STREPTOCOCCUS AGALACTIAE

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está relacionada con la industria acuicultura, particularmente se relaciona con una vacuna que permite el control, prevención, tratamiento y cura de enfermedades causadas por Streptococcus en peces.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Streptococcus iniae y Streptococcus agalactiae representan dos de los patógenos bacterianos más ubicuos en peces de agua cálida, como por ejemplo, Tilapia {Oreochromis sp.), Barramundi ( Lates Sp.), besugo ( Sparidae ), entre otros. Ambas patógenos afectan peces en diferentes etapas de crecimiento, causando grandes pérdidas económicas a la industria de la acuicultura. Hoy en día, el tratamiento contra Streptococcus consiste en vacunas que comprenden una o más cepas inactivadas de dicho patógeno, tal como se describe en la solicitud de patente KR1020130088171 , donde se divulga por ejemplo el uso de las cepas Streptococcus parauberius FPA4164 (KCTC 1 1980BP), Streptococcus iniae FP5024 (KCTC 1 1634BP), y Edwardsiella tarda FP2018 (KCTC 1 1 145BP).

De la misma forma, la patente KR1020100030571 divulga una vacuna que comprende una la combinación de las cepas Streptococcus parauberius FP2284 (KCTC 1 1633BP) y Streptococcus iniae FP5024 (KCTC 1 1634BP) inactivadas, para prevenir la streptococcosis en peces, particularmente en lenguado ( Paralichthys olivaceus). i Si bien en el mercado, existen varios productos que comprenden una o más cepas inactivadas de Streptococcus, capaces de tratar la streptococcosis en peces, se ha reportado que existen cepas de Streptococcus que generan una interferencia antigénica, proceso en donde antígenos y/o su respuesta inducida inmune interactúa negativamente entre diversas fracciones, perjudicando la protección contra una o incluso contra todas las fracciones de antígenos presentes en la vacuna, y generando la disminución de la eficacia de las vacunas contra los referidos patógenos.

En este contexto, Leli Marlia en el año 2010, evaluó la eficacia de vacunas monovalentes y bivalentes para prevenir la streptococosis en la tilapia del Nilo ( Oreochromis niloticus) mediante inyecciones que contenían cepas de Streptococcus agalactiae y Streptococcus iniae. En esta investigación, se comparó el tratamiento A, que comprendía en una vacuna monovalente de Streptococcus agalactiae ; el tratamiento B, que comprendía una vacuna monovalente de Streptococcus iniae] el tratamiento C, que comprendía una vacuna bivalente 1 : 1 ( Streptococcus agalactiae : Streptococcus iniae) y el tratamiento D como control. A partir de esta comparación, se logró demostrar que la virulencia de las cepas de Streptococcus agalactiae es mayor que la virulencia de las cepas de Streptococcus iniae. Adicionalmente, se demostró que frente a una desafío con Streptococcus agalactiae, la tasa de supervivencia de Tilapia fue de 15,56 % y que el porcentaje de relativo de supervivencia fue de 15,56 % al aplicar la vacuna bivalente, y que la tasa de supervivencia de tilapia fue 13,33 % y que el porcentaje de relativo de supervivencia fue 13,33 % al aplicar la vacuna monovalente de Streptococcus agalactiae y Streptococcus iniae, mientras que el control fue de 0 %. Asimismo, se demostró que frente a un desafío con Streptococcus iniae, la tasa de supervivencia de Tilapia fue 86,67 % y porcentaje de relativo de supervivencia fue 64,67 % al aplicar la vacuna monovalente de Streptococcus iniae, que la tasa de supervivencia de Tilapia fue 71 ,1 1 % y porcentaje de relativo de supervivencia fue 23,53 % al aplicar la vacuna bivalente, que la tasa de supervivencia de Tilapia fue 62,22 % y porcentaje de relativo de supervivencia fue 0 % al aplicar la vacuna monovalente de Streptococcus agalactiae, mientras que el control fue 0 %.

Interesantemente, los investigadores evidenciaron que la vacuna bivalente de Streptococcus agalactiae y Streptococcus iniae , no fueron efectivas para prevenir la streptococcosis en Tilapia ( Oreochromis niloticus), por cuanto existiría una interferencia antigénica que queda en evidencia al realizar el desafío con Streptococcus iniae , ya que la vacuna bivalente de Streptococcus agalactiae y Streptococcus iniae , protege menos contra Streptococcus iniae (SR: 71 ,1 1 %; RPS: 23,53 %) en comparación con la vacuna monovalente contra Streptococcus iniae (SR: 86,67 %; RPS: 64,72 %).

En este contexto, hoy en día no existe una vacuna comercial bivalente en el mercado, que sea eficiente y que permita una protección cruzada contra ambos patógenos, Streptococcus agalactiae y Streptococcus iniae , de manera específica al aplicar una única dosis inyectable, permitiendo reducir la manipulación y estrés del pez.

