L'invention a pour objet des analogues C-glycosidiques des alpha- galactosylcéramides ayant des activités immunostimulatrices et immunorégulatrices ainsi que des compositions pharmaceutiques contenant ces analogues notamment pour le traitement des maladies auto-immunes, des cancers et pour utilisation comme adjuvant dans des vaccins.

L'alpha-galactosylcéramide dénommé KRN 7000 est connu pour ses activités immunostimulatrices et anti-cancéreuses. Cette molécule comprend cependant une liaison anomérique C-O sensible à l'hydrolyse qui lui procure une faible durée d'action.

Afin d'obtenir des molécules plus stables in vivo, des analogues C-glycosidiques du KRN 7000 ont été préparés et testés pour leurs activités (Chen et al. (2004), Toba et al. (2005), Yang et al. (2004), Franck et al. (2006)). Les analogues C-glycosidiques des alpha-galactosylcéramides présentent un grand intérêt thérapeutique et il existe donc un besoin important concernant cette classe de molécules.

La présente invention concerne de nouveaux analogues C-glycosidiques des alpha- galactosylcéramides possédant une fonction ester, thionoester ou éther à la place de la fonction amide. Ces analogues C-glycosidiques des alpha-galactosylcéramides ont des propriétés immunorégulatrices et immunostimulatrices démontrées ex vivo et in vivo. En outre, ces molécules peuvent être synthétisées selon un procédé peu coûteux permettant d'accéder à de nombreux analogues portant différentes modifications structurelles.

L'invention a pour objet des composés de formule générale (I) :

dans laquelle

Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe choisi parmi -CO-R', -CS-R' et -CH ₂ - R' ; R ₂ représente un groupe choisi parmi -CO-R' ' , -CS-R' ' et -CH ₂ -R' ' ;

R' et R" représentent indépendamment un groupe choisi parmi les radicaux alkyle ou alkényle, linéaires ou ramifiés, comprenant 5 à 30 atomes de carbone, et de préférence 20 à 26 atomes de carbone, R-3 représente un groupe choisi parmi les radicaux alkyle ou alkényle, linéaires ou ramifiés, comprenant 4 à 15 atomes de carbone.

Dans la présente invention, R' et R" représentent de préférence indépendamment un groupe choisi parmi les radicaux alkyle, linéaires ou ramifiés, comprenant 5 à 30 atomes de carbone, et de préférence 20 à 26 atomes de carbone.

Dans la présente invention, R3 représente de préférence un groupe choisi parmi les radicaux alkyle, linéaires ou ramifiés, comprenant 4 à 15 atomes de carbone

Par alkyle, on entend en particulier selon la présente invention les radicaux alkyles linéraires ou ramifiés.

Par alkényle, on entend de préférence selon l'invention une chaîne hydrocarbonée insaturée, linéaire ou ramifiée, comprenant au moins une double liaison. De préférence, l' alkényle comporte une seule double liaison C=C.

De préférence, ces composés répondent à la formule générale (II) :

dans laquelle R ₂ et R3 sont tels que définis ci-dessus.

Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention se rapporte à des composés de formule générale (III) :

dans laquelle m est un nombre entier compris entre 4 et 29 et de préférence compris entre 19 et 25, n est un nombre entier compris entre 3 et 14. De préférence, m est égal à 21, 22, 23, 24 ou 25 et n est égal à 3, 4, 5, 9, 11, 12, 13 ou 14.

De façon particulièrement avantageuse, l'invention concerne un composé de formule (IV) :

L'invention se rapporte aux composés ci-dessus pour utilisation comme médicament.

L'invention a également pour objet ces composés pour le traitement des maladies auto-immunes, des cancers ou des maladies infectieuses.

L'invention concerne également ces composés pour utilisation comme adjuvant dans un vaccin.

L'invention a ainsi pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant un composé selon l'une des revendications précédentes et un véhicule pharmaceutique approprié.

L'invention se rapporte également à un procédé de préparation d'un composé de formule (I)

(I) dans lequel

Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe choisi parmi -CO-R', -CS-R' et -CH ₂ -R',

R ₂ représente un groupe choisi parmi -CO-R", -CS-R" et -CH ₂ -R",

R' et R" représentent indépendamment un groupe choisi parmi les radicaux alkyle ou alkényle, linéaires ou ramifiés, comprenant 5 à 30 atomes de carbone, et de préférence 20 à 26 atomes de carbone,

R3 représente un groupe choisi parmi les radicaux alkyle ou alkényle, linéaires ou ramifiés, comprenant 4 à 15 atomes de carbone, comprenant une étape de réaction d'un composé de formule (V) dans lequel

R ₄ représente un groupe protecteur choisi parmi TBDPS, TBDMS et TIPS, R5 représente un groupe protecteur choisi parmi PMB, benzyle et TBDMS ; avec un composé de formule (VI)

dans lequel R6 représente un groupe benzyle éventuellement substitué ; pour obtenir un composé de formule (VII)

puis l'obtention du composé de formule générale (I) à partir de ce composé (VII).

TBDPS désigne le tert-butyldiphenylsilyl, TIPS désigne le triisopropylsilyl, TBDMS désigne le te/t-butyldimethylsilyl, PMB désigne le paraméthoxybenzyle.

Le radical R6 représente un benzyle éventuellement substitué avec un groupe alkoxy comprenant 1 à 6 atomes de carbone. De préférence R6 est un groupe protecteur choisi parmi le benzyle et le PMB (paraméthoxybenzyle).

L'obtention de composés de formule générale (I) à partir des composés de formule (VII) s'effectue selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier.

Le composé de formule générale (VII) constitue le composé pivot à partir duquel une grande variété de composés de formule (I) peut être obtenue très facilement. L'invention a donc également pour objet un composé de formule générale (VII) tel que décrit ci-dessus.

