R-a-Liponsäure ist in einer Vielzahl von Pro-und Eukaryonten ein essentieller Cofaktor bestimmter Multienzymkomplexe. Dabei ist die R-a-Liponsäure jeweils kovalent an die s-Aminogruppe eines spezifischen Lysin-Rests des entsprechenden Enzyms ge- bunden. Auf diese Weise ist die R-a-Liponsäure ein Teil der E2-Untereinheit der Pyruvat-Dehydrogenase (PDH) [EC 2.3. 1.12] bzw. der a-Ketoglutarat-Dehydrogenase (KGDH) [EC 2.3. 1.61] und spielt dort als Redoxpartner und Acylgruppenüberträger eine entscheidende Rolle bei der oxidativen Decarboxylierung von a- Ketosäuren. Außerdem fungiert Liponsäure als Aminomethyl- Carrier in Glycin-Cleavage Enzymsystemen. a-Liponsäure ist ein optisch aktives Molekül mit einem Chira- litätszentrum am Kohlenstoffatom C6. Dabei stellt die R-Konfi- guration der a-Liponsäure das natürlich vorkommende Enantiomer dar. Nur diese Form zeigt physiologische Aktivität als Cofak- tor der entsprechenden Enzyme. a-Liponsäure kann sowohl in ei- <BR> <BR> ner oxidierten (5- [1, 2] -Dithiolan-3-yl-Pentansäure) als auch in einer reduzierten Form (6,8-Dimercapto-Oktansäure) vorkom- men. Im Folgenden sind unter der Bezeichnung"a-Liponsäure" beide Formen sowie die jeweiligen Salze der a-Liponsäure, wie z. B. das Calcium-, Kalium-, Magnesium-, Natrium-oder das Am- moniumsalz, zu verstehen.

Die Biosynthese von R-a-Liponsäure wurde besonders an dem Bak- terium Escherichia coli intensiv untersucht (s. Fig. 1). Hier dient Oktansäure, die an das Acyl-Carrier-Protein (ACP) kova- lent gebunden ist, als spezifische Vorstufe bei der Lipon- säure-Synthese. In einer komplexen Reaktion werden zwei Schwe- felatome auf die derart aktivierte Oktansäure (Oktanoyl-ACP) übertragen, wobei R-a-Lipoyl-ACP entsteht. Diese Reaktion wird

von der Sulfurtransferase Liponsäure-Synthase [EC 2.8. 1. -], dem lipA-Genprodukt, katalysiert. Als Schwefeldonor dient da- bei letztendlich die Aminosäure L-Cystein. Der anschließende Transfer der R-a-Liponsäure von R-a-Lipoyl-ACP auf die E2- Untereinheit der a-Ketosäure-Dehydrogenasen wird von der Li- poyl-P-rotein-Ligase B [EC 6.-.-.-], dem lipB-Genprodukt, kata- lysiert, ohne dass dabei jedoch R-a-Lipoyl-ACP oder R-a- Liponsäure als freie Zwischenprodukte auftreten (Miller et al., 2000, Biochemistry 39 : 15166-15178).

Über die Biosynthese von R-a-Liponsäure in Eukaryonten ist we- nig bekannt. Es wird aber vermutet, dass die R-a-Liponsäure- Synthese sowie der Transfer auf die entsprechenden Enzyme in den Mitochondrien eukaryontischer Zellen auf ähnliche Weise wie in Bakterien erfolgt.

Neben ihrer Relevanz als essentieller Bestandteil von Enzymen mit einer zentralen Rolle im Stoffwechsel, wurde schon früh die Bedeutung der a-Liponsäure für die Pharmakotherapie sowie für die Nahrungsmittelergänzung (Nutraceutical) erkannt : a-Liponsäure besitzt aufgrund ihrer beiden Thiolgruppen eine ausgeprägte Wirksamkeit als Antioxidans und kann deshalb den Organismus vor schädlichen Prozessen, die durch oxidativen Stress induziert werden, schützen. Außerdem ist a-Dihydro- liponsäure, die reduzierte Form der a-Liponsäure, aufgrund ih- rer Eigenschaft als starkes Reduktionsmittel in der Lage, an- dere oxidierte natürliche Antioxidationsmittel im Körper wie Ascorbinsäure oder a-Tocopherol direkt oder indirekt zu rege- nerieren oder bei deren Mangel diese auch zu ersetzen. Ent- sprechend kommt der a-Liponsäure im Zusammenspiel mit Ascor- binsäure, a-Tocopherol und Glutathion, dem sogenannten"Netz- werk der Antioxidantien", eine zentrale Bedeutung zu. a-Liponsäure wird außerdem zur Prävention und Bekämpfung von Diabetes mellitus Typ II und dessen Folgeschäden, wie z. B.

