DOMAINE DE L’INVENTION [0001] La présente invention concerne un dispositif et une méthode de détection rapide de bactéries dans un échantillon.

ÉTAT DE LA TECHNIQUE

[0002] Les infections bactériennes sont responsables de nombreuses pathologies, notamment dans les élevages et plus particulièrement dans les élevages ovins ou bovins.

[0003] Pour cela, il est essentiel de pouvoir détecter la présence de la bactérie responsable de l’infection notamment dans le milieu d’élevage, et plus particulièrement d’avoir des méthodes de détection rapide afin de traiter et prévenir les infections bactériennes. Cependant, à ce jour, aucune méthode de détection n’est pleinement satisfaisante.

[0004] Par exemple, les dispositifs de diagnostic présents sur le marché, notamment les dispositifs de détection de la mammite, sont principalement basés sur le dépistage des cellules somatiques qu’on retrouve dans le lait. Or, cette méthode ne permet pas d’identifier la ou les bactérie(s) responsable(s) de l’infection. D’autre part, ces dernières peuvent constituer une trace d’une infection plus ou moins ancienne et donc constituer un indicateur non-spécifique d’une infection en cours. Cela conduit donc les éleveurs à utiliser des antibiothérapies de façon massive et non ciblée.

[0005] D’autres méthodes de détection des bactéries peuvent être utilisées telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) ou la méthode de culture. Toutefois, celles-ci nécessitent d’envoyer les échantillons au laboratoire et donc l’intervention de personnes qualifiées pour mettre en œuvre la méthode de détection et pour analyser les résultats. [0006] De plus, l'utilisation de la méthode de culture nécessite un temps d’incubation de 24h à 48h, ce qui représente une attente trop longue des résultats, compte tenu des enjeux du secteur. Concernant l’approche par la biologie moléculaire (PCR et/ou PCR quantitative), bien que plus rapide et plus spécifique, celle-ci est bien plus onéreuse. De plus, la technique de PCR détecte seulement la présence d’ADN des bactéries et non la présence de bactéries viables, ce qui peut entraîner la détection de faux positifs (bactéries mortes et déjà prises en charge par le système immunitaire de l’hôte).

[0007] Ces méthodes ont donc pour inconvénients d’être longues, fastidieuses, de mettre en œuvre des composés chimiques souvent toxiques pour le manipulateur et pour l’environnement, de nécessiter des matériels coûteux et d’être mises en œuvre dans des locaux adaptés, tels que des laboratoires. Elles ne répondent pas aux besoins des utilisateurs de terrain, notamment des éleveurs.

[0008] A titre d’ exemple particulièrement illustratif, il peut être cité le cas du vétérinaire souhaitant identifier rapidement un agent pathogène infectieux directement sur le lieu où se trouve l’animal malade. Cette approche dite « point-of-care testing » (POCT) fait l’objet d’une attention toute particulière auprès des professionnels concernés.

[0009] Il existe donc un besoin de mettre à disposition des moyens permettant une détection de bactéries rapide, peu coûteuse, peu nocive pour le manipulateur et pour l’environnement, et ne nécessitant pas la contrainte d’une mise en œuvre dans un laboratoire dédié.

[0010] Il existe également un besoin de mettre à disposition des moyens permettant une détection de bactéries « universelle », quelle que soit la nature de l’échantillon d’origine contenant lesdites bactéries.

[0011] Une telle méthode de détection de bactéries pourra également être appliquée dans différents domaines comme par exemple dans la sécurité alimentaire, le contrôle des eaux ou en santé humaine. RÉSUMÉ

[0012] La présente invention concerne l’utilisation d’une solution comprenant un cation et une protéine pour l’immobilisation d’une protéine de bactériophage sur un support.

[0013] Dans un aspect particulier de l’utilisation de cette solution comprenant un cation et une protéine pour l’immobilisation d’une protéine de bactériophage sur un support, ladite protéine de bactériophage est une protéine de liaison au récepteur (RBP).

[0014] Dans un aspect particulier de l’utilisation de cette solution comprenant un cation et une protéine pour l’immobilisation d’une protéine de bactériophage sur un support, ladite protéine de bactériophage est une RBP spécifique de S. aureus. [0015] Dans un aspect particulier de l’invention, la protéine de la solution utilisée est une protéine de lait, l’albumine, l’albumine de sérum bovin (BSA), une protéine de sérum, une protéine de sérum de poulet ou un anticorps.

[0016] Dans un aspect particulier de l’invention, le cation de la solution est choisi parmi un cation monovalent, un cation bivalent, un cation trivalent ou un sel, préférentiellement parmi le groupe comprenant Mg2+, Ca2+, Na+, K+, Fe2+, Fe3+, K+, Zn+, Au3+, Cu+, carbocation, Mn+, Ag+, MgSO ₄ , Na2SCO ₄ , MgCk, CaCk, CaSO ₄ , NaC1, K2SO ₄ et KC1.

[0017] Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une solution comprenant un cation et une protéine pour l’immobilisation d’une protéine de bactériophage sur un support dans laquelle la concentration en cation dans la solution est comprise entre 5 mM et 800 mM de façon inclusive, et la concentration en protéine dans la solution est comprise entre 5 μg/m L et 5 mg/mL de façon inclusive.

[0018] Dans un aspect encore plus particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une solution comprenant un cation et une protéine pour l’immobilisation d’une protéine de bactériophage sur un support dans laquelle la concentration en cation dans la solution est comprise entre 5 mM et 800 mM de façon inclusive, et la concentration en protéine dans la solution est comprise entre 5 μg/m L et 5 mg/mL de façon inclusive et dans laquelle le cation est MgSO ₄ ou NaC1 et la protéine est la BSA. [0019] L’invention concerne également l’utilisation d’une solution comprenant un cation et une protéine pour l’immobilisation d’une protéine de bactériophage sur un support dans laquelle la protéine de liaison au récepteur (RBP) est choisie parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, une RBP du bactériophage CNCM 1-5680 ou un mélange de celles-ci.

[0020] L’invention concerne plus particulièrement encore l’utilisation d’une solution comprenant un cation et une protéine pour l’immobilisation d’une protéine de bactériophage sur un support dans laquelle la protéine de liaison au récepteur (RBP) est choisie parmi une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP de séquence SEQ ID NO : 3, une RBP de séquence SEQ ID NO : 4, une RBP de séquence SEQ ID NO : 5, une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, ou une RBP ayant un pourcentage d’identité d’au moins 95% avec la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID No. 4, une RBP de séquence SEQ ID NO : 5 ou une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, ou un mélange de celles-ci.

[0021] L’invention a également pour objet un procédé de préparation d'un dispositif comprenant un support solide, ledit procédé comprenant une étape a) d’immobilisation d’une protéine de bactériophage ou d’une combinaison de protéines de bactériophage sur le support solide, ladite étape d’immobilisation consistant à mettre en contact le support avec une protéine de bactériophage ou une combinaison de protéines de bactériophage en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine, la protéine de bactériophage étant préférentiellement une RBP, optionnellement une étape b) d'élimination de la ou des protéines de bactériophage non immobilisées au support solide, et optionnellement une étape c) de rinçage, laquelle peut être renouvelée au moins une fois.

[0022] Un autre objet de l’invention concerne un dispositif obtenu selon le procédé de préparation décrit ci-dessus, ledit dispositif étant une plaque de microtitration ou une bandelette. [0023] Dans un autre aspect, l’invention concerne un dispositif de flux latéral comprenant un support solide sur lequel est immobilisé une protéine de liaison au récepteur (RBP).

[0024] Un autre objet de l’invention concerne l’utilisation du dispositif, pour la détection ou la quantification d’une ou plusieurs bactéries présente(s) dans un échantillon.

[0025] L’invention concerne également un procédé pour la détection et/ou la quantification d’une ou plusieurs bactéries présente(s) dans un échantillon avec un dispositif de type bandelette ou plaque de microtitration pour un test ELISA, comprenant les étapes suivantes : i) une étape d’immobilisation d’une protéine de bactériophage ou d’une combinaison de protéine de bactériophages sur le support solide, ladite étape d’immobilisation consistant à mettre en contact le support avec une protéine de bactériophage ou une combinaison de protéines de bactériophages en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine, la protéine de bactériophage étant préférentiellement une RBP, ii) optionnellement une étape d'élimination de la ou des protéines de bactériophage non immobilisées au support solide, iii) optionnellement une étape de rinçage, laquelle peut être renouvelée au moins une fois, iv) détection des bactéries liées aux protéines de bactériophages avec un ligand spécifique de la bactérie choisi parmi un bactériophage spécifique de la bactérie marqué, une protéine de bactériophage spécifique de la bactérie marquée, un bactériophage spécifique de la bactérie couplé à un anticorps marqué, une protéine de bactériophage couplé à un anticorps marqué ou un anticorps marqué ou un aptamère marqué dirigé contre la bactérie dans lequel ladite étape iv) est optionnellement réalisée en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine.

[0026] L’invention a également pour objet une protéine de liaison au récepteur (RBP) d’un bactériophage spécifique de S. aureus, ladite RBP est choisie parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :2, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3, une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, ou une RBP ayant un pourcentage d’identité d’au moins 95% avec la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO :3 , SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 6. DÉFINITIONS

[0027] Dans la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante :

[0028] « Bactériophage » et « phage » sont utilisés indifféremment et désignent la même entité. [0029] « Bactériophage spécifique d’une bactérie » est un bactériophage capable de se lier spécifiquement à cette bactérie. Cette spécificité peut être déterminée par la méthode des spots décrite dans la présente demande.

[0030] « Bandelette » désigne un dispositif de détection par chromatographie à flux latéral, également connu sous le nom d’immunochromatographie à flux latéral. C’est une méthode reposant sur le mouvement d’un échantillon liquide par capillarité à travers une bandelette. Elle a précédemment été décrite pour la détection immunologique d’un analyte d’intérêt dans un échantillon liquide, grâce à un anticorps primaire et un anticorps secondaire (EP1086372B1). Ce sont de simples dispositifs à base de papier destinés à détecter la présence (ou l'absence) d'un analyte cible dans un échantillon liquide (matrice). [0031] « Capture », « liaison », « couplage », « fixation » sont utilisés indifféremment.

[0032] « Immobilisation » est utilisée pour décrire la liaison d’un bactériophage ou d’une protéine de bactériophage sur un support. L’immobilisation peut être réalisée par exemple par adsorption ou par liaison covalente. [0033] « Cation bivalent » et « dication » sont utilisés indifféremment.

[0034] « Elément marqué » est un élément (protéine, bactérie, molécule) conjugué à une molécule pouvant être détectée visuellement. Le marqueur est utilisé pour marquer une bactérie. [0035] “ Identique” ou “ Identité” : lorsqu'il est utilisé dans une relation entre les séquences de deux ou plusieurs séquences d'acides aminés, ce terme fait référence au degré de parenté de séquence entre les séquences d'acides aminés, tel que déterminé par le nombre de correspondances entre les chaînes de deux ou plusieurs résidus d'acides aminés. L'identité mesure le pourcentage de correspondances identiques entre les plus petites séquences de deux ou plusieurs séquences, dont les alignements « à trous » (le cas échéant) sont traités par un modèle mathématique ou un programme informatique particulier (c'est-à-dire des "algorithmes"). L'identité de séquences d'acides aminés apparentées peut être facilement calculée par des méthodes connues par l’Homme du métier. Les méthodes préférées pour déterminer l'identité de séquences sont conçues pour donner la plus grande correspondance entre les séquences testées. Les méthodes de détermination de l'identité entre séquences sont décrites dans des programmes informatiques accessibles au public.

[0036] « Ligand spécifique d’une bactérie » est un ligand capable de se lier spécifiquement à la bactérie. Cette spécificité peut être déterminée par la méthode des billes magnétiques par exemple.

