의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고， 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환.

상기 게 1 에피토프와 제 2 에피토프는 서로 다른 단백질 (항원)이거나 동일한 단백질 (항원)의 서로 다른 (서로 구분되는) 부위에 존재하는 것일 수 있다.

일 예에서， 상기 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 게 1 CH1 도메인과 제 2 CH1 도메인은 서로 다른 전하를 갖는 아미노산으로 치환되고， 상기 제 1 CL 도메인은 상기 게 1 CH1 도메인과 상이한 전하를 갖는 아미노산으로 치환되며， 상기 제 2 CL 도메인은 상기 제 2 CH1 도메인과 상이한 전하를 갖는 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.

예컨대, 상기 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 제 1 CH1 도메인 및 제 1 CL 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 제 1 아미노산 쌍 중 거 U CH1 도메인에 위치하는 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고， 상기 제 1 아미노산 쌍 중 제 1 CL 도메인에 위치하는 아미노산은상기 거 U CHI 도메인에 치환된 아미노산과 상이한 전하를 갖는， 즉 음전하를 갖는 아미노산으로 치환되고，

게 2 CH1 도메인 및 제 2 CL 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 제 2 아미노산 쌍 중 거 12 CH1 도메인에 위치하는 아미노산은， 상기 제 1 CH1 도메인에 치환된 아미노산과 상이한 전하를 갖는， 즉 음전하를 갖는 아미노산으로 치환되고， 상기 제 2 아미노산 쌍 중 제 2 CL 도메인에 위치하는 아미노산은상기 제 2 CH1 도메인에 치환된 아미노산과 상이한 전하를 갖는， 즉 양전하를 갖는 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.

상기 변이 CH1 도메인 및 변이 (X 도메인을 포함하는 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 상기 치환되는 제 1 아미노산 쌍과 게 2 아미노산 쌍은 서로 동일하거나 상이할 수 있으며, 상기 제 1 아미노산 쌍과 게 2 아미노산 쌍에서 치환되는 양전하를 갖는 아미노산과 음전하를 갖는 아미노산은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 변이 CH1 도메인 및 변이 CL 도메인을 포함하는 이중 특이성 항체의 항원 결합 단편은 예컨대， F(ab ' )2 단편일 수 있다. 상기 변이 CH1 도메인 및 변이 CL 도메인을 포함하는 이중 특이성 항체. 또는 이의 항원 결합 단편은 비변이 (야생형) CH1 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 경우와 비교하여 증가된 동일한 에피토프를 표적화하는 중쇄 (또는 중쇄가변영역 -CH1)—경쇄 간 이합체 형성률 및 /또는 안정성을 갖는 것을 특징으로 한다.

상기 변이 CH1 도메인 및 변이 CL 도메인을 포함하는 이중 특이성 항체는， CH3 도메인 또는 Fc 영역으로서， 게 1 에피토프를 인식하는 항체 유래의 제 1 CH3 도메인과 제 2 에피토프를 인식하는 항체 유래의 제 2 CH3 도메인이 다음 중 하나 이상의 변이에 의하여 변이된， 변이 CH3 도메인 또는 상기 변이 CH3 도메인을 포함하는 변이 Fc 영역을 포함하는 것일 수 있다:

( 1) CH3 도메인 간의 하나 이상의 ᅳ아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고， 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환된 변이;

(2) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍의 아미노산이 서로 교환된 변이; 및

(3) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 크기가 큰 아미노산 (예컨대， 트립토판， 페닐알라닌 등과 같은 크기가 큰 소수성 아미노산)으로 치환되고， 다른 하나의 아미노산은 크기가 작은 아미노산 (예컨대， 알라닌， 글라이신, 발린 등과 같은 크기가 작은 소수성 아미노산)으로 치환된 변이.

상기 변이 CH1 도메인, 변이 CL 도메인， 및 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인을 포함하는 이중 특이성 단백질 또는 이중 특이성 항체는， 비변이 CH1 도메인， CL 도메인, 및 Fc 영역 또는 CH3 도메인을 포함하는 이중 특이성 단백질 또는 항체와 비교하여， 증가된 이종 이합체 (heterodimer ) 형성률， 증가된 동일한 에피토프를 표적화하는 중쇄 (또는 중쇄가변영역 -CH1)-경쇄 간 이합체 형성률, 및 /또는 안정성을 갖는 것일 수 있다.

. 다른 예는 다음 중 하나 이상의 단계를 포함하여 제 1 CH3 도메인과 제 2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍에 다음 중 하나 이상의 변이를 도입시키는 단계를 포함하는， 변이 CH3 도메인 또는 상기 변이 CH3 도메인을 포함하는 변이 Fc 영역을 포함하는， 서로 다른 표적을 표적화하는 이중 특이성 단백질의 제조 방법 또는 서로 다른 표적을 표적화하는 이중 특이성 단백질의 이종 이합체 형성을 증가시키는 방법을 제공한다:

( 1) 게 1 CH3 도메인과 게 2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로， 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환;

(2) 제 1 CH3 도메인과 제 2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍의 각각의 아미노산쌍을 이루는 두 개의 아미노산을 서로 교환 ; 및

(3) 게 1 CH3 도메인과 게 2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 크기가 큰 아미노산 (예컨대， 트립토판， 페닐알라닌 등과 같은 크기가 큰 소수성 아미노산)으로， 다른 하나의 아미노산은 크기가 작은 아미노산 (예컨대， 알라닌， 글라이신， 발린 등과 같은 크기가 큰 소수성 아미노산)으로 치환. 다른 예는 다음의 CH1 도메인 및 CL 도메인 변이 단계를 포함하는， 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법 또는 동일한 에피토프를 표적화하는 중쇄 (또는 중쇄가변영역 -CH1)-경쇄 간 이합체 형성률을 증가시키는 방법을 제공한다:

제 1 에피토프를 인식하는 항체의 중쇄 유래의 게 1 CH1 도메인 및 제 1 CL 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 게 1 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고， 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환; 및

게 2 에피토프를 인식하는 항체의 중쇄 유래의 제 2 CH1 도메인 및 게 2 CL 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 게 2 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고， 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환.

상기 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법 또는 동일한 에피토프를 표적화하는 중쇄 (또는 중쇄가변영역 -CH1)-경쇄 간 ^' 이합체 형성을 증가시키는 방법은， 상기 CH1 도메인 및 CL 도메인의 변이 단계에 더하여， 다음 중 하나 이상의 CH3 도메인 변이 단계를 추가로 포함할 수 있다:

( 1) 게 1 에피토프를 인식하는 항체의 중쇄 유래의 게 1 CH3 도메인과 제 2 에피토프를 인식하는 항체의 중쇄 유래의 제 2 CH3 도메인 간 아미노산- 아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로， 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환;

(2) 제 1 CH3 도메인과 제 2 CH3 도메인 간 아미노산―아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍의 각각의 아미노산쌍을 이루는 두 개의 아미노산을 서로 교환; 및

(3) 게 1 CH3 도메인과 게 2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 크기가 큰 아미노산 (예컨대， 트립토판, 페닐알라닌 등과 같은 크기가 큰 소수성 아미노산)으로， 다른 하나의 아미노산은 크기가 작은 아미노산 (예컨대， 알라닌， 글라이신， 발린 등과 같은 크기가 작은 소수성 아미노산)으로 치환. 다른 예는 다음 중 하나 이상의 단계를 포함하여 제 1 CH3 도메인과 제 2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍에 다음 중 하나 이상의 변이를 도입시키는 단계를 포함하는， 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법 또는 서로 다른 표적을 표적화하는 이중 특이성 항체 또는 항원 결합 단편의 이종 이합체 형성을 증가시키는 방법을 제공한다:

( 1) 제 1 에피토프를 인식하는 증쇄 유래의 제 1 CH3 도메인과 제 2 에피토프를 인식하는 중쇄 유래의 제 2 CH3 도메인 간 아미노산―아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로， 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환;

(2) 게 1 CH3 도메인과 게 2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍의 아미노산을 서로 교환; 및

(3 ) 제 1 CH3 도메인과 게 2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 크기가 큰 아미노산 (예컨대， 트립토판, 페닐알라닌 등과 같은 크기가 큰 소수성 아미노산)으로, 다른 하나의 아미노산은 크기가 작은 아미노산 (예컨대， 알라닌， 글라이신, 발린 등과 같은 크기가 작은 소수성 아미노산)으로 치환.

상기 이중 특이성 항체 또는 항원 결합 단편의 제조 방법은， 다음의

CHI 도메인 및 α도메인 변이 단계를 추가로 포함할 수 있다:

거 U 에피토프를 인식하는 항체의 중쇄 유래의 제 1 CH1 도메인 및 제 1 CL 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 게 1 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고， 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환; 및

제 2 에피토프를 인식하는 항체의 증쇄 유래의 제 2 CH1 도메인 및 제 2 CL 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 제 2 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환.

상기 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법은 서로 다를 에피토프를 인식하는 항체 유래의 CH3 도메인 또는 Fc 영역 간의 이종 이합체 (heterodimer) 형성을 증가시키고， 동시에 동일한 에피토프를 인식하는 항체 유래의 CH1 도메인 (중쇄)과 CL 도메인 (경쇄) 간의 이합체 형성을 증가시킬 수 있다.

【과제의 해결 수단】

이하， 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 항체의 Fc 보존 (불변) 영역 및 /또는 Fab 보존 (불변) 영역을 포함하는 상이한 표적을 표적화하는 이중 특이성 단백질 또는 그 제조 방법에 있어서，

서로 다른 표적화 도메인과 연결 (융합)된 Fc 보존 영역 (CH3 도메인)에 아미노산 변이를 도입시킴으로써， 서로 다른 표적화 도메인과 연결된 Fc 보존 영역 간 결합률을 높여서 이종 이합체 형성률을 증가시키고， 동일한 표적화 도메인과 연결된 Fc 간 결합된 동종 이합체의 형성를을 감소시키거나; 및 /또는 ,

서로 다른 표적화 도메인과 연결된 Fab 보존 영역에 아미노산 변이를 도입시킴으로써， 동일한 표적화 도메인과 연결된 Fab 보존 영역 간 결합력을 높여서 동일한 표적화 도메인 및 이와 연결된 Fab 보존 영역 간 이합체 형성률을 증가시켜,

서로 다른 표적화 도메인을 갖는 이중 특이성 단백질 생성률을 증진시키는 기술을 제공한다.

본 명세서에 기재된 항체 (중쇄 및 경쇄)， CH1 도메인， CL 도메인，

Fc 영역， 및 CH3 도메인에서의 아미노산 위치는 모두 Eu 넘버링 시스템 [ ' abat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)'에 기재된 EU-인덱스]에 따라 넘버링 되어 표기되며， 서열목록내의 서열의 위치를 나타내는 슷자와는 다르다.

상기 항체는 모든 종류의 포유류 또는 조류에서 유래하는 모든 종류의 면역글로불린 (i醒 unoglobulin) 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대， 본 명세서에서 사용된 항체는 IgG (예컨대， IgG 타입 1 (IgGl), IgG 타입 2 (IgG2), IgG 타입 3 (IgG3), 및 IgG 타입 4 (IgG4)), IgA (예컨대， IgA 타입 1 (IgAl) 및 IgA 타입 2 (IgA2)), IgD, IgE, 및 IgM로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 항체는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스， 래트 등을 포함하는 설치류 등과 같은 포유류 유래의 면역글로불린, 예컨대， 인간 유래의 면역글로불린 일 수 있다. 일 예에서， 상기 항체는 인간 IgGl (constant region; 단백질: GenBank Accession No. AAC82527.1, 유전자: GenBank Accession No. J00228.1), 인간 IgG2 (constant region; 단백질: GenBank Accession No. AAB59393.1, 유전자: GenBank Accession No. J00230.1), 인간 IgG3 (constant region; 단백질: GenBank Accession No. P01860, 유전자: GenBank Accession No. X03604.1), 인간 IgG4 (constant region; 단백질: GenBank Accession No. AAB59394.1 , 유전자: GenBank Accession No. K01316.1), 인간 IgAl (constant region; 단백질: GenBank Accession No. AAT74070.1, 유전자: GenBank Accession No. AY647978.1), 인간 IgA2 (constant region; 단백질: GenBank Accession No. AAB59396.1, 유전자: GenBank Accession No. J00221.1), 인간 IgD (constant region; 단백질: GenBank Accession No. AAA52771.1, AAA52770.1), 인간 IgE (constant region; 단백질: GenBank Accession No. AAB59395.1, 유전자: GenBank Accession No. J00222.1), 및 인간 IgM (constant region; 단백질: GenBank Accession No. CAB37838.1, 유전자: GenBank Accession No. X57086.1) 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서， 상기 항체는， 예컨대， 인간 유래의， IgGl, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 돌연변이가 도입되는 제 1 CH3 도메인과 제 2 CH3 도메인， 계 1 CH1 도메인과 게 1 CL 도메인， 및 게 2 CH1 도메인과 게 2 CL 도메인은 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 면역글로불린 타입에서 선택된 것일 수 있다.

인간 IgGl 중쇄불변영역 (서열번호 33)과 인간 IgAl 중쇄불변영역 (서열번호 34)의 서열 정렬 결과를 보이는 도 33a 및 인간 면역글로불린 경쇄의 카파 불변영역 (서열번호 35)과. 람다 불변영역 (서열번호 36)의 서열 정렬 결과를 보이는 도 33b에서 보여지는 바와 같이， 중쇄불변영역 및 경쇄불변영역의 아미노산 서열은 아형 간 보존도가 매우 높다.

또한， 면역글로불린은 그 것이 유래하는 종 (species) 및 아형 (subtype) 간의 서열 보존도가 매우 높다. 예컨대， 인간과 마우스와 래트의 IgG 아형들 간의 중쇄불변영역의 서열 정렬 (sequence alignment) 결과를 보이는 도 33c (CHI 도메인 서열 정렬 결과) 및 도 33d (CH3 도메인 서열 정렬 결과)에서 보여지는 바와 같이， 면역글로불린의 중쇄불변영역의 아미노산서열은 종간 보존도가 매우 높다. 따라서， 본 명세서에서 제공되는 CH1 도메인 및 CH3 도메인의 아미노산 위치는 인간 IgGl을 기준으로， CL 도메인은 인간 카파 불변영역을 기준으로 기재되며， 상기 인간 IgGl 및 인간 카파 불변영역을 기준으로 기재된 아미노산 위치는 통상적인 서열정렬 수단 (예컨대， https://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 통하여 다른 아형의 면역글로불린 및 인간 이외의 종의 면역글로불린에서의 대웅되는 아미노산 위치를 명확하게 알수 있다 (표 1 참조).

또한， 본 명세서에서 제공되는 CH1 도메인， CL 도메인， 및 CH3 도메인의 아미노산 위치는 Eu 넘버링 시스템에 의하여 표현되며, 그 상세한 사항은

'http: //www. imgt .org/IMGTScient i f i cChar t /Number i ng/Hu_I GHGnber .html (중쇄불변영역) '，

' http： // www . i mgt . org/ IMGTSc i ent i f i cChar t /Number i ng/Hu_IGLCnber .html (경쇄 람다 영역)' 및 'http:/ /www . imgt . org/ IMGTSc i ent i f i cChar t /Number ing/Hu_IGKCnber .html (경쇄 카파 영역) ¹ 를 통하여 확인할 수 있다.

상기 Eu넘버링에 의하면， 인간 IgGl을 기준으로，

(1) CH1 도메인 (서열번호 1)은 첫 번째 아미노산 (Ala)을 118번 위치로 하여 일련번호로 넘버링되며 (즉， 서열번호 1의 CH1 도메인의 108개 아미노산은 IgGl의 118번부터 215번까지의 위치에 해당함);

(2) CH3 도메인 (서열번호 15)은 첫 번째 아미노산 (Lys)을 340번 위치로 하여 일련번호로 넘버링 된다 (즉， 서열번호 15의 CH3 도메인의 108개 아미노산은 IgGl의 340번부터 447번까지의 위치에 해당함 (이상， http:// www . imgt . org/ IMGTSc i ent i f i cChart /Number i ng/Hu_ I GHGnber . html 참조).

본 명세서에서의 CHI 및 CH3 도메인의 아미노산 위치 및 이에 해당하는 아미노산 종류는 인간 IgGl을 기준으로 기재한다. ^'

또한 Eu 넘버링에 의하면，

인간 카파 불변 영역 (단백질: GenBank Accession No. AAA58989.1 유전자: GenBank Accession No. J00241.1)의 CL 도메인 (서열번호 10)은 첫 번째 아미노산 (Val)을 110번 위치로 하여 일련번호로 넘버링되며 (즉， 서열번호 10의 CL 도메인의 105개 아미노산은 110번부터 214번까지의 위치에 해당함; ht tp： //www . imgt . org/ IMGTSc ientifi cChar t /Number ing/Hu_IGKCnber .html 참조);

인간 람다 불변 영역 (서열번호 11 (Lambdal), 서열번호 12 (Lambda2), 서열번호 13 (Lambda3), 및 서열번호 14 (Lambda7))에서는 첫 번째 아미노산 (Lys)을 110번 위치로 하여 일련번호로 넘버링된다 (단 람다 불변영역의 경우 일련번호에서 169， 201 및 202번이 누락됨; 즉， 서열번호 11 또는 서열번호 12의 CL 도메인의 103개 아미노산은 110번부터 168번， 170번부터 200번， 및 203번부터 215번까지의 위치에 해당함; http:// www . i mgt .org/ IMGTSc i ent i f i cChar t /Number i ng/Hu_IGLCnber .html 참조). 본 명세서에서의 CL 도메인의 아미노산 위치 및 이에 해당하는 아미노산 종류는 인간 카파불변영역을 기준으로 기재한다.