Polyneuropathie, Cataract oder Kardiovaskularleiden, einge- setzt.

Die unterschiedliche biologische Aktivität beider Enantiomere der a-Liponsäure ist derzeit Gegenstand intensiver Untersu- chungen, wobei sich allerdings immer mehr herauskristalli- siert, dass die Applikation des reinen R-Enantiomers der a- Liponsäure deutliche Vorteile gegenüber der S-Form aufweist.

So wurde im in vitro-Versuch gezeigt, dass nur die natürliche R-a-Liponsäure zur Bildung funktioneller a-Ketosäure-Dehydro- genasen führt. Das S-Enantiomer hatte dagegen sogar einen in- hibierenden Effekt auf die Stimulierung der Enzymaktivität durch R-a-Liponsäure. Die Reduktion von a-Liponsäure und damit die Regeneration der antioxidativ wirksamen a-Dihydrolipon- säure in den Mitochondrien ist für die Zelle von essentieller Bedeutung. Die mitochondriale NADH-abhängige Lipoamid- Reduktase von Säugern zeigt mit dem R-Enantiomer eine fast 20- fach höhere Aktivität als mit der S-Form. Des weiteren hat R- a-Liponsäure verglichen mit dem S-Enantiomer einen deutlich stärkeren Effekt auf die insulin-vermittelte Glucose-Aufnahme und den Glucose-Metabolismus von Skelettmuskelzellen insulin- resistenter Ratten. Im Tierversuch zeigte die R-Form außerdem einen antiphlogistischen Effekt, während die S-Form eher eine analgetische Wirkung hatte. Um unerwünschte Nebeneffekte zu vermeiden, ist es daher äußerst wünschenswert, a-Liponsäure jeweils nur in der enantiomerenreinen Form zu applizieren.

Derzeit erfolgt die großtechnische Herstellung von a-Lipon- säure ausschließlich mittels chemischer Verfahren, wobei immer das Razemat aus R-und S-Form als Endprodukt gebildet wird (Yadav et al., 1990, J. Sci. Ind. Res. 49 : 40. 0-409). Zur Ge- winnung von enantiomerenreiner R-a-Liponsäure wurden verschie- dene Verfahren entwickelt. Beispielsweise kann das Razemat der a-Liponsäure oder eines der Syntheseintermediate entweder che- misch mittels chiraler Hilfssubstanzen (Walton et. al, 1954, J. Amer. Chem. Soc. 76 : 4748 ; DE 4137773) oder enzymatisch (Adger et al., 1995, J. Chem. Soc., Chem. Commun. : 1563-1564) aufgespalten werden. In anderen Verfahren unterbleibt die Ent- stehung eines Razemats aufgrund eines enantioselektiven Syn- theseschritts, wobei das neue Chiralitätszentrum entweder che- misch (DE 3629116 ; DE 19533881 ; Bringmann et al., 1999, Z. Na-

turforsch. 54b : 655-661 ; DE 10036516) oder durch eine stereo- spezifische Biotransformation mittels Mikroorganismen einge- führt werden kann (Gopalan und Jacobs, 1989, Tetrahedron Lett.

30 : 5705-5708 ; Dasaradhi et al., 1990, J. Chem. Soc., Chem.

Commun. : 729-730 ; DE 10056025). Andere Prozesse wiederum star- ten die chemische Synthese von enantiomerenreiner a-Liponsäure mit einem natürlich vorkommenden chiralen Edukt wie z. B. S- Maleinsäure oder D-Mannitol (Brookes und Golding, 1988, J.

Chem. Soc. Perkin Trans. I : 9-12 ; Rama Rao et al., 1987, Tetrahedron Lett. 28,2183-2186). Wegen z. T. aufwendiger Syn- theseschritte, geringer Ausbeuten und hoher Materialkosten sind alle bekannten Methoden zur Herstellung von enantiomeren- reiner R-a-Liponsäure derzeit nicht wirtschaftlich.

