Carbamat-substituierte Oxindol-Derivate und ihre Verwendung zur Behandlung von Va- sopressin-abhängigen Erkrankungen

Die vorliegende Erfindung betrifft neue substituierte Oxindol-Derivate, diese enthaltende pharmazeutische Mittel und ihre Verwendung zur Behandlung von Vasopressin- abhängigen Erkrankungen.

Vasopressin ist ein endogenes Hormon, das verschiedenste Wirkungen an Organen und Gewebe ausübt. Bei verschiedenen Krankheitszuständen, wie zum Beispiel Herzinsuffi- zienz und Bluthochdruck, vermutet man, dass das Vasopressin-System eine Rolle spielt. Derzeit sind drei Rezeptoren (V1a, V1 b bzw. V3 und V2) bekannt, über die Vasopressin seine zahlreichen Wirkungen vermittelt. Daher werden Antagonisten dieser Rezeptoren als mögliche neue therapeutische Ansätze zur Behandlung von Krankheiten untersucht (M. Thibonnier, Exp.Opin. Invest. Drugs 1998, 7(5), 729-740).

Vorliegend werden neue substituierte Oxindole beschrieben, die in der 1 -Position eine Phenylsulfonyl-Gruppe tragen. 1-Phenylsulfonyl-1 ,3-dihydro-2/-/-indol-2-one wurden bereits als Liganden der Vasopressin-Rezeptoren beschrieben. Auch die WO 93/15051 , WO 95/18105, WO 98/25901 , WO 01/55130, WO 01/55134, WO 01/164668 und WO 01/98295 beschreiben Derivate, die in der 1 -Position des Oxindolgerüsts Arylsulfon- lygruppen tragen. Diese Verbindungen unterscheiden sich von den erfindungsgemäßen Verbindungen wesentlich durch die Substituenten in der 3-Position.

So werden in der WO 93/15051 und WO 98/25901 1-Phenylsulfonyl-1 ,3-dihydro-2H-indol- 2-one als Liganden der Vasopressinrezeptoren beschrieben, bei denen das Oxindol-

Gerüst in der 3-Position durch zwei Alkylreste substituiert ist, die gemeinsam auch einen Cycloalkylrest (Spiroverknüpfung) bilden können. Als Alternative kann der Spiroring Hete- roatome, wie Sauerstoff und Stickstoff (wahlweise mit Substituenten), enthalten.

Die WO 95/18105 beschreibt 1 -Phenylsulfonyl-1 ,3-dihydro-2/-/-indol-2-one als Liganden der Vasopressinrezeptoren, die ein Stickstoffatom in der 3-Position besitzen. Zusätzlich sind in der 3-Position Reste gebunden, die unter gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Cycloalkyl-, Phenyl- oder Benzylresten ausgewählt sind.

In der WO 03/008407 werden 1-Phenylsulfonyloxindole beschrieben, in denen in der 3- Position Pyridylpiperazine über eine Oxycarbonyl-Gruppe am Oxindol gebunden sind.

In der WO 2005/030755 wird als Beispiel 108 die 2-Methoxy-pyridin-3-yl-Carbamat- Verbindung 4-(1-Methyl-piperidin-4-yl)-piperazin-1 -carbonsäure 5-cyano-1-(2,4- dimethoxy-phenylsulfonyl)-3-(2-methoxy-pyridin-3-yl)-2-oxo-2 ,3-dihydro-1 H-indol-3-yl es- ter (gemäß IUPAC Nomenklatur: 5-Cyano-1-[(2,4-dimethoxyphenyl)sulfonyl]-3-(2- methoxypyridin-3-yl)-2-oxo-2,3-dihydro-1 /-/-indol-3-yl 4-(1 -methylpiperidin-4-yl)piperazin-1 - carboxylat) beschrieben.

In der WO 2006/005609 werden die 2-Ethoxyphenyl-Carbamatverbindungen 4-(1- Methylpiperidin-4-yl)-piperazin-1 -carbonsäure-[1 -(2,4-dimethoxy-1 -benzolsulfonyl)-5- cyano-2-oxo-3-(2-ethoxyphenyl)-2,3-dihydro-1 H-indol-3-yl]-ester (Beispiel 63) und 4-(4- Methylpiperazin-1 -yl)-piperidin-1 -carbonsäure-[5-cyano-1 -(2,4-dimethoxy-benzolsulfonyl)- 3-(2-ethoxy-phenyl)-2-oxo-2,3-dihydro-1 H-indol-3-yl]-ester-dihydrochlorid (Beispiel 172) beschrieben.

Neben der Bindungsaffinität zum Vasopressin V1 b Rezeptor können weitere Eigenschaften vorteilhaft für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Vasopressin-abhängigen Erkrankungen sein, wie beispielsweise:

1.) eine Selektivität zum Vasopressin V1 b Rezeptor im Vergleich zum Vasopressin V1a Rezeptor, d.h. der Quotient aus der Bindungsaffinität zum V1a Rezeptor (Ki(VIa) (bestimmt in der Einheit "Nanomolar (nM)") und der Bindungsaffinität zum V1 b Rezeptor (Ki(VI b)) (bestimmt in der Einheit "Nanomolar (nM)"). Je größer der Quotient Ki(VI a)/Ki(V1 b) ist, desto größer ist die V1 b-Selektivität;

2.) eine Selektivität zum Vasopressin V1 b Rezeptor im Vergleich zum Vasopressin V2 Rezeptor, d.h. der Quotient aus der Bindungsaffinität zum V2 Rezeptor (Ki(V2) (bestimmt in der Einheit "Nanomolar (nM)") und der Bindungsaffinität zum V1 b Rezeptor (Ki(VI b)) (bestimmt in der Einheit "Nanomolar (nM)"). Je größer der Quotient Ki(V2)/Ki(V1 b) ist, desto größer ist die V1 b-Selektivität;

3.) eine Selektivität zum Vasopressin V1 b Rezeptor im Vergleich zum Oxytozin OT Rezeptor, d.h. der Quotient aus der Bindungsaffinität zum OT Rezeptor (Ki(OT) (bestimmt in der Einheit "Nanomolar (nM)") und der Bindungsaffinität zum V1 b Rezeptor (Ki(VI b)) (be- stimmt in der Einheit "Nanomolar (nM)"). Je größer der Quotient Ki(OT)/Ki(V1 b) ist, desto größer ist die V1 b-Selektivität.

4.) die metabolische Stabilität, beispielsweise bestimmt anhand der in-vitro ermittelten Halbwertszeiten in Lebermikrosomen von verschiedenen Spezies (z.B. Ratte oder Mensch);

5.) keine oder nur geringe Inhibierung von Cytochrom P450 (CYP) Enzymen: Cytochrom P450 (CYP) ist die Bezeichnung für eine Superfamilie von Hämproteinen mit enzymati- scher Aktivität (Oxidase). Besondere Bedeutung besitzen sie auch für den Abbau (Metabolismus) von Fremdstoffen wie Pharmaka oder Xenobiotika in Säugetierorganismen. Die wichtigsten Vertreter der Typen und Untertypen von CYP im menschlichen Organismus sind: CYP 1A2, CYP 2C9, CYP 2D6 und CYP 3A4. Bei gleichzeitiger Anwendung von CYP 3A4-Hemmstoffen (z.B. Grapefruitsaft, Cimetidin, Erythromycin) und Arzneistoffen, die über dieses Enzymsystem abgebaut werden und somit um die gleiche Bindungsstelle am Enzym konkurrieren, kann deren Abbau verlangsamt und dadurch Wirkungen und Nebenwirkungen des verabreichten Arzneistoffs unerwünscht verstärkt werden;

6.) eine geeignete Wasserlöslichkeit (in mg/ml);

7.) eine geeignete Pharmakokinetik (zeitlicher Verlauf der Konzentration der erfindungs- gemässen Verbindung im Plasma bzw. in Geweben, zum Beispiel Gehirn). Die Pharmakokinetik kann durch die folgenden Parameter beschrieben werden: Halbwertszeit, Verteilungsvolumen, Plasma-Clearance, AUC ("area under the curve", Fläche unter der Kon- zentrations-Zeit-Kurve), orale Bioverfügbarkeit, das sog. Brain-Plasma-Ratio;

8.) ein geeigneter Anteil der Wirksubstanz liegt gebunden an Plasmaproteinen vor (Drug- Plasma-Protein-Binding (PPB)-Wert);

9.) keine oder nur geringe Blockade des hERG-Kanals: Verbindungen, die den hERG- Kanal blockieren, können eine Verlängerung des QT-Intervalls verursachen und dadurch zu ernsten Herz-Rhythmus-Störungen führen (zum Beispiel sogenannte "torsade de poin- tes"). Mittels eines in der Literatur beschriebenen Verdrängungsassays mit radioaktiv markiertem Dofetilid (G. J. Diaz et al., Journal of Pharmacological and Toxicological Me- thods, 50 (2004), 187-199) kann das Potential von Verbindungen, den hERG-Kanal zu blockieren, bestimmt werden. Je geringer der IC50 in diesem "dofetilide assay", desto wahrscheinlicher ist eine potente hERG-Blockade. Darüber hinaus kann die Blockade des hERG-Kanals durch elektrophysiologische Experimente an Zellen, die mit dem hERG- Kanal transfiziert wurden, durch sogenanntes "whole-cell patch clamping" gemessen wer- den (G. J. Diaz et al., Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, 50 (2004), 187-199).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Verbindungen zur Behandlung oder Prophylaxe von verschiedenen Vasopressin-abhängigen Krankheiten zur Verfügung zu stellen. Die Verbindungen sollten eine hohe Aktivität und Selektivität aufweisen, vor allem eine hohe Affinität und Selektivität gegebenüber dem Vasopressin V1 b Rezeptor. Zusätzlich sollte die erfindungsgemäße Substanz einen oder mehrere der vorstehend genannten Vorteile 1.) bis 9.) besitzen.

Die Aufgabe wird durch Verbindungen der Formel I gelöst

(I) worin

R ¹ für Wasserstoff, Methoxy oder Ethoxy steht; R ² für Wasserstoff oder Methoxy steht;

R ³ für Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl oder Isopropyl steht; X ¹ und X ² für N oder CH stehen, unter der Maßgabe, dass X ¹ und X ² nicht gleichzeitig für N stehen; sowie durch deren pharmazeutisch verträglichen Salze und Prodrugs davon.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen der Formel I (im FoI- genden auch "Verbindungen I"), sowie die pharmazeutisch verträgliche Salze der Verbindungen I und die Prodrugs der Verbindungen I.

Die pharmazeutisch verträglichen Salze von Verbindungen der Formel I, die auch als physiologisch verträgliche Salze bezeichnet werden, sind in der Regel durch Umsetzung der freien Base der erfindungsgemäßen Verbindungen I (d.h. der Verbindungen I gemäß Strukturformel I) mit geeigneten Säuren erhältlich. Geeignete Säuren sind beispielsweise aufgeführt in „Fortschritte der Arzneimittelforschung", 1966, Birkhäuser Verlag, Bd.10, S.224-285. Darunter fallen beispielsweise Salzsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Maleinsäure und Fumarsäure.

Unter dem Begriff "Prodrugs" werden solche Verbindungen verstanden, welche in vivo zu den erfindungsgemäßen Verbindungen I metabolisiert werden. Typische Beispiele von Prodrugs sind beschrieben in CG. Wermeth (Hrsg.): The Practice of Medicinal Chemistry, Academic Press, San Diego, 1996, Seiten 671-715. Darunter fallen beispielsweise Phosphate, Carbamate, Aminosäuren, Ester, Amide, Peptide, Harnstoffe und dergleichen. Im vorliegenden Fall können geeignete Prodrugs beispielsweise solche Verbindungen I sein, in denen das äußere Stickstoffatom des äußeren Piperidin-/Piperazinrings eine Amid- /Peptidbindung bildet, indem dieses Stickstoffatom durch eine CrC ₄ -Alkylcarbonylgruppe, z.B. durch Acetyl, Propionyl, n-Propylcarbonyl, Isopropylcarbonyl, n-Butylcarbonyl oder tert-Butylcarbonyl (Pivaloyl), durch Benzoyl, oder durch einen über CO gebundenen Aminosäurerest, z.B. über CO gebundenes Glycin, Alanin, Serin, Phenylalanin und dergleichen, in der Position des Restes R ³ substituiert ist. Als Prodrugs geeignet sind weiterhin Alkylcarbonyloxyalkylcarbamate, in denen das äußere Stickstoffatom des äußeren Piperi- din-/Piperazinrings in der Position des Restes R ³ eine Gruppe der Formel -C(=O)-O-

CHR ^a -O-C(=O)-R ^b trägt, worin R ^a und R ^b unabhängig voneinander für C _r C ₄ -Alkyl stehen. Solche Carbamate sind beispielsweise in J. Alexander, R. Cargill, S. R. Michelson, H. Schwam, J. Medicinal Chem. 1988, 31 (2), 318-322 beschrieben. Diese Gruppen können dann unter metabolischen Bedingungen abgespalten werden und resultieren in Verbin- düngen I, in denen R ³ für H steht. d-C ₄ -Alkyl steht im Rahmen der vorliegenden Erfindung für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sek-Butyl, Isobutyl oder tert-Butyl.

C-|-C ₃ -Alkoxy steht im Rahmen der vorliegenden Erfindung für einen über ein Sauerstoffatom gebundenen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen. Beispiele sind Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy und Isopropoxy.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I, ihre pharmakologisch verträglichen Salze und ihre Prodrugs können auch in Form von Solvaten oder Hydraten vorliegen. Unter Solvaten versteht man im Rahmen der vorliegenden Erfindung kristalline Formen der Verbindungen I bzw. ihrer pharmazeutisch verträglichen Salze oder Prodrugs davon, die im Kristallgitter Lösungsmittelmoleküle eingebaut enthalten. Vorzugsweise sind die Lö- sungsmittelmoleküle in stöchiometrischen Verhältnissen eingebaut. Hydrate sind eine Spezialform der Solvate; das Lösungsmittel ist hier Wasser.

Die nachstehend gemachten Angaben zu geeigneten und bevorzugten Merkmalen der Erfindung, insbesondere zu den Variablen R ¹ , R ² , R ³ , X ¹ und X ² in der Verbindung I, aber auch zu den Merkmalen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Verwendung gelten sowohl für sich allein genommen als auch vorzugsweise in jeder möglichen Kombination miteinander.

Die Verbindungen I werden bevorzugt in Form der freien Base (d.h. gemäß der Struktur- formel I) oder in Form ihrer Säureadditionssalze bereitgestellt.

In einer bevorzugten Ausführungsform steht R ¹ für Wasserstoff oder Methoxy.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stehen R ¹ und R ² beide für H.

In einer alternativ besonders bevorzugten Ausführungsform steht R ¹ für Methoxy und R ² steht für H.