상기 Fab 보존 영역은， IgG (IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG 4)， IgA (IgAl 및 IgA2), IgD, IgE, 및 IgM의 Fab 단편의 중쇄불변영역 (즉， CHI 도메인)에서 선택된 어느 하나인 중쇄 Fab의 중쇄 불변영역 보존 영역 및 면역글로불린의 경쇄의 카파 타입 및 람다 타입 (예컨대， 람다 타입 1， 람다 타입 2， 람다 타입 3， 및 람다 타입 7)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 경쇄 불변영역 (즉， CL 도메인)을 포함할 수 있다.

예컨대， 상기 Fab 단편의 중쇄불변영역 (CH1 도메인)으로 사용 가능한 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 IgAl, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM의 CHI 도메인은 각각 순서대로 서열번호 1 (Eu 넘버링으로 118번부터 215번까지에 해당함)， 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4ᅳ 서열번호 5， 서열번호 6， 서열번호 7， 서열번호 8， 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한， 상기 경쇄불변영역 (CL 도메인)로서 사용 가능한， 카파 타입， 람다 타입 1, 람다 타입 2, 람다 타입 3， 및 람다 타입 7의 CL 도메인일 수 있으며， 이들 CL 도메인은 각각 순서대로 서열번호 10 (Eu 넘버링으로 110번부터 214번까지에 해당함)， 서열번호 11， 서열번호 12， 서열번호 13, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 Fab 보존 영역은 IgG 타입 1의 CH1 도메인 (서열번호 1) 및 카파 타입의 경쇄불변영역 (CL 도메인) (서열번호 10)을 포함할 수 있다. 동일한 표적을 표적화하는 분자 간 이합체 형성률을 증가시키기 위하여， CH1 도메인에서 음전하를 갖는 아미노산 또는 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되는 아미노산은， Eu 넘버링 시스템에 따라， IgG 타입 1 (서열번호 1)의 145번째 위치의 류신, 147번째 위치의 라이신， 170번째 위치의 페닐알라닌， 1기번 위치의 프를린， 183번째 위치의 세린， 및 185번째 위치의 발린으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상， 예컨대， 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개)， 3개 이상 (예컨대， 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있다. 다른 예에서， CH1 도메인에서 음전하를 갖는 아미노산 또는 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되는 아미노산은 IgG의 다른 서브타입 ( IgG2, IgG3 , 및 IgG4) , IgAl, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM의 CHI 도메인 (순서대로 서열번호 2 내지 9)에서 서열번호 1의 145번째 위치의 류신， 147번째 위치의 라이신， 170번째 위치의 페닐알라닌， 1기번 위치의 프롤린， 183번째 위치의 세린， 및 185번째 위치의 발린에 대웅하는 위치의 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 명세서에 사용된 ¹ 대웅하는 위치의 아미노산'은 서열번호 1의 아미노산 서열과 대상 아미노산 서열 (예컨대， 서열번호 2 내지 9)과의 통상적인 서열 정렬 (sequence al ignment )에 의하여 어렵지 않게 결정될 수 있다 (이하동일함) .

상기 양전하를 갖는 아미노산 (양전하로 하전되도록 하는 아미노산)은 염기성 아미노산 중에서 선택될 수 있으며， 예컨대， 라이신 또는 아르기닌일 수 있다. 따라서， CH1 도메인에 양전하를 갖는 아미노산이 도입되는 경우， 서열번호 1의 145번째 위치의 류신， 147번째 위치의 라이신， 170번째 위치의 페닐알라닌， 1기번 위치의 프를린， 183번째 위치의 세린， 및 185번째 위치의 발린， 및 이들과 대웅되는 위치의 서열번호 2 내지 9의 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상， 예컨대， 하나， 2개 이상 (예컨대 2 개) , 3개 이상 (예컨대， 3개) , 또는 4개 이상 (예컨대 4개)이 각각 독립적으로 염기성 아미노산， 예컨대, 라이신 또는 아르기닌으로 치환될 수 있다.

예컨대， CH1 도메인은 양전하를 갖는 아미노산을 도입하기 위하여， 다음 중 하나 이상， 예컨대， 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개) , 3개 이상 (예컨대， 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 돌연변이를 포함할 수 있다 (서열번호 1 기준; 서열번호 2 내지 9에서 대웅하는 위치의 아미노산에도 적용됨) :

145번째 위치의 류신을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대 라이신으로 치환) ;

183번째 위치의 세린을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대 라이신으로 치환) ;

147번째 위치의 라이신을 아르기닌으로 치환; 170번째 위치의 페닐알라닌을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대, 라이신으로 치환) ;

1기번 위치의 프를린을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대, 라이신으로 치환) ; 및

185번째 위치의 발린을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대， 아르기닌으로 치환) .

상기 음전하를 갖는 아미노산은 산성 아미노산 중에서 선택될 수 있으며， 예컨대， 아스파르트산 또는 글루탐산일 수 있다. 따라서， CH1 도메인에 음전하를 갖는 아미노산이 도입되는 경우， 서열번호 1의 145번째 위치의 류신， 147번째 위치의 라이신, 170번째 위치의 페닐알라닌, 1기번 위치의 프를린, 183번째 위치의 세린， 및 185번째 위치의 발린， 및 이들과 대웅되는 위치의 서열번호 2 내지 9의 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상， 예컨대， 하나， 2개 이상 (예컨대 2 개)ᅳ 3개 이상 (예컨대， 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)이 각각 독립적으로 산성 아미노산， 예컨대， 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환될 수 있다.예컨대， CH1 도메인은 음전하를 갖는 아미노산을 도입하기 위하여， 다음 중 하나 이상, 예컨대， 하나， 2개 이상 (예컨대 2 개)， 3개 이상 (예컨대， 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 돌연변이를 포함할 수 있다 (서열번호 1 기준; 서열번호 2 내지 9에서 대웅하는 위치의 아미노산에도 적용됨) :

145번째 위치의 류신을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환

(예컨대 글루탐산으로 치환) ;

147번째 위치의 라이신을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환 (예컨대， 아스파르트산으로 치환) ;

183번째 위치의 세린을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환 (예컨대 글루탐산으로 치환) ;

185번째 위치의 발린을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환 (예컨대， 아스파르트산으로 치환) ;

170번째 위치의 페닐알라닌을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환 (예컨대， 아스파르트산으로 치환) ; 및

1기번 위치의 프를린을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환

(예컨대， 아스파르트산으로 치환) .

동일한 표적을 표적화하는 분자 간 이합체 형성률을 증가시키기 위하여， 경쇄불변영역 (CL 도메인)에서 음전하를 갖는 아미노산 또는 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되는 아미노산은 카파 타입 (서열번호

10)의 131번째 위치의 세린， 133번째 위치의 발린， 135번째 위치의 류신， 162번째 위치의 세린， 및 180번째 위치의 트레오닌으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대， 하나， 2개 이상 (예컨대 2 개)， 3개 이상 (예컨대， 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있다. 다른 예에서， CL 도메인에서 음전하를 갖는 아미노산 또는 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되는 아미노산은 람다 타입 (람다 타입 1 , 람다 타입 2， 람다 타입 3， 및 람다 타입 7)의 CL 도메인 (순서대로 서열번호 11 내지 14)에서 서열번호 10의 131번째 위치의 세린， 133번째 위치의 발린, 135번째 위치의 류신， 162번째 위치의 세린, 및 180번째 위치의 트레오닌에 대웅하는 위치의 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 양전하를 갖는 아미노산 (양전하로 하전되도록 하는 아미노산)은 염기성 아미노산 중에서 선택될 수 있으며， 예컨대， 라이신 또는 아르기닌일 수 있다. 따라서， CL 도메인에 양전하를 갖는 아미노산이 도입되는 경우， 서열번호 10의 131번째 위치의 세린， 133번째 위치의 발린， 135번째 위치의 류신， 162번째 위치의 세린, 및 180번째 위치의 트레오닌, 및 이들과 대웅되는 위치의 서열번호 11 내지 14의 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상， 예컨대, 하나， 2개 이상 (예컨대 2 개) , 3개 이상 (예컨대, 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)이 각각 독립적으로 염기성 아미노산， 예컨대， 라이신 또는 아르기닌으로 치환될 수 있다.

예컨대， CL 도메인은 양전하를 갖는 아미노산을 도입하기 위하여， 다음 중 하나 이상， 예컨대， 하나， 2개 이상 (예컨대 2 개) , 3개 이상 (예컨대， 3개) , 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 돌연변이를 포함할 수 있다 (서열번호 10 기준; 서열번호 11 내지 14에서 대웅하는 위치의 아미노산에도 적용됨) :

131번째 위치의 세린을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대 라이신으로 치환) ;

133번째 위치의 발린을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대 라이신으로 치환) ;

135번째 위치의 류신을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대 아르기닌으로 치환) ;

162번째 위치의 세린을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대 라이신으로 치환) ; 및 180번째 위치의 트레오닌을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대, 아르기닌으로 치환) .

동형 이합체 형성률을 보다 높이기 위하여， 상기한 변이 CH1 도메인 및 /또는 변이 CL 도메인은 2 가지 이상의 변이를 동시에 포함할 수 있다. 예컨대， CH1 도메인의 147번째 위치의 라이신과 185번째 위치의 발린이 양전하를 갖는 아미노산 또는 음전하를 갖는 아미노산으로 치환될 수 있다. 예컨대， 제 1 CH1 도메인과 제 2 CH1 도메인 중 어느 하나의 CH1 도메인의 147번째 위치의 라이신과 185번째 위치의 발린이 양전하를 갖는 아미노산 (예컨대， 라이신 또는 아르기닌)으로 치환되고， 다른 CH1 도메인의 147번째 위치의 라이신과 185번째 위치의 발린은 음전하를 갖는 아미노산 (글루탐산 또는 아스파르트산)으로 치환될 수 있다. 또한， CL 도메인의 135번째 위치의 류신과 180번째 위치의 트레오닌이 양전하를 갖는 아미노산 또는 음전하를 갖는 아미노산으로 치환될 수 있다. 예컨대，게 1 CL 도메인과 제 2 CL 도메인 중 어느 하나의 CL 도메인의 135번째 위치의 류신과 180번째 위치의 트레오닌이 양전하를 갖는 아미노산 (예컨대， 라이신 또는 아르기닌)으로 치환되고， 다른 CL 도메인의 135번째 위치의 류신과 180번째 위치의 트레오닌은 음전하를 갖는 아미노산 (글루탐산 또는 아스파르트산)으로 치환될 수 있다.

다른 예에서， CH1 도메인의 170번째 위치의 페닐알라닌과 1기번째 위치의 프를린이 양전하를 갖는 아미노산 또는 음전하를 갖는 아미노산으로 치환될 추 있다. 예컨대， 게 1 CH1 도메인과 제 2 CH1 도메인 중 어느 하나의 CH1 도메인의 170번째 위치의 페닐알라닌과 1기번째 위치의 프를린이 양전하를 갖는 아미노산 (예컨대， 라이신 또는 아르기닌)으로 치환되고， 다른 CH1 도메인의 170번째 위치의 페닐알라닌과 1기번째 위치의 프롤린은 음전하를 갖는 아미노산 (글루탐산 또는 아스파르트산)으로 치환될 수 있다. 또한, CL 도메인의 135번째 위치의 류신과 162번째 위치의 세린이 양전하를 갖는 _. 아미노산 또는 음전하를 갖는 아미노산으로 - 치환될 수 있다. 예컨대， 게 1 CL 도메인과 제 2 CL 도메인 중 어느 하나의 CL 도메인의 135번째 위치의 류신과 162번째 위치의 세린이 양전하를 갖는 아미노산 (예컨대， 라이신 또는 아르기닌)으로 치환되고， 다른 CL 도메인의 135번째 위치의 류신과 162번째 위치의 세린은 음전하를 갖는 아미노산 (글루탐산또는 아스파르트산)으로 치환될 수 있다.

상기 음전하를 갖는 아미노산은 산성 아미노산 중에서 선택될 수 있으며， 예컨대， 아스파르트산 또는 글루탐산일 수 있다. 따라서， CL 도메인에 음전하를 갖는 아미노산이 도입되는 경우， 서열번호 10의 131번째 위치의 세린， 133번째 위치의 발린， 135번째 위치의 류신， 162번째 위치의 세린， 및 180번째 위치의 트레오닌， 및 이들과 대웅되는 위치의 서열번호 11 내지 14의 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상， 예컨대， 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개)， 3개 이상 (예컨대， 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)이 각각 독립적으로 산성 아미노산， 예컨대, 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환될 수 있다.예컨대， CL 도메인은 양전하를 갖는 아미노산을 도입하기 위하여， 다음 중 하나 이상， 예컨대， 하나， 2개 이상 (예컨대 2 개)， 3개 이상 (예컨대， 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 돌연변이를 포함할 수 있다 (서열번호 10 기준; 서열번호 11 내지 14에서 대응하는 위치의 아미노산에도 적용됨) :

131번째 위치의 세린을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환 (예컨대 글루탐산으로 치환) ;

133번째 위치의 발린을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환

(예컨대 글루탐산으로 치환) ;

135번째 위치의 류신을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환 (예컨대 아스파르트산으로 치환) ;

162번째 위치의 세린을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환 (예컨대， 아스파르트산으로 치환) ; 및

180번째 위치의 트레오닌을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환 (예컨대， 아스파르트산으로 치환) .

일 예에서， 상기와 같이 CH1 도메인와 CL 도메인 간 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산을 서로 다른 전하를 갖는 아미노산으로 치환하는 돌연변이가 도입되는 CH1 도메인과 CL 도메인 간 아미노산 쌍은， 서열번호 1 (CH1 도메인) 및 서열번호 10 (CL 도메인)의 아미노산 서열을 기준으로， CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 131번째 위치의 세린 쌍ᅳ CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 133번째 위치의 발린 쌍， CH1 도메인의 147번째 위치의 라이신과 CL 도메인의 180번째 위치의 트레오닌 쌍， CH1 도메인의 183번째 위치의 세린과 (X 도메인의 133번째 위치의 발린 쌍， CH1 도메인의 185번째 위치의 발린과 CL 도메인의 135번째 위치의 류신 쌍, CH1 도메인의 170번째 위치의 페닐알라닌과 ⁽ X 도메인의 135번째 위치의 류신 쌍， 및 CH1 도메인의 1기번째 위치의 프롤린과 CL 도메인의 162번째 위치의 세린 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개)， 3개 이상 (예컨대， 3개) , 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있다. 예컨대， 상기 돌연변이가 도입되는 CH1 도메인과 CL 도메인 간 아미노산 쌍은， 서열번호 1 (CH1 도메인) 및 서열번호 10 (CL 도메인)의 아미노산 서열을 기준으로， CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 131번째 위치의 세린 쌍， CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 133번째 위치의 발린 쌍， CH1 도메인의 147번째 위치의 라이신과 CL 도메인의 180번째 위치의 트레오닌 쌍， CH1 도메인의 183번째 위치의 세린과 CL 도메인의 133번째 위치의 발린 쌍， 및 CH1 도메인의 185번째 위치의 발린과 CL 도메인의 135번째 위치의 류신 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 2개 이상 (예컨대， 2개)일 수 있다.

상기 돌연변이가 도입되는 제 1 CH1 도메인과 게 1 CL 도메인 간 아미노산 쌍과， 제 2 CH1 도메인과 제 2 CL 도메인 간 아미노산 쌍은 서로 동일하거나 다를 수 있다.

일 예에서， 제 1 CH1 도메인에 양전하를 갖는 아미노산이 도입된 경우 (제 1 CL 도메인에는 음전하를 갖는 아미노산이 도입됨)， 게 2 CH1 도메인에는 음전하를 갖는 아미노산이 도입 (제 2 CL 도메인에는 양전하를 갖는 아미노산아도입됨)될 수 있다.