[0037] « Marqueur conjugué » peut être une molécule colloïdale par exemple : une nanoparticule d’or (AuNP) ou or colloïdale, une nanoparticule de carbone ou carbone colloïdal, une bille de latex colorée, une particule magnétique, une molécule fluorescente, une molécule luminescente ou une enzyme telle que la peroxydase de raifort qui catalyse la conversion de substrats chromogènes en composés colorés, ou qui produit de la lumière à partir de substrats chimio luminescents.

[0038] « Plaque de microtitration » désigne un dispositif comprenant un ensemble de puits, il s’agit d’un outil standard dans la recherche et l'analyse clinique des tests de diagnostic des laboratoires. Leur utilisation est très fréquente dans l’Enzyme-linked immunosorbent assay (ELIS A).

[0039] « Protéine d’un bactériophage spécifique d’une bactérie » est une protéine capable de se lier spécifiquement à cette bactérie.

[0040] « Protéine de liaison au récepteur » ou « (RBP) (Receptor Binding Protein) d’un bactériophage » : désigne les protéines qui assurent le contact initial avec le récepteur sur l'enveloppe de la cellule hôte. En effet, celles-ci sont capables de reconnaître des motifs cibles à la surface des bactéries. Au sens de la présente demande, une RBP d’un bactériophage spécifique d’une bactérie est une RBP capable de se lier spécifiquement à cette bactérie. Cette spécificité peut être déterminée par la méthode ELISA telle que décrite dans la présente demande.

Les protéines RBP sont différentes des domaines de liaison à la paroi cellulaire (CBD, Cell Binding Domain). Les RBP sont impliquées dans la première étape du cycle d’infection des phages, alors que les CBD sont impliquées en fin du cycle d’infection. Les CDB sont des domaines protéiques retrouvées dans enzymes lytiques produites par les phages, qui permettent la reconnaissance des peptidoglycanes dans les parois cellulaires.

[0041] « Solution contenant des phages » et « suspension contenant des phages » sont utilisés indifféremment.

[0042] « Surfactant » est une molécule amphiphile permettant d’abaisser la tension superficielle d’une solution aqueuse. A titre d’exemple, le surfactant est le Tween 20.

[0043] « X conjugué à Y » et « Y conjugué à X » sont utilisés indifféremment.

DESCRIPTION DÉTAILLÉE

Utilisation d’une solution [0044] La présente invention concerne l’utilisation d’une solution comprenant un cation et une protéine, pour l’immobilisation d’une protéine de bactériophage sur un support.

[0045] Dans une mise en œuvre particulière de l’invention, la protéine de bactériophage est préférentiellement une protéine de liaison au récepteur (RBP).

[0046] Dans une mise en œuvre tout à fait préférentielle, la protéine de bactériophage et en particulier la RBP est spécifique de Staphylococcus aureus (S. aureus).

[0047] Dans le cadre de la présente invention, les protéines de bactériophages sont en solution, ladite solution comprenant un cation et une protéine. [0048] L’utilisation de la solution permet d’améliorer l’immobilisation de la protéine de bactériophage sur un support solide. Elle permet également d’améliorer la capture d’une bactérie par la protéine ainsi immobilisée.

[0049] Cette immobilisation améliorée est observée une fois la bactérie immobilisée sur le support solide par sa liaison avec le bactériophage ou la protéine de bactériophage et après détection de la bactérie ainsi capturée.

[0050] La solution peut être utilisée pour la procédure d’immobilisation de la protéine de bactériophage sur le support et/ou pour détection et/ou quantification d’une bactérie par des bactériophages ou par des protéines de bactériophage. [0051] La protéine de cette solution est notamment choisie parmi les protéines de lait, en particulier l’albumine, encore plus particulièrement l’albumine de sérum bovin (BSA), ou une protéine de sérum, plus particulièrement de sérum de poulet ou encore un anticorps.

[0052] Dans un mode de réalisation particulier, le cation est choisi parmi un cation monovalent, un cation bivalent, un cation trivalent ou un sel, préférentiellement parmi le groupe comprenant Mg ² +, Ca ² +, Na ⁺ , K ⁺ , Le ²⁺ , Le ³⁺ , K ⁺ , Zn ⁺ , Au ³⁺ , Cu ⁺ , carbocation, Mn ⁺ , Ag ⁺ , MgS0 ₄ , Na ₂ S04, MgCk, CaCk, CaS0 ₄ , NaCl, K2SO4 et KC1.

[0053] Dans un mode de réalisation particulier, la concentration en cation dans la solution est comprise entre 5 mM et 800 mM de façon inclusive. [0054] Dans un mode de réalisation plus particulier, la solution comprend du MgSCL dont la concentration est comprise entre 5 mM et 800 mM de façon inclusive, en particulier entre 5 mM et 300 mM de façon inclusive.

[0055] Dans un mode de réalisation plus particulier, la solution comprend du NaCl dont la concentration est comprise entre 5 mM et 800 mM de façon inclusive. [0056] Dans un mode de réalisation particulier, la concentration en protéine dans la solution est comprise entre 5 pg/mL et 5 mg/mL de façon inclusive. Dans un mode de réalisation plus particulier encore, la protéine est la BSA et sa concentration est comprise entre 0,1 mg/mL à 5 mg/mL de façon inclusive.

[0057] Dans un mode de réalisation, la solution comprend de la BSA à une concentration de 5 ug/m L à 5 mg/mL et du MgSCL à une concentration de 5 mM à 800 mM de façon inclusive.

[0058] Dans un mode de réalisation, la solution comprend de la BSA à une concentration de 0,1 mg/mL à 5 mg/mL et du MgSCL à une concentration de 5 mM à 300 mM de façon inclusive.

[0059] Dans un mode de réalisation particulier, la solution comprend de la BSA à la concentration de 2 mg/mL et du MgSCL à la concentration de 50 mM.

[0060] Dans un mode de réalisation, la solution comprend de la BSA à une concentration de 5 Lig/m L à 5 mg/mL et du NaCl à une concentration de 5 mM à 800 mM de façon inclusive.

[0061] Dans un mode de réalisation, la solution comprend de la BSA à la concentration de 1 mg/mL et du NaCl à la concentration de 150 mM.

[0062] Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend en outre un agent stabilisant, comme le glycérol et/ou un sucre, par exemple du sorbitol et/ou du sucrose.

[0063] Dans le cadre de la présente invention, tout type de bactériophage spécifique d’une bactérie peut être utilisé. Dans un mode de réalisation particulier, le bactériophage est spécifique de S. aureus, il s’agit plus particulièrement, d’un bactériophage choisi parmi les bactériophages spécifiques de S. aureus tels que déposés à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680. [0064] Il peut s’agir en particulier d’un bactériophage spécifique de S. aureus, plus particulièrement, d’un bactériophage choisi parmi les bactériophages spécifiques de S. aureus tels que déposés à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, et CNCM 1-5492.

[0065] Il peut s’agir en particulier d’un bactériophage spécifique de S. aureus, plus particulièrement, d’un bactériophage choisi parmi les bactériophages spécifiques de S. aureus tels que déposés à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680.

[0066] En particulier, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de bactériophages spécifiques de S. aureus choisis parmi les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491 et CNCM 1-5492.

[0067] En particulier, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de bactériophages spécifiques de S. aureus choisis parmi les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680. [0068] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 2 bactériophages choisis parmi les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680.

[0069] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange du bactériophage CNCM 1-5408 avec l’un des bactériophages CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 ou CNCM 1-5680, i.e. un mélange des bactériophages CNCM 1-5408 et CNCM 1-5409, des bactériophages CNCM 1-5408 et CNCM 1-5410, des bactériophages CNCM 1-5408 et CNCM 1-5491, des bactériophages CNCM 1-5408 et CNCM 1-5492 ou des bactériophages CNCM 1-5408 et CNCM 1-5680. [0070] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange du bactériophage CNCM 1-5409 avec l’un des bactériophages CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 ou CNCM 1-5680, i.e. un mélange des bactériophages CNCM 1-5409 et CNCM 1-5410, des bactériophages CNCM 1-5409 et CNCM 1-5491, des bactériophages CNCM 1-5409 et CNCM 1-5492 ou des bactériophages CNCM 1-5409 et CNCM 1-5680.

[0071] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange du bactériophage CNCM 1-5410 avec l’un des bactériophages CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 ou CNCM 1-5680, i.e. un mélange des bactériophages CNCM 1-5410 et CNCM 1-5491, des bactériophages CNCM 1-5410 et CNCM 1-5492 ou des bactériophages CNCM 1-5410 et CNCM 1-5680.

[0072] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange du bactériophage CNCM 1-5491 avec l’un des bactériophages CNCM 1-5492 ou CNCM 1-5680, i.e. un mélange des bactériophages CNCM 1-5491 et CNCM 1-5492 ou des bactériophages CNCM 1-5491 et CNCM 1-5680.

[0073] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange du bactériophage CNCM 1-5492 avec le bactériophage CNCM 1-5680, i.e. un mélange des bactériophages CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680. [0074] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 3 bactériophages choisis parmi les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680.

[0075] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange des bactériophages CNCM 1-5408, CNCM 1-5409 et CNCM 1-5410. Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange des bactériophages CNCM 1-5408, CNCM 1-5491 et CNCM 1-5492.

[0076] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 4 bactériophages choisis parmi les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680.

[0077] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 5 bactériophages choisis parmi les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680.

[0078] Selon un mode de réalisation, le bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 6 bactériophages choisis parmi les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680.

[0079] Dans le cadre de la présente invention, tout type de protéine de bactériophage spécifique d’une bactérie peut être utilisé.

[0080] De façon préférentielle, la protéine utilisée est une protéine de liaison au récepteur des phages (Receptor Binding Protein ou RBP). Il s’agit en particulier de l’utilisation d’une protéine d’un bactériophage spécifique de S. aureus.

[0081] En particulier, il peut d’agir d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus choisi parmi les bactériophages spécifiques de S. aureus tels que déposés à la CNCM sous les CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, et CNCM 1-5492 ou d’un mélange de celles-ci.

[0082] En particulier, 1 il peut s’agir d’une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus choisi parmi les bactériophages spécifiques de S. aureus tels que déposés à la CNCM sous les CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680 ou d’un mélange de celles-ci. [0083] En particulier, il peut s’agir d’une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3 ; une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4 ou d’un mélange de celles-ci. [0084] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 2 RBP choisies parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3 ; une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :6, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4. [0085] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange d’une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, et d’une RBP choisie parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3 ; une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence

SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4.

[0086] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange d’une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :2, et d’une RBP choisie parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3 ; une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4.

[0087] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange d’une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :3, et d’une RBP choisie parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4.

[0088] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange d’une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 5, et d’une RBP choisie parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4.

[0089] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange d’une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, et d’une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4.

[0090] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 3 RBP choisies parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3 ; une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence

SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4.

[0091 ] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 4 RBP choisies parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3 ; une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence

SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4.

[0092] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 5 RBP choisies parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3 ; une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence

SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4.

[0093] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 6 RBP choisies parmi une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3 ; une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence

SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 4.

[0094] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 2 ou 3 RBP choisies parmi une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP de séquence SEQ ID NO : 3.

[0095] Selon un mode de réalisation, la RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus est un mélange de 2, 3, 4, 5 ou 6 RBP choisies parmi une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP de séquence SEQ ID NO : 3, une RBP de séquence SEQ ID NO :4, une RBP de séquence SEQ ID NO : 5 et une RBP de séquence SEQ ID NO : 6. [0096] Selon un mode de réalisation, les RBP précédemment décrites englobent également des RBP ayant un pourcentage d’identité d’au moins 95% avec la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 6 ou un mélange de celles-ci. [0097] Notamment, dans le cadre de la procédure de détection selon l'invention, les bactériophages ou protéines de bactériophages, en particulier les protéines de bactériophages et plus particulièrement encore les RBP, sont immobilisés sur des supports par exemple des plaques de microtitration, des bandelettes d'essai, des lames, des plaquettes, des matériaux filtrants ou des chambres cellulaires à flux continu. Les structures de support peuvent par exemple comprendre du polystyrène, du polypropylène, du polycarbonate, du PMMA, de l'acétate de cellulose, de la nitrocellulose, du verre ou une plaquette de silicium.