Por este motivo, surge la necesidad de desarrollar una vacuna bivalente contra Streptococcus iniae y Streptococcus agalactiae, formulada con una combinación de al menos uno o más de los referidos patógenos, que no genere una interferencia antigénica, y que permita controlar, prevenir, tratar y curar la steptococcosis en peces, proporcionando una solución en la industria acuícola que represente una solución eficiente, económica y amigable con los animales.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención está relacionada con la industria de la acuicultura, particularmente se relaciona con una vacuna que permite el control, prevención, tratamiento y cura de enfermedades causadas por Streptococcus en peces. La invención comprende una vacuna bivalente para controlar, prevenir, tratar y curar enfermedades producidas los patógenos Streptococcus iniae y Streptococcus agalactiae en peces, particularmente en peces tales como Tilapia ( Oreochromis sp.), Barramundi ( Lates Sp.), besugo ( Sparidae ). Aún, más particularmente, la invención comprende al menos una o más cepas de la especie Streptococcus iniae y, al menos una o más cepas de la especie Streptococcus agalactiae. Preferentemente, la invención comprende dos cepas de la especie Streptococcus iniae y dos cepas de la especie Streptococcus agalactiae.

Preferentemente, la invención comprende dos cepas de la especie Streptococcus iniae a una concentración entre 1 x10 ⁶ a 1 x10 ¹¹ [UFC/ml], y dos cepas de la especie Streptococcus agalactiae a una concentración entre 1 x10 ⁶ a 1 x10 ¹¹ [UFC/ml] Aún más preferentemente, la invención comprende dos cepas de la especie Streptococcus iniae a una concentración entre 1 x10 ^7,3 a 1 x10 ^9,3 [UFC/ml], y dos cepas de la especie Streptococcus agalactiae a una concentración entre 1 x10 ⁷ ’ ³ a 1 x10 ⁹ ’ ³ [UFC/ml]

En una modalidad de la invención, las cepas de la especie Streptococcus agalactiae incluyen al menos una cepa del serotipo la y otra cepa del serotipo Ib.

En una modalidad, la invención comprende una formulación que incluye un adyuvante y agua estéril. Específicamente, la invención comprende el adyuvante MontadineTM ISA 763A VG al 70 % y una cantidad suficiente de agua estéril.

Adicionalmente, la presente invención comprende el uso de la composición que comprende dos cepas de la especie Streptococcus iniae a una concentración entre 1 x10 ⁶ a 1 x10 ¹¹ [UFC/ml], dos cepas de la especie Streptococcus agalactiae a una concentración entre 1 x10 ⁶ a 1 x10 ¹¹ [UFC/ml], un adyuvante MontadineTM ISA 763A VG al 70 %, y una cantidad suficiente de agua estéril, que sirve para preparar una vacuna bivalente para controlar, prevenir, tratar y curar enfermedades producidas por Streptococcus iniae y/o Streptococcus agalactiae en peces.

Por último, la presente invención comprende el uso de una composición para preparar una vacuna bivalente oral o inyectable para controlar, prevenir, tratar y curar enfermedades producidas por Streptococcus iniae y/o Streptococcus agalactiae en peces.

La invención se comprenderá mejor por medio de los siguientes ejemplos, los que son meramente ilustrativos y no limitativos del alcance de la invención. Varios cambios y modificaciones a las modalidades descritas serán evidentes para los expertos en la materia y tales cambios pueden hacerse sin apartarse del espíritu de la invención y del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLO

Análisis de eficacia de la vacuna bivalente contra Streptococcus iniae y Streptococcus agalactiae.

Con el objeto de determinar cuál es la eficacia de la vacuna bivalente contra Streptococcus iniae y Streptococcus agalactiae, se prepararon distintas formulaciones de vacunas, las cuales incluyeron vacunas monovalentes con distintas cepas de Streptococcus agalactiae (101 , 102, 103, 104, 105), a una concentración de 1 ,36x10 ⁸ [UFC/ml]; y una vacuna bivalente que comprende una combinaciones de al menos una o más cepas de Streptococcus agalactiae y al menos una o más cepas de Streptococcus iniae (107, 108), a una concentración de 1 x10 ^9,3 [UFC/ml], tal como se muestra en la figura N° 1 . A partir de este ensayo, se logró determinar que la vacuna bivalente contra Streptococcus iniae y Streptococcus agalactiae, tiene una tasa de supervivencia del 98,9 %, tal como se muestra en las figura N ^s 1 y N ^s 2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Los anteriores y otros objetos, características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción más particular de las modalidades preferidas de la invención, como se ilustra en los dibujos adjuntos.

