[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Wirkstoff zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung einer Coronavirus- Infektion und/oder einer durch diese Infektion verursachten Erkrankung, eine diesen Wrkstoff enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung sowie ein Verfahren zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung einer Coronavirus-Infektion und/oder einer durch diese Infektion verursachten Erkrankung.

GEBIET DER ERFINDUNG

[0002] Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der molekularen Medizin, insbesondere den Bereich der antiviralen Substanzen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

[0003] Die Coronaviridae, umgangssprachlich auch Coronaviren genannt, sind eine Virusfamilie innerhalb der Ordnung Nidovirales. Ihre Vertreter verursachen bei verschiedenen Wrbel- tieren wie Säugetieren, Vögeln und Fischen sehr unterschiedliche Erkrankungen. Die ersten Coronaviren wurden bereits Mitte der 1960er Jahre beschrieben. Coronaviren sind genetisch hochvariabel. Einzelne Arten aus der Familie der Coronaviridae können durch Überwindung der Artenbarriere auch mehrere Arten von Wirten infizieren. Durch die Über windung der Artenbarriere sind beim Menschen unter anderem Infektionen mit dem SARS-assoziierten Coronavirus (SARS-CoV, gelegentlich auch als SARS-CoV-1 bezeich net) - dem Erreger der SARS-Pandemie 2002/2003 - sowie mit dem 2012 neu aufgetre tenen Middle East respiratory syndrome Coronavirus (MERS-CoV) entstanden.

[0004] Die von der chinesischen Stadt Wuhan ausgegangene COVID-19-Pandemie wird auf ein bis dahin unbekanntes Coronavirus zurückgeführt, das den Namen SARS-CoV-2 erhielt. Das Virus verursacht die Viruserkrankung COVID-19 (für corona virus disease 2019) und war Auslöser der COVID-19-Pandemie, die von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) am 30. Januar 2020 als "gesundheitliche Notlage von internationaler Tragweite" und am 11. März 2020 als Pandemie eingestuft wurde. Die Krankheitsverläufe sind unspezifisch, vielfältig und variieren stark. Neben symptomlosen Infektionen wurden überwiegend milde bis moderate Verläufe beobachtet, jedoch auch schwere mit beidseitigen Lungenentzün dungen bis hin zu Lungenversagen und Tod.

[0005] Derzeit steht keine spezifische Behandlung von COVID-19 zur Verfügung, allenfalls können Symptome gelindert werden. Diskutiert werden einige bereits existierende Virosta tika, die zum Beispiel gegen MERS-CoV und HIV eingesetzt werden. Dazu gehören Proteasehemmer wie Indinavir, Saquinavir, Lopinavir/Ritonavir und Interferon-beta sowie der RNA-Polymerasehemmer Remdesivir.

[0006] Mit Stand 15. Februar 2020 befanden sich in China Remdesivir, Favipiravir und Chloroquin, ein Wirkstoff gegen Malaria, in der Erprobung am Menschen. Am 20. März 2020 startete die WHO die Studie SOLIDARITY, in deren Rahmen Remdesivir, Chloro quin beziehungsweise Hydroxychloroquin, Lopinavir/Ritonavir sowie Lopinavir/Ritonavir mit Interferon-beta an tausenden Patienten weltweit evaluiert werden sollen.

[0007] Die bislang gewonnenen Daten konnten keine überzeugende Wrksamkeit der getesteten Verbindungen belegen. Aus diesem Grunde wird intensiv nach neuen Wrkstoffen gegen eine Coronavirus-Infektion, insbesondere eine solche mit SARS-CoV-2 (COVID-19) gesucht; siehe auch Gordon et al. (2020), A SARS-CoV-2-Human Protein-Protein Interac tion Map Reveals Drug Targets and Potential Drug-Repurposing; bioRxiv, preprint doi.org/10.1101/2020.03.22.002386. Vielversprechende Kandidaten wurden bislang nicht gefunden.

[0008] Vor diesem Hintergrund liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen Wirkstoff bereit zu stellen, der die Nachteile aus dem Stand der Technik reduziert, vorzugsweise vermei det, Insbesondere soll ein Wirkstoff bereitgestellt werden, der vorzugsweise auch in nied rigen Konzentrationen einer Infektion mit Coronaviren entgegen wirken kann und somit zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Coronavi rus-Infektion und/oder einer durch diese Infektion verursachten Erkrankung geeignet ist.

[0009] Die vorliegende Erfindung befriedigt diese und andere Bedürfnisse.

ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG

[0010] Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines Inhibitors des Bromodomain-enthalten- den Proteins (BRD) zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Coronavirus-Infektion und/oder einer durch diese Infektion verursachten Erkrankung gelöst.