[0098] Dans le cadre de la mise en œuvre sur un support de type bandelette, le support est un dispositif à base de papier. Procédé pour la détection et/ou la quantification d’une ou plusieurs bactéries nréscntcfs) dans un échantillon

[0099] La présente invention a pour objet un procédé pour la détection et/ou la quantification d’une ou plusieurs bactéries présente(s) dans un échantillon avec un dispositif de type bandelette ou plaque de microtitration pour un test ELISA, comprenant les étapes suivantes : i) une étape d’immobilisation d’une protéine de bactériophage ou d’une combinaison de protéine de bactériophages sur le support solide, ladite étape d’immobilisation consistant à mettre en contact le support avec une protéine de bactériophage ou une combinaison de protéines de bactériophages en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine, la protéine de bactériophage étant préférentiellement une RBP, ii) optionnellement une étape d’élimination de la ou des protéines de bactériophage non immobilisées au support solide, iii) optionnellement une étape de rinçage, laquelle peut être renouvelée au moins une fois, iv) détection des bactéries liées aux protéines de bactériophages avec un ligand spécifique de la bactérie choisi parmi un bactériophage spécifique de la bactérie marqué, une protéine de bactériophage spécifique de la bactérie marquée, un bactériophage spécifique de la bactérie couplé à un anticorps marqué, une protéine de bactériophage couplé à un anticorps marqué ou un anticorps marqué ou un aptamère marqué dirigé contre la bactérie dans lequel ladite étape iv) est optionnellement réalisée en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine [0100] Les phages ou bactériophages utilisés dans le procédés sont telles que décrites ci-dessous.

Procédé de préparation d’un dispositif

[0101] La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un dispositif comprenant un support solide, ledit dispositif étant préférentiellement une plaque de microtitration ou une bandelette, et ledit procédé comprenant : une étape a) d’immobilisation d’un bactériophage ou d’une combinaison de bactériophages ou d’une protéine de bactériophages ou d’une combinaison de protéines de bactériophages sur le support solide, ladite étape d’immobilisation consistant à mettre en contact le support avec un bactériophage ou une combinaison de bactériophages ou une protéine de bactériophages ou une combinaison de protéines de bactériophages en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine, optionnellement une étape b) d’élimination du ou des bactériophages ou de la ou des protéines de bactériophages non immobilisés au support solide, et optionnellement une étape c) de rinçage, laquelle peut être renouvelée au moins une fois.

[0102] La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un dispositif comprenant un support solide, ledit dispositif étant préférentiellement une plaque de micro titration ou une bandelette, et ledit procédé comprenant : une étape a) d’immobilisation d’une protéine de bactériophages ou d’une combinaison de protéines de bactériophages sur le support solide, ladite étape d’immobilisation consistant à mettre en contact le support avec une protéine de bactériophages ou une combinaison de protéines de bactériophages en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine, optionnellement une étape b) d'élimination de la ou des protéines de bactériophages non immobilisés au support solide, et optionnellement une étape c) de rinçage, laquelle peut être renouvelée au moins une fois. [0103] Dans une mise en œuvre particulière du procédé, le support solide est une plaque de microtitration ou une bandelette.

[0104] Dans une mise en œuvre particulière de l’invention, le procédé de préparation met en œuvre des bactériophages ou une combinaison de bactériophages ou des protéines de bactériophages ou une combinaison de protéines de bactériophages tels que décrits précédemment

[0105] Dans une mise en œuvre particulière du procédé, les bactériophages sont spécifiques de S. aureus, et plus particulièrement encore, sont tels que décrits ci-dessus.

[0106] Dans une mise en œuvre particulière du procédé, la protéine de bactériophage ou la combinaison de protéines de bactériophages est une RBP ou une combinaison de RBP, notamment les RBP spécifiques de S. aureus et plus particulièrement encore, les RBP sont telles que décrites ci-dessus.

[0107] Il est entendu que le procédé de préparation du dispositif selon l’invention se distingue des procédés de l’art antérieur en ce que l’étape d’immobilisation d’une protéine de bactériophages ou d’une combinaison de protéines de bactériophages, notamment une ou plusieurs RBP de bactériophage, ou du bactériophage ou d’une combinaison de bactériophages, se fait en une étape unique en présence d’une solution comprenant simultanément un cation et une protéine. [0108] Dans les différents procédés décrits ci-dessus, l’étape a) se poursuit par une incubation du support en présence de la solution de protéine et de cation et d’un bactériophage ou d’une combinaison de bactériophages ou d’une protéine de bactériophages ou d’une combinaison de protéines de bactériophages. La durée de cette étape et la température d’incubation sont définies par l’homme du métier.

Dispositif obtenu

[0109] Un des objets de la présente invention est un dispositif obtenu par le procédé décrit ci-dessus, ainsi ledit dispositif comprend un bactériophage ou une combinaison de bactériophages ou une protéine de bactériophages ou une combinaison de protéines de bactériophages immobilisés à sa surface.

[0110] Ainsi un autre objet de l’invention est un dispositif de flux latéral comprenant un support solide sur lequel est immobilisé une protéine de liaison au récepteur (RBP).

[0111] Dans une mise en œuvre de l’invention le bactériophage ou la combinaison de bactériophages ou une protéine de bactériophages ou la combinaison de protéine de bactériophages, la RBP ou la combinaison de RBP est spécifique de S. aureus.

[0112] Dans une mise en œuvre de l’invention, la bactérie d’intérêt est S. aureus.

[0113] Un autre objet de l’invention est une plaque de microtitration obtenue par le procédé décrit ci-dessus mettant en œuvre une solution comprenant un cation et une protéine, ainsi ladite plaque de microtitration comprend un bactériophage ou une combinaison de bactériophages ou une protéine de bactériophages ou une combinaison de protéines de bactériophages immobilisés à sa surface {i.e., surface du support solide).

[0114] Un autre objet de l’invention est une plaque de microtitration obtenue par le procédé décrit ci-dessus mettant en œuvre une solution comprenant un cation et une protéine, ainsi ladite plaque de microtitration comprend une protéine de bactériophage ou une combinaison de protéines de bactériophage, notamment une RBP ou une combinaison de RBP, et en particulier, une protéine de bactériophage ou une combinaison de protéines de bactériophage spécifiques de S. aureus immobilisés à sa surface {i.e., surface du support solide). [0115] Dans une mise en œuvre de l’invention, le bactériophage ou la combinaison de bactériophages ou la protéine de bactériophages ou la combinaison de protéines de bactériophages est tel que décrit précédemment.

[0116] Dans une mise en œuvre selon l’invention, le dispositif obtenu selon le procédé de préparation est une plaque de microtitration ou une bandelette, et le support étant préférentiellement constitué de polystyrène, polypropylène, polycarbonate, cellulose acétate, cellulose, verre, et/ou silicium.

[0117] Dans une mise en œuvre particulière de l’invention, le dispositif selon l’invention est une plaque de microtitration ou une bandelette qui comprend un support solide sur lequel est immobilisé une protéine de liaison au récepteur (RB P), le support étant préférentiellement constitué de polystyrène, polypropylène, polycarbonate, cellulose acétate, cellulose, verre, et/ou silicium, le support étant notamment enduit avec une protéine.

[0118] La fixation, capture ou liaison du bactériophage ou de la protéine de bactériophage à la bactérie est un des aspects de l’invention. Ce qui est important à cet égard, c'est la liaison fonctionnelle, c'est-à-dire que les bactériophages ou protéines de bactériophages, anticorps ou aptamères aient des structures accessibles aux bactéries, malgré l’immobilisation au matériau de support.

[0119] Pour supprimer une réaction non spécifique des bactéries à étudier avec le matériau du support, il est possible de mettre en œuvre notamment préalablement au couplage ou postérieurement au couplage sur un support solide, un blocage avec une protéine, notamment de l’albumine de sérum bovin (BSA) ou du Tween 20 ou des substances similaires connues, comme par exemple du lait en poudre ou encore un anticorps non spécifique de la bactérie. [0120] L'immobilisation peut être obtenue sur un support nu ou sur un support préenduit avec une protéine et notamment l’albumine ou un anticorps.

[0121] Ces supports peuvent être produits, préalablement à leur utilisation et être stockés en vue de leur utilisation. [0122] À cette fin, une solution comprenant un cation et une protéine, et des bactériophages ou protéines de bactériophages, en particulier des RBP, est appliquée sur le support. Après immobilisation, par exemple à 4-20°C pendant la nuit ou à 30-65°C pendant 2-4 h, la solution est éliminée et la structure de support est séchée. Dispositif bandelette

[0123] Selon un aspect particulier, l’invention porte sur une bandelette de chromatographie pour détecter une bactérie d’intérêt dans un échantillon.

[0124] Un autre objet de l’invention est une bandelette obtenue par le procédé décrit ci- dessus mettant en œuvre une solution comprenant un cation et une protéine, ainsi ladite plaque de microtitration comprend un bactériophage ou une combinaison de bactériophages ou une protéine de bactériophages ou une combinaison de protéines de bactériophages immobilisés à sa surface (i.e., surface du support solide).

[0125] Un autre objet de l’invention est une bandelette obtenue par le procédé décrit ci- dessus mettant en œuvre une solution comprenant un cation et une protéine, ainsi ladite bandelette comprend une protéine de bactériophage ou une combinaison de protéines de bactériophage, notamment une RBP ou une combinaison de RBP, et en particulier, une protéine de bactériophage ou une combinaison de protéines de bactériophage immobilisées à sa surface (i.e., surface du support solide).

[0126] Chacune des mises en œuvre décrites ci-dessous est particulièrement adaptée à la détection de S. aureus.

[0127] Les mises en œuvre décrites ci-dessous qui font références à des protéines de bactériophages sont particulièrement adaptées à des protéines de type RBP et plus particulièrement encore à des RBP spécifiques de S. aureus.

[0128] Selon un autre aspect, l’invention a pour objet une bandelette sur laquelle est immobilisée une protéine de bactériophage ou une combinaison de protéines de bactériophage. Selon un mode de réalisation, les protéines de bactériophage ou les combinaisons de protéines de bactériophage sont telles que décrites précédemment. [0129] La particularité de la bandelette de détection de l’invention est le blocage de la migration des bactéries sur le support.

[0130] Les modes de réalisation de bandelette sont décrits dans les Figures 1 à 6.

[0131] Les modes de réalisation de la bandelette décrits ci-après sont décrits avant utilisation de ladite bandelette, c’est-à-dire avant mise en contact avec l’échantillon à analyser.

[0132] Ainsi, la présente invention concerne notamment une bandelette pour détecter une bactérie d’intérêt, en particulier S. aureus, dans un échantillon, comprenant au moins une partie qui comprend au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt et/ou au moins une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt.

[0133] Dans un mode de réalisation particulier, ladite bandelette de chromatographie à flux latéral comprend dans l’ordre au moins : une partie de contact (sample pad) comprenant une zone de contact avec l’échantillon ; - une partie de détection comprenant une zone de détection de la bactérie d’intérêt qui comprend au moins un bactériophage spécifique de ladite bactérie d’intérêt et/ou au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de ladite bactérie d’intérêt, une partie absorbante.