이종 이합체 형성률을 증가시키기 위하여， 중쇄의 Fc 영역， 구체적으로 Fc 영역 중 CH3 도메인에 다음으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상， 예컨대， 하나， 2개 또는 3개의 돌연변이를 도입할 수 있다:

( 1) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍 (두 개의 아미노산 중 하나 이상은 소수성 아미노산이 아님) 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고， 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환된 변이 (이하， "정전기적 상호작용 도입 변이 " ) ;

(2) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍의 아미노산이 서로 교환된 변이 (이하， "스와핑 변이 " ) ; 및

(3) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 크기가 큰 아미노산 (예컨대, 트립토판, 페닐알라닌 등과 같은 크기가 큰 소수성 아미노산)으로 치환되고， 다른 하나의 아미노산은 크기가 작은 아미노산 (예컨대, 알라닌, 글라이신， 발린 등과 같은 크기가 작은 소수성 아미노산)으로 치환된 변이 (이하， "사이즈 변이 " ) . 이와 같이 변이가 도입되는 CH3 도메인은 인간 IgGl의 CH3 도메인 (서열번호 15; Eu 넘버링으로， 340번부터 447번까지에 해당함)， 인간 IgG2의 CH3 도메인 (서열번호 16)， 인간 IgG3의 CH3 도메인 (서열번호 17)， 인간 IgG4의 CH3 도메인 (서열번호 18)， 인간 IgAl의 CH3 도메인 (서열번호 19)， 인간 IgA2의 CH3 도메인 (서열번호 20)， 인간 IgD의 CH3 도메인 (서열번호 21)， 인간 IgE의 CH3 도메인 (서열번호 22) , 및 인간 IgM의 CH3 도메인 (서열번호 23)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 변이가 도입되는 게 1 CH3 도메인과 제 2 CH3 도메인은 각각 독립적으로 IgGl , IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM로 이루어진 군에서 선택된 서로 같거나 다른 면역글로불린 타입으로부터 유래하는 것일 수 있다. 일 예에서， 상기 게 1 CH3 도메인과 게 2 CH3 도메인은 모두 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 인간 IgGl의 CH3 도메인일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.

이하 기재되는 제 1 CH3 도메인과 제 2 CH3 도메인 간 아미노산 쌍은 서열번호 15의 ^{" ^} 인간 IgGl의 CH3 도메인을 기준으로 기재된 것이며， 이에 대웅하는 위치의 IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2 , IgD, IgE, 및 IgM의 CH3 도메인 (순서대로， 서열번호 16 내지 23) 간의 아미노산 쌍에도 적용된다. 상기 기재된 변이가 도입되는 게 1 CH3 도메인과 제 2 CH3 도메인 간 아미노산 쌍은 아래의 표 1에 제시된 CH3 도메인 간 아미노산 쌍, 및 이에 대웅하는 위치의 IgG2 , IgG3 , IgG4, IgAl , IgA2, IgE, 및 IgM의 CH3 도메인 (순서대로， 서열번호 16 내지 23) 간의 아미노산 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상， 예컨대， 하나， 2개 이상 (예컨대 2 개)， 3개 이상 (예컨대, 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있다.

【표 1】

D356 439 E356 439 E356 439 W453 - R539 D356 439

E357 Y349 E357 H349 E357 H349 P454 Y446 E357 Y349

E357 K370 E357 R370 E357 R370 P454 Q467 E357 K370 360 Q347 L360 E347 L360 E347 R457 E444 K360 Q347 360 Y349 L360 H349 L360 H349 R457 Y446 360 Y349

S364 L368 T364 L368 T364 L368 T461 L465 S364 L368

S364 370 T364 R370 T364 R370 T461 Q467 S364 370

T366 T366 T366 T366 T366 T366 A463 A463 T366 T366

T366 Y407 T366 T407 T366 T407 A463 F506 T366 Y407

L368 S364 L368 T364 L368 T364 L465 T461 L368 S364

L368 K409 L368 1409 L368 1409 L465 R508 L368 409

K370 E357 R370 E357 R370 E357 Q467 P454 K370 E357 370 S364 R370 T364 R370 T364 Q467 T461 K370 S364

K370 T411 R370 R411 R370 R411 Q467 E510 K370 T411

N390 S400 L390 S400 L390 S400 R489 K499 N390 S400

K392 L398 L392 Q398 L392 Q398 S491 K497 K392 L398

T394 T394 W394 W394 W394 W394 T493 T493 T394 T394

T394 V397 W394 R397 W394 R397 T493 R496 T394 V397

P395 P395 A395 A395 A395 A395 Q494 Q494 P395 P395

P395 V397 A395 R397 A395 R397 Q494 R496 P395 V397

V397 T394 R397 W394 R397 W394 R496 T493 V397 T394

V397 P395 R397 A395 R397 A395 R496 Q494 V397 P395

L398 392 Q398 L392 Q398 L392 497 S491 L398 K392

S400 N390 S400 K390 S400 390 K499 R489 S400 N390

F405 409 A405 1409 A405 1409 F504 R508 F405 409

Y407 T366 T407 T366 T407 T366 F506 A463 Y407 T366

Y407 Y407 T407 T407 T407 T407 F506 F506 Y407 Y407

Y407 409 T407 1409 T407 1409 F506 R508 Y407 409 409 L368 1409 L368 1409 L368 R508 L465 409 L368

K409 F405 1409 A405 1409 A405 508 F504 409 F405 409 Y407 1409 T407 1409 T407 R508 F506 409 Y407

T411 K370 R411 R370 R411 R370 E510 Q467 T411 K370

K439 D356 K439 K439 439 439 R539 W453 439 D356

(Chain A: 제 1 CH3 도메 ¾ Chain B : 제 2 CH3 도머 ^'

보다 구체적으로， (1) 정전기적 상호작용 도입 변이 (표 2 및 도 2에서 Charge (J)로 표시) ;

(2) 스와핑 변이 (표 2 및 도 2에서 Swap (0)로 표시) ; 및

(3) 사이즈 변이 (표 2 및 도 2에서 Size (B)로 표시)

중 어느 하나 이상이 도입되는 계 1 CH3 도메인과 제 2 CH3 도메인 간 아미노산 쌍은 아래의 표 2 및 도 2에 제시된 IgGl의 CH3 도메인 (서열번호 15) 간의 아미노산 쌍， 및 이에 대응하는 위치의 IgG2, IgG3 IgG4 IgAl IgA2 IgD, IgE, 및 IgM의 CH3 도메인 (순서대로， 서열번호 16 내지 23) 간의 아미노산 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개)， 3개 이상 (예컨대， 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있다:

【표 2]

21 370 T411 370 T411

22 N390 S400 N390 S400 N390 S400

23 392 L398 K392 L398

24 T394 T394 T394 T394

25 T394 V397 T394 V397 T394 V397

26 P395 P395 P395 P395

27 P395 V397 . P395 V397

28 V397 T394 V397 T394

29 V397 P395 V397 P395

30 L398 K392 L398 392 L398 392

31 S400 N390 S400 N390

32 ^" F405 409 F405 K409 F405 K409

33 Y407 T366 Y407 T366 Y407 T366

34 Y407 Y407 Y407 Y407

35 Y407 K409 Y407 409

36 409 ' L368 409 L368

^' 37 409 F405 409 F405

38 409 Y407 409 Y407

39 T411 K370 T411 K370 T411 K370

40 439 D356

(Chain A: 제 1 CH3도메인; Chain B: 제 2 CH3도메인;

상기 표 2에 기재된 변이 위치는 IgGl을 기준으로 표시되었으나， IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM의 CH3 도메인의 이에 대웅되는 위치에도 적용됨)

본 명세서에 사용된 바로서， 예컨대， 'Q347'은 서열번호 15의 인간 IgGl의 CH3 도메인의 347번째 아미노산 위치의 글루타민을 의미하며， 이는 IgG2, IgG3 IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM의 CH3 도메인 (순서대로， 서열번호 16 내지 23)에서의 이에 대응하는 위치의 아미노산 잔기에도 적용된다 (이하 동일함).

이하 기재되는 CH3 도메인에 변이가 도입되는 아미노산 쌍은 서열번호 15를 기준으로 넘버링하여 표시되며， 별도의 반대 기재가 없는 한， IgGl의 표시된 위치의 아미노산뿐 아니라， 다른 타입의 면역글로불린 (IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM)의 CH3 도메인의 이에 대웅하는 위치의 아미노산에도 적용되는 것으로 해석된다. 상기 정전기적 상호작용 도입 변이는 Fc 영역 또는 CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍 (두 개의 아미노산 중 하나 이상은 소수성 아미노산이 아님) 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환， 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환에 의하여， 소수성 상호작용을 하지 않는 부분에 정전기적 상호작용을 도입하여 정전기적 상호작용에 의한 결합력 증가에 기여한다.

상기 소수성 아미노산은 글리신， 알라닌， 발린， 루신， 이소루신， 메티오닌， 프를린， 페닐알라닌， 및 트립토판으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 음전하를 갖는 아미노산은 산성 아미노산들 중에서 선택될 수 있으며， 에컨대， 아스파르트산 또는 글루탐산일 수 있다. 상기 상기 양전하를 갖는 아미노산은 염기성 아미노산들 중에서 선택될 수 있으며， 예컨대， 라이신 또는 아르기닌일 수 있다.

상기 정전기적 상호작용 도입 변이가 적용될 수 있는 게 1 CH3 도메인과 게 2 CH3 간 아미노산 쌍은 상기 표 2의 아미노산 쌍 번호 1 내지 39 중 선택된 하나 이상, 예컨대， 하나， 2개 이상 (예컨대 2 개)， 3개 이상 (예컨대, 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있으며， 예컨대, 364번째 위치의 세린과 368번째 위치의 류신, 394번째 위치의 트레오닌과 394번째 위치의 트레오닌， 357번째 위치의 글루탐산과 370번째 위치의 라이신， 357번째 위치의 글루탐산과 349번째 위치의 타이로신， 366번째 위치의 트레오닌과 407번째 위치의 타이로신, 및 394번째 위치의 트레오닌과 397번째 위치의 발린으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상， 예컨대， 하나 2개 이상 (예컨대 2 개) , 3개 이상 (예컨대， 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있다.

즉， 상기 CH3 도메인의 정전기적 상호작용 도입 변이는ᅳ 상기 표 2의 아미노산 쌍 번호 1 내지 39 중 선택된 하나 이상, 예컨대， 하나， 2개 이상 (예컨대 2 개) , 3개 이상 (예컨대， 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 아미노산 쌍 중 각각의 아미노산 쌍의 어느 하나의 아미노산을 양전하를 갖는 아미노산으로， 다른 하나의 아미노산을 음전하를 갖는 아미노산으로 치환을 포함할 수 있으며， 예컨대， 364번째 위치의 세린과 368번째 위치의 류신， 394번째 위치의 트레오닌과 394번째 위치의 트레오닌， 357번째 위치의 글루탐산과 370번째 위치의 라이신, 357번째 위치의 글루탐산과 349번째 위치의 타이로신， 366번째 위치의 트레오닌과 407번째 위치의 타이로신， 및 394번째 위치의 트레오닌과 397번째 위치의 발린으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상， 예컨대， 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개)， 3개 이상 (예컨대, 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 아미노산 쌍 중 각각의 아미노산 쌍의 어느 하나의 아미노산을 양전하를 갖는 아미노산으로， 다른 하나의 아미노산을 음전하를 갖는 아미노산으로 치환을 포함할 수 있다.

예컨대， 상기 CH3 도메인의 정전기적 상호작용 도입 변이는 다음 중 하나 이상, 예컨대， 하나， 2개 이상 (예컨대 2 개)， 3개 이상 (예컨대 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 변이를 포함할 수 있다:

364번째 위치의 세린을 양전하를 갖는 아미노산으로， 368번째 위치의 류신올 음전하를 갖는 아미노산으로 치환;

394번째 위치의 트레오닌을 양전하를 갖는 아미노산으로, 394번째 위치의 트레오닌을 음전하를갖는 아미노산으로 차환;

357번째 위치의 글루탐산을 양전하를 갖는 아미노산으로, 370번째 위치의 라이신을 음전하를 갖는 아미노산으로 치환;

357번째 위치의 글루탐산을 양전하를 갖는 아미노산으로， 349번째 위치의 타이로신을 음전하를 갖는 아미노산으로 치환;

366번째 위치의 ^' 트레오닌을 양전하를 갖는 아미노산으로， 407번째 위치의 타이로신을 음전하를 갖는 아미노산으로 치환;

394번째 위치의 트레오닌을 양전하를 갖는 아미노산으로， 397번째 위치의 발린을 음전하를 갖는 아미노산으로 치환; 및

349번째 위치의 타이로신을 양전하를 갖는 아미노산으로， 357번째 위치의 글루탐산을 음전하를 갖는 아미노산으로 치환.

이와 같은 CH3 도메인의 정전기적 상호작용 도입에 의하여 이종 이합체 형성률이 60% 아상, 65% 이상， 70% 이상， 73% 이상， 75% 이상， 78% 이상， 80% 이상， 85% 이상， 90% 이상， 95% 이상， 또는 100 )일 수 있다.

상기 스와핑 변이는 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산을 서로 맞바꾼 (상호 교환한) 변이를 의미한다.

상기 CH3 도메인의 스와핑 변이가 적용될 수 있는 게 1 CH3 도메인과 계 2 CH3 간 아미노산 쌍은， 표 2 및 도 2에 나타난 바와 같이， 354번째 위치의 글루타민과 360번째 위치꾀 라이신， 357번째 위치의 세린과 349번째 위치의 타이로신， 357번째 위치의 글루탐산과 370번째 위치의 라이신， 360번째 위치의 라이신과 349번째 위치의 타이로신， 364번째 위치의 세린과 368번째 위치의 류신， 364번째 위치의 세린과 370번째 위치의 라이신， 368번째 류신과 409번째 라이신, 390번째 위치의 아스파라긴과 400번 위치의 세린， 394번째 위치의 트레오닌과 397번째 위치의 발린， 398번째 위치의 류신과 392번째 위치의 라이신， 405번째 위치의 페닐알라닌과 409번째 위치의 라이신， 407번째 위치의 타이로신과 366번째 위치의 트레오닌， 및 411번째 위치의 트레오닌과 370번째 위치의 라이신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상， 예컨대， 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개) , 3개 이상 (예컨대， 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있으며， 예컨대， 364번째 위치의 세린과 370번째 위치의 라이신， 407번째 위치의 타이로신과 366번째 위치의 트레오닌， 357번째 위치의 글루탐산과 370번째 위치의 라이신， 405번째 위치의 페닐알라닌과 409번째 위치의 라이신， 및 357번째 위치의 세린과 349번째 위치의 타이로신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상， 예컨대, 하나， 2개 이상 (예컨대 2 개)， 3개 이상 (예컨대， 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있다.

즉， 상기 CH3 도메인의 스와핑 변이는， 354번째 위치의 글루타민과

360번째 위치의 라이신， 357번째 위치의 세린과 349번째 위치의 타이로신， 357번째 위치의 글루탐산과 370번째 위치의 라이신， 360번째 위치의 라이신과 349번째 위치의 타이로신， 364번째 위치의 세린과 368번째 위치의 류신， 364번째 위치의 세린과 370번째 위치의 라이신， 368번째 류신과 409번째 라이신， 390번째 위치의 아스파라긴과 400번 위치의 세린， 394번째 위치의 트레오닌과 397번째 위치의 발린， 398번째 위치의 류신과 392번째 위치의 라이신, 405번째 위치의 페닐알라닌과 409번째 위치의 라이신， 407번째 위치의 타이로신과 366번째 위치의 트레오닌， 및 411번째 위치의 트레오닌과 370번째 위치의 라이신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대， 하나， 2개 이상 (예컨대 2 개)， 3개 이상 (예컨대, 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 아미노산 쌍 중 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산을 서로 맞바꾸어 치환 (교환)된 것을 포함할 수 있으며， 예컨대， 364번째 위치의 세린과 370번째 위치의 라이신， 407번째 위치의 타이로신과 366번째 위치의 트레오닌, 357번째 위치의 글루탐산과 370번째 위치의 라이신， 405번째 위치의 페닐알라닌과 409번째 위치의 라이신， 및 357번째 위치의 세린과 349번째 위치의 타이로신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 예컨대， 하나， 2개 이상 (예컨대 2 개)， 3개 이상 (예컨대， 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 아미노산 쌍 중 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산을 서로 맞바꾸어 치환 (교환)된 것을 포함할 수 있다.

예컨대 상기 CH3 도메인의 스와핑 변이는 다음 중 하나 이상， 예컨대， 하나， 2개 이상 (예컨대 2 개) , 3개 이상 (예컨대, 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 변이를 포함할 수 있다:

364번째 위치의 세린을 라이신으로, 370번째 위치의 라이신을 세린으로 치환;

405번째 위치의 페닐알라닌을 라이신으로， 409번째 위치의 라이신을 페닐알라닌으로 치환;

407번째 위치의 타이로신을 트레오닌으로， 366번째 위치의 트레오닌을 타이로신으로 치환;

357번째 위치의 글루탐산을 라이신으로， 370번째 위치의 라이신을 글루탐산으로 치환; 및

357번째 위치의 세린을 타이로신으로， 349번째 위치의 타이로신을 세린으로 치환.

이와 같은 CH3 도메인의 스와핑 변이에 의하여 이종 이합체 형성률이 60% 이상， 65% 이상， 70% 이상， 73% 이상， 75% 이상, 78% 이상, 80% 이상, 85% 이상， 90% 이상， 95% 이상， 또는 100%일 수 있다.