Die großtechnische Herstellung vieler niedermolekularer Natur- stoffe, wie z. B. Antibiotika, Vitamine oder Aminosäuren, er- folgt heute oftmals mittels eines fermentativen Verfahrens un- ter Verwendung verschiedener Stämme von Mikroorganismen.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Zellen zur Verfügung zu stellen, die enantiomerenreine R-a-Liponsäure in ein Kulturmedium sekretieren.

Diese Aufgabe wird gelöst durch Zellen, die dadurch gekenn- zeichnet sind, dass sie ein Liponsäure-Synthase-Gen (lipA-Gen) überexprimieren.

Unter einer Überexpression ist im Sinne der vorliegenden Er- findung vorzugsweise zu verstehen, dass das Liponsäure- Synthase-Gen im Vergleich zur jeweiligen Wildtyp-Zelle, aus der das Liponsäure-Synthase-Gen gewonnen wurde, mindestens um den Faktor 2, bevorzugt mindestens um den Faktor 5, vermehrt exprimiert wird.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem Liponsäure-Synthase-Gen um ein Gen mit der Sequenz SEQ ID NO : 1 oder um eine funktio- nelle Variante dieses Gens.

Unter einer funktionellen Variante ist im Sinne der vorliegen- den Erfindung eine DNA-Sequenz zu verstehen, die sich durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO : 1 dargestellten Sequenz ableitet, wobei die en- zymatische Aktivität der durch das Gen codierten Liponsäure- Synthase erhalten bleibt.

Um eine Überexpression des lipA-Gens in der Zelle zu errei- chen, kann die Kopienzahl des lipA-Gens in einer Zelle erhöht sein und/oder es kann die Expression des lipA-Gens, vorzugs- weise durch geeignete Promotoren, gesteigert sein.

Durch die Überexpression eines lipA-Gens ist die Liponsäure- Synthase-Aktivität der Zelle jeweils um mindestens den glei- chen Faktor gesteigert.

Vorzugsweise überexprimiert eine erfindungsgemäße Zelle ein Liponsäure-Synthase-Gen, das für ein Protein umfassend die Se- quenz ID NO : 2 oder funktionelle Varianten mit einer Sequenz- homologie zu SEQ ID NO : 2 größer 40 % codiert.

Vorzugsweise ist die Sequenzhomologie zu SEQ ID NO : 2 größer 60 %, besonders bevorzugt ist die Sequenzhomologie zu SEQ ID NO : 2 größer 80 %.

In der vorliegenden Erfindung beziehen sich alle erwähnten Ho- mologiewerte auf Ergebnisse, die mit dem Algorithmus BESTFIT (GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GCG) Madison, Wisconsin) erhalten werden.

Die Erhöhung der Kopienzahl eines lipA-Gens in einer Zelle kann mit dem Fachmann bekannten Methoden erreicht werden. So kann zum Beispiel ein lipA-Gen in einen Plasmid-Vektor mit mehrfacher Kopienzahl pro Zelle (z. B. pUC19, pBR322, pACYC184 für Escherichia coli) kloniert und in die Zelle eingebracht werden. Alternativ kann ein lipA-Gen mehrfach ins Chromosom einer Zelle integriert werden. Als Integrationsverfahren kön- nen die bekannten Systeme mit temperenten Bakteriophagen, in-

tegrative Plasmide oder die Integration über homologe Rekombi- nation genutzt werden (z. B. Hamilton et al., 1989, J. Bacteri- ol. 171 : 4617-4622).

Bevorzugt ist die Erhöhung der Kopienzahl durch Klonierung ei- nes lipA-Gens in einen Plasmid-Vektor unter Kontrolle eines Promotors. Besonders bevorzugt ist die Erhöhung der Kopienzahl in Escherichia coli durch Klonierung eines lipA-Gens in ein pUC-Derivat wie z. B. pASK-IBA3 (IBA, Institut für Bioanaly- tik, Göttingen). Die Erfindung betrifft somit auch ein Plasmid dadurch gekennzeichnet, dass es ein lipA-Gen unter funktionel- ler Kontrolle eines Promotors enthält.