In einer alternativ besonders bevorzugten Ausführungsform steht R ¹ für H und R ² steht für Methoxy. In einer alternativ besonders bevorzugten Ausführungsform stehen R ¹ und R ² beide für Methoxy.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform steht R ³ für Wasserstoff, Methyl oder Ethyl.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform steht eine der Variablen X ¹ , X ² für N und die andere für CH.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform steht dabei X ¹ für N und X ² steht für CH.

In einer alternativ besonders bevorzugten Ausführungsform steht X ¹ für CH und X ² steht für N.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel I, worin

R ¹ Wasserstoff oder Methoxy ist;

R ² Wasserstoff oder Methoxy ist; R ³ Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl oder Isopropyl; vorzugsweise Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist;

X ¹ N oder CH ist;

X ² N oder CH ist; wobei X ¹ und X ² nicht gleichzeitig für N stehen; sowie die pharmazeutisch verträglichen Salzeund Prodrugs davon.

In einer besonderen Ausführungsform steht eine der Variablen X ¹ oder X ² für N und die andere steht für CH.

Ein besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel I, worin

R ¹ Wasserstoff oder Methoxy ist;

R ² Wasserstoff oder Methoxy ist;

R ³ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist; X ¹ N ist; X ² CH ist; sowie die pharmazeutisch verträglichen Salze und Prodrugs davon.

Ein alternativ besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel I, worin

R ¹ Wasserstoff oder Methoxy ist; R ² Wasserstoff oder Methoxy ist; R ³ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist; X ¹ CH ist; X ² N ist; sowie die pharmazeutisch verträglichen Salze und Prodrugs davon.

Ein weiterer besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der

Formel I, worin R ¹ Wasserstoff oder Methoxy ist;

R ² Wasserstoff oder Methoxy ist;

R ³ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist;

X ¹ CH ist;

X ² CH ist; sowie die pharmazeutisch verträglichen Salze und Prodrugs davon.

Insbesondere sind Gegenstand der Erfindung Verbindungen der Formel I, worin R ¹ Methoxy ist; R ² Methoxy ist; R ³ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl, vorzugsweise Methyl oder Ethyl ist; X ¹ CH ist; X ² N ist; sowie die pharmazeutisch verträglichen Salze und Prodrugs davon.

Außerdem sind insbesondere Gegenstand der Erfindung Verbindungen der Formel I, worin

R ¹ Wasserstoff ist;

R ² Methoxy ist;

R ³ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl, vorzugsweise Methyl oder Ethyl ist; X ¹ CH ist; X ² N ist; sowie die pharmazeutisch verträglichen Salze und Prodrugs davon.

Außerdem sind insbesondere Gegenstand der Erfindung Verbindungen der Formel I, worin

R ¹ Methoxy ist; R ² Wasserstoff ist;

R ³ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl, vorzugsweise Methyl oder Ethyl ist; X ¹ CH ist; X ² N ist; sowie die pharmazeutisch verträglichen Salze und Prodrugs davon.

Außerdem sind insbesondere Gegenstand der Erfindung Verbindungen der Formel I, worin R ¹ Wasserstoff ist;

R ² Wasserstoff ist;

R ³ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl, vorzugsweise Methyl oder Ethyl ist;

X ¹ CH ist;

X ² N ist; sowie die pharmazeutisch verträglichen Salze und Prodrugs davon.

Außerdem sind insbesondere Gegenstand der Erfindung Verbindungen der Formel I, worin

R ¹ Methoxy ist; R ² Methoxy ist;

R ³ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl, vorzugsweise Methyl oder Ethyl ist;

X ¹ N ist;

X ² CH ist; sowie die pharmazeutisch verträglichen Salze und Prodrugs davon.

Außerdem sind insbesondere Gegenstand der Erfindung Verbindungen der Formel I, worin

R ¹ Wasserstoff ist;

R ² Methoxy ist; R ³ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl, vorzugsweise Methyl oder Ethyl ist; X ¹ N ist; X ² CH ist; sowie die pharmazeutisch verträglichen Salze und Prodrugs davon.

Außerdem sind insbesondere Gegenstand der Erfindung Verbindungen der Formel I, worin

R ¹ Methoxy ist; R ² Wasserstoff ist; R ³ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl, vorzugsweise Methyl oder Ethyl ist; X ¹ N ist; X ² CH ist; sowie die pharmazeutisch verträglichen Salze und Prodrugs davon.

Außerdem sind insbesondere Gegenstand der Erfindung Verbindungen der Formel I, worin

R ¹ Wasserstoff ist;

R ² Wasserstoff ist;

R ³ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl, vorzugsweise Methyl oder Ethyl ist;

X ¹ N ist;

X ² CH ist; sowie die pharmazeutisch verträglichen Salze und Prodrugs davon.

Beispiele für bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der Formel I sowie die pharmazeutisch verträglichen Salze und Prodrugs davon, worin die Reste X ¹ , X ² , R ¹ , R ² und R ³ jeweils die in der folgenden Tabelle 1 pro Zeile genannten Bedeutungen annehmen.

Tabelle 1 :

Die erfindungsgemäßen Verbindungen I weisen in der 3-Position des 2-Oxindolrings ein Chiralitätszentrum auf. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können daher als ein 1 :1- Gemisch von Enantiomeren (Racemat) oder als ein nicht-racemisches Gemisch von Enantiomeren, in dem eines der beiden Enantiomere, entweder das die Schwingungsebene von linear polarisiertem Licht nach links drehende (d.h. minusdrehende) Enantio- mer (im Folgenden (-)-Enantiomer) oder das die Schwingungsebene von linear polarisiertem Licht nach rechts drehende (d.h. plusdrehende) Enantiomer (im Folgenden (+)- Enantiomer), angereichert ist, oder als im Wesentlichen enantiomerenreine Verbindungen, also als im Wesentlichen enantiomerenreines (-)-Enantiomer oder (+)-Enantiomer, vorliegen. Da bei den erfindungsgemäßen Verbindungen ein einziges Asymmetriezentrum und keine Chiralitätsachse/-ebene existiert, kann man ein nicht-racemisches Gemisch auch als ein Gemisch von Enantiomeren definieren, in welchem entweder das R- oder das S-Enantiomer überwiegt. Im Wesentlichen enantiomerenreine Verbindungen können dementsprechend auch als im Wesentlichen enantiomerenreines R-Enantiomer bzw. im Wesentlichen enantiomerenreines S-Enantiomer definiert werden.

Unter „im Wesentlichen enantiomerenreinen Verbindungen" versteht man im Rahmen der vorliegenden Erfindung solche Verbindungen, die einen Enantiomerenüberschuss (enan- tiomeric excess, ee; % ee = (R-S)/(R+S) x 100 bzw. (S-R)/(S+R) x 100) von wenigstens 80 % ee, vorzugsweise wenigsten 85 % ee, stärker bevorzugt wenigstens 90 % ee, noch stärker bevorzugt wenigstens 95 % ee und insbesondere wenigstens 98 % ee aufweisen.

In einer Ausführungsform der Erfindung liegen die erfindungsgemäßen Verbindungen als im Wesentlichen enantiomerenreine Verbindungen vor. Besonders bevorzugt sind Verbindungen, die einen Enantiomerenüberschuss von wenigstens 85 % ee, stärker bevor- zugt von wenigstens 90 % ee, noch stärker bevorzugt von wenigstens 95 % ee und insbesondere von wenigstens 98 % ee aufweisen.

Gegenstand der Erfindung sind somit sowohl die reinen Enantiomere als auch deren Gemische, z.B. Gemische, in denen ein Enantiomer in angereichter Form vorliegt, aber auch die Racemate. Gegenstand der Erfindung sind auch die pharmazeutisch verträglichen

Salze und die Prodrugs der reinen Enantiomere von Verbindungen I sowie die Enantiome- rengemische in Form der pharmazeutisch verträglichen Salze und der Prodrugs von Verbindungen I.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Verbindungen der Formel I, wie vorstehend ausgeführt, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie in optisch aktiver Form vorliegen und es sich jeweils um das die Schwingungsebene von polarisiertem Licht nach links drehende (d.h. das minusdrehende) Enantiomer der betreffenden Verbindung der Formel I in der Form der freien Base handelt, oder um ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder eine Prodrug davon. Die links- bzw. minusdrehenden Enantiomere der Verbindungen I werden im Folgenden auch als (-)-Enantiomere bezeichnet.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung gemachten Angaben zur Drehrichtung des polarisierten Lichts beziehen sich vorzugsweise auf Vorzeichen [(+) oder (-)] wie sie in Chloroform als Lösungsmittel oder in Chloroform-haltigen Lösungsmittelgemischen, ins- besondere in Chloroform, ermittelt werden.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind solche Verbindungen der Formel I, wie vorstehend ausgeführt, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie in optisch aktiver Form vorliegen, wobei die absolute Konfiguration am chiralen C-3-Ringkohlenstoffatoms des Oxindolgerüsts der absoluten Konfiguration am C-3 des (-)-Enantiomers der Verbindung 5-Cyano-1-[(2,4-dimethoxyphenyl)sulfonyl]-3-(2-ethoxypyridin -3-yl)-2-oxo-2,3-dihydro-1 H- indol-3-yl-4-(1-methylpiperidin-4-yl)piperazin-1-carboxylat (= Verbindung des Beispiels 1 ) in der Form der freien Base entspricht. Diese Konfiguration wird im Folgenden auch als die "bevorzugte Konfiguration" bezeichnet.

Besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel I, pharmazeutisch verträglichen Salze und deren Prodrugs, wie vorstehend ausgeführt, worin das entsprechende (-)-Enantiomer in einer optischen Reinheit (enantiomeric excess, ee) von größer 50 % ee, besonders bevorzugt von wenigstens 80 % ee, stärker bevorzugt von wenigstens 90 % ee, noch stärker bevorzugt von wenigstens 95 % ee und insbesondere von wenigstens 98 % ee vorliegt.

Alternativ sind Verbindungen der allgemeinen Formel I, deren pharmazeutisch verträgli- chen Salze und deren Prodrugs besonders bevorzugt, worin das die bevorzugte absolute Konfiguration am C-3 Ringkohlenstoffatom aufweisende Enantiomer in mit einer optischen Reinheit (enantiomeric excess, ee) von größer 50 % ee, vorzugsweise von wenigstens 80 % ee, stärker bevorzugt von wenigstens 90 % ee, noch stärker bevorzugt von wenigstens 95 % ee und insbesondere von wenigstens 98 % ee vorliegt.

Ebenfalls bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Formel I, wie vorstehend ausgeführt, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie in optisch inaktiver Form, d.h. in Form des Racemats, vorliegen, oder in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder einer Prodrug des Racemats.

Beispiele für besonders bevorzugte Verbindungen I sind die in nachfolgender Tabelle 2 aufgeführten Verbindungen mit den Beispielnummern 1 bis 9OB sowie die pharmazeutisch verträglichen Salze und Prodrugs davon. Dabei entsprechen die Beispiele 1 bis 90 dem Racemat der jeweiligen Verbindungen, die Beispiele mit einem angehängten Buchstaben „A" (1A, 2A, ... bis 90A) dem rechtsdrehenden (+)-Enantiomer und die Beispiele mit einem angehängten Buchstaben „B" (1 B, 2B, ... bis 90B) dem linksdrehenden (-)-Enantiomer der jeweiligen Verbindung 1 bis 90. Die Benennung der Verbindungen entspricht der mit ACD- Labs Version 8.00 release product version 8.05 generierten Benennung.

Tabelle 2

^J

OO

CD

N)

O

N)

N) K)

N)

CO

N) J--

N) Ol

N)

N)

N)

OO

N) CD

CO O

CO

CO

CO CO

CO

J--

CO Ol

CO

CO

CO OO

CO CD

O

CO

J--

Hierunter besonders bevorzugt sind die Racemate (d.h. Verbindungen 1 , 2, ...90) und ihre physiologisch verträglichen Salze sowie ihre Prodrugs. Besonders bevorzugt sind auch die (-)-Enantiomeren (d.h. Verbindungen 1 B, 2B, .... 90B) und ihre physiologisch verträglichen Salze sowie ihre Prodrugs. Insbesondere werden die zuvor genannten Verbindun- gen in Form ihrer freien Base oder in Form ihrer Säureadditionssalze bereitgestellt.

Im Folgenden werden beispielhafte Synthesewege zur Herstellung der erfindungsgemäßen Oxindol-Derivate beschrieben.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Oxindole kann auf verschiedenen Wegen erfolgen und ist in den Syntheseschemata 1 und 2 skizziert. In diesen Syntheseschemata besitzen die Variablen die gleichen Bedeutungen wie in der Formel I.

Die 3-Hydroxy-1 ,3-dihydroindol-2-one IV können durch Addition von metallierten Hetero- cyclen III an die 3-Ketogruppe der lsatine Il erhalten werden. Die metallierten Heterocyc- len, wie beispielsweise die entsprechenden Grignard- (Mg) oder Organyllithium- Verbindung, können in üblicher weise aus Halogen- oder Kohlenwasserstoffverbindungen erhalten werden. Beispielhafte Vorschriften sind in Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Bd. 13, 1-2, Kap. Mg- bzw. Li-Verbindungen, enthalten. Die lsatine Il sind entweder kommerziell erhältlich oder können in Analogie zu in der Literatur beschriebenen Methoden hergestellt werden (Advances in Heterocyclic Chemistry, A.R. Katritzky and AJ. Boulton, Academic Press, New York, 1975, 18, 2-58; J. Brazil. Chem. Soc. 12, 273-324, 2001 ).

Die 3-Hydroxyoxindole IV, die im 6-Ring-Aromaten beispielsweise in der 5-Position als Rest R ^a ein lod enthalten, können mit KCN oder Zn(CN) ₂ unter Pd(0)-Katalyse in Lösungsmitteln wie Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran, gegebenenfalls auch unter Zusatz von Basen wie K ₂ CO ₃ oder anderen Carbonaten oder Aminen, bei höherer Temperatur in das analoge cyanhaltige 3-Hydroxyoxindol IV überführt werden. Als Pd(0)-Salze kann man zum Beispiel Übergangsmetallkomplexe nehmen, die in situ aus PdCI ₂ oder PdOAc ₂ durch Zugabe von Phosphinen wie Tris(ortho-tolyl)phosphin hergestellt werden. Ebenso können kommerzielle Palladium-Komplexe wie beispielsweise der Katalysator Tetrakis(triphenylphosphin)-palladium(0) und / oder Zusätze von Phosphin-Liganden eingesetzt werden. Anschließend erfolgt die Derivatisierung der Hydroxygruppe in der Verbindung IV, beispielsweise mit Chlorameisensäurephenylester, zu den Verbindungen Va und / oder Vb. Dies erfolgt folglich durch Umsetzung mit Reagenzien, wie zum Beispiel Carbonsäuren, Carbonsäurechloriden, Carbonsäureanhydriden, Chloroformaten, Isocyanaten oder Car- bamoylchloriden, in die erfindungsgemäßen Verbindungen V, wobei allgemein übliche Methoden benutzt werden (siehe J. March, Advanced Organic Chemistry, 1992, 4. Auflage, Wiley, New York, Seiten 417-421 ; 499; 903). Beispielsweise kann LG als Fluchtgruppe OPh in den Verbindungen Va und / oder Vb tragen, die aus der Reaktion von IV mit Chlorameisensäurephenylester in Gegenwart einer Base, wie zum Beispiel Pyridin her- vorgeht.