상기 사이즈 변이는 CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 크기가 큰 소수성 아미노산 (예컨대， 트립토판， 페닐알라닌 등과 같은 크기가 큰 소수성 아미노산)으로 치환되고， 다른 하나의 아미노산은 크기가 작은 소수성 아미노산 (예컨대， 알라닌， 글라이신， 발린 등과 같은 크기가 작은 소수성 아미노산)으로 치환된 변이를 의미하는 것으로， 큰 아미노산이 작은 아미노산에 의하여 형성된 공간에 끼워 맞춰질 수 았으므로， 헤테로 이합체 형성에 기여할 수 있다. 상기 큰 아미노산은 고리형 잔기를 포함하는 것일 수 있으며， 트립토판 및 페닐알라닌으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있고， 예컨대， 트립토판일 수 있다. 상기 작은 아미노산은 알라닌, 글라이신, 및 발린으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고， 예컨대, 알라닌일 수 있다.

상기 사이즈 변이가 적용될 수 있는 제 1 CH3 도메인과 제 2 CH3 간 아미노산 쌍은 상기 표 2의 아미노산 쌍 번호 1 내지 40 중 선택된 하나 이상， 예컨대， 하나， 2개 이상 (예컨대 2 개)， 3개 이상 (예컨대， 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있으며, 예컨대, 409번째 위치의 라이신과 407번째 위치의 타이로신， 409번째 위치의 라이신과 405번째 위치의 페닐알라닌， 또는 이들의 조합일 수 있다.

즉， 상기 사이즈 변이는， 상기 표 2의 아미노산 쌍 번호 1 내지 40 중 선택된 하나 이상， 예컨대， 하나， 2개 이상 (예컨대 2 개) , 3개 이상 (예컨대， 3개)， 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 아미노산 쌍 중 각각의 아미노산 쌍의 어느 하나의 아미노산을 크기가 큰 소수성 아미노산 (예컨대， 트립토판， 페닐알라닌 등과 같은 크기가 큰 소수성 아미노산)， 예컨대 트립토판으로 치환， 다른 하나의 아미노산을 크기가 작은 소수성 아미노산 (예컨대， 알라닌， 글라이신， 발린 등과 같은 크기가 작은 소수성 아미노산)， 예컨대 알라닌으로 치환을 포함할 수 있으며, 예컨대， 409번째 위치의 라이신과 407번째 위치의 타이로신， 409번째 위치의 라이신과 405번째 위치의 페닐알라닌， 또는 이들 모두 중 각각의 아미노산 쌍의 어느 하나의 아미노산을 크기가 큰 소수성 아미노산， 예컨대 페닐알라닌 또는 트립토판으로 치환, 다른 하나의 아미노산을 크기가 작은 소수성 아미노산， 예컨대 알라닌， 글라이신， 또는 발린으로 치환을 포함할 수 있다.

예컨대, 상기 CH3 도메인의 사이즈 변이는 다음 중 하나 이상의 변이를 포함할 수 았다:

409번째 위치의 라이신을 트립토판으로， 407번째 위치의 타이로신을 알라닌으로 치환; 및

409번째 위치의 라이신을 트립토판으로， 405번째 위치의 페닐알라닌을 알라닌으로 치환.

상기 변이 CH3 도메인은 앞서 설명한 3가지 변이， 즉 정전기적 상호작용 도입 변이， 스와핑 변이， 및 사이즈 변이 중 하나 이상， 예컨대， 하나또는 2 개의 변이를 모두 포함할 수 있다.

상기한 바와 같은 변이 CH3 도메인에 있어서， 이합체 형성에 가장 유리한 효과를.발휘하도록， 364번째 위치의 세린과 368번째 위치의 류신 중 어느 하나는 양전하를 갖는 아미노산으로， 다른 하나는 음전하를 갖는 아미노산으로 치환 (정전기적 상호 작용 도입 변이)， 364번째 위치의 세린과 370번째 위치의 라이신의 교환 (스와핑 변이)， 및 405번째 위치의 페닐알라닌과 409번째 위치의 라이신의 교환 (스와핑 변이)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상， 예컨대, 하나， 2개 또는 3개의 변이를 포함할 수 았다. 예컨대, 변이 CH3 도메인은 다음의 변이 중 하나 이상, 예컨대 하나, 2개 또는 3개의 변이를 포함하는 것일 수 있다:

(a) 364번째 위치의 세린을 양전하를 갖는 아미노산으로, 368번째 위치의 류신을 음전하를 갖는 아미노산으로 치환;

(b) 364번째 위치의 세린을 라이신으로， 370번째 위치의 라이신을 세린으로 치환; 및

(c) 405번째 위치의 페닐알라닌을 라이신으로， 409번째 위치의 라이신을 페닐알라닌으로 치환.

단량체 생성률을 낮추고 이합체 형성률을 보다 증가시키기 위하여， 상기 선택된 3개의 변이 ( (a)-(c) ) 도입 후， 추가의 아미노산 변이가 도입될 수 있다. 이와 같이 추가의 아미노산 변이가 도입될 수 있는 아미노산은 364번째 위치의 세린， 405번째 위치의 페닐알라닌, 및 /또는 409번째 위치의 라이신일 수 있으며， 예컨대，

정전기적 상호작용 도입 변이가 일어나는 아미노산 쌍인 364번째 위치의 세린과 368번째 위치의 류신의 아미노산 쌍에서， 368번째 위치의 류신을 음전하를 갖는 아미노산 (아스파르트산 또는 글루탐산， 예컨대 아스파르트산)으로 치환하는 경우， 364번째 위치의 세린은 양전하를 갖는 아미노산 (라이신 또는 아르기닌)으로 치환되거나 (S364K 또는 S364R; 정전기적 상호작용 도입 변이)， 아스파라긴으로 치환 (S364N)될 수 있다. 또한， 스와핑 변이가 일어나는 아미노산 쌍인 370번째 위치의 라이신과 364번째 위치의 세린의 아미노산 쌍에서， 370번째 위치의 라이신을 세린으로， 364번째 위치의 세린은 라이신으로 치환되거나 (S364K; 스와핑 변이) , 아르기닌 또는 아스파라긴으로 치환 (S364R또는 S364N)될 수 있다. 또한, 스와핑 변이가 일어나는 아미노산 쌍인 409번째 위치의 라이신과 405번째 위치의 페닐알라닌의 아미노산 쌍에 있어서， 409번째 위치의 라이신을 페닐알라닌으로 치환되거나 (스와핑 변이)， 트립토판으로 치환될 수 있고， 405번째 위치의 페닐알라닌은 라이신으로 치환되거나 (F405K ; 스와핑 변이) , 아르기닌， 글루타민， 또는 아스파라긴으로 치환 (F405R, F405Q , 또는 F405N)될 수 있다.

일 예에서， 변이 CH3 도메인은 다음에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는 것일 수 있다:

364번째 위치의 세린의 라이신으로의 치환과 368번째 위치의 류신의 아스파르트산으로의 치환; 364번째 위치의 세린의 라이신으로의 치환과 370번째 위치의 라이신의 세린으로의 치환;

405번째 위치의 페닐알라닌의 라이신으로의 치환과 409번째 위치의 라이신의 페닐알라닌으로의 치환;

405번째 위치의 페닐알라닌의 아르기닌으로의 치환과 409번째 위치의 라이신의 페닐알라닌으로의 치환;

405번째 위치의 페닐알라닌의 라이신으로의 치환과 409번째 위치의 라이신의 트립토판으로의 치환; 및

405번째 위치의 페닐알라닌의 아르기닌으로의 치환과 409번째 위치의 라이신의 트립토판으로의 치환.

일 예에서， 변이 CH3 도메인은 다음에서 선택된 이중 변이를 포함하는 것일 수 있다:

거 U CH3 도메인의 364번째 위치의 세린의 라이신으로 치환과 제 2 CH3 도메인의 368번째 위치의 류신의 아스파르트산으로의 치환， 및 제 1 CH3 도메인의 409번째 위치의 라이신의 페닐알라닌으로의 치환과 제 2 CH3 도메인의 405번째 위치의 페닐알라닌의 라이신으로의 치환;

제 1 CH3 도메인의 364번째 위치의 세린의 라이신으로 치환과 게 2 CH3 • 도메인의 368번째 위치의 류신의 아스파르트산으로의 치환 및 계 1 CH3 도메인의 409번째 위치의 라이신의 페닐알라닌으로의 치환과 게 2 CH3 도메인의 405번째 위치의 페닐알라닌의 아르기닌으로의 치환;

게 1 CH3 도메인의 364번째 위치의 세린의 라이신으로 치환과 제 2 CH3 도메인의 370번째 위치의 라이신의 세린으로의 치환， 및 게 1 CH3 도메인의 409번째 위치의 라이신의 페닐알라닌으로의 치환과 게 2 CH3 도메인의 405번째 위치의 페닐알라닌의 라이신으로의 치환;

제 1 CH3 도메인의 364번째 위치의 세린의 라이신으로 치환과 제 2 CH3 도메인의 370번째 위치의 라이신의 세린으로의 치환， 및 제 1 CH3 도메인의 409번째 위치의 라이신의 페닐알라닌으로의 치환과 제 2 CH3 도메인의 405번째 위치의 페닐알라닌의 아르기닌으로의 치환;

제 1 CH3 도메인의 364번째 위치의 세린의 라이신으로 치환과 계 2 CH3 도메인의 368번째 위치의 류신의 아스파르트산으로의 치환， 및 제 1 CH3 도메인의 409번째 위치의 라이신의 트립토판으로의 치환과 제 2 CH3 도메인의 405번째 위치의 페닐알라닌의 라이신으로의 치환;

제 1 CH3 도메인의 364번째 위치의 세린의 라이신으로 치환과 제 2 CH3 도메인의 368번째 위치의 류신의 아스파르트산으로의 치환， 및 게 1 CH3 도메인의 409번째 위치의 라이신의 트립토판으로의 치환과 제 2 CH3 도메인의 405번째 위치의 페닐알라닌의 아르기닌으로의 치환;

거 U CH3 도메인의 364번째 위치의 세린의 라이신으로 치환과 제 2 CH3 도메인의 370번째 위치의 라이신의 세린으로의 치환， 및 제 1 CH3 도메인의 409번째 위치의 라이신의 트립토판으로의 치환과 제 2 CH3 도메인의 405번째 위치의 페닐알라닌의 라이신으로의 치환; 또는

거 U CH3 도메인의 364번째 위치의 세린의 라이신으로 치환과 게 2 CH3 도메인의 370번째 위치의 라이신의 세린으로의 치환， 및 게 1 CH3 도메인의 409번째 위치의 라이신의 트립토판으로의 치환과 게 2 CH3 도메인의 405번째 위치의 페닐알라닌의 아르기닌으로의 치환.

상기와 같이 CH3 도메인이 이중 변이를 포함하는 경우의 이종 이합체 형성를은 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상， 85% 이상， 90% 이상， 9 이상, 93% 이상， 94% 이상， 95% 이상또는 96% 이상일 수 있다.

다른 예는 서열번호 27의 중쇄가변영역 및 서열번호 31의 경쇄가변영역을 포함하는 항 -인플루엔자 B 항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다. 다른 예는 서열번호 29의 중쇄가변영역 및 서열번호 31의 경쇄가변영역을 포함하는 항 -인플루엔자 A 항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다.

다른 예는 서열번호 27의 중쇄가변영역 및 서열번호 31의 경쇄가변영역을 포함하는 항 -인플루엔자 B 항체， 및 서열번호 29의 중쇄가변영역 및 서열번호 31의 경쇄가변영역을 포함하는 항 -인플루엔자 A 항체를 포함하는， 항 -인플루엔자 A/ 항 -인플루엔자 B 이중 특이성 항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다. 상기 항 -인플루엔자 A/ 항- 인플루엔자 B 이중 특이성 항체는， 앞서 설명한 ( 1) 변이 CH3 도메인 (즉, 앞서 설명한 CH3-CH3의 돌연변이쌍 도입) ; (2) 변이 CH1 도메인 및 변이 CL 도메인 (즉， 앞서 설명한 CH1-CL의 돌연변이쌍 도입) ; 또는 (2) 변이 CH3 도메인과 변이 CH1 도메인 및 변이 CL 도메인을 모두 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 이중 특이성 단백질 또는 이중 특이성 항체는 단백질 소단위간 연관되고 조화로운 경계 돌연변이 (Correlated and Harmonious Interfaci al Mutat ion between Protein Subuni ts ; 이하 Chimps라 한다)에 따라 생성된 이종 특이성 물질이다. 용어 "항체''는 4개 모두가 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 한 쌍의 저분자량 경쇄 (L) 및 한 쌍의 중쇄 (H)의 2쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어지는， 구조상 관련된 당단백질의 클래스를 나타낸다. 항체의 구조는 특징이 잘 결정되어 있다 (예를 들어， 문헌 [Fundamental I隱 unology Ch. 7 (Paul , W. , 2 ^nd ed. Raven Press, N. Y. (1989)] 참조). 간단히 설명하면， 각각의 중쇄는 대개 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 대개 3개의 도메인， 즉 CHI, CH2, 및 CH3으로 이루어진다. 중쇄는 소위 "힌지 영역"에서 디설파이드 결합을 통해 상호연결된다. 각각의 경쇄는 대개 경쇄가변 영역 (본원에서 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 대개 1개의 도메인 CL로 이루어진다. 일반적으로， 상기 불변 영역 내에서 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에 기재된 EU_인덱스에 따라 수행된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 불리는 초가변 영역 (또는 서열이 초가변성이고 /이거나 구조적으로 규정된 루프를 형성할 수 있는 초가변 영역)으로 추가로 세분될 수 있고， 이들 영역에는 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 대개 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어지고， 이들은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 다음 순서로 배열되어 있다: FRl, CDR1 FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (또한， 문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196， 901-917 (1987)] 참조).

본 명세서에서， 용어 Tab, 또는 Fabᅳ arm' '은 하나의 중쇄-경쇄쌍을 의미한다.

본 명세서쎄서， 용어 "Fc 영역' '은 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 항체 영역을 의미하며， 경우에 따라서 힌지 영역을 추가로 포함할 수 있다.

용어 "이중 특이성 항체' '는 적어도 2개의 상이한 에피토프， 일반적으로 비 -중복 에피토프에 대해 특이성을 갖는 항체를 의미한다.

용어 "전장 항체' '는 본원에서 사용될 때 이소형의 항체에서 통상적으로 발견되는 모든 중쇄 및 경쇄의 불변 및 가변 도메인을 함유하는 항체를 의미한다. 일 예에서 전장 항체는 2 개의 전장 중쇄와 2개의 전장 경쇄를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이， "이소형 ¹ '은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예를 들어 IgGl , IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM)를 의미한다.

용어 "항원 결합 단편 ¹ '은 항체의 가변 도메인을 포함하는 항체의 일부를 의미하는 것으로， Fab, F(ab' )2, scFv, (scFv)2, scFv-Fc , (scFv-Fc) 등에서 선택될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.

용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정자를 의미한다 . 에피토프는 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 표면 군으로 일반적으로 이루어지고, 일반적으로 특이적인 3차원 구조 특성뿐만 아니라 특이적인 전하 특성을 갖는다.