[0011] Erfindungsgemäß umfassen "Coronaviren" sämtliche Spezies, die der Virusfamilie Coro- naviridae angehören, insbesondere SARS-CoV-2 (Sars-CoV-2, severe acute respiratory syndrome Coronavirus 2, "Schweres akutes Atemwegssyndrom Coronavirus 2“).

[0012] Erfindungsgemäß wird unter "Behandlung" einer Infektion bzw. Erkrankung insbesondere eine therapeutische Intervention mit der Zielsetzung einer positiven Beeinflussung des Gesamtgesundheitszustandes des behandelten Lebewesens, der durch die Infektion und/oder Erkrankung bestimmt ist, verstanden. In Ausführungsformen der Erfindung um fasst die Behandlung die Linderung und/oder Aufhebung von Krankheitssymptomen, die Reduzierung der Viruslast, die Eliminierung des Virus und/oder die Heilung der Erkran kung. [0013] Erfindungsgemäß wird unter "Prophylaxe" einer Infektion bzw. Erkrankung insbesondere eine Maßnahme verstanden, die dazu dient, einer Beeinträchtigung des Gesamtgesund heitszustandes des behandelten Lebewesens, der durch die Infektion und/oder Erkran kung bestimmt ist, entgegen zu wirken. In Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Prophylaxe die Verhinderung einer Erkrankung.

[0014] "Bromodomain" oder Bromodomäne ist eine Proteindomäne mit ungefähr 110 Aminosäuren, die acetylierte Lysinreste erkennt, wie jene an den N-terminalen Schwän zen von Histonen. Bromodomänen sind als "Leser" der Lysinacetylierung dafür verant wortlich, das von acetylierten Lysinresten übertragene Signal zu transduzieren und in verschiedene normale oder abnormale Phänotypen umzuwandeln. "Bromodomain-enthal- tende Proteine" (BRD) können eine Vielzahl von biologische Funktionen ausüben, die von Histon-Acetyltransferase-Aktivität und Chromatin-Remodelling bis hin zu Transkriptions vermittlung und Co-Aktivierung reichen. Von den 43 im Jahr 2015 bekannten BRD wiesen 11 zwei Bromodomänen und ein Protein 6 Bromodomänen auf. Die sogenannte BET-Fa- milie (Bromodomäne und extraterminale Domäne), eine Untergruppe der Bromodomain- Familie, beinhaltet bspw. die Mitglieder BRD2, BRD3, BRD4 und BRDT. Herstellung, biochemische Analyse und Strukturbestimmung der Bromodomänen-enthaltenden Proteine wurden ausführlich beschrieben Ren et al. (2016), Preparation, Biochemical Analysis, and Structure Determination of the Bromodomain, an Acetyl-Lysine Binding Domain, Methods in Enzymology 573: 321-43. Erfindungsgemäß sind sämtliche Bromo- domain-enthaltenden Proteine erfasst.

[0015] Erfindungsgemäß wird unter einem "Inhibitor" des BRD, der synonym auch als BRD- Inhibitor bezeichnet wird, ein Agens verstanden, das zu einer selektiven und spezifischen Hemmung von BRD führt. BRD-Inhibitoren sind bspw. beschrieben in Bechter und Schöff- ski (2020), Make your best BET the emerging role of BET inhibitor treatment in malignant tumors, Pharmacology & Therapeutics 208:107479, dort unter der synonymen Bezeich nung BET-Inhibitoren jedoch ausschließlich hinsichtlich ihrer Anti-Tumor-Aktivität.

[0016] Erfindungsgemäß kann die Hemmung durch Verminderung der Aktivität, Funktionalität, Expression oder anderen Phänomenen erfolgen, die zu einer Inhibierung von BRD führen. Das Agens kann sich in jeder denkbaren stofflichen Form darstellen, wie eines kleinen Moleküls, eines Peptids, eines Antikörpers, eines Nucleinsäuremoleküls, etc.

[0017] Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.

[0018] Die Erfinder konnten anhand von zwei Modellverbindungen überraschenderweise experi mentell zeigen, dass BRD-Inhibitoren nicht nur den durch das Virus verursachten zytopa- thischen Effekt verhindern sondern auch die Viruslast und die Anzahl von virusinfizierten Zellen verringern. Diese Effekte zeigen sich bereits bei sehr niedrigen Konzentrationen, die in Nanomolarbereich liegen. Nach einer Ausführungsform der Erfindung wird deshalb der BRD-Inhibitor in einer Konzentration eingesetzt, die auf zellulärer Ebene (bspw. in menschlichen Zellen des Lungenepithels) im Bereich von < 1mM, vorzugsweise < 0,5 mM, weiter vorzugsweise < 0,4 pM, weiter vorzugsweise 0,3 pM, weiter vorzugsweise 0,2 pM, liegt.