La figura N° 1 corresponde al análisis de eficacia de la vacuna bivalente contra Streptococcus iniae y Streptococcus agalactiae. (101 , 102, 103, 104, 105): Vacuna monovalente de Streptococcus agalactiae, a una concentración de 1 ,36x10 ⁸ [UFC/ml]; (107, 108): Vacuna bivalente con Streptococcus agalactiae y Streptococcus iniae, a una concentración de 1 x10 ^9,3 [UFC/ml]

La figura N° 2 corresponde al análisis de eficacia de la vacuna bivalente contra Streptococcus iniae y Streptococcus agalactiae. Vacuna monovalente de Streptococcus agalactiae, a una concentración de 1 ,36x10 ⁸ [UFC/ml]; Vacuna bivalente con Streptococcus agalactiae y Streptococcus iniae, a una concentración de 1 x10 ⁹ ’ ³ [UFC/ml]

La figura N° 3 corresponde a los resultados obtenidos al realizar el test bioquímico API® 20 Strep. en cepas aisladas de Streptococcus iniae. Para este ensayo se analizaron veinte y una cepas aisladas de Streptococcus iniae, y se midió la actividad enzimática y fermentación de azucares de cada una de las cepas aisladas. ESC: Esculina, ADH: L-arginina, MAN: D-manitol, RIB: D- ribosa, TRE: D-trealosa, b-HEM: b-hemolitico, AMD: almidón, GLIG: glicógeno. La figura N° 4 corresponde a los resultados obtenidos al realizar el test bioquímico de API® 20 Strep. en cepas aisladas de Streptococcus agalactiae. Para este ensayo se analizaron tres cepas aisladas de Streptococcus agalactiae, donde se midió la actividad enzimática y fermentación de azucares de cada una de las cepas aisladas. ESC: Esculina, ADH: L-arginina, MAN: D-manitol, RIB: D- ribosa, TRE: D-trealosa, b-HEM: b-hemolitico, AMD: almidón, GLIG: glicógeno.

La figura N° 5 corresponde a la curva de crecimiento de tres cepas aisladas de Streptococcus agalactiae (M1 , M2, M3). Estas cepas crecieron en un medio de cultivo de infusión cerebro-corazón (BHI) y extracto de levadura.

La figura N° 6 corresponde a una microscopía óptica (1000X). Las cepas crecieron en un medio de cultivo de infusión cerebro-corazón (BHI) y extracto de levadura. M1 , M2 y M3 corresponden a cepas aisladas de Streptococcus agalactiae.

La figura N° 7 corresponde a la determinación de la expresión de factores de virulencia, mediante la amplificación por qPCR de los genes fbsA, hylb, sodA, y lytr, cuyas funciones genéticas se refieren a la patogenicidad, invasión y adhesión celular. M1 : Strep. Sp. (01 -01 -2015); M2: Strep. Sp. (07-01 -2015); M3: Strep. Sp. (15-08-2014), corresponden a cepas aisladas de Streptococcus agalactiae. FBSA:

Receptor FbsA de fibrinógeno; SODA: Superóxido Dismutasa; LYTR: Regulador de respuesta de autolisina; HYLBA: Hialuronato Liasa; Control: GYR (Subunidad A de enzima girasa). La figura N° 8 corresponde a un Test de eficacia, donde se realizó un desafío para las cepas de Streptococcus iniae, y se evaluó la mortalidad acumulada. Todas las vacunas protegieron de buena forma (incluso las vacunas monovalentes de Streptococcus agalactiae). PBS; VAC1 : Combinada 1 , +; VAC2: Mono, aga +++; VAC3: Mono aga, +; VAC4: Combinada, +++; VAC5: Competidor. La figura N° 9 corresponde a un Test de eficacia, donde se realizó un desafío para cepa Streptococcus agalactiae. No se observaron mortalidades usando el desafío Streptococcus agalactiae. Resultado ELISA. PBS; VAC1 : Combinado, +; VAC2: Mono, aga +++; VAC3: Mono aga, +; VAC4: combinado, +++; VAC5: competidor.

La figura N° 10 corresponde al análisis de rechazo de los peces frente a la aplicación de la vacuna bivalente contra Streptococcus iniae y Streptococcus agalactiae. La figura N° 1 1 corresponde a la vigilancia de la vacuna bivalente contra Streptococcus iniae y Streptococcus agalactiae (Formulación 107). Las muestras fueron analizadas por técnicas de qPCR, histología y técnicas de impresión de órganos. La figura N° 12 corresponde a la vigilancia de la vacuna bivalente contra Streptococcus iniae y Streptococcus agalactiae (Formulación 108). Las muestras fueron analizadas por técnicas de qPCR, histología y técnicas de impresión de órganos. La figura N° 13 corresponde a la evaluación de la respuesta de la vacuna bivalente contra Streptococcus iniae y Streptococcus agalactiae (Formulación 108) en peces vacunados. La detección de la presencia de anticuerpos contra Streptococus iniae , se realizó mediante ELISA. La figura N° 14 corresponde a la evaluación de la respuesta de anticuerpos a la bivalente contra Streptococcus iniae y Streptococcus agalactiae (Formulación 108) en peces vacunados. La detección de la presencia de anticuerpos contra Streptococus agalactiae, se realizó mediante ELISA.