이중 특이성 항체는 서로 다른 두 개의 항원 또는 하나의 항원 중의 구분되는 (비중복되는) 서로 다른 두 개의 에피토프를 인식 및 /또는 결합하는 항체를 총칭한다. 일 예에서， 상기 이증 특이성 항체는 종양 세포 항원에 대한 하나의 항원 결합 부위 및 세포 독성 개시 분자에 대한 다른 항원 결합 부위를 포함하는 것일 수 있으며， 예컨대， 이중특이성 항체는 항— Fc y RI/항 -CD15, 항 -pl85HER2/Fc x RI I I (CD16) 항 -CD3/항 -악성 B-세포 (1D10) , 항— CD 3/항 -pl85HER2, 항 -CD3/항 -p97, 항 -CD3/항 -신장 세포암， 항 -CD3/항 -0VCAR-3, 항 -CD3/L-D1 (항 -대장암)， 항— CD3/항- 멜라닌세포 자극 호르몬 유사체， 항 -EGF 수용체 /항 -CD3, 항 -CD3/항 -CAMA1 , 항 -CD3/항 -CD19, 항 -CD3/MoV18 , 항 -중성 세포 부착 분자 (NCAM)/항 -CD3, 항-폴레이트 결합 단백질 (FBP)/항 -CD3, 항-범 암종 연관 항원 (細 0C- 31)/항— CD3 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 예에서， 종양 항원에 특이적으로 결합하는 하나의 항원 결합 부위 및 독소에 결합하는 하나의 항원 결합.부위를 지니는 이중특이성 항체는 예를 들어， 항-사포린 /항 -Id-l , 항 -CD22/항-사포린， 항 -CD7/항- 사포린， 항 -CD38/항-사포린， 항 -CEA/항 -리신 A 사슬， 항-인터페론 - a ( IFN- α )/항ᅳ하이브리도마 이디오타입， 항 -CEA/항—빈카 알카로이드 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 예에서， 이중특이성 항체는 항 -CD30/항-알카라인 포스파타제 (미토마이신 포스페이트 전구약물을 미토마이신 알코올로 전환을 촉매하는)과 같이， 전환 효소 활성화 전구약물용에 사용되는 것들 중에서 선택된 것일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 예에 있어서， 이중특이성 항체는 항-피브린 /항 -조직 플라스미노겐 활성인자 (tPA) , 항- 피브린 /항 -유로키나제 유형 플라스미노겐 활성인자 (uPA)와 같이， 피브린분해 제제로서 사용될 수 있는 것들 중에서 선택될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 예에서， 이중특이성 항체는 항-저밀도 지단백질 (LDL)/항 -Fc 수용체 (예를 들어， FCYRI, FCYRII 또는 FCYRIII)등과 같은 세포 표면 수용체에 면역 복합체를 표적화시키는 것들 중에서 선택될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 예에서， 이중특이성 항체는 항 -인플루엔자 A/항 -인플루엔자 B, 항 -CD3/항-단순성 포진 바이러스 (HSV), 항 -T—세포 수용체: CD3 복합체 /항-인플루엔자， 항- FcyR/항 -HIV 등과 같이 감염성 질환 (예컨대， 바이러스성 감염 질환)의 치료에 사용되는 것들 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 예에서， 이중특이성 항체는 시험관 내 또는 생체내 종양 검출용 이중특이성 항체일 수 있으며， 예컨대， 항 -CEA/항 -E0TUBE, 항- CEA/항— DPTA, 항 -pl85HER2/항 -합텐 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 예에세 이중특이성 항체는 항 -토끼 IgG/항-페리틴， 항-겨자무 페록시다제 (HRP)/항-호르몬， 항- 소마토스타틴 /항 -서브스탄스 P, 항 -HRP/항 -FITC, 항 -CEA/항 -β- 갈락토시다제 등과 같이, 진단 수단으로 사용 가능한 것일 수 있다. 또 다른 예에서， 이중특이성 항체는 CD30와 결합하는 게 1 항원 결합 부위 및 erbB2와 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 것; CD30와 결합하는 거 U 항원 결합 부위 및 슈도모나스 외독소 (PE)와 결합하는 게 2 항원 결합 부위를 포함하는 것; CD30와 결합하는 게 1 항원 결합 부위 및 스트렙타비딘과 결합하는 계 2 항원 결합 부위을 포함하는 것일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. ,

다른 예에서， 이중 특이성 단백질은， 상기 표적화 도메인으로， 각종 막 단백질， 예컨대， 각종 수용체 (예컨대， 수용체 티로신 카이네이즈 (RTKs) 등)， 상기 수용체의 엑토도메인 (세포외 도메인)， 각종 리간드 (예컨대， 각종 성장인자， 사이토카안등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표적 특이적 결합 폴리펩타이드을 포함할 수 있다. 예컨대， 상기 수용체는， 종양괴사인자 수용체 (tumor necrosis factor receptor; TNFR) (예컨대， TNFR1, TNFR2 등)， 상피세포 성장인자 수용체 (예컨대， Her Kepi dermal growth factor receptor； EGFR) , Her2 (human e idermal growth factor receptor 2)， Her3 (human e idermal growth factor receptor 3)), 앤지오포이에틴 리셉터 (angiopoietin receptor) (예컨대, Tiel, Tie2 등)， 형질전환성장인자 수용체 (transforming growth factor receptor) (예컨대, TGFbRl , TGFbR2, TGFbR3, TGFaRl 등) , 골형성단백질 수용체 (Bone Morphogenet ic Protein Receptor ; 예컨대， BMPRlb) , 인터류킨 수용체 (예컨대， IL-12R-br ( inter leukin 12 receptor subunit beta 1)， IL ^~ 4Ra, IL-12A, IL-4, IL-1R1L, IL-17RA, IL-17A, IL-12R-b2, IL-13Ral , IL-12B, IL-13, IL-1RAP, IL-17RC, IL-17F 등)， 인테그린 (예컨대， ITGA4 ( integrin alpha 4)， ITGA2B ( integrin subuni t alpha 2b) , ITGB1, ITGB3 등)， 인터페론 수용체 (예컨대， IFNAR1 ( inter feron-alpha/beta receptor 1)， IFNAR2, IFNGR 등)， Fas (tumor necrosis factor receptor super fami ly member 6； TNFRSF6) , VEGF 수용체 (예컨대, Fltl (fms related tyrosine kinase 1) 등)， 간세포 성장인자 수용체 (에컨대， Met 등)， IFNGR ( Interferon ga睡 a receptor) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 리간드는 종양괴사인자 (tumor necrosis factor ; TNF) , 상피세포 성장인자 (EGF) , 혈관내피세포 성장인자 (VEGF- VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 등)， 앤지오포이에틴 (예컨대， Angl , Ang2 등)， 형질전환 성장인자 (transforming growth factor ; TGF) , 간세포 성장인자 (HGF) , 뼈형성단백질 (bone morphogenet ic protein) (예컨대， BMP2 , BMP7 등)， 인터류킨, 인터페론 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 발현 백터, 예를 들어 본 발명의 항체를 코딩하는 발현 백터가 도입된 세포를 지칭하도록 의도된다. 재조합 숙주 세포는 예를 들어， 트랜스펙토마 (transfectoma) , 예컨대 CH0 세포， HEK293 세포， NS/0 세포, 및 림프구성 세포를 포함한다.

본 발명의 항체들의 CL 도메인， CH1 도메인, Fc 부위 (예컨대， CH3 도메인)들은 IgGl , IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아형， IgA, IgE, IgD 또는 IgM와 같이 임의의 항체로부터 얻을 수 있다. 상기 항체들은 인간， 원숭이 등의 영장류， 또는 마우스， 래트 등의 설치류 등과 같은 포유류 유래의 것일 수 있다. 포유류 유래의 항체는， 특히 불변부위에 있어서， 각 종간 높은 서열 상동성 및 구조 상동성을 보이므로， 본 명세서에서 설명된 CL 도메인， CH1 도메인, 및 CH3 도메인에 설명은 포유류 유래 항체에 일반적으로 적용될 수 있다. 일 구체예에서， 상기 CL 도메인， CH1 도메인， 및 CH3 도메인은 IgG (예컨대， IgGl)에서 유래된 것일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 언급한 바와 같이， 본 발명에서 기술된 항체들의 Fc 부위는 두 개 동일하지 않은 중쇄들 (예를 들어， 가변 도메인들의 서열에서 상이한)을 포함하는 데, 상기 두 개 동일하지 않은 중쇄들 중 적어도 하나는 상기 동일하지 않은 중쇄들의 안정한 이종이합체를 형성하는 확률을 높이고 동일한 중쇄들의 안정한 동종이합체를 형성할 확률을 낮추기 위해， 아미노산 변이를 포함한다. ^'

본 명세서에서 제공되는 이중 특이성 단백질， 이중 특이성 항체 및 이의 항원결합단편은 통상적인 모든 수단에 의하여 제조될 수 있으며, 예컨대 화학적 합성 또는 재조합적인 방법에 의하여 생산될 수 있다. 상기 단백질， 항체 및 단편은 자연적으로 얻어지지 않은 것 (non-natural ly occurr ing)일 수 있다.

본 발명에서 Fc의 이종이중화를 위해서 돌연변이화 위치를 도 2에 나타내었다. 정전기적 상호작용 도입 변이의 경우는 39개의 위치를 대상으로 하였고， 스와핑을 위해서는 14개의 위치를 대상으로 하였으며， 사이즈 변이는 40개의 위치를 대상으로 하였다. 도 2에서는 아미노산은 통상의 방법에 따라 영문자 대문자로 나타내었고， 상기 불변 영역 내에서 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed . Publ ic Health Service , Nat ional Inst i tutes of Heal th, Bethesda , MD . ( 1991) ]에 기재된 EU_인덱스에 따라 나타내었다.

다른 예는 앞서 설명한 이중 특이성 단백질 또는 이중 특이성 항체， 및 임의로, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 앞서 설명한 이중 특이성 단백질 또는 이중 특이성 항체를 약학 조성물의 제조에 사용하는 용도를 제공한다. 다른 예는 앞서 설명한 이중 특이성 단백질 또는 이중 특이성 항체를 함유하는 약학조성물의 제조방법을 제공한다.

항체 및 이를 포함하는 조성물 (예, 약학 조성물)을 진단 및 치료 적용에 사용될 수 있고， 그러한 것으로서 치료 또는 진단 키트에 포함될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "약학적으로 허용가능한 담체 ' '는 생리적으로 양립되는 임의의 및 모든 용매， 분산매， 코팅물， 항균, 항진균제， 둥장제， 흡수 지연제 , 기타 약물 제조에 통상적으로 사용되는 담체， 부형제， 첨가제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 바람직하게는， 상기 담체는 정맥내， 근육내， 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여에 적합한 담체일 수 있다 (예， 주사또는 주입에 의해) . 본 발명의 조성물은 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 숙련자에게 이해되는 바와 같이， 투여 경로 및 /또는 양상은 원하는 결과에 따라 변한다. 본 발명의 화합물을 특정 투여 방법으로 투여하기 위해， 상기 화합물을 이의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나 같이 투여하는 것이 필요할 있다. 예를 들어， 상기 화합물을 적합한 담체， 예를 들어， 리포좀이나 희석제 내에서 대상체에 투여될 수 있다. 약학적 허용 희석제는 식염수 및 수성 완층액을 포함한다. 약학 담체는 멸균 수성액이나 분산액, 및 멸균 주사액이나 분산액의 임시적인 제조물용 멸균 분말을 포함한다. 그러한 약학적 활성 물질용 배지와 제제의 사용은 당해분야에 공지되어 있다.

용어 "비경구 투여 " 및 "비경구로 투여되는"은 본 발명에서 사용되는 바와 같이， 장관 및 국소외의 투여 방식을 지치하는 것으로 통상 주사에 의한 것으로, 정맥내, 근육내， 동맥내， 수막내， 관절강내， 안내, 심장내， 피내 복강내， 경기관내， 피하, 각피하， 관절내， 관절강하， 지주막하， 척수내， 경막외 및 흉골내 주사와주입을 포함한다.

이러한 조성물은 또한 보존제, 습윤쩨， 에멀견제， 및 분산제와 같은 보조제를 포함한다. 미생물 존재의 방지는 상기 멸균 과정에 의해， 및 파라벤, 클로로부탄올， 페놀, 소르브산， 등과 같은 다양한 항균 및 항진균제를 포함함으로써 수행될 수 있다. 당， 염화 나트륨 등과 같은 등장제를 상기 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한， 주사용 약학 형태를 장기간 흡수하게 하는 것은 알루미늄 모노스테아레이트와 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 포함함으로써 수행될 수 있다. 선택된 투여 경로와 무관하게， 본 발명의 화합물은 적절한 수화 형태 및 /또는 본 발명의 약학 조성물에서 사용될 수 있는 데， 당해 분야의 숙련자에게 공지된 통상적인 방법으로 약학 허용 투약형태로 제제화된다. 본 발명의 약학 조성물에서 활성 성분의 실제 투약 수준은 특정 환자의 원하는 치료적 반웅을 달성하는데 효과적인 양, 조성 및 투여 양상을 환자에 독성적이지 않게 얻기 위해서 변할 수 있다. 선택된 투여 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물의 활성， 투여 경과， 투여 시간， 사용되는 특정 화합물의 배출 속도， 치료 기간， 사용되는 특정 조성물과 조합 사용되는 다른 약물， 화합물 및 /또는 물질， 치료되는 환자의 나이， 성별, 몸무게, 상태， 일반적 건강 및 이전 의학 이력， 및 의학 분야에 공지된 다른 요소를 포함하는 다양한 약동학적 요소에 달려있다. 상기 투여 대상 환자는 인간, 원숭이 등의 영장류， 마우스， 래트 등의 설치류 등과 같은 포유류, 및 이들로부터 분리된 세포， 조직， 체액 (예컨대, 혈액 등) 및 이들의 배양물로부터 선택된 것일 수 있다. 【발명의 효과】

본 발명은 Chimps 단백질 (예컨대， 항체)는 동종이합체 또는 모노머에 의한 오염이 적은 높은 순도의 이종 이중화된 단백질 및 이의 제조 기술을 제공한다. 본 발명의 또 다른 이점은 천연의 항체에 도입되는 변이 개수를 최소한으로 하면서 이중 특이성 항체의 순도를 높일 수 있어서 천연 항체의 구조에 어떠한 의미있는 구조적 변화를 일으키지 않으며， 이를 통하여 항체의 기능 상실 또는 이상, 및 /또는 면역 거부 반웅이 일어난 위험성을 줄일 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 일 실시예에 따른 이중 특이성 항체의 항체를 제조하는데 만들어질 수 있는 다양한 형태의 항체 (총 10개)중에서 단 하나의 항체 (원 내부의 항체)만이 완전한 이종 이합체 형태의 이중 특이성 항체임을 보이는 모식도이다. A와 B는 각각 다른 중쇄를 나타내고, _a 와 b는 각각 다른 경쇄를 나타낸다.

도 2은 일 실시예에서 Fc 불변영역에서 이종 특이적 결합을 유도하기 위해 사용된 정전기적 상호작용， 스와핑， 사이즈 방법에 사용된 항체의 잔기 위치 및 이와 연관된 잔기의 위치를 나타내었다.

도 3은 표 4에 기재된 바와 같이 정전기적 상호작용에 의한 돌연변이에 의한 이종이합체 형성 결과를 SDS-PAGE수행후 비교한 것이다. 도 4는 표 5에 기재된 바와 같이 스와핑에 의한 연관 돌연변이에 의한 이종이합체 형성 결과를 SDS-PAGE수행후 수행후 비교한 것이다. 도 5는 표 6에 기재된 바와 같이 사이즈에 의한 돌연변이에 의한 이종이합체 형성 결과를 SDS-PAGE수행후 비교한 것이다.

도 6a는 표 7에 기재된 단일 돌연변이 중에서 우수하게 이종 이중화가 일어나는 돌연변이 12개를 비교한 것이다.

도 6b는 일 실시예에서 선택된 2개의 키 돌연변이 중 S364K를 다른 아미노산으로 치환시켜 얻어진 이종이합체 형성 결과를 보여준다.

도 6c는 일 실시예에서 선택된 2개의 키 돌연변이 중 F405K를 다른 아미노산으로 치환시켜 얻어진 이종이합체 형성 결과를 보여준다.

도 6d는 일 실시예에서 선택된 3가지 key- lock돌연변이 쌍인 S364K- L368D , S364K-K370S, 및 F405K-K409F에 추가 돌연변이를 도입하여 얻어진 이종이합체 형성 결과를 보여주며， 세로축의 수치는 분자량 (kD)를 나타낸다.

도 7은 단일 돌연변이 S364K-L368D, S364K-K370S, F405K-K409F의 이종이합체화 (heterodimer i zat ion)의 효율을 종래의 기술 (KiH , CPC , AzS 대조군)과 비교하여 효율을 확인한 것이다. 각 키에 해당하는 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 바꾸어 본 경우 S364의 경우 K가 최선이었고， F405의 경우 K와 R (아르기닌)이 거의 유사한 효과를 보인다. A 사슬 및 B 사슬에서 단일 돌연변이가 일어나는 부분을 나타내었고， 이종이합체화 정도를 수치로 나타내었다.

도 8은 S364K-L368D, S364K-K370S , F405K-K409F세 가지 돌연변이 쌍들을 조합하며 두 가지 이중 돌연변이 쌍을 얻었고， 각각의 쌍에서 F405를 K와 R 두 종류로 만들어서 도합 4가지의 이중 돌연변이 쌍의 이종이합체화의 효율을 종래의 기술 (KiH, CPC , AzS 대조군)과 비교하여 효율을 확인한 것이다.

도 9a 내지 9c는 열쇠 (Lock) 돌연변이에 해당하는 아미노산을 다른 돌연변이로 바꾸었을 경우 더 나은 효과가 있을지를 확인하기 위해， 이중 돌연변이 쌍들에서 열쇠 ( lock)에 해당하는 L368 , K370 , K409를 다른 아미노산들로 표 6에 따라 돌연변이시켜 SDS-PAGE을 수행한 결과이다.

도 10은 항체의 Fab에서 정전기적 상호 작용 연관된 돌연변이， 사이즈 연관 돌연변이， 스와핑 연관 돌연변이를 위치를 보인다.

도 11은 Compet i t ive Pai r ing (CPP) Assay 과정을 모식적으로 보여준다.

도 12는 4D9과 2B9을 이용하여 기존에 효과적인 것으로 보고되어 있는 CI , DuetMab , V23의 중쇄와 경쇄 사이의 돌연변이 쌍을 클론닝하여 공동 -발현하여서 도 11의 과정을 통하여 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.

도 13은 중쇄와 경쇄 사이에 정전기 상호작용에 의한 연관 돌연변이의 하나로 A 사슬 (2B9 중쇄)의 해당 아미노산을 K (리신)으로， B 사슬 (4D9 중쇄)의 경우에는 D (아스파트산)으로 바꾼 돌연변이가 도입된 경우의 짝지음 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 보인다.

도 14는 4D9 및 2B9 항체를 이용한 돌연변이 쌍의 리스트중 SDS- PAGE상에서 비교한 결과， 비교적 정확하게 짝지음이 잘 일어난 30번 돌연변이를 중쇄의 L145와 경쇄 V133을 R 과 D로 바꾼 경우의 짝지음 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.