[0019] Nach einer Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Infektion und Erkran kung um eine Infektion mit einem SARS-assoziierten Coronavirus (SARS-CoV) und um eine durch diese Infektion verursachte Erkrankung, vorzugsweise um eine SARS-CoV-2- Infektion und/oder um COVID-19.

[0020] Mit dieser Maßnahme wird auf vorteilhafte Art und Weise eine Wirksubstanz bereitgestellt, die nach Erkenntnissen der Erfinder den derzeit im Test befindlichen und auch bereits z.T. klinisch getesteten Substanzen überlegen ist. Damit wird dem derzeit dringenden Bedarf an Wirkstoffen zur Bekämpfung von COVID-19 auf vorteilhafte Art und Weise begegnet.

[0021] Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Inhibitor um einen Inhibitor des Bromodomain-enthaltenden Proteins 2 (BRD2).

[0022] In einer noch weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Inhibitor um einen Inhibi tor des Bromodomain-enthaltenden Proteins 4 (BRD4). [0023] Diese Maßnahmen haben den Vorteil, dass Zielstrukturen gehemmt werden, die nach Erkenntnissen der Erfinder für die Interaktion des Virus mit dem infizierten Wirt und damit für die Pathogenität von besonderer Wchtigkeit sind. Damit mit auf vorteilhafte Art und Weise ein besonders wirksamer Inhibitor bereitgestellt. Dabei kann es sich erfindungsge mäß bei einem BRD2-lnhibitor und einem BRD4-lnhibitor um zwei Substanzen handeln. Alternativ kann es sich auch um eine Substanz handelt, die beide Zielstrukturen hemmt und bspw. als BRD2/4-lnhibitor bezeichnet wird.

[0024] Das "BRD4"-Protein wird beim Menschen von dem BRD4- Gen codiert. Es weist zwei Bomodomänen auf, die als BD1 und BD2 bezeichnet werden. Es ist homolog zum Mausprotein MCAP, das während der Mitose mit Chromosomen assoziiert, und homolog zum humanen BRD2 (RING3) -Protein, einer Serin/Threonin-Kinase. Jedes dieser Protei ne enthält zwei Bromodomänen, ein konserviertes Sequenzmotiv, das am Chromatin-Tar- geting beteiligt sein kann. BRD4 wird häufig für die Expression von Myc und anderen "Tumor-treibenden" Onkogenen bei hämatologischen Krebsarten benötigt, einschließlich dem multiplem Myelom, akuter myeloischer Leukämie und akuter lymphoblastischer Leukämie.

[0025] Das "BRD2"-Protein wird beim Menschen von dem BRD2- Gen codiert. Frühe Beschreibungen zeigten, dass das BRD2-Genprodukt eine mitogenaktivierte Kinase ist, die sich im Kern befindet. Das Gen ist auf die Klasse-Il-Region des Haupthistokompatibili- tätskomplexes (MHC) auf Chromosom 6p21.3 abgebildet, aber ein Sequenzvergleich legt nahe, dass das Protein nicht an der Immunantwort beteiligt ist. Die Homologie zum weiblichen sterilen Homöotikum des Drosophila-Gens legt nahe, dass dieses menschliche Gen Teil eines Signaltransduktionsweges sein könnte, der an der Wachstumskontrolle beteiligt ist. BRD2 ist in die Krebsentstehung und in Formen der Fettleibigkeit involviert.

[0026] Als besonders vorteilhaft bei der Erfindung hat sich herausgestellt, dass BRD2- und/oder BRD4-lnhibitoren selbst in einer besonders niedrigen Konzentration im Nanomolarbereich noch Wirksamkeit zeigen, wohingegen bei Wrksoffen wie Chloroquin keinerlei Effekt beobachtet werden. Dies konnten die Erfinder beispielhaft für zwei niedermolekulare Verbindungen in einem Zellkulturexperiment nachweisen. [0027] Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Inhibitor um eine niedermolekulare Verbindung.

[0028] Als niedermolekulare Verbindung (englisch small molecule, dt. "kleines Molekül“) wird erfindungsgemäß eine Klasse von Stoffen mit niedriger Molekülmasse bezeichnet. Sie bilden die Gegengruppe zu größeren, hochmolekularen Stoffen, z. B. langkettigen Poly meren. Sie umfasst Wirkstoffe, deren Molekülmasse etwa 800 g-mol ^-1 nicht übersteigt. Durch ihre geringe Größe sind niedermolekulare Verbindungen teilweise in der Lage, in Zellen einzudringen und dort ihre Wrkung zu entfalten.

[0029] Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Inhibitor um GSK2820151 (IBET151).