[0134] La partie de contact (sample pad) comprend une zone de contact destinée à être mise en contact avec l’échantillon. Sa fonction est de répartir uniformément l'échantillon pour que la migration de l’échantillon par capillarité vers les parties suivantes soit lisse, continue et homogène. La partie de contact et la zone de contact sont une matrice capillaire. Par exemple, la partie de contact et la zone de contact sont en cellulose ou en fibres de verre. [0135] La partie de détection (détection pad) comprend une zone de détection où la bactérie d’intérêt, si elle est présente dans l’échantillon analysé, est captée sur la bandelette grâce à un ligand spécifique de celle-ci qui y est immobilisé. Le rôle de la partie de détection est donc de fournir un bon support et une bonne liaison pour l’immobilisation des ligands spécifiques, tout en limitant les immobilisations non spécifiques. Par exemple, la partie de détection et la zone de détection sont une membrane de nitrocellulose.

[0136] Au sens de la présente demande, un ligand spécifique d’une bactérie est choisi parmi un anticorps dirigé contre la bactérie, un bactériophage spécifique de la bactérie, une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie, un bactériophage spécifique de la bactérie couplé à un anticorps dirigé contre la bactérie, une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie couplée à un anticorps dirigé contre la bactérie. En particulier, il s’agit d’un ligand spécifique de S. aureus et est donc choisi parmi un anticorps dirigé contre S. aureus (ou anti-S. aureus), un bactériophage spécifique de S. aureus, une protéine d’un bactériophage spécifique de S. aureus, un bactériophage spécifique de S. aureus couplé à un anticorps anti-S. aureus, une protéine d’un bactériophage spécifique de S. aureus couplée à un anticorps anti-S. aureus.

[0137] Selon un mode de réalisation, les bactériophages et protéines de bactériophage sont tels que décrits précédemment.

[0138] La partie absorbante (absorption pad) a un rôle d’ absorption. Elle contribue ainsi à maintenir le débit du flux au travers de la bandelette et permet de récupérer les excédents d’échantillon et de réactifs, évitant ainsi le reflux d’échantillon. Par exemple, la partie absorbante est en coton. [0139] Au sens de la présente demande, « dans l’ordre » signifie l’ordre dans lequel les différentes parties qui composent la bandelette vont être traversées par le flux contenant l’échantillon, mais ce terme ne signifie pas que ces parties sont forcément contiguës.

[0140] Dans un mode de réalisation particulier, l’une des extrémités de la partie de contact est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une première zone de superposition, l’une des extrémités de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie en amont de celle-ci pour former une deuxième zone de superposition et l’autre extrémité de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une troisième zone de superposition, et l’une des extrémités de la partie absorbante est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une quatrième zone de superposition. En particulier, la première, la deuxième, la troisième et la quatrième zone de superposition sont distinctes les unes des autres. En particulier, la zone de contact est distincte de la première zone de superposition. En particulier, la zone de détection est distincte de la deuxième et de la troisième zone de superposition.

[0141] Dans un mode de réalisation particulier, l’une des extrémités de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie de contact et l’autre extrémité de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie absorbante. [0142] Dans un mode de réalisation plus particulier, l’une des extrémités de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie de contact pour former une première zone de superposition, et l’autre extrémité de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie absorbante pour former une deuxième zone de superposition. En particulier, la première et la deuxième zone de superposition sont séparées les unes des autres. En particulier, la zone de contact est distincte de la première zone de superposition. En particulier, la zone de détection est distincte de la première et de la deuxième zone de superposition.

[0143] Dans un mode de réalisation particulier, la zone de détection est une zone où les bactériophages et/ou protéines de bactériophages sont déposés (Figures 1, 3). [0144] Dans un mode de réalisation particulier, ladite bandelette comprend en outre, entre la partie de contact et la partie de détection, une partie de marquage qui comprend une zone de marquage comprenant un marqueur.

[0145] La partie de marquage (conjugate pad) comprend une zone de marquage où les bactéries sont marquées avec un marqueur lorsque le flux d’échantillon à analyser la traverse. Son rôle est de maintenir le marqueur jusqu’à utilisation de la bandelette et de libérer le marqueur lorsqu’il y a reconnaissance entre le marqueur et une bactérie, au passage du flux d’échantillon. Par exemple la partie de marquage et la zone de marquage sont en fibres de verre, cellulose ou polyesters. [0146] Dans un mode de réalisation particulier, la zone de détection est répartie après la zone de dépôt de l’échantillon (sample pad) et après la zone de marquage (conjugate pad) si elle est présente (Figure 2), ou si elle est absente (Figure 4) avant la zone d’adsorption.

[0147] Dans un mode de réalisation particulier, la zone de détection se confond avec la zone de marquage (conjugate pad) (Figure 5 et 6).

Marqueurs

[0148] Différents types de marqueurs peuvent être utilisés pour la détection des bactéries capturés par les bactériophages ou protéines de bactériophages.

[0149] Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, le marqueur peut être tout marqueur apte à marquer une bactérie, un bactériophage, une protéine, en particulier une protéine de bactériophage, un anticorps ou un aptamère. Les marqueurs de bactéries sont bien connus de l’Homme du métier.

[0150] Dans un mode de réalisation, le marqueur est un marqueur conjugué, i.e. le marqueur est lié à un ligand pour marquer la bactérie. En particulier, le marqueur conjugué est un marqueur conjugué à au moins un ligand spécifique de la bactérie d’intérêt. Par « conjugué à au moins un ligand spécifique », on entend qu’un marqueur peut être conjugué à un ligand spécifique ou à plusieurs ligands spécifiques différents.

[0151] Dans un mode de réalisation, ledit marqueur est couplé directement au ligand pour marquer la bactérie. Dans un mode de réalisation, ledit marqueur est couplé indirectement au ligand via une ou plusieurs molécule(s).

[0152] Dans la présente demande, les marqueurs utilisés peuvent être des molécules colloïdales, en particulier les nanoparticules d’or (AuNP). A titre d’exemple, il peut s’agit de nanosphères d’or ou de nanobâtonnets d’or. L’agrégation des nanoparticules d’or entraîne l’apparition d’une couleur, en particulier d’une couleur rose, détectable dans le visible, en raison de la longueur d’onde d’absorbance des nanoparticules d’or.

[0153] Dans le cadre d’un dispositif de type plaque de microtitration pour un test ELIS A, l’élément marqué peut être un anticorps spécifique à la bactérie couplé avec une enzyme, par exemple la peroxydase de raifort (HRP), qui catalyse la conversion de substrats chromogènes en composés colorés, ou qui produit de la lumière à partir de substrats chimioluminescents. Des exemples de tels substrats incluent, de façon non limitative, l'ABTS, l'OPD, le DAB, 1AEC ou encore le TMB (3, 3', 5,5'- Tétraméthylbenzidine). Dans la présente demande, il s’agit un anticorps couplé avec une enzyme (la peroxydase de raifort) et la révélation de la couleur est faite grâce à l’ajout du TMB.

[0154] Le marquage peut être réalisé par une liaison intermédiaire par un complexe biotine/streptavidine qui est couplé à HRP ou à une molécule colloïdale, en particulier l’or.

[0155] Sauf mention contraire, au sens de la présente invention, ledit au moins un ligand spécifique de la bactérie d’intérêt peut être au moins un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, au moins un aptamère spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplé à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, au moins une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplée à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt.

[0156] En particulier, la bactérie d’intérêt est S. aureus et ces ligands spécifiques se lisent comme des ligands spécifiques de S. aureus ou dirigés contre S. aureus.

[0157] Dans un mode de réalisation, les bactériophages et protéines de bactériophages sont tels que décrits précédemment.

[0158] Ainsi, le marqueur conjugué à un ligand spécifique de la bactérie d’intérêt, en particulier S. aureus, peut être un marqueur conjugué à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, un marqueur conjugué à un aptamère spécifique de la bactérie d’intérêt, un marqueur conjugué à un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, un marqueur conjugué à une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, un marqueur conjugué à un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplé à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, un marqueur conjugué à une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplée à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, un marqueur conjugué à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt couplé à un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt ou un marqueur conjugué à une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplée à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt.

[0159] Dans un mode de réalisation plus particulier, la présente invention porte sur une bandelette pour détecter S. aureus dans un échantillon, comprenant dans l’ordre au moins : une partie de contact comprenant une zone de contact avec l’échantillon ; une partie de marquage comprenant une zone de marquage qui comprend un marqueur conjugué à au moins un ligand spécifique de S. aureus, en particulier une nanoparticule d’or conjuguée à au moins un ligand spécifique de S. aureus ; une partie de détection comprenant une zone de détection de S. aureus, qui comprend au moins un bactériophage spécifique de S. aureus et/ou une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de S. aureus, en particulier une RBP, une partie absorbante.

[0160] En particulier, la zone de marquage comprend un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus ou un marqueur conjugué à un aptamère spécifique de S. aureus, plus particulièrement une nanoparticule d’or conjugué à un anticorps anti-S. aureus ou une nanoparticule d’or conjugué à un aptamère spécifique de S. aureus.

[0161] En particulier, la zone de marquage comprend un marqueur conjugué à au moins un bactériophage spécifique de S. aureus. En particulier, elle comprend un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5408, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5409, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5410, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5491, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5492, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5680 ou un marqueur conjugué à un mélange de bactériophage tel que décrit précédemment. En particulier, elle comprend ces cinq marqueurs conjugués à des bactériophages. Plus particulièrement, ledit marqueur conjugué à ces phages est une nanoparticule d’or. [0162] En particulier, la zone de marquage comprend un marqueur conjugué à au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de S. aureus. En particulier, ladite au moins une protéine est une RBP. En particulier, elle comprend un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5408, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5409, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5410, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5491, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5492, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5680 ou un marqueur conjugué à un mélange de protéines de bactériophages tel que décrit précédemment. En particulier, elle comprend ces cinq marqueurs conjugués à des protéines de bactériophages. Encore plus particulièrement, ledit marqueur conjugué à ces protéines de bactériophages est une nanoparticule d’or.

[0163] En particulier, la zone de marquage comprend un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5408 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5409 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5410 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5491 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5492 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5680 couplé à un anticorps anti-S. aureus ou un marqueur conjugué à un mélange de bactériophages tels que décrit précédemment couplé à un anticorps anti-S. aureus.

[0164] En particulier, elle comprend un marqueur conjugué à une protéine du bactériophage CNCM 1-5408 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué à une protéine du bactériophage CNCM 1-5409 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué à une protéine du bactériophage CNCM 1-5410 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué à une protéine du bactériophage CNCM 1-5491 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué à une protéine du bactériophage CNCM 1-5492 couplé à un anticorps anti-S. aureus, un marqueur conjugué à une protéine du bactériophage CNCM 1-5680 couplé à un anticorps anti-S. aureus ou un marqueur conjugué à un mélange de protéines de bactériophages tel que décrit précédemment couplé à un anticorps anti-S. aureus.

[0165] En particulier, il s’agit d’un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé au bactériophage CNCM 1-5408, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé au bactériophage CNCM 1-5409, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé au bactériophage CNCM 1-5410, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé au bactériophage CNCM 1-5491, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé au bactériophage CNCM 1-5492, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé au bactériophage CNCM 1-5680 ou un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé à un mélange de bactériophages tel que décrit précédemment.

[0166] En particulier, il s’agit d’un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé à une protéine du bactériophage CNCM 1-5408, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé à une protéine du bactériophage CNCM 1-5409, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé à une protéine du bactériophage CNCM 1-5410, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé à une protéine du bactériophage CNCM 1-5491, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé à une protéine du bactériophage CNCM 1-5492, un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé à une protéine du bactériophage CNCM 1-5680 ou un marqueur conjugué à un anticorps anti-S. aureus couplé à un mélange de protéines du bactériophages tel que décrit précédemment.

[0167] En particulier, la zone de détection comprend au moins un bactériophage CNCM 1-5408, au moins un bactériophage CNCM 1-5409, au moins un bactériophage CNCM 1-5410, au moins un bactériophage CNCM 1-5491, au moins un bactériophage CNCM 1-5492, un bactériophage CNCM 1-5680 ou un mélange de bactériophages tel que décrit précédemment.