Die anschließende Umsetzung mit Aminen VI im Überschuss, gegebenenfalls bei erhöhter Temperatur und / oder unter Zusatz von Hilfsbasen wie beispielsweise Triethylamin oder Diisopropylethylamin, führt zu den Verbindungen VII. Die Amine VI können entweder käuflich erworben oder nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden.

Verbindungen wie VII können anschließend durch Behandlung mit Sulfonsäurechloriden VIII nach Deprotonierung mit einer starken Base, wie zum Beispiel Kalium-te/f-butylat oder Natriumhydrid, in Dimethylformamid (DMF) in die erfindungsgemäßen Verbindungen überführt werden. Die eingesetzten Sulfonsäurechloride VIII können entweder käuflich erworben oder in analoger Weise zu bekannten Verfahren (siehe z.B. J. Med. Chem. 40, 1 149 (1997)) hergestellt werden.

SYNTHESESCHEMA 1

Vb

EtO = Ethoxy

Ph = Phenyl

R ^a = CN oder lod

Alternativ können die erfindungsgemäßen Verbindung I nach Syntheseschema 2 in dem zu Syntheseschema 1 analogen gezeigten dreistufigen Verfahren unter Änderung der Reihenfolge hergestellt werden.

Hier erfolgt zunächst die Sulfonylierung der 3-Hydroxyoxindole IV durch Deprotonierung mit einer starken Base, wie zum Beispiel Natriumhydrid oder Kalium-te/f-butylat, und anschließende Behandlung mit Sulfonsäurechloriden VIII in DMF. Im nächsten Schritt folgt die Derivatisierung der Hydroxygruppe in IX zur der Verbindung X durch Behandlung beispielsweise mit Chlorameisensäurephenylester. Im Überschuss von Amin VI oder auch unter Zuhilfenahme einer Hilfsbase werden letztendlich die erfindungsgemäßen Verbindungen I generiert.

SYNTHESESCHEMA 2

IX

EtO = Ethoxy

Ph = Phenyl

Eine weitere Herstellungsmöglichkeit und Derivatisierung durch R ³ im Amin VI stellt die Umsetzung von Aminen mit Aldehyden oder Ketonen in Gegenwart von Reduktionsmit- teln, wie zum Beispiel Natriumcyanoborhydrid oder Natriumacetoxyborhydrid, im Sinne einer reduktiven Aminierung dar (J. March, Advanced Organic Chemistry, 1992, 4. Auflage, Wiley, New York, Seiten 411 ; 898). Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Mittel, enthaltend mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formel I und/oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder eine Prodrug davon, wie vorstehend ausgeführt, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger hängen unter anderem von der Darreichungsform des Mittels ab und sind dem Fachmann grundsätzlich bekannt. Einige geeignete Träger sind weiter unten beschrieben.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen der Formel I und/oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder Prodrugs davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Va- sopressin-abhängigen Krankheiten.

Vasopressin-abhängige Krankheiten sind solche, bei denen der Krankheitsverlauf zumindest teilweise von Vasopressin abhängt, d.h. Krankheiten, die einen erhöhten Vasopres- sin-Spiegel zeigen, der unmittelbar oder indirekt zum Krankheitsbild beitragen kann. Anders ausgedrückt sind Vasopressin-abhängige Krankheiten solche, die durch Modulation des Vasopressinrezeptors, beispielsweise durch Gabe eines Vasopressinrezeptorligan- den (Agonist, Antagonist, partieller Antagonist/Agonist, inverser Agonist etc.), beeinflusst werden können.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder Prodrugs davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, die ausgewählt sind unter Diabetes, Insulin- Resistenz, Enuresis nocturna, Inkontinenz und Krankheiten, bei denen Blutgerinnungsstörungen auftreten, und/oder zur Verzögerung der Miktion. Unter dem Begriff „Diabetes" sind alle Diabetesformen zu verstehen, vor allem Diabetes mellitus (einschließlich Typ I und insbesondere Typ II), Diabetes renalis und insbesondere Diabetes insipidus. Bevorzugt handelt es sich bei den Diabetesformen um Diabetes mellitus vom Typ Il (mit Insulin- resistenz) oder Diabetes insipidus.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder Prodrugs davon zur Herstellung eines Medikaments zur Be- handlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, die ausgewählt sind unter Hypertonie, pulmonaler Hypertonie, Herzinsuffizienz, Myocardinfarkt, koronarem Spasmus, instabiler Angina, PTCA (percutaneous transluminal coronary angioplastie), Ischämien des Herzens, Störungen des renalen Systems, Ödemen, renalem Vasospasmus, Nekrose des renalen Cortex, Hyponatriämie, Hypokaliämie, Schwartz-Bartter Syndrom, Störungen des Gastrointestinaltraktes, gastritischem Vasospasmus, Hepatozirrhose, Magen- und Darm- ulkus, Emesis, auftretender Emesis bei der Chemotherapie, und Reisekrankheit.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I bzw. ihre pharmazeutisch verträglichen Salze oder ihre Prodrugs oder das erfindungsgemäße pharmazeutische Mittel kön- nen auch zur Behandlung von verschiedenen Vasopressin-abhängigen Beschwerden, die zentralnervöse Ursachen oder Veränderungen in der HPA-Achse (hypothalamic pituitary adrenal axis) aufweisen, verwendet werden, zum Beispiel bei affektiven Störungen, wie depressiven Störungen und bipolaren Störungen. Dazu gehören zum Beispiel dysthyme Störungen, Phobien, posttraumatische Belastungsstörungen, generelle Angsstörungen, Panikstörungen, saisonale Depressionen und Schlafstörungen.

Ebenso können die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I bzw. ihre pharmazeutisch verträglichen Salze oder ihre Prodrugs oder das erfindungsgemäße pharmazeutische Mittel zur Behandlung bei Angststörungen und stressabhängigen Angststörungen eingesetzt werden, wie zum Beispiel generalisierten Angststörungen, Phobien, posttraumatischen Angststörungen, panischen Angststörungen, obsessiv-zwanghaften Angststörungen, akuten stressabhängigen Angststörungen und Sozialphobie.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch zur Behandlung von Ge- dächnisleistungsstörungen, Morbus Alzheimer, Psychosen, psychotischen Störungen,

Schlafstörungen und/oder dem Cushing Syndrom sowie allen stressabhängigen Krankheiten eingesetzt werden.

Dementsprechend betrifft eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder Prodrugs davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von affektiven Störungen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Ver- wendung von erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder Prodrugs davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Angststörungen und/oder stressabhängigen Angststörungen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Ver- wendung von erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder Prodrugs davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Gedächtnisleistungsstörungen und/oder Morbus Alzheimer.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Ver- wendung von erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder Prodrugs davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Psychosen und/oder psychotischen Störungen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Ver- wendung von erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder Prodrugs davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung des Cushing-Syndroms oder sonstigen stressabhängigen Krankheiten.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Ver- wendung von erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder Prodrugs davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Schlafstörungen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Ver- wendung von erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder Prodrugs davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von depressiven Erkrankungen. Eine besondere Form von depressiven Erkrankungen sind sogenannte childhood onset mood disorders, d.h. depressive Verstimmungen, die bereits in der Kindheit einsetzen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder Prodrugs davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von vasomotorischen Symptomen und/oder thermoregulatorischen Fehlfunktio- nen, wie beispielsweise das „hot flush"-Symptom. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder Prodrugs davon zur Herstellung eines Medikaments zur Be- handlung und/oder Prophylaxe von Drogen-, Arzneimittel- und/oder durch sonstige Faktoren vermittelten Abhängigkeiten, zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Stress bedingt durch den Entzug von einem oder mehreren die Abhängigkeit vermittelnden Faktoren und/oder zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Stress-induzierten Rückfällen in die Drogen-, Arzneimittel- und/oder durch sonstige Faktoren vermittelten Abhängigkeiten.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder Prodrugs davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Schizophrenie und/oder Psychose.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Vasopressin-abhängigen Krankheiten, bei dem man einem Patienten eine wirksame Menge wenigstens einer erfindungsgemäßen Verbindung der Formel I oder wenigstens eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder einer Prodrug davon oder eines erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittels verabreicht.

Bezüglich der Definition von Vasopressin-abhängigen Krankheiten wird auf die vorstehenden Ausführungen Bezug genommen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung dient das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, die ausgewählt sind unter Diabetes, Insulin-Resistenz, Enuresis nocturna, Inkontinenz und Krankheiten, bei denen Blutgerinnungsstörungen auftreten, und/oder zur Verzögerung der Miktion. Bezüglich der Definition von Diabetes wird auf die vorstehenden Ausführungen verwiesen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dient das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, die ausgewählt sind unter Hypertonie, pulmonaler Hypertonie, Herzinsuffizienz, Myocardinfarkt, koronarem Spasmus, instabiler Angina, PTCA (percutaneous transluminal coronary angioplastie), Ischämien des Herzens, Störungen des renalen Systems, Ödeme, renalem Vasospasmus, Nekrose des renalen Cortex, Hyponatriämie, Hypokaliämie, Schwartz-Bartter Syndrom, Störungen des Gastrointestinaltraktes, gastritischem Vasospasmus, Hepatozirrhose, Magen- und Darmulkus, Emesis, auftretender Emesis bei der Chemotherapie und Reisekrankheit.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dient das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von affektiven Störungen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dient das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Angststörungen und/oder stressabhängigen Angststörungen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dient das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe Gedächtnisleistungsstörungen und/oder Morbus Alzheimer.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dient das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Psychosen und/oder psychotischen Störungen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dient das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe des Cushing-Syndroms.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dient das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Schlafstörungen bei einem Patienten.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dient das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von depressiven Erkrankungen. Bei den depressiven Erkrankungen sind speziell auch die chlidhood onset mood disorders zu nennen, d.h. depressive Verstimmungen, die bereits im Kindesalter einsetzen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dient das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von von vasomotorischen Symptomen und/oder thermoregulatorischen Fehlfunktionen, wie beispielsweise dem „hot flush"-Symptom.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dient das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Drogen-, Arzneimittel- und/oder durch sonstige Faktoren vermittelte Abhängigkeiten, zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Stress bedingt durch den Entzug von einem oder mehreren die Abhängigkeit vermittelnden Faktoren und/oder zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Stress-induzierten Rückfällen in die Drogen-, Arzneimittel- und/oder durch sonstige Faktoren vermittelten Abhängigkeiten.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dient das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Schizophrenie und/oder Psychose.

Bei dem mit dem erfindungsgemäßen Verfahren prophylaktisch oder therapeutisch zu behandelnden Patienten handelt es sich vorzugsweise um ein Säugetier, beispielsweise um einen Menschen oder um ein nichtmenschliches Säugetier oder um ein nichtmenschliches transgenes Säugetier. Speziell handelt es sich um einen Menschen.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I, ihre pharmazeutisch verträglichen Salze und Prodrugs, wie vorstehend ausgeführt, können von einem Fachmann in Kenntnis der erfindungsgemäßen technischen Lehre in Ausführung und/oder in analoger Ausführung von an sich bekannten Verfahrensschritten hergestellt werden.

Die Verbindungen I bzw. deren Prodrugs und/oder deren pharmazeutisch verträglichen Salze zeichnen sich dadurch aus, dass sie eine Selektivität zum Vasopressin-

Rezeptorsubtyp V1 b gegenüber mindestens einem der nahe verwandten Vasopres- sin/Oxytozin-Rezeptorsubtypen (zum Beispiel Vasopressin V1 a, Vasopressin V2 und/oder Oxytozin) aufweisen.

Alternativ oder vorzugsweise zusätzlich zeichnen sich die Verbindungen I bzw. deren

Prodrugs und/oder deren pharmazeutisch verträglichen Salze dadurch aus, dass sie eine verbesserte metabolische Stabilität aufweisen.

Die metabolische Stabilität einer Verbindung kann beispielsweise gemessen werden, in- dem man eine Lösung dieser Verbindung mit Lebermikrosomen von bestimmten Spezies (zum Beispiel Ratte, Hund oder Mensch) inkubiert und die Halbwertszeit der Verbindung unter diesen Bedingungen bestimmt (RS Obach, Curr Opin Drug Discov Devel. 2001 , 4, 36-44). Dabei kann aus einer beobachteten größeren Halbwertszeit auf eine verbesserte metabolische Stabilität der Verbindung geschlossen werden. Die Stabilität in Gegenwart von humanen Lebermikrosomen ist von besonderem Interesse, da sie eine Vorhersage für den metabolischen Abbau der Verbindung in der menschlichen Leber ermöglicht. Verbindungen mit erhöhter metabolischer Stabilität (gemessen in dem Lebermikrosomen- Test) werden deshalb wahrscheinlich auch in der Leber langsamer abgebaut. Der langsamere metabolische Abbau in der Leber kann zu höheren und/oder länger anhaltenden Konzentrationen (Wirkspiegel) der Verbindung im Körper führen, so dass die Eliminie- rungs-Halbwertszeit der erfindungsgemässen Verbindungen erhöht ist. Erhöhte und/oder länger anhaltende Wirkspiegel können zu einer besseren Wirksamkeit der Verbindung in der Behandlung oder Prophylaxe von verschiedenen Vasopressin-abhängigen Krankheiten führen. Außerdem kann eine verbesserte metabolische Stabilität zu einer erhöhten Bioverfügbarkeit nach oraler Gabe führen, da die Verbindung nach erfolgter Resorption im Darm einem geringeren metabolischen Abbau in der Leber (sogenannter „first pass ef- fect") unterliegt. Eine erhöhte orale Bioverfügbarkeit kann aufgrund erhöhter Konzentration (Wirkspiegel) der Verbindung zu einer besseren Wirksamkeit der Verbindung nach oraler Gabe führen.

Alternativ oder vorzugsweise zusätzlich zeichnen sich die Verbindungen I bzw. deren Prodrugs und/oder deren pharmazeutisch verträglichen Salze dadurch aus, dass sie in Patienten oder relevanten Tiermodellen, die prognostische Aussagen für die Anwendung in der Behandlung ermöglichen, gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Oxindol-Verbindungen eine verbesserte pharmakologische Aktivität aufweisen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind nach Verabreichung auf verschiedenen Wegen wirksam. Die Verabreichung kann beispielsweise intravenös, intramuskulär, subkutan, topisch, intratracheal, intranasal, transdermal, vaginal, rektal, sublingual, bukkal oder oral erfolgen und erfolgt häufig intravenös, intramuskulär oder insbesondere oral.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine wirksame Dosis einer erfindungsgemäßen Verbindung I, eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder einer Prodrug davon und geeignete pharmazeutische Träger (Arznei- träger) enthalten.