[0030] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein nach Erkenntnissen der Erfinder besonders wirksamer Inhibitor bereitgestellt wird. Dieser befindet ich bereits in klinischer Erprobung als Anti-Tumormittel (Trail# NCT02630251) und steht deshalb rasch zur Verfügung. Er wird derzeit von dem Unternehmen GlaxoSmithKline hergestellt. Er ist beschrieben in Gadgeel et al. (2017), Abstract CT104: A first-in-human phase I dose escalation study of BET inhibitor GSK2820151 in patients with advanced or recurrent solid tumors cancers, Cancer Research 77, CT104, sowie in Bechter und Schöffski (a.a.O.).

[0031] Nach einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Inhibitor um R06870810/TEN-010 (CPI203).

[0032] Auch diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein nach Erkenntnissen der Erfinder besonders wirksamer Inhibitor bereitgestellt wird. Dieser befindet ich bereits in klinischer Erprobung als Anti-Tumormittel (Trail# NCT01987362) und steht deshalb rasch zur Verfügung. Er wird derzeit von dem Unternehmen Hoffmann-La Roche hergestellt. Er ist beschrieben in Shapiro et al. (2015), Abstract A49: Clinically efficacy of the BET bromod- omain inhibitor TEN-010 in an open-label substudy with patients with documented NUT- midline carcinoma (NMC), Molecular Cancer Therapeutics 14 (12 Supplement 2), A49, sowie in Bechter und Schöffski (a.a.O.). [0033] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zu sammensetzung zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Coronavirus-Infektion und/oder einer durch diese Infektion verursachten Erkrankung, die den erfindungsgemä ßen Inhibitor sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.

[0034] Die Merkmale, Eigenschaften, Vorteile und Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Inhibitors gelten für die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung gleicher maßen.

[0035] Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Sie umfassen bspw. Bindemittel, Sprengmittel, Füllmittel, Gleitmittel sowie Puffer, Salze und sonstige zur Formulierung von Arzneimitteln geeignete Substanzen; vgl. Rowe et al. (2012), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 7 ^th Edition Pharmaceutical Press; oder Bauer et al. (2017), Lehrbuch der pharmazeutischen Technologie, 10. Auflage, Wissen schaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart mbH. Der Inhalt der vorliegenden Publikationen ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.

[0036] Nach einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung der pharmazeutischen Zusammensetzung liegt der Inhibitor pro Dosiereinheit in einer Konzentration vor, die nach Verabreichung in ein Lebewesen zu einer Konzentration führt, die der Coronavirus-Infektion und/oder einer durch diese Infektion verursachten Erkrankung entgegenwirkt.

[0037] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die pharmazeutische Zusammensetzung das

Optimum an Wrkstoffmenge enthält, die zur Erreichung eines therapeutischen und/oder prophylaktischen Effekts notwendig ist. Zur genauen Einstellung dieser Konzentration stehen dem Fachmann eine Vielzahl von Testsystemen zur Verfügung, über die sich, in Abhängigkeit des zu behandelnden Lebewesens, insbesondere des Alters, Gewichts, etwaiger Vorerkrankungen, individuell die gesuchte Konzentration ermitteln lässt.

[0038] Nach einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung der pharmazeutischen Zusammensetzung liegt der Inhibitor pro Dosiereinheit in einer Konzentration vor, die nach Verabreichung in ein Lebewesen zu einer Konzentration in den Coronavirus-infizierten Zellen, vorzugsweise den Lungenepithelzellen führt, die bei ca. < 10 mM, vorzugsweise bei ca. < 1 pM, weiter vorzugsweise bei ca. < 500 nM, weiter vorzugsweise bei ca. < 400 nM, weiter vorzugswei se bei ca. < 300 nM liegt.

[0039] Mit dieser Maßnahme wird auf vorteilhafte Art und Weise der Erkenntnis der Erfinder Rechnung getragen, dass der BRD-Inhibitor bereits in sehr niedrigen Konzentrationen prophylaktische bzw. therapeutische Wirkung bei einer Coronavirus-Infektion zeigt. Ne benwirkungen lassen sich dadurch reduzieren, ggf. sogar vermeiden. Auch trägt diese Maßnahme zur kostengünstigen Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung bei.

[0040] Nach einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusam mensetzung weist diese neben dem erfindungsgemäßen Inhibitor einen weiteren Wirk stoff, vorzugsweise einen weiteren antiviralen Wirkstoff auf.

[0041] Obgleich der erfindungsgemäße Inhibitor als alleiniger Wirkstoff vorliegen kann, hat diese Maßnahme den Vorteil, dass additive und ggf. synergistische Effekte zu einer Verstärkung des prophylaktischen und therapeutischen Erfolgs führen können.