[0168] En particulier, la zone de détection comprend au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5408, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5409, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5410, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5491, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5492, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5680 ou un mélange de protéines de bactériophages tel que décrit précédemment.

[0169] Dans un autre mode de réalisation, ladite bandelette (de chromatographie à flux latéral) comprend dans l’ordre au moins : une partie de contact comprenant une zone de contact avec l’échantillon ; une partie de marquage comprenant une zone de marquage qui comprend un marqueur conjugué à au moins un ligand spécifique de la bactérie d’intérêt choisi parmi au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplé à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, au moins une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplée à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, une partie de détection comprenant une zone de détection de la bactérie d’intérêt qui comprend au moins un ligand spécifique de la bactérie d’intérêt, une partie absorbante.

[0170] En particulier, ledit au moins un ligand spécifique de la bactérie d’intérêt compris dans la zone de détection est au moins un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, au moins un aptamère spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplé à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt, au moins une protéine d’un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt couplée à un anticorps dirigé contre la bactérie d’intérêt.

[0171] Dans un mode de réalisation plus particulier, la présente invention porte sur une bandelette pour détecter S. aureus dans un échantillon, comprenant dans l’ordre au moins : une partie de contact comprenant une zone de contact avec l’échantillon ; une partie de marquage comprenant une zone de marquage qui comprend un marqueur conjugué à au moins un ligand spécifique de S. aureus choisi parmi : au moins un bactériophage spécifique de S. aureus, au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique S. aureus, au moins un bactériophage spécifique de S. aureus couplé à un anticorps dirigé contre S. aureus, au moins une protéine d’un bactériophage spécifique de S. aureus couplée à un anticorps dirigé contre S. aureus ; - une partie de détection comprenant une zone de détection de S. aureus, qui comprend au moins un ligand spécifique de S. aureus ; une partie absorbante.

[0172] En particulier, la zone de marquage comprend un marqueur conjugué à au moins un bactériophage spécifique de S. aureus. En particulier, elle comprend un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5408, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5409, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5410, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5491, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5492, un marqueur conjugué au bactériophage CNCM 1-5680 ou un mélange de bactériophage conjugués avec un marqueur tel que décrit précédemment. Encore plus particulièrement, ledit marqueur conjugué à ces phages est une nanoparticule d’or.

[0173] En particulier, la zone de marquage comprend un marqueur conjugué à au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de S. aureus. En particulier, ladite au moins une protéine est une RBP. En particulier, elle comprend un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5408, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5409, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5410, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5491, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5492, un marqueur conjugué à au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5680 ou un mélange de protéines de bactériophages conjugués avec un marqueur tel que décrit précédemment. Encore plus particulièrement, ledit marqueur conjugué à ces protéines de bactériophages est une nanoparticule d’or.

[0174] En particulier, la zone de détection comprend un anticorps anti-S aureus ou un aptamère spécifique de S. aureus. En particulier, la zone de détection comprend au moins un bactériophage spécifique de la bactérie d’intérêt, plus particulièrement un bactériophage CNCM 1-5408, un bactériophage CNCM 1-5409, un bactériophage CNCM 1-5410, un bactériophage CNCM 1-5491, un bactériophage CNCM 1-5492, un bactériophage CNCM 1-5680 ou un mélange de bactériophages tel que décrit précédemment. Encore plus particulièrement, elle comprend ces cinq bactériophages.

[0175] En particulier, la zone de détection comprend au moins une protéine d’au moins un bactériophage spécifique de S. aureus, en particulier une RBP. Plus particulièrement, elle comprend au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5408, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5409, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5410, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5491, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5492, au moins une protéine du bactériophage CNCM 1-5680 ou un mélange de protéines de bactériophages tel que décrit précédemment. Encore plus particulièrement, elle comprend ces cinq protéines de bactériophages. [0176] En particulier, la zone de détection comprend au moins un bactériophage spécifique de S. aureus couplé à un anticorps dirigé contre S. aureus et/ou au moins une protéine d’un bactériophage spécifique de S. aureus couplée à un anticorps dirigé contre S. aureus, en particulier ledit bactériophage est choisi parmi les bactériophages CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492, CNCM 1-5680 et un mélange de ces bactériophages tel que décrit précédemment, et ladite protéine est choisie parmi les protéines de ces phages ou un mélange de ces protéines de bactériophage tel que décrit précédemment.

[0177] Dans un mode de réalisation particulier, lorsque la bandelette comprend au moins quatre parties, l’une des extrémités de la partie de contact est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une première zone de superposition ; l’une des extrémités de la partie de marquage est superposée avec l’une des extrémités de la partie en amont de celle-ci pour former une deuxième zone de superposition et l’autre extrémité de la partie de marquage est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une troisième zone de superposition ; l’une des extrémités de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie en amont de celle-ci pour former une quatrième zone de superposition et l’autre extrémité de la partie de détection est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une cinquième zone de superposition ; et l’une des extrémités de la partie absorbante est superposée avec l’une des extrémités de la partie en aval de celle-ci pour former une sixième zone de superposition. En particulier, la première, la deuxième, la troisième, la quatrième, la cinquième et la sixième zone de superposition sont séparées les unes des autres. En particulier, la zone de contact est distincte de la première zone de superposition. En particulier, la zone de marquage est distincte de la deuxième et de la troisième zone de superposition. En particulier, la zone de détection est distincte de la quatrième et de la cinquième zone de superposition.

[0178] Dans un mode de réalisation particulier, l’une des extrémités de la partie de marquage est superposée à l’une des extrémités de la partie de contact et l’autre extrémité de la partie de marquage est superposée à l’une des extrémités de la partie de détection ; l’autre extrémité de la partie de détection étant superposée avec l’une des extrémités de la partie absorbante.

[0179] Dans un mode de réalisation particulier, l’une des extrémités de la partie de marquage est superposée à l’une des extrémités de la partie de contact pour former une première zone de superposition, et l’autre extrémité de la partie de marquage est superposée à l’une des extrémités de la partie de détection pour former une deuxième zone de superposition ; l’autre extrémité de la partie de détection étant superposée avec l’une des extrémités de la partie absorbante pour former une troisième zone de superposition. En particulier, la première, la deuxième et la troisième zone de superposition sont séparées les unes des autres. En particulier, la zone de contact est distincte de la première zone de superposition. En particulier, la zone de marquage est distincte de la première et de la deuxième zone de superposition. En particulier, la zone de détection est distincte de la deuxième et de la troisième zone de superposition.

[0180] Dans un mode de réalisation particulier, la zone de détection est une ligne transversale à la bandelette, formant ainsi une ligne de détection ou ligne de test (test line). [0181] Dans un mode de réalisation particulier, la zone de détection est répartie et est limitée par une ligne transversale à la bandelette.

[0182] Optionnellement, la partie de détection peut comprendre en outre une zone de contrôle comme décrit précédemment. Test ELI SA

[0183] Le principe de TELISA consiste à piéger, entre un « anticorps de capture » et un « anticorps de détection », les analytes (antigènes, bactéries, virus, etc...). La spécificité du système de détection de la présente invention par rapport au système ELISA classique est le remplacement d’un ou des deux anticorps par les bactériophages ou les protéines de bactériophages.

[0184] Dans le cadre de mise en œuvre de la présente invention sous la forme d’un test ELISA, la détection et/ou quantification des bactéries dans un échantillon est réalisée par le remplacement d’un des deux anticorps ou des deux anticorps du test ELISA classique par les bactériophages ou les protéines de bactériophages. [0185] Dans un mode de réalisation particulier du test ELISA selon l’invention, la détection et/ou quantification des bactéries dans un échantillon est réalisée par le remplacement d’un des deux anticorps ou des deux anticorps du test ELISA classique par les bactériophages ou les protéines de bactériophages spécifiques de S. aureus.

[0186] Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, il est possible de remplacer l’anticorps couplé à un marqueur par des protéines de bactériophages ou des bactériophages couplés directement ou indirectement à un marqueur (or ou autre sonde).

[0187] Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, il est possible de remplacer l’anticorps couplé à un marqueur par des RBP couplées directement ou indirectement à un marqueur (or ou autre sonde). [0188] Il est possible d’utiliser un anticorps pour la révélation et /ou de la détection de la présence de la bactérie dans l’échantillon. [0189] Il est possible d’utiliser plusieurs bactériophages ou protéines de bactériophages ou de les combiner avec les anticorps afin de capter plusieurs souches bactériennes (spectre de détection).

[0190] Dans ce système, au lieu d’utiliser l’anticorps couplé à la HRP, il est possible d’utiliser l’anticorps couplé à une molécule colloïdale telle que l’or ou une autre molécule de marqueur afin de mesurer l’absorbance directement, sans besoin de l’étape de la révélation par TMB.

[0191] Selon un mode de réalisation, les bactériophages ou les protéines de bactériophages sont utilisés pour la capture des bactéries (analytes) et un anticorps est utilisé pour la détection (Figure 7A). Dans cette mise en œuvre particulière, les bactériophages ou protéines de bactériophage sont immobilisés sur le support à l’aide d’une solution comprenant un cation et une protéine (en particulier une solution de MgSO ₄ et BSA ou une solution de NaCl et BSA). Dans une mise en œuvre particulière, les bactériophages ou protéines de bactériophage spécifiques de S. aureus sont immobilisées sur le support à l’aide d’une solution comprenant un cation et une protéine (en particulier une solution de MgSC>4 et BSA ou une solution de NaCl et BSA).

[0192] Dans une autre mise en œuvre de l’invention, les protéines de bactériophage, en particulier les RBP, sont immobilisées sur le support à l’aide d’une solution comprenant un cation et une protéine. Dans une autre mise en œuvre de l’invention, les RBP sont immobilisées sur le support à l’aide d’une solution comprenant un cation et une protéine, ces RBP permettent dans une mise en œuvre particulière, la détection de S. aureus.

[0193] Il est aussi possible de remplacer l’anticorps couplé à un marqueur par des protéines de bactériophages ou des bactériophages couplés directement ou indirectement à un marqueur (or ou autre sonde) pour la détection des bactéries (Figure 7B). Dans une autre mise en œuvre de l’invention, les protéines de bactériophage ou les bactériophages sont spécifiques de S. aureus et sont couplés directement ou indirectement à un marqueur (or ou autre sonde) pour la détection des bactéries

[0194] Dans une autre mise en œuvre de l’invention, les protéines de bactériophage, en particulier les RBP, sont utilisées pour la détection des bactéries et sont utilisées dans une solution comprenant un cation et une protéine (en particulier une solution de MgS04 et BSA ou une solution de NaCl et BSA).

[0195] Dans une autre mise en œuvre de l’invention, les RBP sont utilisées pour la détection des bactéries et sont utilisées dans une solution comprenant un cation et une protéine (en particulier une solution de MgS04 et BSA ou une solution de NaCl et BSA). Dans une autre mise en œuvre de l’invention, les RBP sont spécifiques de S. aureus.

[0196] Ainsi, des modes de réalisation alternatifs de la présente invention incluent l’utilisation des bactériophages ou protéines de bactériophages pour la capture et la détection des bactéries (Figure 7C) ou l’utilisation d’un anticorps pour la capture des bactéries et l’utilisation de bactériophages ou protéines de bactériophages pour la détection (Figure 7B). Dans une autre mise en œuvre de l’invention, les protéines de bactériophage sont spécifiques de S. aureus.

[0197] Dans une autre mise en œuvre de l’invention, les protéines de bactériophage, en particulier les RBP, sont utilisées pour la capture et la détection des bactéries et sont utilisées dans une solution comprenant un cation et une protéine (en particulier une solution de MgS04 et BSA ou une solution de NaCl et BSA). Dans une autre mise en œuvre de l’invention, les RBP sont spécifiques de S. aureus.

[0198] Il est également possible d’utiliser plusieurs bactériophages ou protéines de bactériophage ou de les combiner avec les anticorps afin de capter plusieurs souches bactériennes (spectre de détection).