L'invention se rapporte donc à des composés pour le traitement des maladies auto- immunes, des maladies infectieuses et des cancers. L'invention concerne aussi des méthodes de traitement thérapeutique des maladies auto-immunes, des maladies infectieuses et des cancers comprenant l'administration d'une quantité efficace d'un composé selon l'invention à un individu. L'invention concerne enfin l'utilisation des composés selon l'invention pour la fabrication de médicaments pour le traitement des maladies auto-immunes, des maladies infectieuses et des cancers. Par maladies auto-immunes, on entend des maladies dues à une hyperactivité du système immunitaire à l' encontre de tissus ou de substances qui sont normalement présents dans l'organisme. De préférence, l'invention se rapporte à des composés pour le traitement thérapeutique de maladies auto-immunes telles que le diabète de type I, les encéphalo myélites, les rhumatismes et les inflammations, les allergies, l'asthme, la sensibilité de contact et l'athérosclérose.

Dans un autre mode de réalisation, la présente invention a pour objet des composés pour le traitement des cancers. Par « cancer », on entend toutes les formations néoplasiques malignes, quelle qu'en soit la nature histologique. Il existe deux grandes catégories de tumeurs malignes : les carcinomes, d'origine épithéliale, et les sarcomes, d'origine conjonctive. Les tumeurs malignes sont formées de cellules atypiques, envahissantes ou disséminantes, caractérisées généralement par un pouvoir d'accroissement autonome, une délimitation imprécise, une capacité d'envahissement des tissus et vaisseaux voisins et une tendance à disséminer par la production de métastases. On citera notamment les cancers du sein, de la prostate, des poumons, de l'œsophage, de la peau, de la vessie, de l'estomac, du foie, de l'utérus, du côlon et du rectum.

L'invention se rapporte aussi à des composés pour le traitement des maladies infectieuses et en particulier pour les maladies infectieuses à Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumoniae, Plasmodium spp., Trypanosoma cruzi, Cryptococcus neoformans, le virus de l'hépatite B, le virus de l' encéphalo myocardie diabétogénique et le virus syncytium respiratoire.

Les composés selon la présente invention ont des propriétés immunorégulatrices et/ou immunostimulatrices. Ainsi, les composés selon la présente invention peuvent être utilisés comme adjuvant dans des vaccins. En vaccination, les adjuvants sont classiquement définis comme des substances capables de potentialiser ou de moduler la réponse immunitaire contre un ou plusieurs antigènes coadministrés.

L'invention concerne des compositions pharmaceutiques comprenant un composé tel que défini ci-dessus et un véhicule pharmaceutique approprié. Ces compositions peuvent être formulées pour l'administration aux mammifères, y compris l'homme. La posologie varie selon le traitement et selon l'affection en cause. Ces compositions sont réalisées de façon à pouvoir être administrées par la voie digestive ou parentérale. Dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, locale ou rectale, l'ingrédient actif peut être administré sous formes unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques, aux animaux ou aux êtres humains. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale et buccale, les formes d'administration sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intranasale ou intraoculaire et les formes d'administration rectale.

Lorsque l'on prépare une composition solide sous forme de comprimés, on mélange l'ingrédient actif principal avec un véhicule pharmaceutique tel que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique ou analogues. On peut enrober les comprimés de saccharose ou d'autres matières appropriées ou encore on peut les traiter de telle sorte qu'ils aient une activité prolongée ou retardée et qu'ils libèrent d'une façon continue une quantité prédéterminée de principe actif. On obtient une préparation en gélules en mélangeant l'ingrédient actif avec un diluant et en versant le mélange obtenu dans des gélules molles ou dures.

Une préparation sous forme de sirop ou d'élixir peut contenir l'ingrédient actif conjointement avec un édulcorant, un antiseptique, ainsi qu'un agent donnant du goût et un colorant approprié. Les poudres ou les granules dispersibles dans l'eau peuvent contenir l'ingrédient actif en mélange avec des agents de dispersion ou des agents mouillants, ou des agents de mise en suspension, de même qu'avec des correcteurs du goût ou des édulcorants.

Les composés selon l'invention peuvent être employés en thérapie seuls, ou en combinaison avec au moins un autre agent actif. La présente invention concerne donc également un produit comprenant un composé selon l'invention et un autre agent actif comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie, et en particulier dans le traitement des cancers.

Un autre objet de l'invention est une composition vaccinale comprenant un composé selon l'invention et au moins un antigène. L'antigène est typiquement choisi parmi les agents infectieux inactivés, les agents vivants atténués et les sous-unités d'agents infectieux ou les toxines inactivées. Les vaccins sont habituellement inoculés par injection, mais ils peuvent l'être par voie orale ou par spray nasal. Les composés selon l'invention peuvent être préparés selon les différents modes de préparation exposés ci-dessous et dans les exemples.

Les analogues C-glycosidiques sont synthétisés selon le procédé général décrit ci- dessous.

Une solution 1 mol/L de triméthylsilylacétylure de magnésium dans le THF est préparée par addition lente de bromure de méthylmagnésium (5 éq., 3 mol/L dans le THF) sur du triméthylsilylacétylène (5 éq.) à -20 ⁰ C. Après retour à la température ambiante, le milieu réactionnel est agité vigoureusement pendant lh30. La solution d'alcynure de magnésium (5 éq.) est ensuite ajoutée à - 78°C à l'aide d'une canule sur le dérivé du D- Erythrose A (1 éq.) en solution dans le THF (C = 0.4 mol/L). Après retour rapide à 0 ⁰ C, le milieu réactionnel est ensuite agité à 4°C pendant 12h. Après traitement, le produit désiré est purifié pour donner 1 (75 à 87%) sous forme d'une huile jaune.