Als Kontrollregion für die Expression eines plasmid-codierten lipA-Gens kann die natürliche Promotor-und Operatorregion des lipA-Gens dienen, die verstärkte Expression eines lipA-Gens kann jedoch insbesondere auch mittels anderer Promotoren er- folgen. Entsprechende Promotorsysteme, die entweder eine an- dauernde oder eine kontrollierte, induzierbare Expression des Liponsäure-Synthase-Gens ermöglichen, wie beispielsweise in Escherichia coli der konstitutive GAPDH-Promotor des gapA-Gens oder die induzierbaren lac-, tac-, trc-, lambda-, ara-oder tet-Promotoren, sind dem Fachmann bekannt (Makrides S. C., 1996, Microbiol. Rev. 60 : 512-538). Solche Konstrukte können in an sich bekannter Weise auf Plasmiden oder chromosomal ver- wendet werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform für die Klonie- rung eines lipA-Gens wird ein Plasmid verwendet, das bereits einen Promotor zur verstärkten Expression enthält, wie bei- spielsweise das induzierbare tet-Promotor/Repressorsystem von Escherichia coli.

Des weiteren kann eine verstärkte Expression dadurch erreicht werden, daß Translationsstartsignale, wie z. B. die Ribosomen- bindestelle oder das Startcodon des Gens, in optimierter Se- quenz auf dem jeweiligen Konstrukt vorhanden sind, oder dass

gemäß der"codon usage"seltene Codons gegen häufiger vorkom- mende Codons ausgetauscht werden.

Bevorzugt enthalten erfindungsgemäße Zellen ein Plasmid mit einem lipA-Gen sowie den genannten Modifikationen der Regula- tionssignale.

Die Klonierung eines lipA-Gens in einen Plasmid-Vektor erfolgt beispielsweise durch spezifische Amplifikation eines lipA-Gens mittels der Polymerase-Ketten-Reaktion unter Einsatz von spe- zifischen Primern, die das komplette lipA-Gen erfassen, und anschließende Ligation mit Vektor-DNS-Fragmenten.

Erfindungsgemäße Zellen, die eine gegenüber einer Ausgangszel- le erhöhte Expression eines lipA-Gens und verbunden damit eine gesteigerte Liponsäure-Synthase Aktivität aufweisen, können mit Standardtechniken der Molekularbiologie aus einer Aus- gangszelle erzeugt werden.

In einer Vielzahl von Zellen konnten Liponsäure-Synthase-Gene identifiziert werden. Erfindungsgemäße Zellen lassen sich so- mit vorzugsweise aus Zellen von pro-oder eukaryontischen Or- ganismen herstellen, die in der Lage sind, R-a-Liponsäure selbst zu synthetisieren (Ausgangszelle), die rekombinanten Verfahren zugänglich sind und die durch Fermentation kulti- vierbar sind. Auch pflanzliche oder tierische Zellen, die in Zellkultur züchtbar sind, sind somit zur Herstellung erfin- dungsgemäßer Zellen geeignet.

Bevorzugt handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Zellen um Mikroorganismen, wie zum Beispiel Hefe-oder Bakterienstämme.

Besonders bevorzugt handelt es sich um Bakterienstämme aus der Familie der Enterobacteriaceae, ganz besonders bevorzugt um Stämme der Art Escherichia coli.

Durch eine gängige Transformationsmethode (z. B. Elektroporati- on) werden die lipA-haltigen Plasmide in eine Ausgangszelle

eingebracht und beispielsweise mittels Antibiotika-Resistenz auf plasmid-tragende Klone selektiert.

Die Erfindung betrifft somit auch Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass in eine Ausgangszelle ein erfindungsgemäßes Plasmid eingebracht wird.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung war es, ein Fermentations- verfahren zur Verfügung zu stellen, welches die Herstellung enantiomerenreiner R-a-Liponsäure ermöglicht.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine erfindungsgemäße Zelle in einem Kulturmedium kultiviert wird, wobei die Zelle enantiomerenrei- ne R-a-Liponsäure in freier Form in das Kulturmedium ausschei- det und die enantiomerenreine R-a-Liponsäure von dem Kulturme- dium abgetrennt wird.