Mises en œuyre particulières de l’invention

[0199] Dans le cadre de l’invention, il est entendu que le terme bactériophage peut être remplacé par l’un des bactériophages spécifiques de S. aureus tels que déposés à la CNCM sous les numéros CNCM 1-5408, CNCM 1-5409, CNCM 1-5410, CNCM 1-5491, CNCM 1-5492 et CNCM 1-5680 ou par un mélange de ces bactériophages tel que décrit précédemment.

[0200] De la même façon, il est entendu que le terme RBP peut être remplacé par une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM-I-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3, une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :4, une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 5, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 6 ou un mélange de ces RBP tel que décrit précédemment. Il est entendu également que le terme RBP peut être remplacé par une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM-I-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3, une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, une RBP du bactériophage CNCM 1-5680, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :4 ou encore un mélange de ces RBP tel que décrit précédemment. Protéines de phases

[0201] La présente invention concerne également une RBP d’un bactériophage spécifique de S. aureus, en particulier une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, plus particulièrement une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM-I-5409, plus particulièrement une RBP de séquence SEQ ID NO : 2, une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, plus particulièrement une RBP de séquence SEQ ID NO : 3, une RBP du bactériophage CNCM 1-5491, plus particulièrement une RBP de séquence SEQ ID NO : 5, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5492, plus particulièrement une RBP de séquence SEQ ID NO : 6.

[0202] En particulier, la présente invention concerne une RBP du bactériophage CNCM 1-5408, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :1, une RBP du bactériophage CNCM 1-5409, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO :2, et une RBP du bactériophage CNCM 1-5410, en particulier une RBP de séquence SEQ ID NO : 3. [0203] Selon un mode de réalisation, les RBP telles que décrites précédemment englobent des RBP ayant un pourcentage d’identité d’au moins 95% avec la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 6. BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES

[0204] Figure 1 est un schéma d’un mode de réalisation Ml dans lequel A est un marqueur de la bactérie cible (exemples : anticorps spécifique à la bactérie couplé à un marquage ou phage/protéine de phages couplé(e) à un marquage ou un marqueur qui colore la bactérie) et l’ovale plein est une bactérie. Le marqueur est déposé sur la partie de marquage. Les phages/protéines de phages sont déposé(e)s sur une ligne de la membrane de cellulose.

[0205] Figure 2 est un schéma d’un mode de réalisation M2 dans lequel A est un marqueur de la bactérie cible (exemples : anticorps spécifique à la bactérie couplé à un marquage ou phage/protéine de phages couplé(e) à un marquage ou un marqueur qui colore la bactérie) et l’ovale plein est une bactérie. Le marqueur est déposé sur la partie de marquage. Les phages/protéines de phages sont déposé(e)s sur une partie de la membrane de cellulose.

[0206] Figure 3 est un schéma d’un mode de réalisation M3 identique à Ml mais dans lequel les bactéries sont colorées dans la solution par un marqueur A, ledit marqueur A étant un marqueur de la bactérie cible (exemples : anticorps spécifique à la bactérie couplé à un marquage ou phage/protéine de phages couplé(e) à un marquage ou un marqueur qui colore la bactérie dans la solution). Les phages/protéines de phages sont déposé(e)s sur une ligne de la membrane de cellulose.

[0207] Figure 4 est un schéma d’un mode de réalisation M4 identique à M2 mais dans lequel les bactéries sont colorées dans la solution par un marqueur A, ledit marqueur A étant un marqueur de la bactérie cible (par exemple : un anticorps spécifique à la bactérie couplé à un marquage ou phage/protéine de phages couplé(e) à un marquage ou un marqueur qui colore la bactérie). Les phages/protéines de phages sont déposé(e)s sur une partie de la membrane cellulose. [0208] Figure 5 est un schéma d’un mode de réalisation M5 identique à Ml mais dans lequel les phages/protéines de phages et le marqueur A des bactéries sont déposés sur la partie de marquage (Conjuguée PAD), ledit marqueur A étant un marqueur de la bactérie cible (par exemple, un anticorps spécifique à la bactérie couplé à un marquage ou phage/protéine de phages couplé(e) à un marquage ou un marqueur qui colore la bactérie).

[0209] Figure 6 est un schéma d’un mode de réalisation M6 identique à M5 mais dans lequel les phages/protéines de phages sont déposé(e)s sur la partie de marquage (Conjuguée PAD) mais pas le marqueur. Les bactéries sont colorées dans la solution par un marqueur A, ledit marqueur A étant un marqueur de la bactérie cible (par exemple : un anticorps spécifique à la bactérie couplé à un marquage ou phage/protéine de phages couplé(e) à un marquage ou un marqueur qui colore la bactérie dans la solution).

[0210] Figure 7A est un schéma d’un mode de réalisation de l’invention d’un système ELISA, dans lequel les phages ou protéines de phage sont utilisé(e)s pour la capture de la bactérie. [0211] Figure 7B est un schéma d’un mode de réalisation de l’invention d’un système

ELISA, dans lequel les phages ou protéines de phage sont utilisé(e)s pour la détection de la bactérie.

[0212] Figure 7C est schéma d’un mode de réalisation de l’invention d’un système ELISA, dans lequel les phages ou protéines de phage sont utilisé(e)s pour la capture et la détection de la bactérie.

[0213] Figure 8 est une photographie montrant la détection de S. aureus sur une bandelette sur laquelle sont immobilisées des protéines de bactériophages. L’effet de la solution A seule est testée (solution contenant du MgSOf), de la solution B (BSA) ou de la combinaison des solutions A et B. [0214] Figure 9 est une photographie montrant la détection de S. aureus sur une bandelette sur laquelle sont immobilisée des protéines de bactériophages. Différentes concentrations de bactéries sont testées ainsi que l’absence de bactérie dans l’échantillon. [0215] Figure 10A est une photographie montrant une plaque de microtitration montrant la présence de S. aureus.

[0216] Figure 10B est un graphique montrant l’intensité du signal en fonction de la concentration en bactéries. [0217] Figure 11 est un histogramme présentant le lien entre la densité optique mesurée (OD) et la concentration en bactérie exprimée en UFC/mL, un témoin sans bactérie est présent (TM (sans bactérie)).

[0218] Figure 12 est une photographie montrant que l’expression des protéines RBP des phages 2, 3 5 et 7 dans les bactéries BL21 a été vérifiée sur gel. [0219] Figure 13 est un graphique montrant la spécificité des protéines des phages phi5 (cD5-biotinylé) par la mesure de la densité optique (en abscisse) pour différentes souches de bactéries (dont les noms figurent en ordonnée), évaluée par un test ELISA indirect.

[0220] Figure 14 est un graphique montrant la spécificité des protéines du phage phi5 (cD5-biotinylé) et de l’anticorps anti S. aureus par la mesure de la densité optique (en abscisse) pour différentes souches de bactéries (dont les noms figurent en ordonnée), évaluée par un test ELISA indirect.

[0221] Figure 15 est un histogramme montrant la quantité de bactérie S. aureus de la souche 79 capturée (déterminée par l’air sous la courbe) en fonction de la solution utilisée pour l’immobilisation de la RBP du bactériophage phi 5 (protéine) : NaCl et BSA, BSA seul, NaCl seul, et sans BSA ni NaCl.

[0222] Figure 16 est un histogramme montrant la quantité de bactérie S. aureus de la souche C24b capturée (déterminée par l’air sous la courbe) en fonction de la solution utilisée pour l’immobilisation de la RBP du bactériophage phi 5 (protéine) : NaCl et BSA, BSA seul, NaCl seul, et sans BSA ni NaCl. [0223] Figure 17 est un histogramme qui montre que la protéine RBPs du phage 2 a une affinité pour l’espèce S. aureus, i.e., pas d’affinité pour les bactéries S. epidermis ou S. algenitis. EXEMPLES

[0224] La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui illustrent non-limitativement l’invention.

Exemple 1 : Activité de bactériophages

1.1. Détermination de l’activité d’un bactériophage sur une souche bactérienne [0225] Pour identifier si un bactériophage est spécifique d’une bactérie, la méthode des spots a été utilisé. Sur une boite de Pétri où est étalée une culture de bactérie en phase exponentielle, au moins un spot comprenant le bactériophage est déposé. Si une plage de lyse est observée autour du spot, cela signifie que le bactériophage est actif pour cette bactérie, autrement dit que le bactériophage est spécifique de cette bactérie. 1.2. Bactériophages utilisés

[0226] Plusieurs phages ont été testés dans la présente demande, notamment les souches suivantes :

- la souche de bactériophage déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro CNCM 1-5408 (phage 2), - la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro

CNCM 1-5409 (phage 3),

- la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro

CNCM 1-5410 (phage 7),

- la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5491 (phage 9),

- la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro

CNCM 1-5492 (phage 10),

- la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5680 (phage 5).

1.3 Détermination du spectre d’activité des phages isolés

[0227] Selon les profils de digestion, neuf phages ont finalement été sélectionnés pour tester leur activité sur différentes souches de S. aureus isolées à partir des échantillons d’élevage.

[0228] Pour les phages 2 à 7, l’activité des phages isolés est comparée à celle du phage de référence qui est le phage K (phage 1).

[0229] Résultats :

Le spectre d’activité a été testé sur les 30 souches de S. aureus (Tableau 1) ou sur 19 souches de S. aureus (Tableau 2) par la méthode de spot. L’intensité de lyse de ces phages sur chacune des souches bactériennes est détaillée dans le tableau 1 et le tableau 2. Le tableau 1 représente donc le spectre d’activité des phages isolés sur les souches de S. aureus bovines et le tableau 2 représente le spectre d’activité des phages isolés sur différentes souches bactériennes. La lyse obtenue par la méthode de spot est notée de (-) = pas d’activité à (+++++) = très active.

Tableau 1 : H cr cT

C

K)

[0230] L’appréciation de l’intensité de lyse est appréciée de 0 (-) à +++++. La notation «C » signifie que quelques colonies sont observées dans la plage de lyse.

[0231] Ces résultats montrent que :

- Le phage K (ATCC 19685-B1) (phage 1) infecte 28 souches sur les 30 souches testées, soit 93 % (Tableau 1) ;

- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5408 (phage 2) infecte 29 souches sur les 30 souches testées, soit 97 % (Tableau 1) ;

- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5409 (phage 3) infecte 22 souches sur les 30 souches testées, soit 73 % (Tableau 1) ; - Le bactériophage 4 infecte 25 souches sur les 30 souches testées, soit 83 % (Tableau 1) ;

- Le bactériophage 5 infecte 14 souches sur les 30 souches testées, soit 47 % (Tableau 1) ; - Le bactériophage 6 infecte 14 souches sur les 30 souches testées, soit 47 % (Tableau 1) ;

- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5410 (phage 7) infecte 28 souches sur les 30 souches testées, soit 93 % (Tableau 1) ;

- Le cocktail des trois phages (2, 3 et 7) infecte 30 souches sur les 30 souches testées, soit 100 % (Tableau 1) ;

- Le bactériophage 8 infecte 14 souches sur 19 souches S. aureus, soit 68.4% (Tableau 2) ;

- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5491 (phage 9) infecte 15 souches sur 19 souches S. aureus, soit 79% (Tableau 2) ; - Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM 1-5492 (phage 10) infecte

15 souches sur 19 souches S. aureus, soit 79% (Tableau 2) ;

- Le cocktail des trois phages (2, 9 et 10) infecte 19 souches sur 19 souches S. aureus, soit 100% des souches S. aureus testées (Tableau 2).