Au composé 1 (1 éq.) dissous dans un solvant approprié (C = 0.35 mol/L) est ajoutée au goutte à goutte à 0 ⁰ C une solution du réactif protecteur choisi (RCl, 1.07 éq.) et d'une base (1.1 éq.) dans le même solvant (C = 4 mol/L). De la DMAP (0.09 éq.) est ajoutée et le milieu réactionnel est agité pendant 3h. Après traitement, le produit désiré 2 est isolé.

A une solution de la base (1.7 éq., C = 0.5 mol/L) dans un solvant approprié a été lentement ajoutée à 0 ⁰ C une solution de l'alcool 2 dissous dans le même solvant (C = 0.2 mol/L). De l'iodure de tétra-n-butylammonium (0.11 éq.) et de l'imidazole (0.11 éq.) sont rapidement ajoutés, et ensuite une solution du réactif protecteur choisi (R'Br, 1.07 éq.) dans le même solvant (1.5 éq., C = 0.5 mol/L) est lentement ajoutée. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 4h. Après traitement, le produit désiré B est isolé.

Composé Pivot C L'alcyne B, l'époxyaldéhyde (S. Guillarme, K. Plé and A. Haudrechy, J. Org. Chem., 2006, 71, 3, 1015 et A. Banchet, S. Guillarme, A. Haudrechy, Synlett, 2007, 9, 1467) et le bromure de lithium sont coévaporés trois fois avec du toluène et ensuite séchés sous vide. L'alcynure de lithium est préparé par addition de n-butyl-lithium (0.9 éq.) à -78°C sur une solution de l'alcyne B (C = 0.5 mol/L) dans un solvant approprié. Le milieu réactionnel est agité pendant lh30, laissant la température remonter à 0 ⁰ C. En parallèle, le dichlorure de zinc (1.9 éq.) est fondu sous vide et dissous dans le même solvant (C = 0.9 mol/L) à 0 ⁰ C. Après 20 min, l'alcynure de lithium est lentement ajouté à la solution de dichlorure de zinc. Le milieu réactionnel est concentré sous vide (C~0.9 mol/L) et agité pendant Ih à 0 ⁰ C. Ensuite une solution de l'époxyaldéhyde (0.29 éq.) dans le même solvant (C = 0.2 mol/L) est lentement ajoutée. Le milieu réactionnel est concentré sous vide (C~0.9 mol/L) et agité pendant 4h à 0-5 ⁰ C. Finalement le bromure de lithium (1 éq.) est ajouté et le milieu réactionnel est agité pendant 12h à température ambiante. Après traitement le produit C est isolé.

Le composé C (1 éq.), coévaporé plusieurs fois avec du toluène, en solution dans un solvant approprié (C = 0.1 mol/L), est ensuite lentement ajouté à 0 ⁰ C à une solution d'une base (2.3 éq.) dans le même solvant (C = 0.2 mol/L). Ensuite le réactif protecteur choisi (RiBr ou RiCl, 2.5 éq.) est lentement ajouté. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 3h. Après traitement, le produit désiré 3 est isolé.

Le composé 3 (1 éq.) est dissous dans un solvant approprié (C = 0.06 mol/L). Le réactif déprotecteur est ensuite ajouté et le mélange réactionnel est éventuellement chauffé. Après traitement, le produit désiré 4 est isolé.

A une solution de chlorure d'oxalyle (1.5 éq. C = 0.14 mol/L) dans un solvant approprié à -78°C, est additionnée une solution de diméthylsulfoxyde (3 éq.) dans le même solvant (C = 1.4 mol/L). Le mélange réactionnel est agité pendant 15 min après addition d'une solution de 4 (1 éq.) dans le même solvant (C = 0.1 mol/L). La température est gardée à -78°C pendant Ih. Ensuite la base choisie (5 éq.) est lentement ajoutée. La température est lentement augmentée jusqu'à température ambiante en environ lh30. Après lh30 de plus à température ambiante, puis traitement, le brut réactionnel est co- évaporé trois fois avec du toluène et utilisé pour l'étape de réaction de Wittig sans aucune purification supplémentaire.

A une solution de sel de Wittig approprié (4 éq., R"-CH ₂ -PPh ₃ ⁺ X ^" , C = 0.1 mol/L) dans un solvant approprié à -40 ⁰ C est lentement ajoutée du n-butyl- lithium (3.9 éq.) en solution dans l'hexane. La solution rouge sombre est agitée pendant Ih, permettant à la température de remonter à 0 ⁰ C. L'aldéhyde (venant de l'oxydation de Swern) dissous dans le même solvant (C = 0.15 mol/L) est ajouté au goutte à goutte. La solution orange est agitée pendant Ih à température ambiante. Après traitement, le produit désiré 5 est isolé.

A une solution de composé 5 (C = 2.2 mol/L) dans un solvant approprié, est ajoutée de la tosylhydrazine (100 éq.) et le milieu réactionnel est agité vigoureusement au reflux. Une solution d'acétate de sodium (200 éq., C = 4.4 mol/L) est additionnée en 6h. Après traitement, le produit désiré D est isolé.

Au composé saturé D (1 éq.), est ajouté le réactif déprotecteur (1.5 éq.) dissous dans un solvant approprié (C = 0.1 mol/L). Après agitation pendant 40 min à température ambiante, puis traitement, le produit désiré 6 est isolé.

A une solution de l'alcool 6 (1 éq., C = 0.03 mol/L) dans un solvant approprié est ajouté l'acide carboxylique choisi (4 éq.), de la DMAP (4 éq.) et de l'EDCI (5.2 éq.). Le mélange réactionnel est ensuite chauffé à 26-28°C. Après agitation pendant 18h, puis traitement, le produit désiré 7 est isolé.