[0042] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur prophylakti schen und/oder therapeutischen Behandlung einer Coronavirus-Infektion und/oder einer durch diese Infektion verursachten Erkrankung, gekennzeichnet durch die Verabreichung des erfindungsgemäßen Inhibitors und/oder der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Lebewesen, vorzugsweise einen Menschen.

[0043] Die Merkmale, Eigenschaften, Vorteile und Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Inhibitors und der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung gelten für das erfindungsgemäße Verfahren gleichermaßen.

[0044] Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläutern den Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in ande- ren Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorlie genden Erfindung zu verlassen.

AUSFÜHRUNGSBEISPIELE

[0045] Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Merkmale, Eigenschaften und Vorteile der Erfindung ergeben. Die Ausführungsbeispiele sind dabei nicht einschränkend.

[0046] Es versteht sich außerdem, dass einzelne Merkmale, die in den Ausführungsbeispielen offenbart sind, nicht nur im Kontext der jeweiligen spezifischen Ausführungsform sondern in einer Allgemeingültigkeit offenbart sind und für sich genommenen einen eigenen Beitrag zur Erfindung liefern. Der Fachmann kann deshalb diese Merkmale frei mit anderen Merkmalen der Erfindung kombinieren.

[0047] In den Ausführungsbeispielen wir Bezug auf die beiliegenden Figuren genommen. Dort ist Folgendes dargestellt:

Fig. 1: Hellfeld-Mikroskopieaufnahmen von Calu3-Zellen, die unbehandelt (mock) geblie ben sind, mit SARS-CoV-2 infiziert (SARS-CoV-2) und zusätzlich zur SARS-CoV- 2-lnfektion mit 10 mM und 1 pM des BRD2/4-lnhibitors BET151 behandelt wurden.

Fig. 2: Hellfeld-Mikroskopieaufnahmen von Calu3-Zellen, die unbehandelt (mock) geblie ben sind, mit SARS-CoV-2 infiziert (SARS-CoV-2) und zusätzlich zur SARS-CoV- 2-lnfektion mit 10 pM und 1 pM des BRD2/4-lnhibitors CPI203 behandelt wurden.

Fig. 3: Hellfeld-Mikroskopieaufnahmen von Calu3-Zellen, die unbehandelt (mock) geblie ben sind, mit SARS-CoV-2 infiziert (SARS-CoV-2) und zusätzlich zur SARS-CoV- 2-lnfektion mit 10 pM und 1 pM des CDK-Inhibitors RCB behandelt wurden. Fig. 4: Hellfeld-Mikroskopieaufnahmen von Calu3-Zellen, die unbehandelt (mock) geblie ben sind, mit SARS-CoV-2 infiziert (SARS-CoV-2) und zusätzlich zur SARS-CoV- 2-lnfektion mit 10 mM und 1 pM des CDK-Inhibitors ACB behandelt wurden.

Fig. 5: Hellfeld-Mikroskopieaufnahmen von Calu3-Zellen, die unbehandelt (mock) geblie ben sind, mit SARS-CoV-2 infiziert (SARS-CoV-2) und zusätzlich zur SARS-CoV- 2-lnfektion mit 10 pM und 1 pM Hydroxychloroquin (HChl) behandelt wurden.

Fig. 6: Hellfeld-Mikroskopieaufnahmen von Calu3-Zellen, die unbehandelt (mock) geblie ben sind, mit SARS-CoV-2 infiziert (inf) und zusätzlich zur SARS-CoV-2-lnfektion mit 10 pM, 5 pM und 2,5 pM von I BET 151, CPI203 und HChl behandelt wurden.

Fig. 7: Hellfeld-Mikroskopieaufnahmen von Calu3-Zellen, die unbehandelt (mock) geblie ben sind, mit SARS-CoV-2 infiziert (inf) und zusätzlich zur SARS-CoV-2-lnfektion mit 1,25 pM, 0,612 pM und 0,306 pM von IBET151, CPI203 und HChl behandelt wurden.

Fig. 8 Auswirkungen von BRD2/4-lnhibitoren auf die SARS-CoV-2-lnfektion. Calu3-Zellen wurden mit SARS-CoV-2 infiziert und mit IBET151, CPI203 oder Hydroxychloro quin (HChl) behandelt. 24 hpi (Stunden nach der Infektion) wurden die Zellen mit 80% Aceton fixiert und mit DAPI und Immunfluoreszenz gegen SARS-CoV-2 ge färbt. Die Anzahl der Zellen wurde mit einem Cytation3-Multiplikationsbildgeber analysiert. (A) Repräsentative Aufnahmen, (B) Quantifizierung der Gesamtzellzahl (DAPI +), infizierter Zellen (IF +) und der Infektionsrate (IF + / DAPI + -Zellen), (C) Westernblot-Analyse von Calu3-Zelllysaten unter Verwendung von Serum eines rekonvaleszenten COVID-19-Patienten zum Nachweis von SARS-CoV-2-Protei- nen.