Diese Arzneiträger werden entsprechend der pharmazeutischen Form und der gewünschten Applikationsart gewählt und sind dem Fachmann grundsätzlich bekannt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I oder gegebenenfalls geeignete Salze dieser Verbindungen können zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur oralen, sublingualen, bukkalen, subkutanen, intramuskulären, intravenösen, topischen, intratrachealen, intranasalen, transdermalen, vaginalen oder rektalen Verabreichung verwendet werden und Tieren oder Menschen in einheitlichen Verabreichungsfor- men, gemischt mit herkömmlichen pharmazeutischen Trägern, zur Prophylaxe oder Behandlung der obigen Störungen oder Krankheiten verabreicht werden.

Die geeigneten Verabreichungsformen (Dosiereinheiten) umfassen Formen zur oralen Verabreichung, wie Tabletten, Gelatinekapseln, Pulver, Körnchen und Lösungen oder Suspensionen zur oralen Einnahme, Formen zur sublingualen, bukkalen, intratrachealen oder intranasealen Verabreichung, Aerosole, Implantate, Formen der subkutanen, intramuskulären oder intravenösen Verabreichung und Formen der rektalen Verabreichung.

Zur topischen Verabreichung können die erfindungsgemäßen Verbindungen in Cremes, Salben oder Lotionen verwendet werden.

Um den gewünschten prophylaktischen oder therapeutischen Effekt zu erzielen, kann die Dosis des Wirkstoffs zwischen 0.01 und 50 mg pro kg Körpergewicht und pro Tag variieren.

Jede Einheitsdosis kann 0.05 bis 5000 mg, vorzugsweise 1 bis 1000 mg, des Wirkstoffs in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger enthalten. Diese Einheitsdosis kann 1- bis 5-mal am Tag verabreicht werden, so dass eine tägliche Dosis von 0,5 bis 25000 mg, vorzugsweise 1 bis 5000 mg, verabreicht wird.

Falls eine feste Zusammensetzung in Form von Tabletten zubereitet wird, wird der Wirkstoff mit einem festen pharmazeutischen Träger, wie Gelatine, Stärke, Laktose, Magnesi- umstearat, Talk, Siliziumdioxid oder Ähnlichem, gemischt.

Die Tabletten können mit Saccharose, einem Cellulosederivat oder einer anderen geeigneten Substanz beschichtet werden oder anders behandelt werden, um eine anhaltende oder verzögerte Aktivität aufzuweisen und um eine vorbestimmte Menge des Wirkstoffs kontinuierlich freizugeben.

Eine Zubereitung in Form von Gelatinekapseln wird durch Mischen des Wirkstoffs mit ei- nem Streckmittel und Aufnehmen der resultierenden Mischung in weiche oder harte Gelatinekapseln erhalten.

Eine Zubereitung in Form eines Sirups oder Elixiers oder zur Verabreichung in Form von Tropfen kann Wirkstoffe zusammen mit einem Süßstoff, der vorzugsweise kalorienfrei ist, Methylparaben oder Propylparaben als Antiseptika, einen Aromastoff und einen geeigneten Farbstoff enthalten.

Die wasserdispergierbaren Pulver oder Körnchen können die Wirkstoffe, gemischt mit Dispergiermitteln, Benetzungsmitteln oder Suspensionsmitteln, wie Polyvinylpyrrolidone, sowie Süßstoffe oder Geschmackskorrigentien, enthalten.

Eine rektale oder vaginale Verabreichung wird durch Verwendung von Zäpfchen erreicht, die mit Bindemitteln zubereitet werden, die bei rektaler Temperatur schmelzen, zum Bei- spiel Kakaobutter oder Polyethylenglykole. Eine parenterale Verabreichung erfolgt unter Verwendung von wässrigen Suspensionen, isotonischen Salzlösungen oder sterilen und injizierbaren Lösungen, die pharmakologisch verträgliche Dispergiermittel und/oder Benetzungsmittel, zum Beispiel Propylenglykol oder Polyethylenglykol, enthalten.

Der Wirkstoff kann auch als Mikrokapseln oder Zentrosome, falls geeignet mit einem oder mehreren Trägern oder Additiven, formuliert werden.

Zusätzlich zu den erfindungsgemäßen Verbindungen können die erfindungsgemäßen Mittel andere Wirkstoffe enthalten, die zur Behandlung der oben angegebenen Störungen oder Krankheiten nützlich sein können.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit weiterhin pharmazeutische Mittel, in denen mehrere Wirkstoffe zusammen anwesend sind, wobei mindestens einer von diesen eine erfindungsgemäße Verbindung I, Salz oder eine Prodrug davon ist.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen näher erläutert, wobei die Beispiele nicht einschränkend zu verstehen sind.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann über verschiedene Synthe- serouten erfolgen. Die genannten Vorschriften, wie entsprechend in den Synthesesche- mata 1 und 2 beschrieben, sind nur exemplarisch anhand der genannten Beispiele näher erläutert, ohne ausschließlich auf die genannten Synthesewege 1 oder 2 oder Analogvorschriften beschränkt zu sein.

EXPERIMENTELLER TEIL

Abkürzungen:

THF: Tetrahydrofuran

DMSO: Dimethylsulfoxid

TFA: Trifluoressigsäure p: pseudo (beispielsweise pt pseudo Triplett) b: breit (beispielsweise bs breites Singulett) s: Singulett d: Doublett t: Triplett m: Multiple« dd: doppeltes Doublett dt: doppeltes Triplett tt: dreifaches Triplett

I. Herstellung der Ausgangsverbindung VI

a) 1 -Ethyl-4-piperidin-4-yl-piperazin

a.1 ) tert-Butyl 4-(4-ethylpiperazin-1-yl)piperidin-1-carboxylat

29.2 g (256 mmol) Λ/-Ethylpiperazin wurden mit 50.0 g (256 mmol) tert-Butyl 4- oxopiperidin-1-carboxylat (entspricht 1-Boc-4-piperidon) unter Eiskühlung in 800 ml Etha- nol vorgelegt. Man gab 15.4 g (256 mmol) Eisessig zu. Anschließend wurden portionsweise 16.1 g (256 mmol) Natriumacetoxyborhydrid zur gekühlten Reaktionsmischung gege- ben. Zunächst war eine leichte Gasbildung und nach 2/3-Zugabe des Reduktionsmittels eine Schaumbildung zu beobachten. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung unter Kühlung mit 200 ml 2 N Natronlauge versetzt, das Lösungsmittel Ethanol abdestilliert und die übrigbleibende Reaktionsmischung mit Wasser verdünnt. Es wurde mit Diethylether (2 x) ext- rahiert, mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung (1 x) gewaschen, und die vereinigten orga- nischen Phasen über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die rohe Titelverbindung wurde als gelbes Öl erhalten, das anschließend über eine mit Kieselgel gefüllte, 4 I-Nutsche mit Dichlormethan und 10 % Methanol als Elutionsmittel chromatographiert wurde. Es wurden insgesamt 40 g (135 mmol, 53 %) tert- Butyl 4-(4-ethylpiperazin-1-yl)piperidin-1-carboxylat erhalten.

a.2) 1-Ethyl-4-piperidin-4-yl-piperazin als Chlorid-Salz

Zur Schutzgruppenentfernung wurden 40 g (135 mmol) te/f-Butyl 4-(4-ethylpiperazin-1- yl)piperidin-1-carboxylat aus Beispiel a.1 in 200 ml Methanol und 1.8 I Dichlormethan vor- gelegt und mit 100 ml 5-6 M HCI-Lösung in Isopropanol versetzt. Es entstand eine Suspension, wobei auch eine leichte Gasentwicklung zu beobachten war. Der Reaktionsansatz wurde eine Stunde bei 40 ⁰ C (Wasserbadtemperatur) gerührt und 48 Stunden bei Raumtemperatur nachgerührt. Zur vollständigen Entschützung wurden nochmals 50 ml der 5-6 M HCI-Lösung in Isopropanol zugegeben und die Reaktionsmischung bei 40 ⁰ C gerührt. Am Rotationsverdampfer wurde das Dichlormethan abdestilliert. Es wurden nochmals 200 ml Methanol und 30 ml der 5-6 M HCI-Lösung in Isopropanol zugesetzt. Man rührte die Reaktionsmischung eine Stunde am Rückfluss, wobei sich eine weiße Suspension mit starker Gasentwicklung bildete. Danach entstand eine dünnflüssige Suspension, die auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. Der Niederschlag wurde abgesaugt und mit Methanol und Diethylether gewaschen. Nach dem Trocknen wurden 36 g (1 17 mmol, 87 %) des 1-Ethyl-4-piperidin-4-yl-piperazins als Chlorid-Salz isoliert.

¹ H-NMR (D ₂ O, 400 MHz) δ [ppm] = 3.74 - 3.47 (m, 1 1 H), 3.28 (q, 2H, J = 7.3 Hz), 3.06 (dt, 2H, J = 2.2 Hz, J = 13.2 Hz), 2.38 (m, 2H, J = 13.6 Hz), 1.89 (dq, 2H, J = 4.1 Hz, J = 13.3 Hz), 1.30 (t, 3H, J = 7.3 Hz).

II. Herstellung der racemischen Verbindungen der Formel I

BEISPIEL 1 : (±)-5-Cyano-1-[(2,4-dimethoxyphenyl)sulfonyl]-3-(2-ethoxypy ridin-3-yl)-2-oxo-2,3-dihydro- 1 /-/-indol-3-yl 4-(1 -methylpiperidin-4-yl)piperazin-1 -carboxylat

1.1 (±)-3-(2-Ethoxypyridin-3-yl)-3-hydroxy-5-iod-1 ,3-dihydro-2H-indol-2-on Zu 20.86 g (76.40 mmol) 5-lodisatin in 400 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) gab man unter Kühlung mit einem Eisbad und Rühren 3.22 g (80.50 mmol, 60%w/w) Natrium- hydrid portionsweise zu, wobei die Temperatur zwischen 0-10 ⁰ C gehalten wurde. Die erhaltene Suspension wurde unter Kühlung mit einem Eisbad eine Stunde gerührt. Zur Herstellung des Pyridin-Grignards wurden 20 g (80.30 mmol) 2-Ethoxy-3-iod-pyridin in 400 ml wasserfreiem THF bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurden 95.6 ml (1 M Lösung in THF, 95.60 mmol) Ethylmagnesiumbromid in einem Zeitraum von 5-10 Minuten unter Kühlung bei einer Temperatur zwischen 22 und 15 ⁰ C gegeben. Die Lösung wurde 20 Minuten gerührt, wobei sie sich von farblos zu leicht gelblich färbte.

Die Lösung des Pyridin-Grignards wurde anschließend zur Eisbad-gekühlten Lösung des 5-lodisatin-Natrium-Salzes in einem Zeitraum von 5-10 Minuten bei einer Temperatur zwischen 5 und 18 ⁰ C gegeben. Nach beendeter Zugabe des Pyridin-Grignards wurde das Eisbad entfernt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden nachgerührt. Ein Überschuss an gesättigter Ammoniumchlorid-Lösung wurde zugegeben, gefolgt von Ethylacetat, wobei die Mischung 5 Minuten nachgerührt wurde. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und mit Ethylacetat (2 x) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser (2 x) gewaschen und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Dabei fiel aus der noch verdünnten Lösung zuerst unreagiert.es 5-lodisatin aus und wurde abgetrennt. Nach dem weiteren Aufkonzentrieren kristallisierte schließlich auch die Titelverbindung aus. Die Suspension wurde im Kühlschrank zwei Stunden bei 5 ⁰ C gelagert. Der ausgefallene, schwach gelbe Feststoff wurde anschließend abfiltriert und mit wenig Ethylacetat nachgewaschen. Nach dem Trocknen bei 40 ⁰ C wurde (±)-3-(2-Ethoxypyridin-3-yl)- 3-hydroxy-5-iod-1 ,3-dihydro-2/-/-indol-2-on (17.1 g, 43.16 mmol, 57 %) isoliert.

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 397.05 Berechnet für Ci ₅ H ₁₃ IN ₂ O ₃ = 396.19

1.2 (±)-5-Cyano-3-hydroxy-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-1 ,3-dihydroindol-2-on 7.1 g (17.92 mmol) (±)-3-(2-Ethoxypyridin-3-yl)-3-hydroxy-5-iod-1 ,3-dihydro-2/-/-indol-2-on aus Beispiel 1.1 wurden in 100 ml wasserfreiem THF unter Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur gerührt. 2.1 g (17.92 mmol) Zinkcyanid wurden zugegeben, gefolgt von 0.51 g (0.45 mmol) des Katalysators Tetrakis(triphenylphosphin)-palladium(0). Die Reaktionsmischung wurde direkt in ein vorgeheiztes Ölbad mit einer Temperatur von 100 ⁰ C gestellt. Man rührte bei 100 ⁰ C (Ölbadtemperatur) und gab nach 30 Minuten weitere 0.51 g (0.45 mmol) des Katalysators zu. Insgesamt wurde 2 Stunden gerührt. Man ließ die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abkühlen und gab einen Überschuss an Wasser zu. Anschließend extrahierte man mit Ethylacetat (3 x) und wusch die vereinigten organi- sehen Phasen mit Wasser (3 x). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum bis zur Trockene verdampft, und der Rückstand mit kleinen Volumina an Ethylacetat aufgeschlämmt. Ein schwach gelber Feststoff konnte abfiltriert werden, der mit Ethylacetat nachgewaschen und im Vakuumtrockenschrank getrocknet wurde. Man erhielt 3.7 g (12.44 mmol, 69.4%) 5-Cyano-3-hydroxy-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-1 ,3-dihydroindol-2-on.

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 296.05 Berechnet für Ci ₆ H ₁₃ N ₃ O ₃ = 295.30

1.3 (±)-Phenyl 5-cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-3-[(phenoxycarbonyl)o xy]-indolin- 1-carboxylat

Zu einer auf 0 ⁰ C gekühlten Suspension aus 5.20 g (17.61 mmol) (±)-5-Cyano-3-hydroxy- 3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-1 ,3-dihydroindol-2-on aus Beispiel 1.2 in 100 ml Pyridin wurden 4.63 ml (36.98 mmol) Phenylchlorformiat bei der vorgegebenen Temperatur langsam unverdünnt getropft. Nach dem Auftauen der Reaktionsmischung auf Raumtemperatur wur- de 2 Stunden nachgerührt. Der Reaktionsverlauf wurde dünnschichtchromatographisch verfolgt (Kieselgel, Dichlormethan / Methanol 9 : 1 ). Überschüssiges Pyridin wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand auf 200 ml Eiswasser gegossen und mit Ethylacetat (3 x) extrahiert. Die organische Phase wurde noch mit Wasser (2 x) gewaschen. Spuren von Pyridin waren in der Phase weiterhin enthalten. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Ethylacetats im Vakuum wurde durch mehrmaliges Versetzen mit Toluol und Entfernen im Vakuum das restliche Pyridin ausgetrieben. Der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 8.20 g (15.31 mmol, 87 %) des Phenyl-5-cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-3- [(phenoxycarbonyl)oxy]-indolin-1 -carboxylats erhalten.