A une solution de 7 (1 éq., C = 0.02 mol/L) dans un solvant approprié est ajouté à 0 ⁰ C de l'acide chlorhydrique 12N (0.45 éq.). Après 5 jours d'agitation, puis traitement, le produit désiré 8 est isolé.

A une solution du diol 8 (C = 0.08 mol/L) dans un solvant approprié est ajouté du dihydroxyde de palladium (II) à 20% sur charbon (0.46 éq.) et le ballon est placé sous une atmosphère d'hydrogène. Après 6h30 d'agitation vigoureuse, le milieu réactionnel est dilué avec un mélange CHCI3 / MeOH (1/1 en volume), filtré, le résidu étant lavé avec ce même mélange. Après évaporation, le solide blanc obtenu est purifié par chromatographie sur colonne (CHCl ₃ /MeOH 85/15 puis CHCl ₃ /MeOH 90/10). Figures

Figure 1 : Détermination de l'interaction entre le ligand [C-KRN] selon l'invention et les cellules TNK

Figure 2 : Comparaison de l'activité avec les ligands de contrôle Figure 3 : Rapport [IFNγ]/[IL4] indiquant que le ligand [C-KRN] favorise une réponse Th2 Figure 4 : Activation in vivo des cellules TNK avec le ligand [C-KRN]

Exemples

Exemple 1 : Synthèse composé [C-KRN]

Un composé actif dénommé [C-KRN] a été synthétisé et testé dans le cadre de la présente invention. Ce composé est représenté ci-dessous :

Ce composé a été synthétisé selon le procédé détaillé décrit ci-dessous.

Une solution 1 mol/L de triméthylsilylacétylure de magnésium dans le THF est préparée par addition lente de bromure de méthylmagnésium (5 éq., 3 mol/L dans le THF) sur du triméthylsilylacétylène (5 éq.) à -20 ⁰ C. Après retour à la température ambiante, le milieu réactionnel est agité vigoureusement pendant lh30. La solution d'alcynure de magnésium (5 éq.) est ensuite ajoutée à - 78°C à l'aide d'une canule sur le dérivé du D-Erythrose A (1 éq.) en solution dans le THF (C = 0.4 mol/L). Après retour rapide à O ⁰ C, le milieu réactionnel est ensuite agité à 4°C pendant 12h. Après traitement, le produit désiré est purifié pour donner 1 (75 à 87%) sous forme d'une huile jaune.

Au composé 1 (1 éq.) dissous dans CH ₂ Cl ₂ (C = 0.35 mol/L) est ajoutée au goutte à goutte à 0 ⁰ C une solution de TBDMSCl (1.07 éq.) et de Et ₃ N (1.1 éq.) dans CH ₂ Cl ₂ (C = 4 mol/L). De la DMAP (0.09 éq.) est ajoutée et le milieu réactionnel est agité pendant 3h. Après traitement, le produit désiré 2 est isolé (80%).

A une solution de NaH (1.7 éq., C = 0.5 mol/L) dans du THF/DMF (4/1) a été lentement ajoutée à 0 ⁰ C une solution de l'alcool 2 dissous dans du THF/DMF (4/1) (C = 0.2 mol/L). De l'iodure de tétra-n-butylammonium (0.11 éq.) et de l'imidazole (0.11 éq.) sont rapidement ajoutés, et ensuite une solution de PMBBr (1.07 éq.) dans du THF/DMF (4/1) (1.5 éq., C = 0.5 mol/L) est lentement ajoutée. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 4h. Après traitement, le produit désiré B est isolé (80%).

Composé Pivot C

L'alcyne B, l'époxyaldéhyde (S. Guillarme, K. Plé and A. Haudrechy, J. Org. Chem., 2006, 71, 3, 1015 and A. Banchet, S. Guillarme, A. Haudrechy, Synlett, 2007, 9, 1467) et le bromure de lithium sont coévaporés trois fois avec du toluène et ensuite séchés sous vide. L'alcynure de lithium est préparé par addition de n-butyl-lithium (0.9 éq.) à -78°C sur une solution de l'alcyne B (C = 0.5 mol/L) dans de l'éther diéthylique. Le milieu réactionnel est agité pendant lh30, laissant la température remonter à 0 ⁰ C. En parallèle, le dichlorure de zinc (1.9 éq.) est fondu sous vide et dissous dans de l'éther diéthylique (C = 0.9 mol/L) à 0 ⁰ C. Après 20 min, l'alcynure de lithium est lentement ajouté à la solution de dichlorure de zinc. Le milieu réactionnel est concentré sous vide (C~0.9 mol/L) et agité pendant Ih à 0 ⁰ C. Ensuite une solution de l'époxyaldéhyde (0.29 éq.) dans de l'éther diéthylique (C = 0.2 mol/L) est lentement ajoutée. Le milieu réactionnel est concentré sous vide (C~0.9 mol/L) et agité pendant 4h à 0-5 ⁰ C. Finalement le bromure de lithium (1 éq.) est ajouté et le milieu réactionnel est agité pendant 12h à température ambiante. Après traitement, le produit désiré C est isolé (60-65%).

Le composé C (1 éq.), coévaporé plusieurs fois avec du toluène, en solution dans du DMF anhydre (C = 0.1 mol/L), est ensuite lentement ajouté à 0 ⁰ C à une solution de NaH (2.3 éq.) dans du DMF anhydre (C = 0.2 mol/L). Ensuite BnBr (2.5 éq.) est lentement ajouté. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 3h. Après traitement, le produit désiré 3 est isolé (83-86%).