Fig. 9 Interaktion der BRD2/4-lnhibitoren mit den zellulären SARS-CoV-2-Signalwegen. Calu3-Zellen wurden mit SARS-CoV-2 infiziert und mit 2,5 pM IBET151 und CPI203 behandelt. 24 hpi wurden die Zellen lysiert und die Pellets wurden Digi- West-Analysen unterzogen (n = 2, mock; n = 6, inf. ; n = 2, IBET151; n = 1, CPI203).

Fig.10: Schaubild, das die Wirkung von BRD2/4-lnhibitoren auf die Gesamtzahl bzw. das Überleben der Calu3-Zellen nach einer SARS-CoV-2-lnfektion illustriert.

1. Material

Testsubstanzen

BRD2/4-lnhibitor GSK2820151 (IBET151), GlaxoS ithKline

BRD2/4-lnhibitor R06870810/TEN-010 (CPI203), Hoffmann-La Roche CDK-Inhibitor Ribociclib (RCB)

CDK-Inhibitor Abemaciclib (ACB)

Hydroxychloroquin (HChl, HCQN)

2. Methodik

Etablierung eines SARS-CoV-2 Patientenisolat

[0048] -200 mI Rachenabstrich eines SARS-CoV2 positiv getesteten Patienten wurde mit 1 ml

DM EM aufgefüllt, steril filtriert (0,22 mM) und auf Caco2 Zellen kultiviert. 2 Tage später Abnahme des Überstands, Zellernte und Lysat für Westernblot generiert. Detektion der SARS-CoV-2-Proteine im Westernblot über Serum eines COVID-19 Rekonvaleszenten. Bestätigung SARS-CoV-2 über qRT-PCR Anayse des Überstandes. [0049] Restlicher Überstand auf neue Caco2 Zellen über 2-5 Tage kultiviert. Kontinuierliche Ernte des Überstandes als Virusstock. Aliquotierung und Lagerung bei -80°C.

Testung von Substanzen auf antivirale Aktivität

[0050] Calu3 (50.000 Zellen / Well) in 96-Well-Platte aussäen. 24h später Mediumwechsel zu

170 mI DMEM+5%FCS (Infektionsmedium) pro Well. Erstellen von Inhibitorverdünnungen so dass nach Zugabe von 20 mI Verdünnung die gewünschte Endkonzentration erreicht wird. Dann Zugabe von 10 - 5 mI Virusstock (1:20, MOI:0,4 - 1:40, MOI:0,2) zum Gesamtvolumen von 200 mI. Inkubation für weitere 24-48 h. Nach jeweils 24 und 48 h Aufnahme von Durchlichtbildern über automatische Mikroskopie (4-fache Vergrößerung) mittels Multiplate-Reader. Evaluierung des zytopathischen Effekts der Virusinfektion über visuelle Beurteilung des Zellrasens.

Datenreihe 1:

Calu3 50.000 Zellen/ Inf 9/4/20 Vertiefung

Wir säten die Zellen in 170 mI, 1 Tag später Hinzugegeben von 10 pl der Virus- Stammlösung (Tü1) und 20 mI oder vorverdünnte Komponenten zu jeder Vertiefung

Nix IBET151 CPL203 HChl IBET151 CPL203 HChl Nix

PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS Mock 10 10 10 10 10 10 Mock PBS PBS Mock 5 5 5 5 5 5 Mock PBS PBS Mock 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Mock PBS PBS inf 1 ,25 1 ,25 1 ,25 1 ,25 1 ,25 1 ,25 inf PBS PBS inf 0,625 0,625 0,625 0,625 0,625 0,625 inf PBS PBS inf 0,3125 0,3125 0,3125 0,3125 0,3125 0,3125 inf PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS beobachten der Zellen, bei 1 dpi oder potenziell 2 dpi ernte SN (in 96- Vertiefung-Platte). Von den Zellen Aufnahmen und Lysate präparieren für Zelltiter glo (oder MTT oder SRB) Speicher die SNs.