도 15와 도 16은 중쇄의 L145와 경쇄 V133을 각각 E 또는 D 과 R로 바꾼 것에 경쇄에 29번 돌연변이 S131D 및 /또는 S131K 를 더한 돌연변이가 도입된 경우의 짝지음 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.

도 17은 48번 돌연변이 쌍 (중쇄의 S183과 경쇄의 V133을 각각 K(R) 과 D(E)로 바꾼 것)의 짝지음 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.

도 18은 표 19에 나타난 돌연변이쌍 c29c30c48F 29f30f48 , 및 이의 변형 돌연변이쌍이 도입된 경우의 짝지음 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.

도 19는 표 20의 돌연변이쌍이 도입된 경우의 짝지음 양상을 SDS- PAGE로 확인한 결과이다.

도 20은 표 21의 돌연변이쌍이 도입된 경우의 짝지음 양상을 SDS- PAGE로 확인한 결과이다.

도 21은 일 실시예에 따른 중쇄와 경쇄쌍 돌연변이 중 34번 돌연변이와 51번 돌연변이를 조합하여 도입시킨 경우의 짝지음 정도를 보여주는 결과이다.

도 22는 일 실시예에 따른 중쇄와 경쇄쌍 돌연변이 중 34Φ ί51 돌연변이 쌍을 도입시킨 경우의 짝지음 정도를 보여주는 결과이다.

도 23은 일 실시예에 따른 중쇄와 경쇄쌍 돌연변이 중 c40 $ f44 돌연변이 쌍을 도입시킨 경우의 짝지음 정도를 보여주는 결과이다.

도 24는 일 실시예에 따라 중쇄 및 경쇄가 돌연변이화된 이중 특이성 항체의 모식도이다.

도 25는 일 실시예에 따라 제조된 항체의 중쇄 A사슬 및 B사슬， 및 경쇄 a사슬 및 b사슬의 열적안정성을 보여주는 그래프이다.

도 26은 pcDNA3의 개열지도이다.

도 27은 일 실시예에 따라 제조된 (Γ29(Γ3^48 Φ Γ 29Γ30Γ48 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Trabev 및 Adabev의 Hydrophobi c Interact ion Chromatography(HIC) 결과를 보여주는 그래프이다. 도 28은 일 실시예에 따라 제조된 (Γ29(Γ30ε48 Φ Γ 29Γ30Γ48 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된이중항체 Trabev의 Si ze exclusion Chromatography (SEC) Analysi s) 결과를 보여주는 그래프이다. 도 29는 일 실시예에 따라 제조된 (: 29(: 30ε48ΦΓ29Γ30Γ48 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Adabev의 Size exclusion Chromatography (SEC) Analysis 결과를 보여주는 그래프이다.

도 30은 일 실시예에 따라 제조된 (Γ29(Γ30ε48ΦΓ29Γ30Γ48 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이증항체 Trabev 및 Adabev의 이합체 형성 양상을 보여주는 결과이다.

도 31은 일 실시예에 따라 제조된 (Γ29(Γ30ε48ΦΓ29Γ30Γ48 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Trabev의 항원 (Her2 및 VEGF)에 대한 결합력을 보여주는 그래프이다.

도 32은 일 실시예에 따라 제조된 _C 29c 30c48$r29r30r48 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Adabev의 항원 (TNF- alpha 및 VEGF)에 대한 결합력을 보여주는 그래프이다.

도 33a는 인간 IgGl 중쇄불변영역과 인간 IgAl 중쇄불변영역의 서열 정렬 결과를 보여준다 (인간 IgGl 중쇄불변영역: 서열번호 33; 인간 IgAl 중쇄블변영역: 서열번호 34).

도 33b는 인간 면역글로불린 경쇄의 카파 불변영역과 람다 불변영역의 서열 정렬 결과를 보여준다 (인간 면역글로불린 경쇄의 카파 불변영역: 서열번호 35; 인간 면역글로불린 경쇄의 람다 불변영역: 서열번호 36).

도 33c 및 도 33d는 인간과 마우스와 래트의 IgG 아형들 간의 중쇄불변영역의 서열 정렬 (sequence alignment) 결과를 보여주는 것으로， 도 33c는 CH1 도메인 서열 정렬 결과를， 도 33d는 CH3 도메인 서열 정렬 결과를 각각 보여준다 (도 33c에서 (CHI domain), Human IgGl: 서열번호 1， Human IgG2: 서열번호 2， Human IgG3: 서열번호 3， Human IgG4: 서열번호 4 Mouse IgGl: 서열번호 37， Mouse IgG2a ^b : 서열번호 38， Mouse IgG2a ^a : 서열번호 39， Mouse IgG2b: 서열번호 40， Mouse IgG3: 서열번호 41， Rat IgGl: 서열번호 42， Rat IgG2a: 서열번호 43， Rat IgG2b: 서열번호 44， Rat IgG2c: 서열번호 45; 도 33d에서 (CH3 domain), Human IgGl: 서열번호 15， Human IgG2: 서열번호 16， Human IgG3: 서열번호 17, Human IgG4: 서열번호 18， Mouse IgGl: 서열번호 46， Mouse IgG2a ^b : 서열번호 47， Mouse IgG2a ^a : 서열번호 48， Mouse IgG2b: 서열번호 49， Mouse IgG3: 서열번호 50, Rat IgGl: 서열번호 51, Rat IgG2a: 서열번호 52， Rat IgG2b: 서열번호 53， Rat IgG2c: 서열번호 54). 도 34는 일 실시예에 따라 제조된 c34$f51 돌연변이쌍이 도입된 항체의 경쇄와 중쇄 간 짝지음 정도를 보여주는 결과이다.

도 35는 일 실시예에 따라 제조된 c343 ⁾ f51 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Trabev의 HIC 결과를 보여주는 그래프이다. 도 36은 일 실시예에 따라 제조된 c34$f51 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Adabev의 HIC 결과를 보여주는 그래프이다. 도 37은 일 실시예에 따라 제조된 c34 ⁽ Df51 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 _Trabev 및 Adabev의 이합체 형성 양상을 보여주는 결과이다.

도 38은 일 실시예에 따라 제조된 c40 ⁽ Df44 돌연변이쌍 도입된 항체의 경쇄와 중쇄 간 짝지음 정도를 보여주는 결과이다.

도 39는 일 실시예에 따라 제조된 c40i ⁾ f44 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Trabev의 HIC 결과를 보여주는 그래프이다. 도 40은 일 실시예에 따라 제조된 c40 ⁽ 5f44 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Adabev의 HIC 결과를 보여주는 그래프이다. 도 41은 일 실시예에 따라 제조된 c40$f44 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Trabev 및 Adabev의 이합체 형성 양상을 보여주는 결과이다.

도 42는 비교예에 따른 Enb-Fc와 Fas— Fc를 각각 single

transfection시킨 경우에 SDS-PAGE로 동종 이합체 형성 정도를 비교한 결과이다.

【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】

본 발명을 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나， 본 발명의 권리범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다. 욘 발명의 실시를 위해서 모든 시료는 다음과 같은 과정을 거쳐서 준비되었다.

단백질 발현

1. 타겟이 되는 유전자를 발현 백터 (pcDNA3 (Invitrogen; 도 )에 클론닝하였다.

2. Hek293E (ATCC) 세포를 습윤화된 C0 ₂ 인큐베이터에서 5%

FBS(Fetal bovine serum)이 보층된 고농도 포도당 DMEM (Dulbecco's modi f ied Eagle ' s medium)에서 배양하였다.

3. 준비된 플라스미드 DNA를 풀 컨플러언시로 Hek293E세포로 일시적 주입 (transi ent trans feet ion) 한다. 전이전에 배양 배지를 PBS (phosphate-buf fered sal ine)로 세척한 후 혈청이 없는 고농도 DMEM으로 교체하여 준다.

4. 1 주일 인큐베이션 후에， 컨디션된 배지 (condit ioned medium)르 수확하여 여과하였다. Fc-융합 단백질 및 항체를 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 분리하였다.

5. 정제된 단백질의 농도의 정량은 280nm 파장을 관측하여 측정하였다.

<실시예 1> 2개의 Fc 영역의 이종이중화의 돌연변이의 선택

2개의 Fc 영역 (CH3 도메인; 서열번호 15) ( IgGl 기준)의 이종이합체화 (heterodimer i zat ion)를 위한 돌연변이 위치는 도 2에 나타내었다. 정전기적 상호작용에 의한 연관 돌연변이 (정전기적 상호작용 도입 변이)를 위해서 39개의 위치가 선정되었으며 ( "Charge Γ로 표시)， 스와핑에 의한 연관 돌연변이 (스와핑 변이)를 위하여 14개의 위치가 선정되었고 ( "Swap 0"로 표시) , 사이즈에 의한 연관 돌연변이 (사이즈 변이)를 위하여 40개의 위치가 선정되었다 ( "Si ze B"로 표시) . 최종적으로 선정된 CH3 도메인의 위치 및 돌연변이된 아미노산을 표 3에 나타내었다. 각 돌연변이 쌍을 서로 다른 항체로부터 유래하는 두 개의 Fc 영역 (각각 A 사슬과 B 사슬로 표현)에 적용하여 클론닝하여 공동-발현하였다. 정전기 상호작용에 의한 연관 돌연변이의 경우는 A 사슬의 해당 아미노산을 양전하를 포함하는 아미노산을 대표하여 K (라이신)으로， B 사슬의 경우에는 음전하를 포함하는 아미노산을 대표하여 D (아스파트산)으로 바꾸었다. 스와핑에 의한 연관 ^ᅵ 돌연변이의 경우에는 A 사슬과 B 사슬의 아미노산을 서로 바꾸었다. 사이즈에 의한 연관 돌연변이의 경우에는 A 사슬은 W (트립토판)으로， B 사슬은 사이즈가 작은 A (알라닌)으로 바꾸었다.

【표 3】

Ϊ6Ζ.Ζ.00/Ζ.Ϊ0ΖΗΜ/Χ3<Ι Ϊ889Ϊ0/8Ϊ0Ζ OAV 37 K409 F405D K409W F405A

38 K409 Y407D K409W Y407A

39 T411K K370D T411 K370T T411W 370A

40 K439W D356A

Fc-융합 단백질에서 동종이합체 (homodimer)와 이종이합체 (heterodimer )를 SDS-PAGE를 통해 쉽게 구별하기 위해서， pcDNA3 vector (도 26 참조; Invi trogen)을 백본으로 사용하여， 한 쪽 사슬 (사슬 A : Enbrel )에는 TNF-알파 수용체 (TNFRSF1B : NP_001057. 1 (암호화 유전자: 丽_001066.2의 CDS; 서열번호 24) )의 세포외 도메인 (서열번호 24의 1-771 부위의 암호화 서열)을 Fc (암호화 유전자: 서열번호 26)에 융합시켰고， 다른 한쪽 (사슬 B : Fas)에는 Fas 수용체 (NP_000034. 1 (암호화 유전자: 醒 _000043.5의 CDS; 서열번호 25) )의 세포외 도메인 (서열번호 25의 1—519 부위의 암호화 서열)을 Fc (암호화 유전자: 서열번호 26)에 융합시켰다. A 사슬의 모노머는 53 kD이며， B 사슬의 모노머는 약 44 kD이다. 상기 Fc- 세포외 도메인이 융합되어 있는 사슬 A와 B의 사이즈가 상이하기 때문에， SDS-PAGE에서 2개의 동형결합 (AA 및 BB) 및 이종 결합 (AB)이 쉽게 구별될 수 있다.

A 사슬과 A 사슬의 결합 (동형 결합) 수치 (%)를 S _M 로 나타내었고， A사슬과 B사슬의 결합 (이종 결합) 수치 (%)를 SA _B 로 나타내었고， B 사슬과 B 사슬 사이의 결합수치 (%)를 S _BB 로 나타내었다.

표 3에 표시된 바와 같은 돌연변이가 도입된 A사슬과 B사슬의 접합 양상을 SDS-PAGE로 관찰한 동형결합 (AA 및 BB) 및 이종 결합 (AB) 비율 (%)을 변이가 일어나지 않은 A 사슬과 B 사슬 (각각 WT로 표시)의 결과와 비교하였으몌 이 중에서 정전기적 상호작용에 의한 돌연변이가 도입된 경우의 결과를 표 4 및 도 3에 나타내었고， 사이즈에 의한 돌연변이가 도입된 경우의 결과를 표 5 및 도 4에 나타내었고， 스와핑에 의한 연관 돌연변이가 도입된 경우의 결과를 표 6 및 도 5에 나타내었다.

【표 4】

【표 5】

【표 6]

상기 표 4 내지 6에서 이종이합체 (heterodimer) 형성률 (¾; S _AB )이 70%가 넘는 돌연변이를 굵은 글씨로 표시하였다. 상기 표 4 내지 6에서 확인되는 바와 같이， 시험된 돌연변이 쌍들은 60% 이상의 이종이합체 형성률을 보였다.

위의 결과를 통하여 동종이합체 (homodimer) 보다 이종이합체 (heterodimer) 형성률이 높고， 이종이합체 형성률이 70% 이상인 12쌍 (Y349K-E357D, E357K-Y349D, E357K-K370D, S364K— L368D, T366 -Y407D, T394K-T394D, T394K-V397D; 이상 정전기적 상호작용 도입 변이, E357Y- Y349E, E357K-K370E, S364K-K370S, F405K-K409F, Y407T-T366Y; 이상 스와핑 변이)의 돌연변이가 선택되었다 (표 4 및 5에서 굵은 글씨로 표시).

상기 선택된 12쌍의 아미노산 쌍에 포함된 12개의 아미노산 잔기 변이를 Fas-Fc 융합 단백질에 각각 도입시켜 상기 아미노산 위치에서 단일 변이를 포함하는 변이 Fas-Fc 융합 단백질을 발현시킴으로써， 동등한 조건에서의 동종이합체 및 단량체 , 잔존를 1=100%)을 비교하여， 그 결과를 표 7 및 도 6a에 나타내었다.

【표 7]

L368D 0.06

S364K 0.77

370S 0.05

S400N 0.05

T394D 0. 11

F405 0.67

K409F 0.05

T366A 0.09

T366Y 0.46

표 7 및 도 6a에서 동종이합체 형성률이 낮고 단량체 잔존률이 높은 (50% 이상)인 2개의 돌연변이 S364K, F405K를 선택하였다.

선택된 2가지 돌연변이를 "키 (key) " 돌연변이로 하였고， 이와 상호작용하는 다른 사슬의 CH3 도메인 부분을 "열쇠 ( lock) " 돌연변이를 보고 이를 조합하여 S364K-L368D, S364K-K370S, F405K-K409F의 3가지 key ^¬ lock 돌연변이 쌍을 선택하였다. 이 돌연변이 쌍들을 A 사슬 (키 돌연변이) 및 B 사슬 (열쇠 돌연변이)에 도입하여， 세 종류의 단일 돌연변이 쌍을 얻었다 (표 8 참조) .

【표 8]

각각의 키 돌연변이가 일어나는 위치의 아미노산을 다른 아미노산으로 바꾸어 앞서 설명한 바와 같은 단일 변이에 의한 이종이합체화 (heterodimer i zat ion) 효과를 시험하여， 상기 위치에서 이종이합체화에 효과가 좋은 돌연변이 종류를 확인하였다. S364에 있어서， K (라이신)로 치환되는 경우 이종이합체화 효과가 가장 좋게 나타났으며， N(아스파라긴)과 R (아르기닌)으로 치환된 경우에도 이종이합체화 효과가 우수하게 나타났다 (도 6b 참조) . F405에 있어서는， K와 R로 치환되는 경우 유사한 정도의 우수한 이종이합체화 효과를 보였으며， N과 Q (글루타민)으로 치환되는 경우에도 우수한 이종이합체화 효과를 보였다 (도 6c 참조) .

상기 선택된 3가지 key-lock 돌연변이 쌍인 S364K-L368D , S364K- K370S , 및 F405K-K409F에 도 6b 및 도 6c에서 확인된 추가 돌연변이 S364N, S364R, F405R, F405N, 및 F405Q를 적용하여, lock 돌연변이를 A chain (TNFR2-Fc)에 도입시키고， key 돌연변이를 B chain (Fas-Fc)에 도입시켜， SDS-PAGE상에서 이종이합체화 효과를 시험하였다.

상기 얻어진 결과를 표 9 및 도 6d에 나타내었다:

【표 9】

(SAA : AA동종 이합체 형성를 (%)；

S _AB : AB 이종 이합체 형성률 (%) ;

S _BB : BB 동종 이합체 형성률 (%) )

<실시예 2>단일 돌연변이에 의한 Fc 영역와 이종이합체화 시험 상기 실시예 1에서 선택된 3가지 key-lock 돌연변이 쌍인 S364K- L368D , S364K- 370S , 및 F405K— K409F와， key 돌연변이 위치의 F405를 K 대신 R로 변이시킨 F405RK409F 돌연변이쌍의 이종이합체화 효과를 SDS-PAGE 상에서 측정하여， 기존에 알려진 이종이합체 Fc 돌연변이 쌍 대조군 KiH, CPC , 및 AzS의 결과와 비교하였다.