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 536.25 Berechnet für C ₃₀ H _2I N ₃ O ₇ = 535.52

1.4 (±)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-2,3-dihydro-1 H-indol-3-yl 4-(1 - methylpiperidin-4-yl)piperazin-1-carboxylat Zu einer Lösung von 1.60 g (2.89 mmol) (±)-Phenyl 5-cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2- oxo-3-[(phenoxycarbonyl)oxy]-indolin-1-carboxylat aus Beispiel 1.3 in 50 ml THF wurden 2.74 g (14.94 mmol) 1-(1-Methylpiperidin-4-yl)piperazin gegeben. Dabei bildete sich zunächst eine leichte Trübung und letztendlich fiel ein Niederschlag aus. Nach 2-stündigem Rühren bei Raumtemperatur war die Reaktion vollständig (Kontrolle durch Dünnschichtch- romatographie (Kieselgel, Dichlormethan / Methanol 9 : 1 ) ). Es wurde über Nacht nach- gerührt. Der Niederschlag wurde abgesaugt und mit THF und Diethylether gewaschen. Man erhielt 0.923 g (1.829 mmol, 61 %) 5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-2,3- dihydro-1 H-indol-3-yl 4-(1-methylpiperidin-4-yl)piperazin-1-carboxylat. Die Titelverbindung war gemäß MS und HPLC rein. Die Mutterlauge enthielt nur noch Spuren der Titelverbin- düng sowie das Nebenprodukt Phenyl-4-(1-methylpiperidin-4-yl)piperazin-1-carboxylat.

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 505.25 Berechnet für C ₂₇ H ₃₂ N ₆ O ₄ = 504.59

1.5 (±)-5-Cyano-1 -[(2,4-dimethoxyphenyl)sulfonyl]-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2- oxo-2,3- dihydro-1 H-indol-3-yl 4-(1 -methylpiperidin-4-yl)piperazin-1 -carboxylat

Zu einer Lösung von 100 mg (0.20 mmol) (±)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-2,3- dihydro-1 H-indol-3-yl 4-(1-methylpiperidin-4-yl)piperazin-1 -carboxylat in 2 ml absolutem Dimethylformamid wurden unter Kühlung bei 0 ⁰ C 24.47 mg (0.22 mmol) Kalium-te/t- butylat in Substanz gegeben. Die Reaktionsmischung wurde eine Stunde bei 0 ⁰ C gerührt. Es bildete sich eine klare farblose Lösung. Bei 0 ⁰ C wurden 51.6 mg (0.22 mmol) 2,4- Dimethoxybenzolsulfonylchlorid zugegeben. Man ließ die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur auftauen und rührte über Nacht bei Raumtemperatur nach. Nach vollständigem Umsatz wurde die Reaktionsmischung auf 10 ml Eiswasser gegossen und mit 2 ml 1 N Natronlauge zunächst neutralisiert und dann auf pH 9 gestellt. Ein Niederschlag fiel aus, der mit Wasser gewaschen und im Vakuumtrockenschrank getrocknet wurde, so dass 68 mg getrockneter Feststoff erhalten wurden. Um die geringfügigen Verunreinigungen zu entfernen, wurde der Feststoff in 3 ml Diethylether ausgerührt. Nach Stehenlassen über Nacht wurde der Feststoff erneut abfiltriert und mit wenig Diethylether nachgewaschen und getrocknet. Man erhielt 40 mg (0.06 mmol, 29 %) (±)-5-Cyano-1-[(2,4- dimethoxyphenyl)sulfonyl]-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-2,3 -dihydro-1 /-/-indol-3-yl 4-(1 - methylpiperidin-4-yl)piperazin-1 -carboxylat.

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 705.4 Berechnet für C ₃₅ H ₄₀ N ₆ O ₈ S = 704.81

¹ H-NMR ([d ₆ ]-DMSO, 500 MHz) δ [ppm] = 8.22 - 8.10 (m, 2H), 7.96 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.92 (d, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.85 (d, 1 H, J = 8.7 Hz), 7.65 (s, 1 H), 7.13 (m, 1 H), 6.67 - 6.63 (m, 2H), 4.08 (m, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.67 - 3.45 (m, 3H), 3.51 (s, 3H), 3.04 (m, 2H), 2.74 (pd, 2H, J = 9.4 Hz), 2.46 (m, 1 H), 2.28 (m, 2H), 2.14 (m, 1 H), 2.10 (s, 3H), 1.79 (pt, 2H, J = 10.3 Hz), 1.61 (pd, 2H, J = 10.2 Hz), 1.36 (m, 2H), 0.99 (t, 3H, J = 6.4 Hz).

Die erfindungsgemäßen Verbindungen I können auch alternativ zur Kristallisation durch herkömmliche Säulenchromatographie über Normalphase (wie beispielsweise NP-SiC> ₂ - Kartusche, Chromabond und Dichlormethan / Methanol als Eluenten) und / oder durch präparative HPLC (RP, Eluenten Acetonitril / Wasser, 0.1 % TFA oder 0.1 % Essigsäure) gereinigt werden. Die Verbindungen I fallen dann gegebenenfalls als Trifluoressigsäure- Salz, Bis(trifluoressigsäure)-Salz bzw. Essigsäure-Salz an.

BEISPIELE 2 bis 90:

Die Verbindungen der Formel I gemäß den Beispielen 2 bis 90 können unter Verwendung der entsprechenden Ausgangsverbindungen analog zum Herstellungsverfahren des Bei- spiels 1 hergestellt werden.

BEISPIEL 2:

(±)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-1-[(2-methoxyphenyl )sulfonyl]-2-oxo-2,3-dihydro-1 /-/- indol-3-yl 4-(1 -methylpiperidin-4-yl)piperazin-1 -carboxylat

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 675.15 Berechnet für C ₃₄ H ₃₈ N ₆ O ₇ S = 674.78

BEISPIEL 4:

(±)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-1 -(phenylsulfonyl)-2,3-dihydro-1 /-/-indol-3-yl 4- (1 -methylpiperidin-4-yl)piperazin-1 -carboxylat

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 645.20 Berechnet für C ₃₃ H ₃₆ N ₆ O ₆ S = 644.76

¹ H-NMR ([dβl-DMSO, 500 MHz) δ [ppm] = 8.18 - 8.15 (m, 2H), 8.05 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 7.97 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 7.93 (dd, 1 H, J = 1.7 Hz, J = 8.6 Hz), 7.79 (pt, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.70 (pd, 1 H, J = 1.6 Hz), 7.66 (pt, 2H, J = 7.9 Hz), 7.15 (dd, 1 H, J = 5.1 Hz, J = 7.5 Hz), 4.05 (m, 1 H), 3.88 (m, 1 H), 3.55 (m, 2H), 3.03 (m, 2H), 2.97 (m, 2H), 2.47 - 2.21 (m, 10H), 1.74 (m, 2H), 1.51 (m, 2H), 0.89 (t, 3H, J = 7.1 Hz).

BEISPIEL 5: (±)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-1 -[(4-methoxyphenyl)sulfonyl]-2-oxo-2,3-dihydro-1 H- indol-3-yl 4-(1 -methylpiperidin-4-yl)piperazin-1 -carboxylat

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 675.15 Berechnet für C ₃₄ H ₃₈ N ₆ O ₇ S = 674.78

BEISPIEL 10: (±)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyιϊdin-3-yl)-2-oxo-1 -(phenylsulfonyl)-2,3-dihydro-1 H-indol-3-yl 4- (1 -ethylpiperidin-4-yl)piperazin-1 -carboxylat, Trifluoressigsäure-Salz

Zu 50 mg (0.06 mmol) 5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-1-(phenylsulfonyl)-2, 3- dihydro-1 H-indol-3-yl 4-piperidin-4-ylpiperazin-1 -carboxylat in Form des

Bis(trifluoressigsäure)-Salzes aus Beispiel 28 in 5 ml Dimethylformamid wurden 4 μl (0.06 mmol) Acetaldehyd getropft. Die Mischung wurde 5 Minuten nachgerührt. Zu dieser Suspension wurden zuerst 41.3 mg (0.29 mmol) Natriumsulfat und danach 10 μl (0.12 mmol) Eisessig gegeben und eine Stunde nachgerührt. 18.5 mg (0.09 mmol) Natrium- acetoxyborhydrid wurden in einer Portion eingetragen, wobei sich bereits nach 15 Minuten eine fast klare Lösung bildete. Der Reaktionsverlauf wurde mittels LC-MS (RP, Acetonitril / Wasser als Eluenten und 0.1 % TFA) verfolgt. Nach vollständigem Umsatz wurde mit Wasser verdünnt und mit 2 N Natronlauge auf pH 10 eingestellt. Nach Abtrennen der organischen Phase wurde nochmals die wässrige Phase mit Dichlormethan (2 x) extrahiert, die vereinigte organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Es wurden 35 mg der rohen Titelverbindung isoliert, die über präparative HPLC auf einer Chromolith-Säule (Normalphase, Fa. Merck) mit den Eluenten Dichlormethan und Methanol (Gradient 0 - 5 Vol% Methanol innerhalb von 15 Min.) aufgereinigt wurde. Da neben der Titelverbindung noch Nebenprodukt (das desulfo- nylierte Analog zum Produkt) nachweisbar war, wurde nochmals über die präparative HPLC (RP, Eluenten Acetonitril / Wasser, 0.1 % TFA) aufgereinigt. Man isolierte 19 mg (0.027 mmol, 45 %) 5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-1-(phenylsulfonyl)-2, 3- dihydro-1 /-/-indol-3-yl 4-(1 -ethylpiperidin-4-yl)piperazin-1 -carboxylat, Trifluoressigsäure- Salz.

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 659.3 Berechnet für C ₃₄ H ₃₈ N ₆ O ₆ S = 658.78

BEISPIEL 25: (±)-5-Cyano-1-[(2,4-dimethoxyphenyl)sulfonyl]-3-(2-ethoxypy ridin-3-yl)-2-oxo-2,3-dihydro- 1 /-/-indol-3-yl 4-piperidin-4-ylpiperazin-1 -carboxylat als Bis(trifluoressigsäure)-Salz

Zu einer Lösung von 0.220 g (0.278 mmol) 5-Cyano-1-[(2,4-dimethoxyphenyl)sulfonyl]-3- (2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-2,3-dihydro-1 /-/-indol-3-yl-4-[1-(te/f-butoxycarbonyl)piperidin- 4-yl]piperazin-1 -carboxylat (hergestellt in Analogie zu Beispiel 1 , Verfahrensstufe 1.1 ) bis 1.5)) in 3 ml Dichlormethan wurden 0.159 mg (1.391 mmol) Trifluoressigsäure getropft. Die Reaktionsmischung wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt, wobei die Um- setzung mittels Dünnschichtchromatographie (Dichlormethan / Methanol 9 : 1 ) kontrolliert wurde. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand (304 mg) wurde anschließend über präparative HPLC (RP, Eluenten Acetonitril / Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt, wobei 20 mg (0.022 mmol, 8 %) 5-Cyano-1-[(2,4-dimethoxyphenyl)sulfonyl]-3-(2- ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-2,3-dihydro-1 /-/-indol-3-yl 4-piperidin-4-ylpiperazin-1 -carboxylats als Bis(trifluoressigsäure)-Salz isoliert wurden.

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 691.25 Berechnet für C ₃₄ H ₃₈ N ₆ O ₈ S = 690.78

BEISPIEL 28:

(±)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-1 -(phenylsulfonyl)-2,3-dihydro-1 /-/-indol-3-yl 4- piperidin-4-ylpiperazin-1 -carboxylat als Bis(trifluoressigsäure)-Salz

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 631.20 Berechnet für C ₃₂ H ₃₄ N ₆ O ₆ S = 630.73

BEISPIEL 31 :

(±)-5-Cyano-1-[(2,4-dimethoxyphenyl)sulfonyl]-3-(2-ethox ypyridin-3-yl)-2-oxo-2,3-dihydro- 1 /-/-indol-3-yl 4-(4-methylpiperazin-1-yl)piperidin-1 -carboxylat

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 705.25 Berechnet für C ₃₅ H ₄₀ N ₆ O ₈ S = 704.81

BEISPIEL 32:

(±)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-1-[(2-methoxyphenyl )sulfonyl]-2-oxo-2,3-dihydro-1 /-/- indol-3-yl 4-(4-methylpiperazin-1 -yl)piperidin-1 -carboxylat

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 675.15 Berechnet für C ₃₄ H ₃₈ N ₆ O ₇ S = 674.78

BEISPIEL 34:

(±)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-1 -(phenylsulfonyl)-2,3-dihydro-1 /-/-indol-3-yl 4- (4-methylpiperazin-1 -yl)piperidin-1 -carboxylat

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 645.15 Berechnet für C ₃₃ H ₃₆ N ₆ O ₆ S = 644.76

BEISPIEL 35: (±)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-1 -[(4-methoxyphenyl)sulfonyl]-2-oxo-2,3-dihydro-1 H- indol-3-yl 4-(4-methylpiperazin-1 -yl)piperidin-1 -carboxylat

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 675.25 Berechnet für C ₃₄ H ₃₈ N ₆ O ₇ S = 674.78

BEISPIEL 37:

(±)-5-Cyano-1-[(2,4-dimethoxyphenyl)sulfonyl]-3-(2-ethox ypyridin-3-yl)-2-oxo-2,3-dihydro- 1 /-/-indol-3-yl 4-(4-ethylpiperazin-1 -yl)piperidin-1 -carboxylat

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 719.30 Berechnet für C ₃₆ H ₄₂ N ₆ O ₈ S = 718.84 1H-NMR ([d ₆ ]-DMSO, 500 MHz) δ [ppm] = 8.19 (dd, 1 H ₁ J = 1.6 Hz, J = 4.9 Hz, 8.15 (dd,

1 H, J = 1.6 Hz, J = 7.6 Hz), 7.97 (m, 2H), 7.87 (d, 1 H, J = 8.7 Hz), 7.69 (m, 1 H), 7.16 (dd,

1 H, J = 5.0 Hz, J = 7.6 Hz), 6.72 - 6.68 (m, 2H), 4.19 (m, 1 H), 4.10 (m, 2H), 3.86 (s, 3H),

3.74 (m, 2H), 3.52 (s, 3H), 3.58 - 3.50 (m, 2H), 3.08 - 2.44 (m, 1 1 H), 1.57 (m, 3H), 1.18

(m, 3H), 1.01 (t, 3H, J = 6.8 Hz).