Le composé 3 (1 éq.) est dissous dans du méthanol 99% (C = 0.06 mol/L). Du fluorure d'ammonium (15 éq.) est ensuite ajouté et le mélange réactionnel est chauffé à 45°C. Après traitement, le produit désiré 4 est isolé (92-95%). A une solution de chlorure d'oxalyle dans CH ₂ Cl ₂ (1.5 éq. C = 0.14 mol/L) à -78°C, est additionnée une solution de diméthylsulfoxyde (3 éq.) dans CH ₂ Cl ₂ (C = 1.4 mol/L). Le mélange réactionnel est agité pendant 15 min après addition d'une solution d'alcool 4 (1 éq.) dans CH ₂ Cl ₂ (C = 0.1 mol/L). La température est gardée à -78°C pendant Ih. Ensuite Et ₃ N (5 éq.) a été lentement ajoutée. La température est lentement augmentée jusqu'à température ambiante en environ lh30. Après lh30 de plus à température ambiante, puis traitement, le brut réactionnel est coévaporé trois fois avec du toluène et utilisé pour l'étape de réaction de Wittig sans aucune purification supplémentaire.

A une solution de CH ₃ -(CH ₂ )I ₂ PPh ₃ ⁺ Cl ^" dans du THF (4 éq., C = 0.1 mol/L) à -40 ⁰ C est lentement ajouté du n-butyl- lithium (3.9 éq.) en solution dans l'hexane. La solution rouge sombre est agitée pendant Ih, permettant à la température de remonter à 0 ⁰ C. L'aldéhyde (venant de l'oxydation de Swern) dissous dans du THF (C = 0.15 mol/L) est ajouté au goutte à goutte. La solution orange est agitée pendant Ih à température ambiante. Après traitement, le produit désiré 5 est isolé (70-79%).

A une solution de composé 5 (C = 2.2 mol/L) dans du DME, est ajoutée de la tosylhydrazine (100 éq.) et le milieu réactionnel est agité vigoureusement au reflux. Une solution d'acétate de sodium (200 éq., C = 4.4 mol/L) est additionnée en 6h. Après traitement, le produit désiré D est isolé (77-79%).

CH _{3 χ}

C(Me) ₂ ) H, H) Au composé saturé D (1 éq.), est ajouté du DDQ (1.5 éq.) dissous dans CH ₂ CVH ₂ O 18:1

(C = 0.1 mol/L). Après agitation pendant 40 min à température ambiante, puis traitement, le produit désiré 6 est isolé (77-82%).

A une solution de l'alcool 6 dans CH ₂ Cl ₂ (1 éq., C = 0.03 mol/L) est ajouté CH ₃ (CH ₂ )I ₄ COOH (4 éq.), de la DMAP (4 éq.) et de l'EDCI (5.2 éq.). Le mélange réactionnel est ensuite chauffé à 26-28°C. Après agitation pendant 18h, puis traitement, le produit désiré 7 est isolé (77-82%).

A une solution de 7 dans du méthanol HPLC (1 éq., C = 0.02 mol/L) est ajoutée à 0 ⁰ C de l'acide chlorhydrique 12N (0.45 éq.). Après 5 jours d'agitation, puis traitement, le produit désiré 8 est isolé (78-81%).

A une solution du diol 8 (C = 0.08 mol/L) dans CH ₂ Cl ₂ /Me0H 1 :1 est ajouté du dihydroxyde de palladium (II) à 20% sur charbon (0.46 éq.) et le ballon est placé sous une atmosphère d'hydrogène. Après 6h30 d'agitation vigoureuse, le milieu réactionnel est dilué avec un mélange CHCl ₃ / MeOH (1/1 en volume), filtré, le résidu étant lavé avec ce même mélange. Après évaporation, le solide blanc obtenu est purifié par chromatographie sur colonne (CHCl ₃ /MeOH 85/15 puis CHCl ₃ /MeOH 90/10).

Les données spectroscopiques sont rassemblées ci-dessous :

1 : ¹ H RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 4.58 (dd, IH, J=5.8, 6.0 Hz), 4.3 (ddd, IH, J=4.3, 5.3, 6.4 Hz), 4.24 (q, IH, J=6.4, 12 Hz), 3.99 (dd, IH, J=4.3, 6.0 Hz), 3.91 (dd, IH, J=5.3, 12 Hz), 1.47 (s, 3H), 1.36 (s, 3H), 0.17 (s, 9H). ¹³ C RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 108.9, 103.7, 91.7, 79.1, 77.4, 62, 60.5, 27.4, 25.3, 0. MS (HR) (ESI) m/z calculé pour Ci ₂ H ₂₂ O ₄ Si (M+Na): 281.128, trouvé: 281.09. Micro-analyse : calculé C = 55.78% et H = 8.58%, trouvé C = 55.67% et H = 8.39%.

2 : IR (film, V, cm ^"1 ) : 3418, 2957, 2858, 2174, 1472, 1381, 1251, 1217, 1082, 843, 779. ¹ H RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 4.61 (dd, IH, J=6.0, 6.3 Hz), 4.31 (dd, IH, J=6.0, 12.4 Hz), 4.25-

4.30 (m, IH), 4.25 (d, IH, J=6.3 Hz), 3.94 (dd, IH, J=7.6, 11 Hz), 3.86 (dd, IH, J=3.5, 11 Hz), 3.11 (s, 3H), 1.41 (s, 3H), 0.95 (s, 9H), 0.43 (s, 9H), 0.32 (s, 6H). ¹³ C RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 108.9, 104.1, 90.4, 79.9, 76.9, 62, 61.4, 27.7, 25.9, 25.4, 18.4, 0. MS (HR) (ESI) m/z calculé pour CiSH ₃₆ O ₄ Si ₂ (M+Na): 395.214, trouvé: 395.317. Micro-analyse : calculé C = 58.02% et H = 9.74%, trouvé C = 58.11% et H = 10.05%.