Tabelle 1: Datenreihe 1 Datenreihe 2:

Calu3 50.000 Zellen/ Inf 9/4/20 Vertiefung

Wir säten die Zellen in 170 mI, 1 Tag später Hinzugegeben von 10 pl der Virus- Stammlösung (Tü1) und 20 mI oder vorverdünnte Komponenten zu jeder Vertiefung

Nix IBET151 CPL203 HChl IBET151 CPL203 HChl Nix

PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS Mock 10 10 10 10 10 10 Mock PBS PBS Mock 5 5 5 5 5 5 Mock PBS PBS Mock 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Mock PBS PBS inf 1 ,25 1,25 1,25 1 ,25 1 ,25 1,25 inf PBS PBS inf 0,625 0,625 0,625 0,625 0,625 0,625 inf PBS PBS inf 0,3125 0,3125 0,3125 0,3125 0,3125 0,3125 inf PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS beobachten der Zellen, bei 1 dpi oder potenziell 2 dpi ernte SN (in 96-Vertiefung-Platte). Von den Zellen Aufnahmen und Lysate präparieren für Zelltiter glo (oder MTT oder SRB) Speicher die SNs.

Tabelle 2: Datenreihe 2

3- Ergebnis

[0051] In den Figuren ist unter "mock" der Kontrollansatz dargestellt. Die eingesetzten

Lungenepithelzellen Calu3 zeigen in der Zellkultur unter dem Mikroskop ein flächiges Gebilde. Nach Infektion der Zellen mit SARS-CoV-2 (Aufnahmen überschrieben mit "SARS-CoV-2" oder "inf') zeigt sich ein deutlicher zytopathischer Effekt, der in der morphologischen Veränderung der Zellformationen in Form von "Verklumpungen" sichtbar wird, siehe z.B. Fig. 1-5, zweite Spalte.

Datenreihe 1 :

[0052] Die BRD2/4 Inhibitoren IBET151 und CPI203 zeigen bei Konzentrationen von 10 und 1 mM eine deutliche Reduktion des zytopathischen Effekts, verursacht durch die Virusinfektion (Vergleich zu mock/nicht infiziert und SARS-CoV-2 infiziert); siehe Fig. 1 und 2, 3. und 4. Spalte. Im Gegensatz dazu zeigen gleiche Konzentrationen von Hyrdoxychloroquin

(HChl, Fig. 5), sowie der klinisch zugelassenen CDK-Inhibitoren Ribociclib (RGB; Fig. 3) und Abemaciclib (AGB; Fig. 4) keine hemmenden Effekte. 13

[0049] Restlicher Überstand auf neue Caco2 Zellen über 2-5 Tage kultiviert. Kontinuierliche Ernte des Überstandes als Virusstock. Aliquotierung und Lagerung bei -80°C.

Testung von Substanzen auf antivirale Aktivität

[0050] Calu3 (50.000 Zellen / Well) in 96-Well-Platte aussäen. 24h später Mediumwechsel zu

170 pl DMEM+5%FCS (Infektionsmedium) pro Well. Erstellen von Inhibitorverdünnungen so dass nach Zugabe von 20 pl Verdünnung die gewünschte Endkonzentration erreicht wird. Dann Zugabe von 10 - 5 mI Virusstock (1:20, MOLO, 4 - 1:40, MOLO.2) zum Gesamt volumen von 200 mI. Inkubation für weitere 24-48 h. Nach jeweils 24 und 48 h Aufnahme von Durchlichtbildern über automatische Mikroskopie (4-fache Vergrößerung) mittels Mul- tiplate-Reader. Evaluierung des zytopathischen Effekts der Virusinfektion über visuelle Beurteilung des Zellrasens.

Datenreihe 1:

Tabelle 1: Datenreihe 1

14

Datenreihe 2

Tabelle 2: Datenreihe 2

3. Ergebnis

[0051] In den Figuren ist unter "mock" der Kontrollansatz dargestellt. Die eingesetzten Lungenepithelzellen Calu3 zeigen in der Zellkultur unter dem Mikroskop ein flächiges Gebilde. Nach Infektion der Zellen mit SARS-CoV-2 (Aufnahmen überschrieben mit "SARS-CoV-2" oder "inf") zeigt sich ein deutlicher zytopathischer Effekt, der in der mor phologischen Veränderung der Zellformationen in Form von "Verklumpungen" sichtbar wird, siehe z.B. Fig. 1-5, zweite Spalte.

Datenreihe 1:

[0052] Die BRD2/4 Inhibitoren IBET151 und CPI203 zeigen bei Konzentrationen von 10 und 1 mM eine deutliche Reduktion des zytopathischen Effekts, verursacht durch die Virusinfekti on (Vergleich zu mock/nicht infiziert und SARS-CoV-2 infiziert); siehe Fig. 1 und 2, 3. und 4. Spalte. Im Gegensatz dazu zeigen gleiche Konzentrationen von Hyrdoxychloroquin (HChl, Fig. 5), sowie der klinisch zugelassenen CDK-Inhibitoren Ribociclib (RCB; Fig. 3) und Abemaciclib (ACB; Fig. 4) keine hemmenden Effekte. 15

Datenreihe 2:

[0053] Bei einer Dosis-abhängigen Reduktion der Konzentrationen von IBET151 und CPI203 von 10 mM - 0,3125 mM zeigen sich selbst bei niedrigsten Konzentrationen noch inhibierende Effekte auf den Virus-verursachten zytopathischen Effekt, anders als bei gleichen Kon zentration von Hydroxychloroquin (Fig. 6 und 7).