BEISPIEL 40:

(±)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-1 -(phenylsulfonyl)-2,3-dihydro-1 /-/-indol-3-yl 4-

(4-ethylpiperazin-1 -yl)piperidin-1 -carboxylat

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 659.30 Berechnet für C ₃₄ H ₃₈ N ₆ O ₆ S = 658.78

¹ H-NMR ([dβl-DMSO, 500 MHz) δ [ppm] = 8.19 - 8.17 (m, 2H), 8.07 (d, 2H, J = 7.7 Hz), 7.99 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 7.95 (m, 1 H, J = 8.4 Hz), 7.81 (t, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.73 (d, 1 H, J = 32.5 Hz), 7.67 (pt, 2H, J = 7.8 Hz), 7.17 (dd, 1 H, J = 5.0 Hz, J = 7.6 Hz), 4.18 - 4.04 (m, 2H), 3.92 (m, 1 H), 3.43 (m, 2H), 3.01 (m, 1 H), 2.62 (m, 1 H), 2.45 - 2.25 (m, 1 1 H), 1.79 (m, 1 H), 1.61 (m, 1 H), 1.36 (m, 1 H), 1.09 (m, 1 H), 0.97 (m, 3H), 0.92 (t, 3H, J = 7.1 Hz).

BEISPIEL 55: 5-Cyano-1-[(2,4-dimethoxyphenyl)sulfonyl]-3-(2-ethoxypyridin -3-yl)-2-oxo- 2, 3-dihydro-1 /-/-indol-3-yl 4-piperazin-1 -ylpiperidin-1 -carboxylat als Bis(trifluoressigsäure)- SaIz

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 691.25 Berechnet für C ₃₄ H ₃₈ N ₆ O ₈ S = 690.78

IM. Herstellung von chiralen Verbindungen der allgemeinen Formel I

A.) Racemattrennung von Verbindungen der Formel I Die Trennung von racemischen Verbindungen der Formel I kann beispielsweise durch Separation auf einer präparativen chiralen Säule erfolgen.

BEISPIEL 1A und BEISPIEL 1 B: (+)-5-Cyano-1-[(2,4-dimethoxyphenyl)sulfonyl]-3-(2-ethoxypyr idin-3-yl)-2-oxo-2,3-dihydro- 1 /-/-indol-3-yl 4-(1-methylpiperidin-4-yl)piperazin-1-carboxylat (Beispiel 1A) und (-)-5- Cyano-1-[(2,4-dimethoxyphenyl)sulfonyl]-3-(2-ethoxypyridin-3 -yl)-2-oxo-2,3-dihydro-1 /-/- indol-3-yl 4-(1-methylpiperidin-4-yl)piperazin-1-carboxylat (Beispiel 1 B)

68 mg (0.096 mmol) des racemischen 5-Cyano-1-[(2,4-dimethoxyphenyl)sulfonyl]-3-(2- ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-2,3-dihydro-1 /-/-indol-3-yl-4-(1 -methylpiperidin-4-yl)piperazin-1 - carboxylats aus Beispiel 1 wurden über eine chirale präparative Säule (Chiralcell OD, Fluss 55 ml/min) mit n-Heptan / Ethanol (700 : 300) als Elutionsmittel getrennt. Das zuerst eluierte Enantiomer (Beispiel 1A) mit positivem Drehwert (Drehwert bestimmt in Chloro- form) konnte in Ausbeute von 20 mg (0.028 mmol, 29 %) und das darauffolgende Enantiomer (Beispiel 1 B) mit negativem Drehwert (Drehwert bestimmt in Chloroform) in Ausbeute von 17 mg (0.024 mmol, 25 %) isoliert werden.

BEISPIEL 1A: (+)-5-Cyano-1-[(2,4-dimethoxyphenyl)sulfonyl]-3-(2-ethoxypyr idin-3-yl)-2-oxo-2,3-dihydro- 1 /-/-indol-3-yl 4-(1-methylpiperidin-4-yl)piperazin-1-carboxylat

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 353.4 (1/2 Masse) Berechnet für C ₃₅ H ₄₀ N ₆ O ₈ S = 704.81

HPLC (Chiracel OD 0.46 cm x 25 cm ; n-Heptan / Ethanol 7:3) R _f = 9.10 Min. Drehwert α (22 ⁰ C, 589 nm, CHCI ₃ , 1 mg/ml) = plusdrehend

¹ H-NMR ([dβl-DMSO, 500 MHz) δ [ppm] = 8.16 (dd, 1 H, J = 1.7 Hz, J = 4.9 Hz), 8.12 (dd, 1 H, J = 1.7 Hz, J = 7.6 Hz), 7.97 - 7.91 (m, 2H), 7.85 (pd, 1 H, J = 8.8 Hz), 7.66 (d, 1 H, J = 36.9 Hz), 7.13 (dd, 1 H, J = 5.0 Hz, J = 7.6 Hz), 6.66 (m, 2H), 4.15 (m, 1 H), 4.09 (q, 2H, J = 6.9 Hz), 3.84 (s, 3H), 3.53 - 3.48 (m, 1 H), 3.50 (s, 3H), 2.97 (pt, 1 H, J = 12.1 Hz), 2.62 (pt, 1 H, J = 12.6 Hz), 2.40 - 2.25 (m, 9H), 2.11 (s, 3H), 1.74 (m, 1 H), 1.58 (m, 1 H), 1.37 - 1.26 (m, 1 H), 1.04 (m, 1 H), 1.00 (t, 3H, J = 7.1 Hz).

BEISPIEL 1 B:

(-)-5-Cyano-1-[(2,4-dimethoxyphenyl)sulfonyl]-3-(2-ethoxy pyridin-3-yl)-2-oxo-2,3-dihydro- 1 /-/-indol-3-yl 4-(1-methylpiperidin-4-yl)piperazin-1-carboxylat ESI-MS [M+H ⁺ ] = 353.45 (1/2 Masse) Berechnet für C ₃₅ H ₄₀ N ₆ O ₈ S = 704.81 HPLC (Chiracel OD 0.46 cm x 25 cm ; n-Heptan / Ethanol 7:3) R _f = 15.91 Min. Drehwert α (22 ⁰ C, 589 nm, CHCI ₃ , 1 mg/ml) = minusdrehend 1H-NMR ([d ₆ ]-DMSO, 500 MHz) δ [ppm] = 8.17 (dd, 1 H, J = 1.7 Hz, J = 4.9 Hz), 8.12 (dd, 1 H, J = 1.7 Hz, J = 7.6 Hz), 7.97 - 7.91 (m, 2H), 7.84 (pd, 1 H, J = 8.5 Hz), 7.66 (d, 1 H, J = 37.5 Hz), 7.14 (dd, 1 H, J = 5.0 Hz, J = 7.6 Hz), 6.66 (m, 2H), 4.15 (m, 1 H), 4.08 (q, 2H, J = 6.9 Hz), 3.84 (s, 3H), 3.51 (s+m, 4H), 2.98 (pt, 1 H, J = 12.0 Hz), 2.62 (pt, 1 H, J = 11.1 Hz), 2.47 - 2.21 (m, 9H), 2.12 (s, 3H), 1.74 (m, 1 H), 1.57(m, 1 H), 1.40 - 1.23 (m, 1 H), 1.04 (m, 1 H), 1.00 (t, 3H, J = 7.1 Hz).

In analoger Weise lassen sich die Racemate der Beispiele 2 bis 90 unter Erhalt der entsprechenden (+)-Enantiomere 2A, 3A, 4A, 5A, 6A, 7A, 8A, 9A, 10A, 11 A, 12A, 13A, 14A, 15A, 16A, 17A, 18A, 19A, 2OA, 21 A, 22A, 23A, 24A, 25A, 26A, 27A, 28A, 29A, 3OA, 31 A, 32A, 33A, 34A, 35A, 36A, 37A, 38A, 39A, 4OA, 41 A, 42A, 43A, 44A, 45A, 46A, 47A, 48A, 49A, 5OA, 51 A, 52A, 53A, 54A, 55A, 56A, 57A, 58A, 59A, 6OA, 61 A, 62A, 63A, 64A, 65A, 66A, 67A, 68A, 69A, 7OA, 71A, 72A, 73A, 74A, 75A, 76A, 77A, 78A, 79A, 8OA, 81A, 82A, 83A, 84A, 85A, 86A, 87A, 88A, 89A und 9OA

sowie der entsprechenden (-)-Enantiomere 2B, 3B, 4B, 5B, 6B, 7B, 8B, 9B, 10B, 1 1 B,

12B, 13B, 14B, 15B, 16B, 17B, 18B, 19B, 2OB, 21 B, 22B, 23B, 24B, 25B, 26B, 27B, 28B, 29B, 3OB, 31 B, 32B, 33B, 34B, 35B, 36B, 37B, 38B, 39B, 4OB, 41 B, 42B, 43B, 44B, 45B, 46B, 47B, 48B, 49B, 5OB, 51 B, 52B, 53B, 54B, 55B, 56B, 57B, 58B, 59B, 6OB, 61 B, 62B, 63B, 64B, 65B, 66B, 67B, 68B, 69B, 7OB, 71 B, 72B, 73B, 74B, 75B, 76B, 77B, 78B, 79B, 8OB, 81 B, 82B, 83B, 84B, 85B, 86B, 87B, 88B, 89B und 9OB trennen.

BEISPIEL 2A:

(+)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-1-[(2-methoxyphenyl) sulfonyl]-2-oxo-2,3-dihydro-1 H- indol-3-yl 4-(1 -methylpiperidin-4-yl)piperazin-1 -carboxylat

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 675.20 Berechnet für C ₃₄ H ₃₈ N ₆ O ₇ S = 674.78

HPLC (Chiracel OD 0.46 cm x 25 cm ; n-Heptan / Ethanol 7:3) R _f = 10.10 Min. Drehwert α (22 ⁰ C, 589 nm, CHCI ₃ , 1 mg/ml) = plusdrehend

BEISPIEL 2B: (-)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-1-[(2-methoxyphenyl)sul fonyl]-2-oxo-2,3-dihydro-1 /-/- indol-3-yl 4-(1 -methylpiperidin-4-yl)piperazin-1 -carboxylat

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 675.20 Berechnet für C ₃₄ H ₃₈ N ₆ O ₇ S = 674.78 HPLC (Chiracel OD 0.46 cm x 25 cm ; n-Heptan / Ethanol 7:3) R _f = 12.73 Min. (ee = 80

%)

Drehwert α (22 ⁰ C, 589 nm, CHCI ₃ , 1 mg/ml) = minusdrehend

B.) Synthese der (+)- und (-)-Enantiomere der Verbindung der Formel I unter Verwendung von enantiomerenreinen Vor- und Zwischenstufen

Die Herstellung des (+)-Enantiomers der Formel I und des (-)-Enantiomers der Formel I kann auch unter Verwendung enantiomerenreiner Vor- und Zwischenstufen beispielsweise in Analogie zu Syntheseschema 1 oder 2 erfolgen, vorzugsweise gemäß Synthese- Schema 2. Anhand der Zwischenverbindung IV, racemisches 5-Cyano-3-hydroxy-3-(2- ethoxypyridin-3-yl)-1 ,3-dihydroindol-2-on, soll die Enantiomerentrennung näher erläutert werden, ohne auf dieses beschränkt zu sein. Die Trennung des Racemats in die Enanti- omere kann über eine chirale präparative Chromatographie erfolgen.

Trennung von racemischem 5-Cyano-3-hydroxy-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-1 ,3-dihydroindol- 2-on:

Von 10.0 g (33.86 mmol) des racemischen 5-Cyano-3-hydroxy-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)- 1 ,3-dihydroindol-2-ons aus Beispiel 1.2 wurden nach chromatographischer Trennung 4.85 g (16.42 mmol) des zuerst eluierenden 5-Cyano-3-hydroxy-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-1 ,3- dihydroindol-2-ons (minusdrehend, Drehwert bestimmt in Chloroform) mit einem Enantio- merenüberschuss (e.e.) von >99 % und 4.66 g (15.78 mmol) des zuletzt eluierenden 5- Cyano-3-hydroxy-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-1 ,3-dihydroindol-2-ons (plusdrehend, Drehwert bestimmt in Chloroform) mit einem Enantiomerenüberschuss (e.e.) von 99 % isoliert. Die Bedingungen der Enantiomerenseparation waren eine präparative chirale Säule (Chiral- pak AD 20 micron 5 cm ID x 500 cm) mit den Eluenten Hexan / Ethanol / Methanol im Verhältnis 80 / 10 / 10 und einer Flussrate von 80 ml/min.

Enantiomer 1 von 5-Cyano-3-hydroxy-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-1 ,3-dihydroindol-2-on: ESI-MS [M+H ⁺ ] = 296.15 Berechnet für Ci ₆ H ₁₃ N ₃ O ₃ = 295.30 HPLC (Chiralpak AD 4.6 mmID x 25 cm; Hexan / Ethanol / Methanol 80 / 10 / 10) R _f =

4.61 Min.

Drehwert α (22 ⁰ C, 589 nm, CHCI ₃ , 1 mg/ml) = minusdrehend

Enantiomer 2 von 5-Cyano-3-hydroxy-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-1 ,3-dihydroindol-2-on: ESI-MS [M+H ⁺ ] = 296.15 Berechnet für Ci ₆ H ₁₃ N ₃ O ₃ = 295.30

HPLC (Chiralpak AD 4.6 mmID x 25 cm; Hexan / Ethanol / Methanol 80 / 10 / 10) R _f = 6.43 Min.

Drehwert α (22 ⁰ C, 589 nm, CHCI ₃ , 1 mg/ml) = plusdrehend

Beispielhaft wird an Beispiel 4B die Syntheseroute in Analogie zum Syntheseschema 2 erläutert.

BEISPIEL 4B: (-)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-1 -(phenylsulfonyl)-2,3-dihydro-1 H-indol-3-yl 4- (1 -methylpiperidin-4-yl)piperazin-1 -carboxylat

4B.1 ) 3-(2-Ethoxypyridin-3-yl)-3-hydroxy-2-oxo-1-(phenylsulfonyl)i ndolin-5-carbonitril 2.50 g (7.79 mmol) (-)-5-Cyano-3-hydroxy-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-1 ,3-dihydroindol-2-ons (hergestellt gemäß Beispiel 1.2 und Trennung des Racemats in die entsprechenden Enantiomere wie zuvor beschrieben) wurden in 30 ml Dimethylformamid gelöst, wobei eine gelbe Lösung entstand. Nach Kühlung auf 0 ⁰ C gab man 1.00 g (8.94 mmol) Kalium- te/f.-butylat portionsweise zu, so dass die Temperatur zwischen 0 ⁰ C und 5 ⁰ C gehalten wurde. Die Lösung änderte die Farbe von gelb zu dunkelgelb. Man rührte 30 Minuten nach und tropfte bei 0 ⁰ C langsam 1.07 ml (8.20 mmol) Benzolsulfonsäurechlorid zu. Die Lösung trübte sich und färbte sich schwach orange. Man rührte eine Stunde unter Eiskühlung nach. Der Fortschritt der Reaktion wurde mittels Dünnschichtchromatographie (Dich- lormethan / Methanol 9 : 1 ) verfolgt. Zur Aufarbeitung wurde die Reaktionsmischung in Eiswasser getropft. Dabei fiel ein Niederschlag aus, der nach 5 Minuten Rühren abfiltriert und mit Wasser nachgewaschen wurde. Die Titelverbindung (2.65 g, 6.09 mmol, 78 %) wurde im Vakuumtrockenschrank bei 40 ⁰ C getrocknet und ohne weitere Aufreinigung für die Folgeumsetzung verwendet.