B : [CC] ¹⁹ D = + 43,7° (C= 0,0125g/mL, CHCl ₃ ). IR (film, v, cm ^"1 ) : 3284, 2986, 2954, 2933, 2883, 2856, 2114, 1613, 1586, 1515, 1464, 1381, 1372, 1303, 1251, 1173, 1079, 1037, 837, 778. ¹ H RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 4.72 (d, IH, J=I 1.2 Hz), 4.42 (d, IH, J=I 1.2 Hz), 4.10-4.35 (m, 3H, J=I.9, 4.6, 5.9 Hz), 3.92 (dd, IH, J=4.7, 9.5 Hz), 3.67 (dd, IH, J=5.8, 9.5 Hz), 2.55 (d, IH, J=I.9 Hz), 1.47 (s, 3H), 1.35 (s, 3H), 0.82 (s, 9H), 0 (s, 6H). ¹³ C RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 158.9, 129.5, 128.6, 113.3, 108.4, 80.0, 77.1, 74.9, 69.6, 66.8, 61.1, 54.7, 26.7, 25.4, 24.5, 17.7, 0. MS (HR) (ESI) m/z calculé pour C ₂₃ H ₃₆ O ₅ Si (M+Na): 443.232, trouvé: 443.218. Micro-analyse : calculé C = 65.68% et H = 8.63%, trouvé C = 65.77% et H = 8.40%.

C : [CC] ¹⁹ D = + 68,7° (C = 0,011g/mL, CHCl ₃ ) IR (film, v, cm ^"1 ) : 3484, 3063, 3030, 2929, 2358, 1721, 1612, 1586, 1514, 1497, 1454, 1371, 1077, 836, 735, 697. UV (ε en Lm ₀ F ¹ Cm ^{" 1} Y εl = 1129 (CHCl ₃ , C = 0,002 mol/L, λ = 244 nm, Abs = 2,257), ε2 = 1486 (CHCl ₃ , C = 0,002 mol/L, λ = 268 nm, Abs = 2,972). ¹ H RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 7.32-7.50 (m, 15H), 7.30 (d, 2H, J=8Hz), 6.82 (d, 2H, J=8Hz), 5.02 (d, IH, J=5Hz), 4.8-4.88 (dd, 2H, J=12, 68 Hz), 4.80-4.83 et 4.92-4.96 (dd, 2H, J=U, 170 Hz), 4.70-4.75 et 5.00-5.05 (dd, 2H, J=U, 128 Hz), 4.43 (d, IH, J=4Hz), 4.27-4.30 (m, 2H, J=4, 6 Hz), 4.20 (dd, IH, J=5, 9 Hz), 4.08 (ddd, IH, J=6, 7, 11 Hz), 4.05 (dd, 2H, J=I, 11 Hz), 4.00 (2dd, 2H, J=6, 9 Hz), 3.84 (s, 3H), 3.77 (dd, 2H, J=4.5, 11 Hz), 3.70 (dd, 2H, J=9, 11 Hz), 3.56 (dd, 2H, J=5, 11 Hz), 1.52 (s, 3H), 1.40 (s, 3H), 1.33 (s, 3H), 0.91 (s, 9H), 0.08 (s, 6H). ¹³ C RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 159.4, 138.2-138.7, 130.0, 129.3, 127.5-128.6, 113.9, 108.9, 85.2, 82.6, 80.5, 78.0, 75.9, 74.9, 74.6, 74.1, 73.7, 73.1, 70.2, 67.6, 62.4, 61.9, 55.3, 27.6, 25.9, 25.2, 18.4. MS (HR) (ESI) m/z calculé pour C ₅₀ H ₆₄ Oi ₀ Si (M+Na): 875.426, trouvé: 875.4. Micro-analyse : calculé C = 70.39% et H = 7.56%, trouvé C = 70.16% et H = 7.88%.

3 : IR (film, V, cm ^"1 ) : 3418, 2931, 2361, 2341,1732, 1615, 1587, 1516, 1455, 1110, 836. UV (ε en Lm ₀ I ¹ Cm ^"1 ): εl = 1717 (CHCl ₃ , C= 0,00146 mol/L, λ= 245 nm, Abs = 2,507) ε2 = 1962 (CHCl ₃ , C= 0,00146 mol/L, λ= 264 nm, Abs = 2,865). ¹ H RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 4.72 (d, IH, J=I 1.2 Hz), 4.42 (d, IH, J=I 1.2 Hz), 4.10-4.35 (m, 3H, J=1.9, 4.6, 5.9 Hz), 3.92 (dd, IH, J=4.7, 9.5 Hz), 3.67 (dd, IH, J=5.8, 9.5 Hz), 2.55 (d, IH, J=I.9 Hz), 1.47 (s, 3H), 1.35 (s, 3H), 0.82 (s, 9H), 0 (s, 6H). ¹³ C RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 158.9, 129.5, 128.6, 113.3, 108.4, 80.0, 77.1, 74.9, 69.6, 66.8, 61.1, 54.7, 26.7, 25.4, 24.5, 17.7, 0. MS (HR) (ESI) m/z calculé pour C ₅₇ H ₇₀ Oi ₀ Si (M+Na): 965.473, trouvé: 965,400. Micro-analyse : calculé C = 72.74% et H = 7.49%, trouvé C = 72.46% et H = 7.84%.