- Le bactériophage 5 infecte 17 souches sur les 19 souches testées, soit 89 % (Tableau 2). [0232] Le spectre d’activité du phage 2 (CNCM 1-5408) est le plus large et comparable au phage K (phage référence). Cependant, le phage K ne peut pas infecter toutes les souches testées. En revanche, certains mélanges de bactériophages selon l’invention permettent d’infecter plus de souches de S. aureus que le phage K, voire 100% des souches de S. aureus testées. [0233] En particulier, il a été montré que le mélange des phages

CNCM 1-5408 (phage 2), CNCM 1-5409 (phage 3), et CNCM 1-5410 (phage 7) permettait d’infecter la totalité des 30 souches, soit 100 % des souches testées (Tableau 1).

[0234] Il a été également montré que le mélange des phages CNCM 1-5408 (phage 2), CNCM 1-5491 (phage 9), et CNCM 1-5492 (phage 10) permettait d’infecter la totalité des 19 souches S. aureus, soit 100 % des souches S. aureus testées (Tableau 2).

[0235] Les phages selon l’invention ont un large spectre d’activité d’infection des souches de S. aureus et une vitesse d’élimination de S. aureus particulièrement intéressante (après 3 h d’incubation à 37°C en milieu BHI). Exemple 2 : Sélection des protéines de bactériophages

[0236] L’adsorption des bactériophages sur la bactérie hôte s’effectue grâce à la reconnaissance spécifique des protéines de liaison des phages (Receptor Binding Protein ou RBP) à la surface bactérienne. Ces protéines sont localisées à la base (« baseplate ») de la queue des phages.

[0237] Afin de déterminer la spécificité de liaison des différents types de protéines de phages à S. aureus, les protéines suivantes ont été sélectionnées et synthétisées :

- une RBP du phage 2,

- une RBP du phage 3, - une RBP du phage 7

- une RBP du phage 9

- une RBP du phage 10

- une RBP du phage 5.

[0238] Pour cela, les phages 2, 3, 5, 7, 9 et 10 ont été séquencés. La recherche des RBPs a été réalisée à partir des annotations complètes des génomes des phages 2, 3, 5, 7 9 et 10 en ciblant sur les séquences de la région « base plate ». L’alignement des séquences « base plate » de chaque phage a été réalisé un utilisant la technique BlastX des ORLs (open reading firame) des phages.

[0239] Les protéines RBPs ont été retrouvées au niveau du cluster des gènes de la queue et plus précisément au niveau de la partie « base plate ».

[0240] Les RBP des phages 2, 3, 5, 7, 9 et 10 correspondent respectivement à SEQ ID NO :1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO :6.

Production des RBP de phage [0241] Les protéines RBPs des phages 2, 3, 5, 7, 9 et 10 ont ensuite été produites dans la bactérie BL21 par la technique de clonage. Pour cela, les gènes correspondants aux protéines de phages ont été clonés dans un vecteur d’expression bactérien permettant la synthèse des protéines en fusion avec l’enzyme Glutathione-S-Transférase (GST) par la bactérie hôte BL21.

[0242] Les protéines GST-P1 et GST-P2 sont exprimées dans un plasmide pDEST15 avec une souche Escherichia coli BL21 star (Invitrogen, C601003) dans un milieu LB (BD, 240230) contenant 100 mg/L d’ampicilline (Fisher bioreagent, BP 1760-25). Une culture bactérienne est ensemencée à DO 0.05 dans le même milieu et incubée à 37°C et 140 rpm jusqu’à DO 0.5. Les cultures sont ensuite induites avec 0.1 mM d’IPTG (Invitrogen, 15529-019) et incubées à 25°C et 140 rpm pendant une nuit. Les cellules sont ensuite centrifugées à 5000 g et les culots sont repris dans un tampon de lyse contenant de l’Hepes 50 mM (Fisher bioreagent , BP310-500) pH 8,

NaCl 250 mM (Euromedex, 1112-A), Glycerol 10 % (Carlo Erba, 453751), NP40 0.1% (Sigma Aldrich, 18896)) et soniquées 4 x 1 minute. Les lysas sont ensuite centrifugés à 14000 g pendant 30 minutes. Le surnageant est récupéré est incubé une nuit avec la résine Glutathione Sepharose 4B (Cytiva, 17-0756-01). La résine est ensuite récupérée à l’aide d’une colonne avec un verre fritté, lavée avec le tampon HEPES 50 mM pH8, NaCl 250 mM, Glycerol 10 %, NP40 0.1% ; équilibrée avec le tampon HEPES 50 mM pH8, NaCl 50 mM et éluée dans le tampon HEPES 50 mM pH8, NaCl 50 mM, 20 mM glutathion oxydé. Les protéines sont ensuite conservées à -80°C Exemple 3 : Évaluation de la spécificité de liaison des protéines de phases à S. aureus

3.1 - Matériel et Méthodes

[0243] Pour évaluer la spécificité de liaison de chacune de ces protéines pour l’espèce bactérienne S. aureus, des billes magnétiques conjuguées aux protéines à tester ont été utilisées. [0244] Chacune des protéines a été conjuguée avec des billes magnétiques de manière à ce que la surface de ces billes soit recouverte par l’une des protéines RBP.

[0245] Les protéines conjuguées ont été ajoutées à un mélange de bactéries comprenant différentes espèces de Staphylocoques ( Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis et Staphylococcus algnetis). L’expérience est réalisée pour chacune des protéines indépendamment.

[0246] S’il y a une interaction spécifique (une affinité) entre la protéine testée et une ou plusieurs espèces bactériennes du mélange, la protéine va capturer la ou les bactéries. [0247] Les billes sont ensuite séparées de la phase liquide grâce à un support aimanté, et lavées plusieurs fois avec une solution tampon afin d’éliminer les interactions non spécifiques.

[0248] Les billes sont ensuite récupérées et étalées en boite de Pétri sur une gélose spécifique (Baird Parker). Après incubation, les espèces bactériennes immobilisées par les protéines sont identifiées visuellement selon la morphologie et la couleur des colonies se développant sur gélose. Le nombre de bactéries retenues est également déterminé par dénombrement des colonies sur la gélose. L’affinité ou l’interaction de la protéine testée pour la bactérie cible est évaluée par le nombre de bactéries retenues. Plus le nombre de bactéries cibles sur la gélose est élevé, plus l’affinité de la protéine pour la bactérie cible est grande.

3.2. - Résultats

[0249] L’expression des protéines RBP des phages 2, 3, 5 et 7 dans les bactéries BL21 a été vérifiée sur gel (Figure 12). Les tailles respectives des RBPs des phages 2, 3 et 7 sont 78,1 kDa, 100,8 kDa et 79,5 kDa. La taille de RBP du phage 5 est de 100 kDa. [0250] La spécificité de liaison de ces protéines à l’espèce bactérienne S. aureus a ensuite été étudiée. Les résultats présentés en Figure 17 ont montré que la protéine RBP (gp68) du phage 2 a une affinité pour la bactérie Staphylococcus aureus et uniquement pour cette espèce de Staphylocoque.

[0251] Les résultats obtenus avec la RBP des bactériophages 3 et 7 sont identiques à ceux obtenus avec la RBP du bactériophage 2. Exemple 4 : Évaluation de la spécificité de liaison de la RBP du phage phi 5

4.1 Méthode : ELISA indirect

[0252] L'ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay,) est un dosage immuno-enzymatique sur support solide, basé sur la réaction spécifique antigène-anticorps.

Le principe d’un ELISA indirect est de mettre sur une micro-plaque un antigène et ajouter un anticorps primaire dirigé contre cet antigène. Un anticorps secondaire contre les chaînes lourdes du premier anticorps, couplé à une enzyme, est ensuite ajouté. L’ajout du substrat de l’enzyme permet d’obtenir une réaction colorée dosable par absorbance. 1. Isolement de la protéine RPB du phage 5

[0253] Le phage 5 a été isolé à partir d’un échantillon provenant d’une ferme laitière en Lrance. Ce phage est spécifique à la bactérie Staphylococcus aureus (S. aureus ). Le phage a été déposé auprès de la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes - Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, L-75724 Paris cedex 15) le 7 mai 2021 sous le numéro CNCM 1-5680. Le génome de ce phage a été séquencé et la protéine de liaison au récepteur (RBP) du phage phi5 a été identifiée (ci-dessous).

[0254] La séquence protéique de la protéine RBP du phage 5 est SEQ ID NO : 4.

2, Production de la protéine RPB du phage 5

[0255] Les protéines de phage 5 ont été reproduites dans la bactérie BL21 par la technique de clonage. Les gènes correspondants aux protéines de phages ont été clonés dans un vecteur d’expression bactérien permettant la synthèse par la bactérie hôte de protéines en utilisant la fusion avec l’enzyme Glutathione-S-Transférase (GST). La production de la protéine est faite selon le protocole décrit dans l’exemple 2. 3. Evaluation de la spécificité de la protéine RPB du phage 5

[0256] Pour déterminer la spécificité des protéines, ce principe a été adapté comme suit. Les protéines sont biotinylées préalablement (greffage de biotine) à l’aide d’un kit commercial (EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylation, Thermo, Réf : 21955). Des bactéries à la concentration de 10 ⁷ UFC/mL sont immobilisées au fond des puits d’une plaque de microtitration pendant lh30 à 37°C. La suspension bactérienne est enlevée et les puits sont saturés avec une solution contenant de la BSA à 3% et du Tween20 à 0,05 %. La solution de saturation est éliminée, puis les RBP biotinylées sont ajoutées. Les RBP sont dans une solution à 10pg/ml dans un tampon PBS 1% BSA, 0,05% Tween20. Une incubation de lh à 37°C suit. Les puits sont lavés 5 fois avec tampon PBS -Tween de 0,05%. De la streptavidine couplée à HRP (Invitrogene, ref, 434323) à 0,25 pg/mL, en solution dans un tampon PBS 1% BSA, 0,05% Tween20, est ajoutée et suivie d’une incubation pendant 1 h à 37°C. Les puits sont lavés 5 fois avec tampon PBS -Tween de 0,05%. 100pL d’une solution de TMB sont ajoutés, et suivi par une incubation de 15 à 30 min à température ambiante. 50m1 d’acide sulfurique 2 M sont ajoutés pour stopper la réaction. La densité optique des puits de la plaque est ensuite lue à 540nm.

4.2 - Résultats

[0257] L’affinité de la protéine à la bactérie est exprimée par la quantité de protéines retenues par chaque souche bactérienne. Cette quantité est évaluée par l’absorbance liée à la streptavidine couplée à HRP.

[0258] Différentes souches ont été testés par le système ELISA indirect avec la protéine RPB du phage 5 biotinylée.

[0259] Les résultats sont présentés dans le tableau 3 (D : détection, ND : pas de détection) et dans la Figure 13. [0260] Le seuil de détection est fixé à une valeur de densité optique de 0,6 : au-delà de cette valeur, la souche de bactérie est considérée comme détectée (D) ; en deçà, elle est considérée comme non détectée (ND). [0261] Tableau 3

[0262] Les résultats obtenus démontrent que la protéine de phage phi5 reconnaît 100% des souches de S.aureus testées. Elle ne reconnaît pas les souches de Staphylocoques non aureus et les autres types de bactéries. Exemple 5 : Comparaison de la spécificité de la protéine 5 et l’anticorps anti

Stavhylococcus aureus „ évaluée par ELISA indirect

[0263] Un protocole identique à celui de l’exemple 4 a été utilisé pour la fixation des bactéries et pour la réalisation du test ELISA avec la RBP de phi5. [0264] Pour déterminer la spécificité de l’anticorps anti S. aureus (ThermoFischer, ref, PA1-7246), le protocole est le suivant ; Les bactéries sont fixées au fond des puits d’une micro-plaque (ELISA) à 10 ⁷ UFC/mL pendant lh30 à 37°C. Une étape de saturation par une solution contenant de la BSA à 3% et du Tween à 0,05 % est réalisée, puis la solution de BSA est éliminée. [0265] Parallèlement, dans une autre micro plaque, l’anticorps anti S. aureus (ThermoFischer, ref, PA1-7246) est déposé dans chaque puits de 9 pg/mL (la concentration peut être modifiée dans l’intervalle de 5 pg/mL à 50 pg/mL) dans un tampon PBS (1% BSA ; 0,05% Tween). Une incubation pendant lh à 37°C est ensuite réalisée. [0266] Les puits des deux types de plaques sont lavés (au moins 5 fois) avec le tampon

PBS contenant du Tween à 0,05%. Une étape d’incubation avec l’anticorps secondaire Goat anti Rabbit IgG (H+L) couplé à HRP (ThermoFischer, ref Al 6096) à 1 mg/mL. Les puits sont lavés (au moins 5 fois) avec le tampon PBS contenant du Tween à 0,05%. Pour la détection, 100 pl d’une solution de TMB sont ajoutés et incubés de 15 à 30 minutes à température ambiante. Puis, 50pl d’acide sulfurique 2 M sont ajoutés pour stopper la réaction. La plaque est ensuite lue à 540nm.