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 436.05 Berechnet für C ₂₂ H ₁₇ N ₃ O ₅ S = 435.46 4B.2) 5-Cyano-3-(2-ethoxypyιϊdin-3-yl)-2-oxo-1 -(phenylsulfonyl)-2,3-dihydro-1 H-indol-3-yl phenyl carbonat

2.65 g (6.09 mmol) optisch aktives 3-(2-Ethoxypyridin-3-yl)-3-hydroxy-2-oxo-1- (phenylsulfonyl)indolin-5-carbonitril aus Beispiel 4B.1 wurden unter Eiskühlung bei 0 ⁰ C vorgelegt und in 4.9 ml Pyridin und 6.0 ml Dichlormethan gelöst, wobei sich die Lösung braun färbte. Bei dieser Temperatur wurden langsam 1.24 g (7.91 mmol) Chlorameisen- säurephenylester zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde im Eisbad 2 Stunden nachgerührt. Nach vollständigem Umsatz wurde die Reaktionsmischung mit Dichlormethan weiter verdünnt und in Eiswasser gegossen. Die Phasen wurden getrennt und die organische Phase nochmals mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung (1 x) und Wasser (1 x) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum eingedampft, und das überschüssige Pyridin durch Kodestillation mit Toluol entfernt. 50 ml Diisopropylether wurden zum Ausfällen des Produkts zugegeben, wobei nach Absaugen des Feststoffs und Nachwaschen mit Diisopropylether insgesamt 2.16 g (3.89 mmol, 64 %) des optisch aktiven 5-Cyano-3-(2- ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-1-(phenylsulfonyl)-2,3-dihydro-1 /-/-indol-3-yl phenyl carbonats isoliert wurden. Aus der Mutterlauge ließen sich nach weiterer Reinigung durch Choma- tographie über Normalphase mit Dichlormethan als Laufmittel 800 mg des optisch aktiven 5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-1-(phenylsulfonyl)-2, 3-dihydro-1 /-/-indol-3-yl- phenyl-carbonats erhalten.

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 556.15 Berechnet für C ₂₉ H _2I N ₃ O ₇ S = 555.57

4B.3) (-)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-1 -(phenylsulfonyl)-2,3-dihydro-1 H-indol- 3-yl 4-(1 -methylpiperidin-4-yl)piperazin-1 -carboxylat

Zu einer Lösung von 1.30 g (2.34 mmol) optisch aktivem 5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3- yl)-2-oxo-1-(phenylsulfonyl)-2,3-dihydro-1 /-/-indol-3-yl phenyl carbonats aus Beispiel 4B.2 in 10 ml trockenem Tetrahydrofuran (getrocknet über Molekularsieb) gab man 1.29 g (7.02 mmol) 1-(1-Methylpiperidin-4-yl)-piperazin. Die Reaktionsmischung wurde zunächst eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt, dann nochmals auf 40 ⁰ C erwärmt, bis vollständiger Reaktionsumsatz erreicht war. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde erneut in 100 ml Dichlormethan gelöst und mit Wasser (4 x) extrahiert. Zur besseren Phasentrennung wurde gesättigte Natriumchlorid-Lösung tropfenweise hinzugefügt. Die vereinigte organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Man erhielt 1.5 g eines gelb-braunen Schaums, der nochmals mit 1 ml Dichlormethan und 30 ml Diethylether versetzt wurde. Nach Rühren erhielt man einen festen Niederschlag, der abgesaugt wurde. Das Kristalli- sat wurde durch Säulenchromatographie an einer präparativen MPLC (ISCO Companion, 12 g NP-Kartusche) mit Dichlormethan / Methanol als Elutionsmittel aufgereinigt. Insge- samt wurden 0.547 g (0.848 mmol, 36 %) (-)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-1- (phenylsulfonyl)-2,3-dihydro-1 H-indol-3-yl 4-(1 -methylpiperidin-4-yl)piperazin-1 - carboxylats gewonnen. Die Mutterlauge enthielt ebenfalls Produkt, das auch durch Kristallisation und Chromatographie aufgereinigt wurde.

Um das Produkt auch als Mesylat-Salz zu erhalten, wurden zu einer Lösung von 130 mg (0.20 mmol) (-)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-1-(phenylsulfonyl )-2,3-dihydro-1 H- indol-3-yl 4-(1-methylpiperidin-4-yl)piperazin-1-carboxylat in 5 ml Dichlormethan 18.41 mg (0.19 mmol) Methansulfonsäure gegeben. Die Reaktionsmischung wurde eine Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgedampft und der Rückstand wurde über Stickstoffatmosphäre getrocknet. Letzte Lösungsmittelspuren wurden durch Trocknung im Vakuumtrockenschrank bei 35 ⁰ C entfernt. Insgesamt wurden 142 mg (0.19 mmol) des optisch aktiven 5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-1-(phenylsulfonyl)-2, 3-dihydro-1 H- indol-3-yl 4-(1-methylpiperidin-4-yl)piperazin-1-carboxylat Mesylats erhalten.

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 645.25 Berechnet für C ₃₃ H ₃₆ N ₆ O ₆ S = 644.76

Drehwert α (22 ⁰ C, 589 nm, CHCI ₃ , 1 mg/ml) = minusdrehend

¹ H-NMR ([dβl-DMSO, 500 MHz) δ [ppm] = 8.18 (m, 2H), 8.07 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 7.99 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 7.94 (dd, 1 H, J = 1.7 Hz, J = 8.6 Hz), 7.79 (t, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.71 (d, 1 H, J = 1.5 Hz), 7.66 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 7.15 (dd, 1 H, J = 5.6 Hz, J = 7.0 Hz), 4.06 (m, 1 H), 3.91 (m, 1 H), 3.57 (m, 2H), 2.98 (m, 2H), 2.78 (pd, 2H, J = 1 1.3 Hz), 2.47 (m, 2H), 2.29 (m, 2H), 2.18 - 2.1 1 (m, 1 H), 2.14 (s, 3H), 1.85 (pt, 2H, J = 1 1.3 Hz), 1.64 (pd, 2H, J = 11.7 Hz), 1.39 (m, 2H), 0.92 (t, 3H, J = 7.1 Hz).

Die Verbindungen gemäß den Beispielen 37B und 40 B können unter Verwendung der entsprechenden Ausgangsverbindungen analog zum Herstellungsverfahren des Beispiels 4B hergestellt werden.

BEISPIEL 37B:

(-)-5-Cyano-1-[(2,4-dimethoxyphenyl)sulfonyl]-3-(2-ethoxy pyridin-3-yl)-2-oxo-2,3-dihydro- 1 /-/-indol-3-yl 4-(4-ethylpiperazin-1 -yl)piperidin-1 -carboxylat ESI-MS [M+H ⁺ ] = 719.25 Berechnet für C ₃₆ H ₄₂ N ₆ O ₈ S = 718.84

HPLC (Chiracel OD 0.46 cm x 25 cm ; n-Heptan / Ethanol 7:3) R _f = 11.65 Min. (ee = 80%)

BEISPIEL 4OB:

(-)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-1 -(phenylsulfonyl)-2,3-dihydro-1 /-/-indol-3-yl 4- (4-ethylpiperazin-1 -yl)piperidin-1 -carboxylat

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 659.25 Berechnet für C ₃₄ H ₃₈ N ₆ O ₆ S = 658.78 1H-NMR ([d ₆ ]-DMSO, 500 MHz) δ [ppm] = 8.24 - 8.19 (m, 2H), 8.10 (d, 2H, J = 7.7 Hz), 8.03 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 7.97 (m, 1 H, J = 8.5 Hz), 7.83 (t, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.75 (d, 1 H, J = 31.6 Hz), 7.70 (pt, 2H, J = 7.9 Hz), 7.20 (dd, 1 H, J = 5.1 Hz, J = 7.5 Hz), 4.21 - 4.08 (m, 2H), 3.97 (m, 1 H), 3.44 (m, 2H), 3.05 (m, 1 H), 2.64 (m, 1 H), 2.48 - 2.28 (m, 1 1 H), 1.83 (m, 1 H), 1.65 (m, 1 H), 1.41 (m, 1 H), 1.13 (m, 1 H), 1.01 (m, 3H), 0.97 (t, 3H, J = 7.1 Hz).

(+)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-1 -(phenylsulfonyl)-2,3-dihydro-1 /-/-indol-3-yl 4- (1-methylpiperidin-4-yl)piperazin-1 -carboxylat, Beispiel 4A, kann analog zu dem Beispiel 4B ausgehend von dem enantiomerenreinen (+)-5-Cyano-3-hydroxy-3-(2-ethoxypyridin-3- yl)-1 ,3-dihydroindol-2-on (plusdrehendes Enantiomer [Drehwert bestimmt in Chloroform]) und gemäß den Verfahrensstufen 4B.1 ) bis 4B.3) als das Enantiomer 4A erhalten werden.

BEISPIEL 4A:

(+)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-1 -(phenylsulfonyl)-2,3-dihydro-1 /-/-indol-3-yl 4- (1 -methylpiperidin-4-yl)piperazin-1 -carboxylat als Trifluoressigsäure-Salz

ESI-MS [M+H ⁺ ] = 645.25 Berechnet für C ₃₃ H ₃₆ N ₆ O ₆ S = 644.76

Die Verbindung gemäß dem Beispiel 4OA kann unter Verwendung der entsprechenden Ausgangsverbindungen analog zum Herstellungsverfahren des Beispiels 4A hergestellt werden.

BEISPIEL 4OA:

(+)-5-Cyano-3-(2-ethoxypyridin-3-yl)-2-oxo-1 -(phenylsulfonyl)-2,3-dihydro-1 /-/-indol-3-yl 4- (4-ethylpiperazin-1 -yl)piperidin-1 -carboxylat als Trifluoressigsäure-Salz ESI-MS [M+H ⁺ ] = 659.25 Berechnet für C ₃₄ H ₃₈ N ₆ O ₆ S = 658.78

IV. BESTIMMUNG DER BIOLOGISCHEN AKTIVITÄT

1. Vasopressin V1 b Rezeptorbindungstest:

Substanzen:

Die Testsubstanzen wurden in einer Konzentration von 10 ^"2 M in DMSO gelöst und in DMSO auf 5x10 ^"4 M bis 5x10 ^"9 M weiter verdünnt. Diese DMSO-Vorverdünnungsreihe wurde mit Testpuffer 1 :10 verdünnt. Im Testansatz wurde die Substanzkonzentration nochmals 1 :5 verdünnt (2 % DMSO im Ansatz).

Membran-Präparation: CHO-K1 Zellen mit stabil exprimiertem humanem Vasopressin V1 b Rezeptor (Klon 3H2) wurden abgeerntet und in 50 mM Tris-HCI und in Gegenwart von Proteaseinhibitoren (Roche complete Mini # 1836170) mit einem Polytron Homogenizer auf mittlerer Stellung 2x10 Sekunden homogenisiert und anschließend 1 h bei 40.000 x g abzentrifugiert. Das Membranpellet wurde nochmals wie beschrieben homogenisiert und zentrifugiert und an- schließend in 50 mM Tris-HCI, pH 7,4 aufgenommen, homogenisiert und in Aliquots bei -190 ⁰ C in flüssigem Stickstoff eingefroren aufbewahrt.

Bindungstest:

Der Bindungstest wurde in Anlehnung an die Methode von Tahara et al. (Tahara A et al., Brit. J. Pharmacol. 125, 1463-1470 (1998)) durchgeführt.

Inkubationspuffer war: 50 mM Tris, 10 mM MgCI ₂ , 0.1 % BSA, pH 7.4.

Im Testansatz (250 μl) wurden Membranen (50 μg/ml Protein in Inkubationspuffer) von

CHO-K1 -Zellen mit stabil exprimierten humanen V1 b Rezeptoren (Zelllinie hV1 b_3H2_CHO) mit 1 ,5 nM ³ H-AVP (8-Arg-Vasopressin, PerkinElmer #18479) in Inku- bationspuffer (50 mM Tris, 10 mM MgCI ₂ , 0.1 % BSA, pH 7.4) (totale Bindung) oder zusätzlich mit steigenden Konzentrationen an Testsubstanz (Verdrängungsexperiment) inkubiert. Die unspezifische Bindung wurde mit 1 μM AVP (Bachern # H1780) bestimmt. Alle Bestimmungen wurden als Dreifachbestimmungen durchgeführt. Nach Inkubation (60 Minuten bei Raumtemperatur), wurde der freie Radioligand mittels Vakuumfiltration (Skatron cell harvester 7000) über Wathman GF/B Glasfaserfiltermatten abfiltriert und die Filter in Szintillationsgefäße überführt. Die Flüssigszintillationsmessung erfolgte in einem Tricarb-Gerät Model 2000 oder 2200CA (Packard). Die Umrechnung der gemessenen cpm in dpm wurde mit Hilfe einer Standardquenchreihe durchgeführt.

Auswertung:

Die Bindungsparameter wurden durch nichtlineare Regression in SAS berechnet. Die Algorithmen des Programms arbeiten analog zum LIGAND Auswerteprogramm (Munson PJ und Rodbard D, Analytical Biochem. 107, 220-239 (1980)). Der Kd-Wert von ³ H-AVP zu den rekombinanten humanen V1 b-Rezeptoren beträgt 0,4 nM und wurde zur Bestimmung des Ki-Wertes herangezogen.

2. Vasopressin V1a Rezeptorbindungstest:

Substanzen: Die Testsubstanzen wurden in einer Konzentration von 10 ^"2 M in DMSO gelöst. Die weitere Verdünnung dieser DMSO-Lösungen erfolgte in Inkubationspuffer (50 mM Tris, 10 mM MgCI ₂ , 0.1 % BSA, pH 7,4).

Membran-Präparation: CHO-K1 Zellen mit stabil exprimiertem humanem Vasopressin V1 a Rezeptor (Klon 5) wurden abgeerntet und in 50 mM Tris-HCI und in Gegenwart von Proteaseinhibitoren (Roche complete Mini # 1836170) mit einem Polytron Homogenizer auf mittlerer Stellung 2x10 Sekunden homogenisiert und anschließend 1 h bei 40.000 x g abzentrifugiert. Das Membranpellet wurde nochmals wie beschrieben homogenisiert und zentrifugiert und an- schließend in 50 mM Tris-HCI, pH 7,4 aufgenommen, homogenisiert und in Aliquots bei -190 ⁰ C in flüssigem Stickstoff eingefroren aufbewahrt.