4 : UV (ε en Lm ₀ I ¹ Cm ^"1 ): εl = 1544 (CHCl ₃ , C= 0,00169 mol/L, λ= 247 nm, Abs = 2,609) ε2 = 1841 (CHCl ₃ , C= 0,00146 mol/L, λ= 264 nm, Abs = 3,111). ¹ H RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 4.72 (d, IH, J=I 1.2 Hz), 4.42 (d, IH, J=I 1.2 Hz), 4.10-4.35 (m, 3H, J=1.9, 4.6, 5.9 Hz), 3.92 (dd, IH, J=4.7, 9.5 Hz), 3.67 (dd, IH, J=5.8, 9.5 Hz), 2.55 (d, IH, J=I.9 Hz), 1.47 (s, 3H), 1.35 (s, 3H), 0.82 (s, 9H), 0 (s, 6H). ¹³ C RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 158.9, 129.5, 128.6, 113.3, 108.4, 80.0, 77.1, 74.9, 69.6, 66.8, 61.1, 54.7, 26.7, 25.4, 24.5, 17.7, 0. MS (HR) (ESI) m/z calculé pour C ₅₇ H ₇₀ Oi ₀ Si (M+Na): 851.386, trouvé: 851.357. Micro-analyse : calculé C = 73.89% et H = 6.81%, trouvé C = 73.87% et H = 6.91%. D : ¹ H RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 4.72 (d, IH, J=I 1.2 Hz), 4.42 (d, IH, J=I 1.2 Hz), 4.10-4.35 (m, 3H, J=I.9, 4.6, 5.9 Hz), 3.92 (dd, IH, J=4.7, 9.5 Hz), 3.67 (dd, IH, J=5.8, 9.5 Hz), 2.55 (d, IH, J=I.9 Hz), 1.47 (s, 3H), 1.35 (s, 3H), 0.82 (s, 9H), 0 (s, 6H). ¹³ C RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 158.9, 129.5, 128.6, 113.3, 108.4, 80.0, 77.1, 74.9, 69.6, 66.8, 61.1, 54.7, 26.7, 25.4, 24.5, 17.7, 0. MS (HR) (ESI) m/z calculé pour C ₆₄ H ₈₆ O ₉ (M+Na): 1021.626, trouvé: 1021.630. Micro-analyse : calculé C = 76.98% et H = 8.69%, trouvé C = 76.94% et H = 8.62%.

6 : ¹ H RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 4.72 (d, IH, J=I 1.2 Hz), 4.42 (d, IH, J=I 1.2 Hz), 4.10-4.35 (m, 3H, J=I.9, 4.6, 5.9 Hz), 3.92 (dd, IH, J=4.7, 9.5 Hz), 3.67 (dd, IH, J=5.8, 9.5 Hz), 2.55 (d, IH, J=I.9 Hz), 1.47 (s, 3H), 1.35 (s, 3H), 0.82 (s, 9H), 0 (s, 6H). ¹³ C RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 158.9, 129.5, 128.6, 113.3, 108.4, 80.0, 77.1, 74.9, 69.6, 66.8, 61.1, 54.7, 26.7, 25.4, 24.5, 17.7, 0. MS (HR) (ESI) m/z calculé pour C ₅₆ H ₇₈ O ₈ (M+Na): 901.569, trouvé: 901,500. Micro-analyse : calculé C = 76.50% et H = 8.94%, trouvé C = 76.92% et H = 9.03%. 7 : PF = 70-72 ⁰ C. ¹ H RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 4.72 (d, IH, J=I 1.2 Hz), 4.42 (d, IH, J=I 1.2 Hz), 4.10-4.35 (m, 3H, J=I.9, 4.6, 5.9 Hz), 3.92 (dd, IH, J=4.7, 9.5 Hz), 3.67 (dd, IH, J=5.8, 9.5 Hz), 2.55 (d, IH, J=I.9 Hz), 1.47 (s, 3H), 1.35 (s, 3H), 0.82 (s, 9H), 0 (s, 6H). ¹³ C RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 158.9, 129.5, 128.6, 113.3, 108.4, 80.0, 77.1, 74.9, 69.6, 66.8, 61.1, 54.7, 26.7, 25.4, 24.5, 17.7, 0. MS (HR) (ESI) m/z calculé pour C ₈₂ Hi ₂₈ O ₉ (M+Na): 1279.955, trouvé: 1279.954. Micro-analyse : calculé C = 78.30% et H = 10.26%, trouvé C = 77.90% et H = 10.26%.

8 : PF = 40-41 ⁰ C. ¹ H RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 4.72 (d, IH, J=I 1.2 Hz), 4.42 (d, IH, J=I 1.2 Hz), 4.10-4.35 (m, 3H, J=I.9, 4.6, 5.9 Hz), 3.92 (dd, IH, J=4.7, 9.5 Hz), 3.67 (dd, IH, J=5.8, 9.5 Hz), 2.55 (d, IH, J=I.9 Hz), 1.47 (s, 3H), 1.35 (s, 3H), 0.82 (s, 9H), 0 (s, 6H). ¹³ C RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 158.9, 129.5, 128.6, 113.3, 108.4, 80.0, 77.1, 74.9, 69.6, 66.8, 61.1, 54.7, 26.7, 25.4, 24.5, 17.7, 0. MS (HR) (ESI) m/z calculé pour C ₇₉ Hj ₂₄ O ₉ (M+Na): 1239.924, trouvé: 1239.886. Micro-analyse (% calculé avec une molécule d'eau M = 1235,858 g/mol): C = 76,78 % et H = 10,28 %, trouvé C = 76.91% et H = 10.17%. (I) : ¹ H RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 4.72 (d, IH, J=I 1.2 Hz), 4.42 (d, IH, J=I 1.2 Hz), 4.10-4.35 (m, 3H, J=I.9, 4.6, 5.9 Hz), 3.92 (dd, IH, J=4.7, 9.5 Hz), 3.67 (dd, IH, J=5.8, 9.5 Hz), 2.55 (d, IH, J=I.9 Hz), 1.47 (s, 3H), 1.35 (s, 3H), 0.82 (s, 9H), 0 (s, 6H). ¹³ C RMN (ppm, CDCl ₃ ) δ: 158.9, 129.5, 128.6, 113.3, 108.4, 80.0, 77.1, 74.9, 69.6, 66.8, 61.1, 54.7, 26.7, 25.4, 24.5, 17.7, 0. MS (HR) (ESI) m/z calculé pour C ₅ iHi ₀₀ O ₉ (M+Na): 879.736, trouvé: 879.50.