본 실시예를 포함하여 하기의 모든 실시예에서의 SDS-PAGE 결과의 정량화는 Gel Quant .NET Software를 사용하여 밴드 강도 (band intensi ty)를 수치화한 것이다.

상기 얻어진 결과를 표 10 및 도 7에 나타내었다: 【표 10】

(S _AB : AB 이종 이합체 형성률 (¾); S _A ; AA동종 이합체 형성률 (%)；

¾: BB 동종 이합체 형성률 (%)； S _M : 단량체 잔존률 (¾>))

상기 Tm은 다음의 방법으로 측정하였다:

Reagent： Invitrogen 4461146 "Protein Thermal Shift™" Dye Kit

Instrument: Chromo4-PTC200 (MJ Research)

Reaction mixture: 20 μί in total

Protein 10 μί

DW 3 ≠

Protein Thermal Shift™ Buffer 5 ί

1/100 diluted Protein Thermal Shift™ Dye 2 μί

Protocol：

1. Incubate at 50.0 ^° C for 30sec;

2. Melting Curve from 50.0 ^° C to 90.0 ^° C, read every 0.2 ^° C, hold or 2 sec;

3. Incubate at 90.0 ^° C for 2 min

4. Incubate at 10.0 ^° C forever

5. End

표 10 및 도 7에서와 같이， A 사슬과 B 사슬을 각각 단일 발현 하였을 경우， 키 (key)가 들어있는 A 사슬은 동종이합체 (homodimer )를 거의 형성하지 않고 모노머로 발현되며 공동-발현된 시료에서도 동종이합체 (homodimer )는 거의 없이 이종이합체 (heterodimer)로만 존재하는 것이 확인되었다 (도 7 참조) .

<실시예 3> 이중돌연변이에 의한 Fc 영역의 이종이합체화

키 돌연변이가 A, B 사슬 중 한쪽에만 존재하는 것보다 양쪽 모두에 존재할 경우 동종이합체 (homodimer )화 가능성을 낮출 수 있을 것으로 보아서， 실시예 1에서 선택된 세 가지 돌연변이 쌍들을 조합하여 두 가지 이중 돌연변이 쌍을 얻었고， 각각의 쌍에서 F405를 K와 R 두 종류로 만들어서 총 4가지의 이중 돌연변이 쌍을 얻었다. 이들 4 가지 이중 돌연변이 쌍의 이종이합체화 효과를 SDS— PAGE 상에서 측정하여 대조군 KiH , CPC , AzS의 결과와 비교하였다.

상기 얻어진 결과를 표 11 및 도 8에 나타내었다:

【표 11】

표 11 및 도 8에서와 같이， 네 가지 돌연변이 쌍들 모두， 양쪽 사슬에 들어 있는 키 돌연변이로 인해 단일 발현하였을 경우 동종이합체 (homodimer )가 별로 형성되지 않고， 공동-발현된 시료에서 거의 모든 단백질이 이종이합체 (heterodimer)로만 발현되는 것이 확인되었다 (도 참조) . 또한， F405K보다 F405R이 도입된 이중 돌연변이 쌍이 열적 안정성를 보였다 (표 11).

열쇠 (Lock) 돌연변이에 해당하는 아미노산을 다른 돌연변이로 바꾸었을 경우 더 나은 효과가 있을지를 확인하기 위해， 이중 돌연변이 쌍들에서 열쇠 (lock)에 해당하는 L368, K370, 및 K409를 다른 아미노산 ¾로 돌연변이시켜 보았다. L368, K370, 및 K409를 다양하게 돌연변이시킨 돌연변이 조합을 표 12에 정리하였으며， 이들 조합의 이종이합체화 효과를 SDS-PAGE 상에서 측정하여 (NR: 8% SDS— PAGE gel; Sample: 24ul Loading) , 그 결과를 도 9a 내지 9c에 나타내었다.

【표 12】

Lock variants

S364 / L368M/ S364K/ Κ370 / S364K/ K370S/

UM XM ΖΜ

K409F F405R K409F F405R 409Μ F405R

S364K/ L368N/ S364K/ Κ370Ν/ S364K/ 370S/

UN XN ΖΝ

409F F 05R K409F F405R 409Ν F 05R

S364K/ L368Q/ S364K/ K370Q/ S364K/ K370S/

UQ XQ ZQ

409F F 05R 409F F 05R K409Q F405R

S364K/ L368R/ S36 / 370R/ S364 / 370S/

UR XR ZR

409F F405R K409F F405R K409R F405R

S364K/ L368S/ S364K/ 370S/ S364 / K370S/

US XS ZS

K409F F 05R 409F F 05R K409S F405R

S364K/ L368T/ S364K/ 370Τ/ S36 K/ 370S/

UT XT ΖΤ

K409F F405R K409F F 05R Κ409Τ F 05R

S36 / L368V/ S364K/ K370V/ S36 / 370S/ uv XV ZV

409F F405R K409F F405R K409V F 05R

S364K/ L368W/ S364K/ K370W/ S364 / K370S/ uw XW ZW

K409F F405R 409F F405R K409W F405R

S364K/ L368Y/ S36 / Κ370Υ/ S364 / K370S/

UY XY ΖΥ

K409F F 05R K409F F 05R Κ409Υ F405R 이들 조합에 대한 열적안정성을 측정 (실시예 2 침ᅳ조)하여 표 13에 나타내었다.

【표 13】

ZI S364K/ 409I 370S/F405R 62.4

ZN S364 / 409N K370S/F405R 61.0

ZR S364 / 409R K370S/F405R 62.8

ZT S364 /K409T K370S/F405R 65.4

ZV S364 /K409V 370S/F405R 66.0

zw S364 /K409W K370S/F405R 67.0

ZY S364 / 409Y 370S/F405R 63.8

열적안정성을 분석한 결과， K409를 트립토판 (W)로 돌연변이시키는 경우에 K409F보다 더 높은 열적안정성을 보였다.

위 결과를 참조하여, 하기의 Fc 이종이합체 시험을 위한 CH3 도메인에 도입되는 돌연변이로서 A 사슬에는 S364K, K409W이 들어가고 B 사슬에는 K370S, F405R이 들어간 이중 돌연변이를 선택하여 AWBB 돌연변이쌍으로 명명하였다.

<실시예 4>항체의 Fab에서 중쇄와 경쇄에 대한돌연변이 선택 항체의 중쇄와 경쇄의 돌연변이을 선택하기 위해서 정전기적 상호 작용 연관된 돌연변이， 사이즈 연관.돌연변이, 스와핑 연관 돌연변이를 수행하였다. 중쇄와 경쇄쎄서의 상호작용의 위치를 도 10에 나타내었다. 중쇄와 경쇄의 돌연변이를 용이하게 확인하기 위하여 동일한 경쇄를 가지는 항체를 클로닝하였다. 4D9 항체 (ant i-Inf luenza A ant ibody)와 2B9 항체 (ant i-Inf luenza B ant ibody)는 모두 항 -인플루엔자 항체로서 동일한 경쇄 (co隱 on l ight chain: CLC)를 가진다. 이들은 동일한 경쇄를 가지고 있기 때문에 SDS-PAGE를 통해 중쇄와 경쇄간의 상호작용을 쉽게 파악할 수 있다. 4D9과 2B9 두 항체는 경쇄의 아미노산 서열은 동일하지만 중쇄의 서열도 다르고 크기도 차이가 나기 때문에 (2B9의 중쇄가 4D9의 중쇄보다 아미노산 6개가 더 많고， 단백질 크기도 2B9의 중쇄 (50130.62 Dal tons)가 4D9의 중쇄 (49499.98 Dal tons)보다 큼: SDS-PAGE 상에서 뚜렷이 식별 가능함)， 둘 중 어느 중쇄가 경쇄와 상호작용하는지 환원 조건에서 SDS- PAGE상에서 사이즈로 구별이 가능하다.

4D9과 2B9 두 항체의 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 핵산 서열을 아래의 표 14에 나타내었다: 【표 14]

4D9과 2B9 두 항체의 중쇄 불변영역은 IgGl의 불변 영역을， 경쇄 불변영역은 카파 불변 영역을 각각사용하였다.

경쇄에 돌연변이를 도입하고， 그 돌연변이와 상호작용하는 돌연변이를 가진 중쇄 사슬만이 이 경쇄와 결합하는지 확인하기 위해 경쇄， 그 경쇄와 짝지는 중쇄와 잘못된 결합 ( _m i _S p _a i _r )를 이루는 중쇄를 공동- 발현하여 만들어진 항체를 환원 조건에서 SDS-PAGE하면 짝지음이 얼마나 정확하게 이루어졌는지 확인할 수 있다. 편의상 4D9 중쇄를 A 사슬로， 이와 짝지음하는 경쇄를 a 사슬로， 그리고 2B9 중쇄를 B 사슬로， 이와

먼저， 4D9과 2B9을 이용하여 기존에 효과적인 것으로 보고되어 종래 중쇄와 경쇄 사이의 돌연변이 쌍을 클로닝하여 공동 -발현하여, 변이시킨 2개의 중쇄와 1개의 경쇄의 compet i t ion을 통해 형성된 짝지음 양상을 SDS-PAGE로 확인하였다 (Compet it ive Pairing (CPP) Assay) . 상기 Compet it ive Pairing (CPP) Assay 과정을 도 11에 모식적으로 나타내었으며 얻어진 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에서와 같이， 기존에 보고된 모든 돌연변이 쌍이 정상 짝지음 (pair)와 비정상 짝지음 (mispair)의 같이 일어나는 것으로 확인되었다.

중쇄와 경쇄 사이에 정전기 상호작용에 의한 연관 돌연변이의 경우는

B 사슬 (2B9 중쇄)의 해당 아미노산을 K (라이신)으로, A 사슬 (4D9 중쇄)의 경우에는 D (아스파트산)으로 바꾸면서， 다양한 돌연변이 쌍들이 도입된 항체에 대하여 SDS-PAGE상에서의 CPP assay (도 11 참조)를 수행하였다. 그 결과， 정전기적 상호작용에 의한 연관 돌연변이 그룹에서 비교적 정확하게 짝지음이 일어나는 것으로 확인된 7개의 후보 돌연변이쌍을 스크리닝하였다. 스크리닝된 7개 돌연변이 쌍이 도입된 항체의 SDS-PAGE 상에서의 CPP assay 결과를 표 15 및 도 13에 나타내었다.

【표 15]

(CPP Score (^ ^pp ) =

a ^UP = ιοο ⁽ _Α )/(θΑ+α _Β ⁾ = ιοο ^{( )} / ⁽ + ⁾

b ^pp = 100½ _B )/½ _B +: _bA ) = 100((¾)/(C _A +ft))

4D9 (A 사슬) 및 2B9 (B 사슬) 항체를 이용한 돌연변이 쌍의 리스트중 SDS-PAGE 상에서 비교한 결과， 비교적 정확하게 짝지음이 일어나는 돌연변이 쌍 몇 가지를 발견할 수 있었다 (표 15에서 굵은 글씨로 표시). 이에 대한 추가 연구를 하기 위해서 위 30번 돌연변이 (c30<Df30로 표시 )를 표 16과 같이 변형하여 보았다.

【표 16】

것이며, 상기 표 16과 같이， 중쇄의 L145와 경쇄 V133을 R 과 D로 바꾼 변형 형태의 경우도 효과 (짝지음 정확도: Aa 짝지음 또는 Bb 짝지음 비율)가 좋았다 (도 14 참조 (Aa 짝지음 정확도 75%, Bb 짝지음 정확도: 60%)).

상기 30번 돌연변이 또는 그 변형 (중쇄의 L145와 경쇄 V133을 각각 K 또는 R 과 D 또는 E로 치환)에, 경쇄에 돌연변이 S131D (29번 돌연변이로 칭함)을 더하자 짝지음의 정확도가 보다 향상되었다 (표 17 및 도 15 (c29c ^R 30 f ^R 30 결과; Aa 짝지음 정확도: 80%, Bb 짝지음 정확도: 70%) 및 도 16 (ΛθΛθΦ ί^θί^Ο 결과; Aa 짝지음 정확도: 90%, Bb 짝지음 정확도: 80%) 참조) .

【표 17]

도 14 및 도 15에서 확인되는 바와 같이， 중쇄의 L145와 경쇄 V133을 각각 K 과 D로 바꾼 30번 돌연변이뿐 아니라， 중쇄의 L145와 경쇄 V133을 각각 R 과 D로 치환한 경우와 중쇄의 L145를 R 또는 E로， 경쇄의 S131 및 V133을 각각 K와 R, 또는 D와 E로 치환한 경우도 짝지음 정확도가 우수하게 나타났다.

또한， 중쇄의 S183과 경쇄의 V133을 각각 K (또는 R)과 D (또는 E)로 바꾼 돌연변이 쌍 (48번 돌연변이로 칭함) 역시 효과적인 것으로 확인되었다 (표 18 및 도 17 (Aa 짝지음 정확도 (아래쪽 밴드) : 45%, Bb 짝지음정확도 (위쪽 밴드) : 95%) .

【표 18】

앞서 설명한 29번 돌연변이， 30번 돌연변이， 및 48번 돌연변이를 조합한 돌연변이쌍 (c29c30c48F ⁽ D 29f30f48) 또는 이의 변형 돌연변이쌍을 포함하는 항체를 제작하고 (표 19 참조) , 이들의 짝지음 정확도를 시험하여 그 결과를 도 18에 나타내었다 (도 18에서 아래쪽 밴드가 Aa 짝지음을， 위쪽 밴드가 Bb짝지음을 나타냄) :

【표 19】 Aa (4D9) L145E/S183D S131K/V133R 100%

Bb (2B9) L145R/S183 S131D/V133E 90%

변형 1

Aa (4D9) L145D/S183D S131K/V133K 85%

Bb (2B9) L145 /S183 S131D/V133D 90%

변형 2

Aa (4D9) L145D/S183D S131D/V133K 95%

Bb (2B9) L145K/S183 S131 /V133D 95%

또한, 앞서 설명한 29번 돌연변이, 30번 돌연변이， 및 48번 돌연변 ⁰ 중 하나 이상을 조합한 변형 돌연변이 쌍 (표 20 참조)를 포함하는 항체에 대하여 짝지음 정확도를 측정하여 도 19에 나타내었다 (도 19에서 아래쪽 밴드가 Aa 짝지음을， 위쪽 밴드가 Bb 짝지음을 나타냄) :

【표 20】

Bb 50% 62% 70% 80% 90%

(Aa : Aa 짝지음 정확도; Bb : Bb 짝지음 정확도)

또한， 앞서 설명한 29번 돌연변이 , 30번 돌연변이， 및 48번 돌연변 0 조합에서， D와 E를 서로 바꾸면서 비교적 정확한 짝지음이 가능하게 조합을 얻어내었다 (표 21 및 도 20) .

【표 21]

(Aa : Aa 짝지음 정확도; Bb : Bb 짝지음 정확도)

상기 표 21과 도 20에서 보여지는 바와 같이， 시험된 돌연변이쌍 ab , gh, 및 abgh 모두 65% 이상 또는 95% 이상의 짝지음 정확도를 나타내었다. 이 중에서 abgh를 선택하여 이를 (Γ29(Γ3^48 Φ Γ 29Γ30Γ48 돌연변이쌍으로 명명하였다.

또한， 표 15에서 확인된 돌연변이쌍들 중 34번 돌연변이 쌍과 51번 돌연변이 쌍을 조합하여 도입시킨 경우의 짝지음 정도를 시험하여 아래의 표 22 및 도 21에 나타내었다.

【표 22]

또한, 표 15의 34번 돌연변이 쌍과 51번 돌연변이 쌍에서 K를 R로，

D를 E로 치환하여 짝지음 정도를 시험하여， 짝지음 정확도가 개선된 조합을 찾았다. 그 조합은 경쇄의 L135와 T180을 각각 E로 바꾼 돌연변이 쌍으로ᅳ 이를 c34i ⁾ f51 돌연변이 쌍으로 명명하였다 (표 23 및 도 22 참조) .