Bindungstest:

Der Bindungstest wurde in Anlehnung an die Methode von Tahara et al. (Tahara A et al., Brit. J. Pharmacol. 125, 1463-1470 (1998)) durchgeführt.

Inkubationspuffer war: 50 mM Tris, 10 mM MgCI ₂ , 0.1 % BSA, pH 7.4. Im Testansatz (250 μl) wurden Membranen (20 μg/ml Protein in Inkubationspuffer) von CHO-K1 -Zellen mit stabil exprimierten humanen V1 a Rezeptoren (Zelllinie hV1 a_5_CHO) mit 0.04 nM ¹²⁵ I-AVP (8-Arg-Vasopressin, NEX 128) in Inkubationspuffer (50 mM Tris, 10 mM MgCI ₂ , 0.1% BSA, pH 7.4) (totale Bindung) oder zusätzlich mit steigenden Konzentra- tionen an Testsubstanz (Verdrängungsexperiment) inkubiert. Die unspezifische Bindung wurde mit 1 μM AVP (Bachern # H 1780) bestimmt. Dreifachbestimmungen wurden durchgeführt.

Nach Inkubation (60 Minuten bei Raumtemperatur), wurde der freie Radioligand mittels Vakuumfiltration (Skatron cell harvester 7000) über Wathman GF/B Glasfaserfiltermatten abfiltriert und die Filter in Szintillationsgefäße überführt.

Die Flüssigszintillationsmessung erfolgte in einem Tricarb-Gerät Model 2000 oder 2200CA (Packard). Die Umrechnung der gemessenen cpm in dpm wurde mit Hilfe einer Standardquenchreihe durchgeführt.

Auswertung:

Die Bindungsparameter wurden durch nichtlineare Regression in SAS berechnet. Die Algorithmen des Programms arbeiten analog zum LIGAND Auswerteprogramm (Munson PJ und Rodbard D, Analytical Biochem. 107, 220-239 (1980)). Der Kd-Wert von ¹²⁵ I -AVP zu den rekombinanten hV1a-Rezeptoren wurde in Sättigungsexperimenten bestimmt. Ein Kd-Wert von 1 ,33 nM wurde zur Bestimmung des Ki-Wertes herangezogen.

3. Vasopressin V2 Rezeptorbindungstest:

Substanzen:

Die Testsubstanzen wurden in einer Konzentration von 10 ^"2 M in DMSO gelöst. Die weitere Verdünnung dieser DMSO-Lösung erfolgte in Inkubationspuffer (50 mM Tris, 10 mM MgCI ₂ , 0.1 % BSA, pH 7,4).

Membran-Präparation:

CHO-K1 Zellen mit stabil exprimiertem humanem Vasopressin V2 Rezeptor (Klon 23) wurden abgeerntet und in 50 mM Tris-HCI und in Gegenwart von Proteaseinhibitoren (Roche complete Mini # 1836170) mit einem Polytron Homogenizer auf mittlerer Stellung 2x10 Sekunden homogenisiert und anschließend 1 h bei 40.000 x g abzentrifugiert. Das Membranpellet wurde nochmals wie beschrieben homogenisiert und zentrifugiert und anschließend in 50 mM Tris-HCI, pH 7,4 aufgenommen, homogenisiert und in Aliquots bei -190 ⁰ C in flüssigem Stickstoff eingefroren aufbewahrt.

Bindungstest: Der Bindungstest wurde in Anlehnung an die Methode von Tahara et al. (Tahara A et al., Brit. J. Pharmacol. 125, 1463-1470 (1998)) durchgeführt. Inkubationspuffer war: 50 mM Tris, 10 mM MgCI ₂ , 0.1 % BSA, pH 7.4. Im Testansatz (250 μl) wurden Membranen (50 μg/ml Protein in Inkubationspuffer) von CHO-K1 -Zellen mit stabil exprimierten humanen V2 Rezeptoren (Zelllinie hV2_23_CHO) mit 1-2 nM ³ H-AVP (8-Arg-Vasopressin, PerkinElmer #18479) in Inkubationspuffer (50 mM Tris, 10 mM MgCI ₂ , 0.1% BSA, pH 7.4) (totale Bindung) oder zusätzlich mit steigenden Konzentrationen an Testsubstanz (Verdrängungsexperiment) inkubiert. Die unspezifische Bindung wurde mit 1 μM AVP (Bachern # H1780) bestimmt. Dreifachbestimmungen wurden durchgeführt. Nach Inkubation (60 Minuten bei Raumtemperatur), wurde der freie Radioligand mittels Vakuumfiltration (Skatron cell harvester 7000) über Wathman GF/B Glasfaserfiltermatten abfiltriert und die Filter in Szintillationsgefäße überführt.

Die Flüssigszintillationsmessung erfolgte in einem Tricarb-Gerät Model 2000 oder 2200CA (Packard). Die Umrechnung der gemessenen cpm in dpm wurde mit Hilfe einer Standardquenchreihe durchgeführt.

Auswertung:

Die Bindungsparameter wurden durch nichtlineare Regression in SAS berechnet. Die Algorithmen des Programms arbeiten analog zum LIGAND Auswerteprogramm (Munson PJ und Rodbard D, Analytical Biochem. 107, 220-239 (1980)). Der Kd-Wert von ³ H-AVP zu den rekombinanten hV2-Rezeptoren beträgt 2,4 nM und wurde zur Bestimmung des Ki- Wertes herangezogen.

4. Oxytozin-Rezeptorbindungstest

Substanzen:

Die Substanzen wurden in einer Konzentration von 10 ^"2 M in DMSO gelöst und mit Inkubationspuffer (50 mM Tris, 10 mM MgCI ₂ , 0.1 % BSA, pH 7,4) verdünnt.

Zellpräparation:

Konfluente HEK-293 Zellen mit transient exprimierenden rekombinanten humanen Oxyto- zinrezeptoren wurden bei 750 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Rückstand wurde in eiskaltem Lysispuffer (50 mM Tris-HCI, 10 % Glycerin, pH 7,4 und Roche Complete Protease-Inhibitor) aufgenommen und 20 Minuten bei 4 ⁰ C einem osmo- tischen Schock unterworfen. Danach wurden die lysierten Zellen bei 750 x g für 20 Minu- ten bei 4 ⁰ C zentrifugiert, der Rückstand in Inkubationspuffer aufgenommen und Aliquots von 10 ⁷ Zellen/ml hergestellt. Die Aliquots wurden bis zur Verwendung bei -8O ⁰ C eingefroren.

Bindungstest:

Am Tag des Versuches wurden die Zellen aufgetaut, mit Inkubationspuffer verdünnt und mit einer Multipette Combitip (Eppendorf, Hamburg) homogenisiert. Der Reaktionsansatz von 0,250 ml setzte sich zusammen aus 2 bis 5x10 ⁴ rekombinante Zellen, 3-4 nM ³ H- Oxytozin (PerkinElmer, NET 858) in Anwesenheit von Testsubstanz (Hemmkurve) oder nur Inkubationspuffer (totale Bindung). Die unspezifische Bindung wurde mit 10 ^"6 M Oxy- tozin (Bachern AG, H2510) bestimmt. Dreifachbestimmungen wurden angesetzt. Gebundener und freier Radioligand wurden getrennt durch Filtration unter Vakuum mit Whatman GF/B Glasfaserfilter mit Hilfe eines Skatron Cell Harvester 7000. Die gebundene Radioaktivität wurde durch Flüssigkeitszintillationsmessung in einem Tricarb Beta-Zählgerät, Mo- dell 2000 oder 2200CA (Packard) bestimmt.

Auswertung:

Die Bindungsparameter wurden durch nicht-lineare Regressionsanalyse berechnet (SAS), analog zum Programm LIGAND von Munson und Rodbard (Analytical Biochem 1980; 107: 220-239). Der Kd-Wert von ³ H-Oxytozin zu den rekombinanten hOT-Rezeptoren beträgt 7.6 nM und wurde zur Bestimmung des Ki-Wertes herangezogen.

5. Bestimmung der mikrosomalen Halbwertszeit:

Die metabolische Stabilität der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde in dem folgenden Test bestimmt.

Die Testsubstanzen werden in einer Konzentration von 0.5 μM wie folgt inkubiert:

In Mikrotiterplatten werden 0.5 μM Testsubstanz zusammen mit Lebermikrosomen ver- schiedener Spezies (von Ratte, Mensch oder andere Spezies) (0.25 mg mikrosomales Protein/ml) in 0.05M Kalium-Phosphatpuffer pH 7,4 bei 37 ⁰ C für 5 min vorinkubiert. Der Start der Reaktion erfolgt durch die Zugabe von NADPH (1 mg/mL). Nach 0, 5, 10, 15, 20 und 30 min werden 50 μl Aliquots entnommen und die Reaktion wird sofort mit dem gleichen Volumen an Acetonitril abgestoppt und runtergekühlt. Die Proben werden bis zur Analyse eingefroren. Mittels MSMS wird die verbliebene Konzentration an nicht abgebau- ter Testsubstanz bestimmt. Aus der Steigung der Kurve Signal Testsubstanz/Zeiteinheit wird die Halbwertszeit (T1/2) ermittelt, wobei die Halbwertszeit der Testsubstanz unter Annahme einer Kinetik erster Ordnung aus der zeitlichen Abnahme der Konzentration der Verbindung berechnet werden kann. Die mikrosomale Clearance (mCI) berechnet sich aus mCI= ln2/T1/2 / (Gehalt an mikrosomalem Protein in mg/ml) x 1000 [ml/min/mg] (modifiziert nach Literaturstellen: Di, The Society for Biomoleculaur Screening, 2003, 453-462; Obach, DMD, 1999 vol 27. N 1 1 , 1350-1359).

6. Bestimmung der Plasmaproteinbindung (PPB) durch Gleichgewichtsdialyse:

150 μl Ratten- bzw Humanplasma, dem 1 bzw 10 μM an Testsubstanz hinzugefügt wurde, wird auf die eine Seite der 96 Well-Dialysekammern pipettiert, auf die andere Seite werden 150 μl PPS-Buffer pipettiert. Die Kammern sind durch eine Dialysemembran mit einen Cut-off von 6-8000 Dalton getrennt. Die 96 Well-Dialysekammern werden zugedeckt und über Nacht leicht geschüttelt. Am nächsten Morgen werden 10 μl Plasma entnommen mit 90 μl PPS -Puffer verdünnt und das Protein wird mit 200 μl Acetonitril gefällt. Das gefällte Eiweiß wird abzentrifugiert und 100 μl des Überstandes wird für die MSMS-Analytik verwendet. Von der Pufferseite werden 100 μl für die MSMS-Analytik entnommen. Siehe auch die folgende Literaturstelle: Banker, Journal of Pharmaceutical Sciences VoI, 92, 5, 967-974, 2003.

7. Methoden zur in vitro Bestimmung der Cytochrom P450 (CYP) Inhibierung

Lumineszenzsubstrate für 2C9 und 3A4: 0.4 mg/ml humane Lebermikrosomen werden 10 min mit den zu untersuchenden Testsubstanzen (0-20 μM), den CYP-spezifischen Substraten, in 0.05 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,4 bei 37 ⁰ C vorinkubiert. Das Cyp-spezifische Substrat für CYP 2C9 ist Luciferin H, für CYP 3A4 Luciferin BE. Die Reaktion wird durch Hinzufügen von NADPH gestartet. Nach 30 min Inkubation bei RT wird das Luciferin Detektionsreagenz hinzugefügt, und das entstandene Lumineszenzsignal gemessen (modifiziert nach Literaturstelle: Promega, Technical Bulletin P450-GLO ™ Assays).

Midazolam CYP 3A4 Time dependent Inhibition Der Test besteht aus 2 Teilen. Einmal wird die Testsubstanz mit den Lebermikrosomen vorinkubiert (mit NADPH = Prä-Inkubation, danach Zugabe des Substrates, im 2 Teil wird das Substrat und die Testsubstanz gleichzeitig zugegeben = Co-Inkubation.

Prä-Inkubation:

0.05 mg/ml mikrosomales Protein (humane Lebermikrosomen) werden mit 0-10 μM (bzw 50 μM) Testsubstanz in 50 mM Kaliumphosphatpuffer 5 Min vorinkubiert. Die Reaktion wird mit NADPH gestartet. Nach 30 min werden 4 μM Midazolam (Endkonzentration) hinzugefügt und für weitere 10 Min inkubiert. 75 μl der Reaktionslösung werden nach 10 min entnommen und mit 150 μl Acetonitrillösung abgestoppt.

Co-Inkubation:

0.05 mg/ml mikrosomales Protein (humane Lebermikrosomen) werden mit 4 μM Midazolam (Endkonzentration) und 0-10 μM (bzw 50μM) Testsubstanz in 50 mM Kaliumphos- phatpuffer 5 min vorinkubiert. Die Reaktion wird mit NADPH gestartet. 75 μl der Reaktionslösung werden nach 10 min entnommen und mit 150 μl Acetonitrillösung abgestoppt. Die Proben werden bis zur MSMS-Analytik eingefroren (modifiziert nach Literaturstellen: Obdach, Journal of Pharmacology & Experimental Therapeutics, VoI 316, 1 , 336-348, 2006; Walsky, Drug Metabolism and Disposition VoI 32, 6, 647-660, 2004).

8. Methode zur Bestimmung der Wasserlöslichkeit (in mg/ml)

Die Wasserlöslichkeit der erfindungsgemässen Verbindungen kann zum Beispiel nach der sogenannten "shake flask" Methode bestimmt werden (gemäss ASTM International: E 1148-02, Standard test methods for measurement of aqueous solubility, Book of Standards Volume 11.05.). Dabei wird ein Überschuss der festen Verbindung in eine Pufferlösung mit einem bestimmten pH-Wert (zum Beispiel Phosphatpuffer pH 7.4) gegeben und die entstehende Mischung geschüttelt oder gerührt, bis sich das Gleichgewicht eingestellt hat (typischerweise 24 oder 48 Stunden, manchmal auch bis zu 7 Tage). Anschließend wird der ungelöste Feststoff durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt und die Konzentration der gelösten Verbindung durch UV-Spektroskopie oder Hochdruckflüssigkeits- Chromatographie (HPLC) anhand einer entsprechenden Kalibrierkurve bestimmt.

9. Ergebnisse Die Ergebnisse der Rezeptor-Bindungsuntersuchungen sind als Rezeptorbindungskonstanten [K ₁ (VI b), K ₁ (VIa), K,(V2), K ₁ (OT)] ausgedrückt. Die Ergebnisse der Untersuchung der metabolischen Stabilität sind als mikrosomale Clearance (mCI) angegeben.

In diesen Tests zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen sehr hohe Affinitäten für den V1 b-Rezeptor höchstens 100 nM, oder höchstens 50 nM, häufig < 10 nM). Außerdem zeigen die Verbindungen auch hohe Selektivitäten gegenüber dem V1 a-, V2- und/oder OT-Rezeptor und eine gute metabolische Stabilität, gemessen als mikrosomale Clearance.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle 3

h = human