Exemple 2 : Synthèse d'autres composés

D'autres composés préférés répondant à la formule générale III ayant une activité biologique potentielle seront synthétisés. n et m sont définis dans les tableaux ci-dessous :

Ces molécules pourront être testées selon notamment les protocoles décrits ci-dessous. Exemple 3 : Capacité du ligand estérifïé à activer les cellules TNK ex vivo

a) Protocole expérimental Le ligand est dissous dans le DMSO pour obtenir un échantillon de concentration 2mg/mL.

Les splénocytes des souris naïves BALB/c sont cultivés en présence de quantités croissantes du ligand (de 0,02 à 20 μg/mL).

Les contrôles internes sont effectués avec deux ligands synthétiques : le KRN 7000 (commercialisé par Alexis Biochemicals®) et le α-Gal (C 12) Cer (commercialisé par Avanti Polar Lipids®), dont l'efficacité à induire une réponse cellulaire spécifique des cellules TNK est déjà reconnu (Schéma 1).

Schéma 1 : Ligands de contrôle

KRN 7000 β-Gal(C12)Cer

La prolifération cellulaire est mesurée après trois jours de culture par incorporation de thymidine tritiée (mesure de la radioactivité incorporée par les cellules pendant l'activation). Les quantités de cytokines (IL-4 et IFN-γ) sont déterminées par le test ELISA dans les récoltés après 3Oh de culture.

Afin de déterminer si la reconnaissance des ligands est restreinte à la molécule CDId, les cultures ont été réalisées en absence ou en présence d'anticorps anti-CDld bloquant. Ils rendent alors impossible la présentation du ligand par la molécule CDId au TCR invariant du lymphocyte TNK. b) Tests effectués ex vivo

Les résultats obtenus nous montrent que notre ligand estérifïé est capable d'induire la prolifération des splénocytes ainsi que la sécrétion d'IL-4 et d'IFN-γ. Ces réponses sont dose-dépendantes et spécifiques des cellules TNK puisqu'elles sont totalement inhibées en présence d'anticorps anti-CDld bloquant (Figure 1). Toutefois, comparé aux contrôles internes, le ligand [C-KRN] donne des réponses plus faibles, à la fois pour la prolifération cellulaire et pour la sécrétion de cytokines. Mais, étant donné la pureté moyenne du ligand, ces résultats sont très encourageants (Figure 2). Il est à noter également que les gammes de concentrations sont différentes pour les contrôles internes et le ligand [C-KRN].

Le calcul du rapport [IFN-γ]/[IL-4] permet de déterminer si le ligand favorise les réponses de type ThI (inflammatoire) ou Th2 (immuno -régulatrices). Une diminution significative du rapport [IFN-γ]/[IL-4] est observable avec le ligand estérifîé, comme avec le ligand α- GaI(C 12)Cer, traduisant un déséquilibre de la balance cytokinique vers une réponse de type Th2 (sécrétion d'IL-4 supérieure à la sécrétion d'IFN-γ) (Figure 3).

Ce résultat est surprenant et nous amène à penser que la nature de la ramification entre les chaînes phytosphingosine et acyle pourrait avoir une influence non négligeable sur la production de certaines cytokines. Cette implication peut alors soit améliorer soit compromettre les interactions entre le ligand et le CDId ou entre le complexe GalCer/CDld et le récepteur des lymphocytes TNK.

Ainsi notre ligand estérifîé présente un potentiel dans le traitement de pathologies auto- immunes où les réponses Th2 doivent être favorisées afin de contrecarrer les réponses ThI .

Exemple 4 : Capacité du ligand estérifîé à activer les cellules TNK in vivo a) Protocole expérimental

Le ligand (KRN 7000 ou [C-KRN]) est injecté par voie intra-péritonéale à des souris naïves BALB/c (2 souris par ligand). Le taux de cytokines sériques (IL-4 et IFN-γ) a été détecté à différents temps après l'injection. b) Résultats obtenus Le ligand estérifîé est capable d'activer in vivo les lymphocytes TNK. En effet, 6h après l'injection du ligand [C-KRN], le rapport [IFN-γ]/[IL-4] reflète une réponse Th2. Celle-ci reste toutefois peu marquée mais durable car on observe également que la sécrétion d'IFN- γ semble plus tardive qu'avec le KRN 7000. La forte sécrétion d'IFN-γ est obtenue 24h après l'injection du [C-KRN] (contre 6h pour le KRN 7000). Ainsi, notre ligand estérifîé induit une réponse Th2 faible mais relativement prolongée dans le temps (Figure 4).

Remarque : le faible rapport [IFN-γ]/[IL-4] peut être dû à la pureté moyenne de notre échantillon. On peut noter aussi que les impuretés présentes ne semblent pas cytotoxiques. Les informations fournies par les tests immuno logiques sur notre ligand estérifïé sont très encourageantes. Contre toute attente, cet analogue semble induire, in vitro et in vivo, une réponse Th2 favorable aux traitements des maladies auto-immunes inflammatoires.

REFERENCES

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