[0267] Les résultats sont présentés en Figure 14.

[0268] L’affinité de la protéine pour la bactérie est exprimée par la quantité de protéines ou d’anticorps retenue par chaque souche bactérienne. Cette quantité est évaluée par l’absorbance liée à la streptavidine couplé à HRP pour les protéines de phage et à l’anticorps secondaire Goat anti Rabbit IgG (H+L) pour l’anticorps.

[0269] Le seuil de détection est fixé à une valeur de densité optique de 0,6 : au-delà de cette valeur, la souche de bactérie est considérée comme détectée (D) ; en deçà, elle est considérée comme non détectée (ND).

[0270] Les résultats montrent que les protéines de phages sont plus spécifiques que l’anticorps. Elles ne reconnaissent pas les souches de Staphylocoques non-aureus et les autres espèces bactériennes alors que l’anticorps anti Staphylococcus reconnaît Staphylococcus saprophyticus et Staphyoloccus epidermidis.

[0271] Cette protéine est donc spécifique. Elle peut donc être utilisée pour la détection de S. aureus.

Exemple 6 : Système bandelette

[0272] Dans un mode de réalisation du système de bandelette selon l’invention, l’immobilisation des phages ou des protéines de phages en utilisant la solution spécifique entraîne, en présence de la bactérie S. aureus dans l’échantillon, un blocage de la migration due aux phages ou à la protéine de phage immobilisé(s) sur la membrane.

[0273] Les protéines du bactériophage 2 ont été déposées sur la membrane. Un séchage à 37°C pendant 1 h. Le lait cru contenant la souche de S. aureus 79 à 10 ⁸ UFC/mL a été dilué au l/10 ^eme dans un tampon contenant du Tween de 6% et du NaCl à 200 mM

[0274] La bandelette est ensuite trempée 10 min puis sortie de l’échantillon, la migration des bactéries se fait pendant 10 min avant de voir le signal. Les résultats sont présentés dans la Figure 8.

[0275] Dans le cadre de cet exemple, la solution d’immobilisation des protéines de phage comprend soit le composé A qui est la BSA utilisée à la concentration de 2 mg/mL, soit le composé B, qui est MgSCL utilisé à la concentration de 50 mM, soit la combinaison des solutions A et B (BSA à la concentration de 2 mg/mL et MgSCL utilisé à la concentration de 50 mM).

[0276] La Figure 8 présente (à gauche) un mode de réalisation dans lequel les protéines de phages (RBP) ont été immobilisées dans une solution contenant de la BSA à la concentration de 2 mg/mL uniquement (A sans B). La bandelette de gauche est plongée dans un échantillon de lait cru sans bactéries, la bandelette de droite est plongée dans un échantillon de lait cru contenant des bactéries S. aureus.

[0277] La Figure 8 présente (au centre) un mode de réalisation dans lequel les protéines de phages (RBP) ont été immobilisées dans une solution contenant du MgS04 uniquement à la concentration de 50 mM (B sans A). La bandelette de gauche est plongée dans un échantillon de lait cru sans bactéries, la bandelette de droite est plongée dans un échantillon de lait cru contenant des bactéries S. aureus.

[0278] La Figure 8 présente (à droite) un mode de réalisation dans lequel les protéines de phages (RBP) ont été immobilisées dans une solution contenant de la BSA à la concentration de 2 mg/mL et du MgSCL à la concentration de 50 mM (A et B). La bandelette de gauche est plongée dans un échantillon de lait cru sans bactéries, la bandelette de droite est plongée dans un échantillon de lait cru contenant des bactéries S. aureus.

[0279] La Figure 8 établit clairement que lorsque les protéines de phages sont immobilisées sur la bandelette grâce à la solution contenant à la fois de la BSA à la concentration de 2 mg/mL et du MgSCL à la concentration de 50 mM, les bactéries sont capturées dans la zone où les protéines de phage (RBP) ont été immobilisées.

[0280] Le système de bandelette a permis de détecter les bactéries à 10 ³ UFC/mL dans un échantillon de lait cru (Figure 9). Le signal est différent lorsque la bactérie est présente dans l’échantillon et en l’absence de la bactérie. [0281] En conclusion : le système de bandelette selon l’invention est basé sur l’immobilisation des phages ou des protéines de phages en utilisant la solution comprenant une protéine et un cation (BSA et MgSO ₄ ) ; le signal traduisant la présence de la bactérie n’est pas représenté par une ligne de couleur comme dans le système classique mais par un blocage de la migration. Ce type de signal n’est jamais décrit dans l’art antérieur.

[0282] La sensibilité de détection fait la différence essentielle entre le système classique et le système de l’invention. Exemple 7 : Utilisation de la RBP du bactériophage phi 5 pour la détection des bactéries par le système LFA (bandelette)

7.1 - Matériel et Méthodes

[0283] Deux souches de S.aureus (79 et C24b) sont utilisées, le contrôle est réalisé sans bactéries.

[0284] Les tests suivants sont réalisés :

- La RBP du bactériophage phi 5 est déposée et immobilisée sur la membrane à une concentration de 1 mg/mL dans une solution contenant de la BSA à lmg/mL et du NaCl à 150 mM - La RBP du bactériophage phi 5 est déposée et immobilisée sur la membrane à une concentration de 1 mg/mL dans une solution contenant de la BSA à 1 mg/mL.

- La RBP du bactériophage phi 5 est déposée et immobilisée sur la membrane à une concentration de 1 mg/mL dans une solution contenant du NaCl à 150 mM.

- La RBP du bactériophage phi 5 est déposée et immobilisée sur la membrane dans une solution ne contenant ni BSA, ni NaCl.

[0285] L’anticorps anti S. aureus couplé à l’or a été déposé sur le Conjugé PAD. Le système est trempé dans la solution contenant les bactéries à une concentration de 10 ⁷ UFC/mL pendant 20 min. Le signal est traité par un logiciel ImageJ : sélection de la zone de traitement et détermination par logiciel aire sous courbe, proportionnelle à l’intensité du signal.

7.2 - Résultats

[0286] Les résultats présentés sur les Figures 15 et 16 montrent que la quantité de bactéries capturées par la RBP du phage phi 5 est beaucoup plus importante lorsque la RBP est immobilisée sur la membrane en présence d’une solution comprenant un cation et une protéine (NaCl et BSA). Exemple 8 : mode de réalisation ELISA

[0287] Le principe de l’ELISA consiste à piéger, entre un « anticorps de capture » et un « anticorps de détection », les analytes (antigènes, bactéries, virus, etc...). La spécificité du système de détection de la présente invention par rapport au système ELISA classique est le remplacement d’un ou des deux anticorps par les phages ou les protéines de phages.

8.1 - Matériel et Méthodes

[0288] La protéine RBP sur phage 2 est préparée dans un tampon de coating contenant du MgS04 (50 mM) et de la BSA (2 mg/mL). La solution est répartie dans les puits d’une plaque de microtitration. La plaque est ensuite couverte et placée dans une enceinte à 4°C durant une nuit.

[0289] Le lendemain, la solution d’immobilisation (coating) est éliminée de chaque puit et la plaque est rincée plusieurs fois (au moins 3 fois) avec un tampon de rinçage (tampon PBS qui contient optionnellement du Tween 0,5%). [0290] Optionnellement, les interactions non spécifiques sont ensuite bloquées avec un tampon de saturation, par exemple le tampon de référence : Prod 37578 de Thermofischer.

[0291] L’échantillon comprenant des bactéries S. aureus à différentes dilutions est distribué à raison de 100 mΐ d’échantillon dans chaque puits. Dans cet exemple, la solution PBS contient la souche 79 à différentes concentrations. Une incubation d’une heure à température ambiante suit. L’échantillon est éliminé et les puits sont rincés au moins 3 fois avec le tampon de rinçage (tampon PBS qui contient optionnellement du Tween 0,5%).

[0292] L’anticorps anti-S. aureus (Staphylococcus aureus Rabbit Polyclonal Antibody fourni par Thermofïsher (Réf. 11578351)) conjugué à HRP est ajouté : le volume de 50 μL de la solution de l’anticorps dilué 1/10000 dans une solution PBS 1% BSA 0,05% Tween. Une incubation d’au moins 30 min à une température de 4°C à 37°C est ensuite réalisée. [0293] La solution d’anticorps est éliminée et les puits sont rincés au moins 3 fois avec le tampon de rinçage (tampon PBS qui contient optionnellement du Tween 0,5%).

[0294] La révélation de la présence de bactérie est faite par l’ajout de TMB (prêt à l’emploi). [0295] La réaction est stoppée par ajout de 100 pL d’acide sulfurique à 1 M.

[0296] Une lecture de la densité optique est faite (Figure 10A). L’intensité du signal permet de déterminer la concentration en bactéries (Figure 10B).

8.2 - Interprétation des résultats et analyse

[0297] Le lecteur de plaque donne des densités optiques (DO) correspondantes à chaque puits. Les résultats extraits sont traités dans un tableur. La détermination des concentrations se fait selon les étapes suivantes :

- Soustraire pour chaque DO la DO correspondant au 0 (DO du tampon)

- Déterminer l’équation de la gamme (qui généralement est linéaire, avec les concentrations de gamme en X et les DO correspondantes en Y) : DO=A*[C] + B [0298] À partir de cette équation, une gamme est établie (Figure 11). Elle permet de déterminer les concentrations en introduisant les valeurs de DO obtenues pour les échantillons et de ramener ensuite ces concentrations aux valeurs réelles en fonction des dilutions opérées de l’échantillon.

[0299] La détection de S. aureus en utilisant la protéine du phage 2 (immobilisée au puits des plaques) pour la capture des bactéries et un anticorps anti-S. aureus couplé à la HRP pour la révélation par TMB a permis de détecter S. aureus à un seuil entre 10 ² à 10 ³ bactéries/mL (Figure 11).

Références à du matériel biologique déposé

[0300] Dans la présente demande, il est fait référence aux souches de bactériophages suivantes, déposées à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes - Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris cedex 15) le 21 Mars 2019 par Vetophage SAS :

- phage 2, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage - phi 2 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM 1-5408 » ;

- phage 3, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage - phi 3 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM 1-5409 »,

- phage 7, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage - phi 7 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM 1-5410 ».

[0301] Dans la présente demande, il est fait référence aux souches de bactériophages suivantes, déposées à la CNCM Collection Nationale de Culture de Microorganismes - Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris cedex 15) le 12 février 2020 par Vetophage SAS :

- phage 9, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage - phi 9 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM 1-5491 » ;

- phage 10, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage - phi 10 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM 1-5492 ».

[0302] Dans la présente demande, il est fait référence à la souche de bactériophage déposée à la CNCM Collection Nationale de Culture de Microorganismes - Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris cedex 15) le 7 mai 2021 par Vetophage SAS : phage 5 (phi 5), référence d’identification auprès de la CNCM « CNCM -39284. 2105 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM 1-5680 ».