[0054] In weiteren Experimenten konnten die Erfinder zeigen, dass die BRD2/4-lnhibitor- Behandlung von Calu3-Zellen, die mit einer hohen Multiplizität der Infektion (MOI = 2) von SARS-CoV-2 infiziert sind, den virusinduzierten Zelltod vollständig blockiert, die Viruspro duktion jedoch nicht beeinträchtigt (Fig. 8). Bei Verwendung hoher MOIs konnten die Erfinder keine Verringerung der infizierten Zellen oder der Gesamtmenge an viralem Protein feststellen, obwohl die virusinduzierten zytopathischen Effekte vollständig blockiert waren. Bei einer Infektion mit niedrigeren MOIs war die Infektionsrate jedoch verringert (Fig. 8B). Dies legt nahe, dass BRD-Proteine keinen Einfluss auf den Viruseintritt und die Infektion oder die Produktion von Virusproteinen haben, aber die späten Schritte der Virusreplikation beeinflussen könnten. Diese Annahme ist mit einer möglichen Rolle des E-Proteins bei der Assemblierung und Freisetzung von Coronaviren vereinbar.

[0055] In weiteren Experimenten haben die Erfinder untersucht, inwiefern die BRD2/4-lnhibitoren in die zellulären Signalwege eingreifen, die von SARS-CoV-2 zur Induktion von zytopathi schen Effekten genutzt werden. Die Erfinder haben mehrere Kontrollen eingeschlossen, die wiederum bestätigen, dass die BRD2/4-lnhibitoren, wenn hohe MOIs zur Infektion verwendet werden, die virale Proteinproduktion nicht reduzieren, was durch die Menge des produzierten viralen Nucleocapsids belegt wird. Wie beobachtet blockieren BRD2/4- Inhibitoren die Phosphorylierung von Histon H3, unabhängig von der SARS-CoV-2-lnfekti- on. Bemerkenswerterweise scheint eine SARS-CoV-2-lnfektion eine apoptotische Signal kaskade zu induzieren, was durch die Induktion der Caspase-6/7-Spaltung und der AKT- Phosphorylierung deutlich wird. Alle diese Ereignisse werden spezifisch durch BRD2/4-ln- 16 hibitoren Inhibitoren blockiert, was das Fehlen von SARS-CoV-2-induziertem Zelltod bei der Behandlung mit den Verbindungen erklären kann (Fig. 9).

[0056] In der Fig. 10 ist die Wirkung der BRD2/4-lnhibitoren auf die Gesamtzahl bzw. das Überle ben der Calu3-Zellen nach einer SARS-CoV-2-lnfektion nochmals zusammenfassend il lustriert. Calu-3-Zellen wurden mit dem klinischen SARS-CoV-2-lsolat infiziert oder scheininfiziert (mock). Gleichzeitig wurden die Zellen mit den beiden BRD2/4-lnhibitoren IBET151 und CPI203 und Hydroxychloroquin (HCQN) als Referenzwirkstoff in den ange gebenen Konzentrationen behandelt. 48 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen mit 80% Aceton fixiert und die Kerne mit DAPI-Lösung (2 mg/ml) 10 Minuten bei RT gegenge färbt. Zur Quantifizierung wurde die Gesamtmenge an Zellen (DAPI +) durch automatisier te Mikroskopie analysiert. Die durchschnittliche Anzahl von Schein- und infizierten Zellen ist mit einer gepunkteten Linie angegeben. Es zeigt sich, dass in den durchgeführten Ex perimenten ab einer Konzentration der BRD2/4-lnhibitoren von ca. 20 nM positive Effekte auf die Gesamtzahl bzw. das Überleben der Calu3-Zellen nach einer SARS-CoV-2-lnfekti- on auftreten. Bei HQCN-behandelten Zellen ist dies nicht zu beobachten. Diese Beobach tung wurde von den Erfindern in weiteren Experimenten bestätigt (nicht gezeigt).

4. Fazit

[0057] Die Erfinder konnten anhand von zwei ausgewählten Beispielverbindungen zeigen, dass Inhibitoren des Bromodomain-enthaltenden Proteins (BRD) eine wirksame prophylakti sche und therapeutische Behandlung einer Coronavirus-Infektion und/oder einer durch diese Infektion verursachten Erkrankung ermöglicht und damit insbesondere im Hinblick auf eine SARS-CoV-2-lnfektion (COVID-19) eine vielversprechende pharmakologische Option darstellen.