Die Gewinnung von R-a-Liponsäure aus dem Kulturmedium kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren, wie Zentrifugation des Mediums zur Abtrennung der Zellen und durch anschließende Ex- traktion oder Präzipitation des Produkts, erfolgen.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um das erste Verfahren, bei dem die gesamte Synthese von R-a- Liponsäure ausschließlich in einem Fermentationsprozess mit lebenden Zellen erfolgt. Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den herkömmlichen chemischen Prozessen liegt in der enantiomerenspezifischen Biosynthese von R-a- Liponsäure, weshalb eine aufwendige Razemattrennung während oder am Ende der Synthesekette entfällt. Des weiteren ist bei dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren für R-a-Liponsäure die Umweltbelastung im Vergleich zur chemischen Synthese we- sentlich geringer.

Aus physiologischen und biochemischen Daten geht hervor, dass Liponsäure in Wildtyp-Zellen nahezu ausschließlich in gebunde-

ner Form vorkommt, da bereits die Synthese der R-a-Liponsäure vollständig proteingebunden erfolgt (vgl. Fig. 1) (Herbert und Guest, 1975, Arch. Microbiol. 106 : 259-266 ; Miller et al., 2000, Biochemistry 39 : 15166-15178). Überraschenderweise wurde jedoch im Rahmen der vorliegenden Erfindung gefunden, dass die Überexpression eines Liponsäure-Synthase-Gens zur Anhäufung freier, enantiomerenreiner R-a-Liponsäure im Kulturmedium des Wirtsorganismus führt. Dies wiederum erlaubt eine einfache I- solierung des Produkts aus dem Kulturmedium nach Abtrennung der Biomasse, ohne dass die Zellen zuvor aufgebrochen werden müssen bzw. ohne dass die R-a-Liponsäure durch einen aufwendi- gen und verlustreichen Hydrolyseschritt vom daran gebundenen Trägerprotein (ACP oder die E2-Untereinheit der a-Ketosäure- Dehydrogenasen) abgespalten werden muss.

Die Kultivierung der erfindungsgemäßen Zellen zur Produktion von R-a-Liponsäure erfolgt vorzugsweise in einem aus der Lite- ratur bekannten Minimalsalzmedium (Herbert und Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272).

Als Kohlenstoffquelle können prinzipiell alle verwertbaren Zu- cker, Zuckeralkohole oder organische Säuren bzw. deren Salze verwendet werden. Dabei werden bevorzugt Asparaginsäure, Äp- felsäure, Bernsteinsäure, Brenztraubensäure, Fumarsäure, Glu- taminsäure, Glucose, Glycerin oder Oxalessigsäure eingesetzt.

Besonders bevorzugt sind Bernsteinsäure und Oxalessigsäure.

Auch ist eine kombinierte Fütterung mehrerer verschiedener Kohlenstoffquellen möglich. Des weiteren können kurzkettige Fettsäuren mit einer Kettenlänge von C2-C8, bevorzugt mit ei- ner Kettenlänge von C6-C8 (Hexan-bzw. Oktansäure) als spezi- fische Vorstufen für die a-Liponsäure-Synthese dem Medium zu- gesetzt werden. Dabei beträgt die Konzentration der zugesetz- ten Kohlenstoffquelle vorzugsweise 1-30 g/l.

Die Inkubation der erfindungsgemäßen Zellen erfolgt vorzugs- weise unter aeroben Kultivierungsbedingungen über einen Zeit- raum von 16-150 h und im Bereich der für die jeweiligen Zel- len optimalen Wachtumstemperatur.

Als optimaler Temperaturbereich werden 15-55 °C bevorzugt.

Besonders bevorzugt ist eine Temperatur zwischen 30 und 37 °C.

Der Nachweis und die Quantifizierung der im erfindungsgemäßen Verfahren produzierten R-a-Liponsäure erfolgt beispielsweise mittels eines Bioassays unter Verwendung eines liponsäure- auxotrophen Indikatorstammes (lipA-Mutante). Diese Art der turbidimetrischen Quantifizierung von R-a-Liponsäure ist aus der Literatur bekannt (Herbert und Guest, 1970, Meth. Enzymol.