【표 23]

IX L135K/T180 (a) L135E/T180E (b)

4D9중쇄 (A) 147D/V185D

2B9중쇄 (B) 147/V185K

Aa(%) 95% Bb(%) 86%

또한， 표 15에서 발견한 여러 돌연변이 쌍 중에서， 40번 돌연변이에 44번 돌연변이를 더해주었을 때 짝지음의 정확도가 향상됨을 확인하였다. 또한, 앞선 실시예와 동일하게 돌연변이 쌍의 모든 K와 R을 서로 바꾸고 모든 D와 E를 서로 바꾸어 보아 가장 정확한 짝지음을 가능하게 하는 조합을 찾았다. 그 조합은 경쇄의 L135을 각각 R과 E로 바꾼 돌연변이 쌍으로， 이를 c40 ⁽ Df44 돌연변이 쌍이라 명명하였다 (표 24 및 도 23 참조):

【표 24]

<실시예 5> 중쇄 간 및 중쇄 및 경쇄 간의 결합에 의한 이중 항체 형성

5.1. ^29^30ε48ΦΓ29Γ30Γ48돌연변이쌍이 도입된 이중 항체 5.1.1. 4D9/2B9항체를 이용한중쇄 및 경쇄 간결합시험

상기 시험된 (Γ29(^3^48ΦΓ29Γ30Γ48 돌연변이쌍을 포함하는 중쇄와 경쇄를 결합하여 항체를 제작하였다 (표 25 참조):

【표 25]

상기 이중 항체의 A사슬, B사슬， a 사슬 및 b 사슬의 짝지음의 정확도를 확인하기 위해， 각각의 중쇄와 경쇄를 제대로짝지음 및 비정상적 짝지음의 형태로 가능한 모든 조합으로 공동-발현한 후 발현 정도를 SDS- PAGE로 확인한 결과를 아래의 표 26에 나타내고， 열적 안정성 (Tm)을 측정하여 그 결과를 표 27 및 도 25에 나타내었다:

【표 26] 발현량 89.8mg/l 18.8 24.5 68.5

mg/1 mg/1 mg/1

【표 27】

상기 표 26， 표 27， 및 도 25에 나타난 바와 같이， c 29c 30c48Of 29f ^v 30f ^v 48 돌연변이쌍이 도입된 이중 항체의 경우， 정상적인 짝지음 (Aa/Bb)의 경우， 비정상적 짝지음 (Ab/Ba)에 비해, 발현 수준이 높고, 열적안정성도 매우 우수한 것으로 확인되었다.

5.1.2. Tr astuzumab/Bevac i zumab 이중항체 또는 Adal imumab/ Bevac i zumab이중항체

Trastuzumab (Hercept in®； Roche) , Bevac i zumab (Avast in™; Roche) 및 Adal imumab (Humira®; Abbvie)를 구입하여 아미노산 서열을 시퀀싱하고 (기초과학지원센터 (KBSI); 한국)， 이에 해당하는 cDNA를 합성하였으며， 이를 사용하여 아래의 표 28의 조합으로 (Γ29^30ο48ΦΓ29Γ30Γ48 돌연변이쌍과 실시예 3에서 선택된 CH3 도메인의 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체를 제작하였다 (pcDNA3 vector (도 26 참조) 사용).

【표 28]

Adal imumab (Aa) L145E/S183E S364 /K409W S131K/V133K

Bevac i zumab (Bb) L145 /S183K K370S/F405R S131E/V133E

상기 얻어진 이중항체 Trabev와 Adabev에 대하여 다음의 조건으로 Hydrophobic Interaction Chromatography(HIC)를 수행하여， 그 결과를 도 27 (y축: Value (mAU) , x축: 시간 (min))에 각각 나타내었다:

장비 : HPLC-U3000

컬럼 : MAbPac Hic-20

Flow rate: 0.2mL/min

Detection: UV, 280nm ^'

Mobile Phase: 0.10 M Ammonium acetate, pH7.0

상기 얻어진 단백질을 HIC Column에 통과시켜주면 단백질의 소수성 정도에 따라 서로 다른 시간대에 피크가 생성되며， 이를 통하여 이중 항체가 잘 만들었는지 확인할 수 있다. 도 27에 나타난 바와 같이， 두 개의 동종 이합체 항체 (Trastuzumab와 Bevacizumab 또는 Adal imumab와 Bevacizumab)의 피크 가운데 이종 이합체의 이중항체 (Trabev와 Adabev)의 피크가 뚜렷하게 관찰된다. 이는 각각의 항체의 half antibody로 만들어진 이중항체가잘 생성되어 있음을 의미한다.

또한， 상기 얻어진 이중항체 Trabev와 Adabev에 대하여 다음의 조건으로 Size exclusion Chromatography (SEC) Analysis 를 수행하여, 그 결과를 표 29, 도 28 및 도 29 (X축: 시간 (min))에 나타내었다:

장비： HPLC-U3000

컬럼: Size-exclusion chromatography T S gel G3000SWXL Tosoh

Bioscience

Flow rate: l.OmL/min

Detection: UV, 280nm

Mobile Phase: 25mM Tris-HCl (pH 8.5), 150 mM NaCl

【표 29】

상기 SEC 분석에서 단백질의 크기에 따라서 peak가 나오며， 단백질 간 웅집 상태 등을 알 수 있다. 표 29， 도 28 및 도 29에 나타난 바와 같이, 이중항체의 피크가 두 단일 항체 피크의 가운데 시간대에 위치하는 것을 확인할 수 있다. 이는 이중항체가 잘 생성되어 있음을 의미한다. 또한， 상기 얻어진 이중항체 Trabev와 Adabev에 대하여 SDS-PAGE 상에서 이합체 형성 양상을 도 30에 나타내었다. 도 30에서 확인되는 바와 같이， 이종이합체인 이중항체 Trabev는 Trastuzumab과 Bevacizumab의 중간 size에， Adabev는 Adalimumab과 Bevacizumab의 중간 size에 단일 band로 나타났다. 이는 '동종 이합체가 형성되지 않고 오직 제대로 짝지음된 이중 특이성 항체들만 만들어졌음을 의미한다.

ELISA를 통해서 BsAb가 각각의 항원 (Trastuzumab: Her2),

Bevacizumab (VEGF) , 및 Adalimumab (TNF-alpha)에 잘 결합하는지 시험하였다.

항원 결합력 측정은 다음을 참조하여 수행하였다:

Reagent

Detection antibody: goat ant i -human kappa-HRP (southern biotech,

2060-05)

TMB single solution (LIFE TECHNOLOGY, 002023)

Instrument

Emax precision microplate reader (Molecular devices)

Protocol

Coating buffer： Carbonate buffer pH 9.6

Blocking buffer： proteinᅳ free(TBS) blocking buffer (Thermo scientific)

Wash buffer: 0.05%(w/v) Tween20 in TBS, pH7.4 (TBST)

Diluent： 0.05%(w/v) Tween20 in TBS, pH7.4

Stop buffer： IN Hydrochloric acid solution (HCl )

과정

Coating: antigen을 coating buffer에 희석하여 well당 lOOul씩 loading, 4 ^° C overnight incubation (Her2, VEGF: 50ng/wel 1 , TNF-alpha: lOOng/well);

Washing 3 times with washing buffer；

Blocking: blocking buffer 300ul 분주， incubation at room temperature (RT) for 1 hour； Washing 3 times with washing buffer；

Binding: antibodies lOOng/well로 loading, incubation RT lhr； Washing 3 times with washing buffer；

Detect ion Antibody: goat ant i -human kappaᅳ HRP를 TBST에 1:4000으로 희석， incubation RT lhr;

Washing 3 times with washing buffer

Detect ion: TMB solution lOOul씩 loading, incubation RT 3 min in the dark;

Stop solution: IN HC1 lOOul씩 loading;

Reading: optical density 450nm에서 즉정

상기 얻어진 결과를 표 30과 도 31 (이상, Trabev에 대한 결과)， 및 표 31와 도 32 (이상， Adabev에 대한 결과)에 각각 나타내었다:

【표 30】

표 29 및 도 31에 나타난 바와 같이， 이중항체 Trabev는

Trastuzumab의 항원인 Her2와, Bevacizumab의 항원인 VEGF 모두에 결합함이 확인되었으며 , 표 30 및 도 32에 나타난 바와 같이 , 이중항체 Adabev 역시 Adal imumab의 항원인 TNF-alpha와 Bevacizumab의 항원인 VEGF 모두에 결합함이 확인되었다. 이러한 결과는 의도한 기능을 정상적으로 발휘하는 두 이중항체가 성공적으로 생성되었음을 다시 한번 확인시켜주는 것이다. 5.2. c34 f51돌연변이 쌍이 도입된 이중항체

실시예 5. 1. 1을 참조하여， 4D9(Aa)와 2B9(Bb)에 c340 f51 돌연변이쌍 (표 23 참조)이 도입된 항체를 제작하였다. 각 중쇄 별로 경쇄 _a 와 b를 함께 발현시켜, SDS-PAGE 상에서 경쇄와 중쇄 간 짝지음 정도를 측정하고 (중쇄 A 및 B에 대하여 각각 실시함)， 실시예 2를 참조하여 Tm을 측정하여， 그 결과를 아래의 표 32 및 도 34에 나타내었다.

【표 32]

N/A: not avai lable)

표 32 및 도 34에 나타난 바와 같이， 정상적인 중쇄 /경쇄 쌍 (Aa 또는 Bb)의 형성률이 각각 90% 및 89%로 매우 높게 나타났으며， 열적 안정성도 우수한 것으로 확인되었다.

또한， 실시예 5. 1.2의 이중항체 제작 과정을 참조하여， Trastuzumab (Hercept in®； Roche) , Bevacizumab (Avast in™; Roche) , 및 Adal imumab (Humira®； Abbvie)를 사용하여 c340 ⁾ f51 돌연변이 쌍 및 실시예 3에서 선택된 CH3 도메인 AWBB 돌연변이 쌍 (Aa: S364K/K409W; Bb : K370S/F405R)이 도입된 이중항체 Trabev (Aa : Trastuzumab ; Bb : Bevacizumab)와 Adabev (Aa : Adal imumab ; Bb : Bevacizumab)를 각각 제작하였다.

실시예 5. 1.2의 Hydrophobi c Interact ion Chr oma t ogr aphy ( H I C ) 방법을 참조하여， 상기 제작된 c34d f51 돌연변이쌍 및 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중 항체 Trabev와 Adabev를 분석하였다.

상기 얻어진 분석 결과를 표 33과 도 35 (이상 Trabev) 및 표 34와 도 36 (이상， Adabev)에 나타내었다.

【표 33] # Set l Ant ibody Time (min . )

Aa Trastuzumab 23.41

Bb Bevac i zumab 38.05

1AB Trabev 29.13

【표 34]

# Set2 Ant ibody Time (min. )

Aa Adal imumab 22.07

Bb Bevac i zumab 38.05

2AB Adabev 30.21

표 33과 도 35 및 표 34와 도 36에 나타난 바와 같이， 두 개의 동종 이합체 항체 (Trastuzumab와 Bevac i zumab 또는 Adal imumab와 Bevaci zumab)의 피크 가운데 이종 이합체의 이중항체 (Trabev와 Adabev)의 피크가 뚜렷하게 관찰된다. 이는 c34i ⁾ f51 돌연변이쌍 및 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 각각의 항체의 hal f ant ibody로 만들어진 이중항체가 잘 생성되어 있음을 의미한다. 또한, 상기 c34 f51 돌연변이 쌍 및 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체의 이합체 형성 양상을 시험하여 도 37에 나타내었다 (SI^-PAGE gel 6%, Non-Reducing condi t ion) . 도 37에 나타난 바와 같이， 기존에 알려진 항체에 c34<t f51 돌연변이 쌍과 AWBB 돌연변이 쌍을 동시에 도입시켰을 때， 순수한 이종이합체 밴드가 형성됨을 확인할 수 있다.

4.3. c40 f44돌연변이 쌍이 도입된 이중항체

실시예 5.1. 1을 참조하여， 4D9(Aa)와 2B9(Bb)에 c40O f44돌연변이쌍 (표 24 참조)이 도입된 항체를 제작하였다. 각 중쇄 별로 경쇄 _a 와 b를 함께 발현시켜， SDS-PAGE 상에서 경쇄와 중쇄 간 짝지음 정도를 측정하고 (중쇄 A 및 B에 대하여 각각 실시함)， 실시예 2를 참조하여 을 측정하여， 그 결과를 아래의 표 35 및 도 38에 나타내었다.

【표 35]

Q 99% 1% 99% 1%

Tm 65.0 N/A 63.4 N/A

(q: 경쇄 /중쇄 짝지음 정도 (%)；

N/A: not available)

표 35 및 도 38에 나타난 바와 같이， 정상적인 중쇄 /경쇄 쌍 (Aa 또는 Bb)의 형성률이 모두 99% 로 매우 높게 나타났으며， 열적 안정성도 우수한 것으로 확인되었다.

또한， 실시예 5.1.2의 이중항체 제작 과정을 참조하여， Trastuzumab (Herceptin®； Roche) , Bevac i zumab (Avast in™; Roche), 및 Adal imumab (Humira®; Abbvie)를 사용하여 c40$f44 돌연변이 쌍 및 AWBB 돌연변이 쌍 (A: S364K/K409W; B: K370S/F405R)이 도입된 이중항체 Trabev (Aa: Trastuzumab; Bb: Bevac i zumab)와 Adabev (Aa: Adal imumab; Bb: Bevac i zumab)를 각각 제작하였다.

실시예 5.1.2의 Hydrophobic Interaction Chromatography(HIC) 방법을 참조하여， 상기 제작된 c40i>f44 돌연변이쌍 및 AWBB 돌연변이 쌍이 도입된 이중 항체 Trabev와 Adabev를 분석하였다.

상기 얻어진 분석 결과를 표 36과 도 39 (이상 Trabev) 및 표 37과 도 40 (이상， Adabev)에 나타내었다.

【표 36]

표 36과 도 39 및 표 37과 도 40에 나타난 바와 같이， 두 개의 동종 이합체 항체 (Trastuzumab와 Bevac i zumab 또는 Adal imumab와 Bevac i zumab)의 피크 가운데 이종 이합체의 이중항체 (Trabev와 Adabev)의 피크가 뚜렷하게 관찰된다. 이는 c40 <D f44 돌연변이 쌍 및 AWBB 돌연변이 쌍이 도입된 각각의 항체의 hal f ant ibody로 만들어진 이중항체가 잘 생성되어 있음을 의미한다. 또한， 두 개의 동종 이합체 항체 사이에 뚜렷한 peak가 단 한 개만 나타나는 것으로 보아， 두 개의 중쇄 사이， 그리고 각각의 중쇄와 경쇄 사이에 잘못된 짝지음이 일어나지 않고 오직 한 종류의 제대로 짝지음된 이중 특이성 항체만이 만들어졌음을 알 수 있다.

또한， 상기 c40 $ f44돌연변이 쌍 및 BB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체의 이합체 형성 양상을 시험하여 도 41에 나타내었다 (SDS-PAGE gel 6%, Non-Reducing condi t ion) . 도 41에 나타난 바와 같이, 기존에 알려진 항체에 c40 ⁽ 5 f44돌연변이 쌍과 AWBB돌연변이 쌍을 동시에

도입시켰을 때， 순수한 이종이합체 밴드가 형성됨을 확인할 수 있다.

<비교예 1>

본 명세서에서 제시되는 CH3 도메인의 돌연변이에 있어서， 동일한 아미노산 쌍이라도 실시예 1 내지 3에서 제시되는 돌연변이와 상이한 돌연변이가도입되는 경우의 이종 이합체 형성를을 시험하였다.

비교예로서， 실시예 1을 참조하여， 하기의 표 38의 돌연변이가 도입된 TNFRSFIB-Fc 융합 단백질 (Enbrel ; Enb)과 Fas-Fc 융합 단백질 (Fas)을 제조하였다 (표 38에서 BEAT-A 및 BEAT-B로 표시) .

【표 38】

본 명세서에서 제시되는 CH3 도메인의 돌연변이를 대표하기 위하여， 실시예 3에서 선택된 CH3 도메인 돌연변이를 포함하는 TNFRSFIB-Fc 융합 단백질 (A 사슬)과 Fas-Fc 융합 단백질 (즉， S364K 및 K409W이 도입된 A 사슬 ^' 및 K370S 및 F405R이 도입된 B 사슬) (표 38에서 AW/BB로 표시됨)을 준비하였다.

또한， 상기 표 38에 기재된 돌연변이 쌍을 포함하는 Enb-Fc와 Fas- Fc를 각각 s ingle trans feet ion시킨 경우의 동종 이합체 형성 양상을 SDS- PAGE상에서 관찰하여， 도 42에 나타내었다.

도 42에 나타난 바와 같이， AW/BB에서는 monomer의 비율이 높은 데 비해， BEAT— A 및 BEAT-B에서는 monomer보다는 homodimer의 비율이 더 높게 나타났다. 이러한 결과에 근거하여， A chain과 B chain의 expression 양에 차이가 있을 경우， homodimer를 형성할 확률은 AW/BB보다 BEAT-A 및 BEAT- B가 더 높다고 할 수 있다. 또한， 이중항체를 만들기 위해 heavy chain과 l ight chain을 조합하였을 때， homodimer가 많이 만들어진다면 이 homodimer는 제대로 만들어진 heterodimer와 물성에 차이가 거의 없기 때문에, 제대로 만들어진 heterodimer를 분리하기가 매우 어렵게된다. 따라서, homodimer izat ion을 최소화하는 것은 순도가 높은 이중항체를 제조하는 데 있어 매우 중요하다고 할 수 있으며， 가능한 한 homodimer를 형성하지 않는 돌연변이 조합이 이중 특이성 이중항체의 제작에 유리하다고 할 수 있다.

이러한 결과로 볼 때, BEAT-A 및 BEAT-B의 경우， /BB와 비교하여， 동종 이합체의 형성률이 높으므로， heterodimer i zat ion potent ial이 낮다고 할 수 있고， 제대로 형성된 이종 이합체의 분리에 어려움이 있다.