18A, 269-272). Der im Rahmen der vorliegenden Erfindung ver- wendete Indikatorstamm W14851ip2 (ATCC 25645) würde allerdings auch ohne supplementierte R-a-Liponsäure wachsen, wenn das Me- dium neben Glucose auch noch Acetat und Succinat enthielte. Um ein falschpositives Wachstum des Indikatorstammes im Bioassay bei der Bestimmung der produzierten R-a-Liponsäure zu vermei- den-beispielsweise verursacht durch einen Eintrag von Gluco- se und den vom Produktionsstamm zusätzlich zur R-a-Liponsäure ausgeschiedenen Säuren Acetat und Succinat-erfolgt bereits die Anzucht des R-a-Liponsäure-Produzenten bevorzugt mit Suc- cinat als einziger Kohlenstoffquelle. Dieser Stamm wird mit dem Kulturüberstand einer erfindungsgemäßen Zellanzucht supplementiert ; anhand des Wachstums des Indikatorstammes kann dann der Liponsäure-Gehalt im Kulturmedium bestimmt werden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Der Bakterienstamm Escherichia coli W3110/pASK- IBA3-lipA, der für die Ausführung der Beispiele verwendet wur- de, wurde bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38142 Braunschweig) unter der Nummer DSM 15104 gemäß Budapester Vertrag hinterlegt.

Beispiel 1 : Konstruktion des Vektors pASK-IBA3-lipA A. Amplifizierung des lipA-Gens Das lipA-Gen aus E. coli wurde mittels der Polymeraseketten- reaktion (PCR) unter Verwendung der Pwo-DNA-Polymerase nach

gängiger, dem Fachmann bekannter Praxis amplifiziert. Als Mat- rize diente die chromosomale DNA des E. coli-Wildtypstammes W3110 (ATCC 27325). Als Primer wurden die phosphorothioat- geschützten Oligonukleotide lipAS1 und lipAS2 mit folgenden Sequenzen verwendet : lipAS1 : (SEQ ID NO : 3) 5'-GAT CGA GGT CTC GAA TGA GTA AAC CCA TTG TGA TG-3' BsaI lipAS2 : (SEQ ID NO : 4) 5'-GAT CGA GGT CTC GGC GCT CTT AAC TTC CAT CCC TTT CG-3' BsaI Das bei der PCR erhaltene DNA-Fragment mit einer Länge von ca.

1 kb wurde anschließend mittels eines DNA-Adsorptionssäulchens des QIAprep Spin Miniprep Kits (Qiagen, Hilden) nach Herstel- lerangaben gereinigt.

B. Klonierung des lipA-Gens in den Vektor pASK-IBA3 In das PCR-Fragment wurden über die Primer-Sequenzen Schnitt- stellen für die Restriktionsendonuklease BsaI (Erkennungsse- quenz in den Oligonukleotiden unterstrichen) eingeführt. Das gereinigte PCR-Fragment wurde mit der Restriktionsendonuclease BsaI unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen ge- schnitten, anschließend über ein Agarosegel aufgetrennt und dann mittels des GENECLEAN Kits (BIO 101 Inc., La Jolla, Kali- fornien, USA) nach Herstellerangaben aus dem Agarosegel iso- liert.

Der Klonierungs-und Expressionsvektor pASK-IBA3 (IBA, Insti- tut für Bioanalytik, Göttingen) enthält verschiedene geneti- sche Elemente, die eine kontrollierte Expression eines belie- bigen Gens erlauben. Es handelt sich dabei um einen high-copy Vektor mit einem von der pUC-Plasmidfamilie abgeleiteten Replikationsursprung. Die Expression des klonierten Gens wird durch den Tet-Repressor unterdrückt und kann durch (Anhydro- ) Tetracyclin induziert werden. Des weiteren enthält der Vektor noch die sogenannte Strep-tag II-Sequenz, welche bei der Klo-

nierung direkt an das letzte Codon des klonierten Gens anfusi- oniert wird. Die auf diese Weise entstandene Genfusion codiert nun für ein Protein, das C-terminal um die Aminosäuresequenz des Strep-tag II (SAWSHPQFEK : SEQ ID NO : 5) verlängert ist.

Mit Hilfe dieses Anhängsels ist eine einfache Affinitätsreini- gung des Proteins möglich, da das StrepTagII-Peptid eine Bin- dung an Streptavidin-Säulen vermittelt.

Zur Klonierung des lipA-Gens wurde der Vektor pASK-IBA3 mit dem Restriktionsenzym Eco31I (Isoschizomer von BsaI) unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen geschnitten, anschlie- ßend durch Behandlung mit Alkalischer Phosphatase an den 5'- Enden dephosphoryliert und dann wie das PCR-Fragment mittels der GENECLEAN-Methode gereinigt.

Die Ligation des PCR-Fragments mit dem geschnittenen und dephosphorylierten Vektor erfolgte. nach Herstellerangaben un- ter Verwendung der T4-DNA-Ligase. Die Transformation von E. coli-Zellen des Stammes DH5o. mit dem Ligationsansatz wurde mittels Elektroporation in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise durchgeführt. Der Transformationsansatz wurde auf LB-Ampicillin-Agarplatten (10 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 10 g/1 NaCl, 15 g/1 Agar, 100 mg/1 Ampicillin) ausgebracht und über Nacht bei 37 °C inkubiert.

Die gewünschten Transformanden wurden nach einer Plasmidiso- lierung mittels eines QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hil- den) durch eine Restriktionsanalyse identifiziert.

Im dem auf diese Weise erhaltenen Plasmid pASK-IBA3-lipA (Fig.

2) ist wie oben beschrieben an das letzte Codon des lipA-Gens die Strep-tag II-Sequenz anfusioniert. Diese C-terminale Ver- längerung ist allerdings für die Erfindung nicht relevant, da sie auf die Aktivität des LipA-Proteins und damit auf die R-a- Liponsäure-Produktionsleistung des erfindungsgemäßen Wirtsor- ganismus keinen signifikanten Einfluss hat.

Beispiel 2 : Herstellung eines Produzenten von R-a-Liponsäure Das in Beispiel 1 beschriebene Plasmid pASK-IBA3-lipA wurde mittels Elektroporation in den E. coli-Stamm W3110 transfor- miert und nach Selektion auf LB-Agarplatten mit 100 mg/1 Ampi- cillin wurde das Plasmid aus einer der Transformanden reiso-

liert, mit Restriktionsendonucleasen gespalten und überprüft.

Mit dem Kontrollplasmid pASK-IBA3 wurde in analoger Weise ver- fahren.

Beispiel 3 : Fermentative Produktion von R-a-Liponsäure Für die fermentative Produktion von R-a-Liponsäure wurde der Stamm W3110/pASK-IBA3-lipA verwendet. Als Vergleich diente der Stamm W3110 mit dem Plasmid pASK-IBA3, der unter exakt denselben Bedingungen kultiviert wurde.

Als Vorkultur für die Produktionsanzucht wurden zunächst 5 ml LB-Flüssigmedium, das 100 mg/1 Ampicillin enthielt, mit dem jeweiligen Stamm beimpft und für 16 h bei 37 °C und 160 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und zweimal mit dem entsprechen- den Volumen steriler Saline (0,9 % NaCl) gewaschen. Mit den auf diese Weise vorbereiteten Zellen wurden schließlich 15 ml BS-Medium (7 g/1 K2HP04 ; 3 g/1 KH2PO4 ; 1 g/l (NH4) 2S04 ; 0,1 g/1 MgS04 x 7 H2O ; 0,5 g/1 Na3Citrat x 3 H20 ; 0, 2% säurehydroly- siertes Casein (vitaminfrei) ; 13,5 g/1 Na2Succinat x 6 H20 ; pH 6,8 mit HCl eingestellt), das außerdem 100 mg/1 Ampicillin enthielt, im Verhältnis 1 : 100 angeimpft. Die Inkubation der Produktionskulturen erfolgte bei 37 °C und 160 rpm auf einem Schüttler für 48 h. Die Expression des Liponsäure-Synthase- Gens wurde durch Zugabe von 0,2 mg/1 Anhydrotetracyclin nach ca. 4 h Inkubation induziert. Nach 24 h und 48 h wurden Proben entnommen und die Zellen durch Zentrifugation vom Kulturmedium abgetrennt. Die darin enthaltene R-a-Liponsäure wurde mittels des bekannten turbidimetrischen Bioassays (Herbert und Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272) quantifiziert. Tabelle 1 zeigt die erzielten Gehalte freier R-a-Liponsäure im jeweili- gen Kulturüberstand : Tabelle 1 : Stamm R-a-Liponsäure [pg/l] 24 h 48 h W3110/7, 0 10,0 pASK-IBA3-lipA W3110/0 0 pASK-IBA3