La présente invention est relative au domaine de la protection de semences, telles que des graines ou autre partie d'un végétal apte à former une plante complète, contre les attaques par les oiseaux et au traitement de celles-ci par des composés d’origine naturelle.

Pour l’agriculture, l'agriculteur sème des semences comme par exemple les graines de maïs, tournesol, soja, pois et autres céréales dans son champ à l'intérieur de sillons ménagés dans le sol. Or les oiseaux, comme par exemple les corvidés sont à l’origine de dégâts significatifs sur les semences qui ont été semées, ce qui engendre des pertes économiques non négligeables pour l'agriculteur. Et même lorsque l'on cherche à camoufler les sillons dans lesquels les graines ont été semées, on observe que les oiseaux arrivent quand même à les trouver pour les manger.

Face à ce risque difficilement prévisible et maîtrisable, il existe un besoin de prendre certaines précautions lors de l’implantation et de l’entretien des cultures.

Des traitements de semences sont disponibles sur le marché pour un usage répulsif des oiseaux. Ces produits chimiques contiennent des substances actives de la famille des carbamates (thirame ou zirame) qui font l’objet d’expérimentations depuis plusieurs années mais qui ne sont pas souhaitables pour des problématiques environnementales.

Les travaux de Brower et Fink (Ann N Y Acad Sci. 1985 ;443 : 171 -88) ont, tout d’abord, rapporté que la présence de cardénolides dans certaines espèces de papillons (page 173, 1er paragraphe) avait un pouvoir émétique sur les oiseaux. Cet effet est dû à la présence de cardénolides accumulés par ingestion de feuilles d'Asclépias (« milkweed » en anglais). Ainsi, les cardénolides présents chez les plantes du genre Asclépias sont connus pour leur effet émétique sur les oiseaux.

Des broyats de plantes du genre Asclépias ont été proposés dans la demande WO 2020/109529, pour protéger les semences des attaques par les oiseaux et éviter qu'elles ne soient mangées par ceux-ci. Les produits utilisés sont des broyats bruts et complets d’une plante Asclépias, en particulier de feuilles d’Asclépias. Le broyât est employé tel quel et ne subit aucune transformation ou extraction après broyage. Le broyât brut est utilisé pour former un pelliculage autour de semences à protéger contre les oiseaux et pour la réalisation de produit phytosanitaire.

Il existe un besoin de développer des extraits et formulations adaptés à l’enrobage des semences visant à les protéger des attaques par les oiseaux.

Dans ce contexte, l’invention a pour but de proposer un procédé qui permette de produire de nouveaux extraits d’au moins une plante du genre Asclépias, qui soient concentrés en cardénolides. En particulier, l’invention propose des procédés qui soient faciles à mettre en œuvre sur le plan industriel. L’invention propose, ainsi, de nouveaux extraits qui sont particulièrement adaptés pour servir de répulsifs contre les oiseaux, et donc pour assurer une protection des semences. La présente invention concerne ainsi un extrait d’au moins une plante contenant des cardénolides, caractérisé en ce qu’il comprend certaines proportions de cardénolides et de matière sèche.

Un tel extrait selon l’invention présente les avantages de performance pour la répulsion des oiseaux et une simplification dans son utilisation pour l’enrobage de semences tout en permettant un contrôle des doses appliquées sur les semences.

Un tel extrait est particulièrement adapté pour protéger les semences des attaques d’oiseaux, qui mangent les graines après le semis ou au moment de la germination. En particulier, cet effet est observé contre les corvidés notamment les corneilles et les corbeaux, en particulier les corbeaux freux et autres volatiles ravageurs.

E’extrait selon l’invention présente également des avantages industriels. Un extrait liquide en premier lieu permet un dosage plus précis. E’extrait peut par ailleurs être concentré, donc permettre une efficacité similaire mais avec un volume d’application moindre sur les semences. Cela implique une diminution des problématiques d’encrassement des enrobeuses industrielle, une amélioration de la cadence (temps de séchage ou de pénétration des bouillies appliquées allongé si les volumes sont trop élevés), ainsi qu’un gain en qualité si le caractère collant du traitement résultant d’un volume appliqué trop important conduit à du mottage dans les sacs où sont stockées les semences.

Enfin, l’application en traitement de semence d’une trop grande quantité de matière “sèche” n’ayant pas de caractère liant mais pulvérulent peut conduire à la génération de poussières, une caractéristique essentielle de qualité faisant l’objet d’une réglementation stricte.

L’invention concerne ainsi des extraits, préférentiellement des extraits d’au moins une plante contenant des cardénolides, comprenant au moins :

- 0,5 à 4 % en poids de cardénolides, par rapport au poids total dudit extrait,

- 10 à 85% en poids de matière sèche, par rapport au poids total dudit extrait,

- 1 à 8 % en poids de cardénolides, par rapport au poids total de ladite matière sèche, avec ledit extrait présentant une viscosité comprise entre 1 et 10000 mPa.s.

La présente invention concerne également des procédés d’obtention d’extraits d’au moins une plante contenant des cardénolides, ainsi que des formulations comprenant de tels extraits, des semences enrobées avec des extraits, et l’utilisation de ces extraits et formulations pour traiter des semences, notamment en tant que répulsif contre les oiseaux, notamment pour éviter la consommation par les oiseaux de semences enrobées avec lesdits extraits. Definitions

On entend par semences, une partie d'un végétal, telle qu’une graine, noyau ou pépin, apte à former une plante complète et que l’on peut semer.

On entend par plantes, les organismes photosynthétiques et autotrophes, caractérisés par des cellules végétales. Le terme « plante » tel qu'il est utilisé ici se réfère à un membre du Royaume Plantae et comprend toutes les étapes du cycle de vie de la plante, y compris, sans limitation, les graines, et comprend toutes les parties de la plante . Les plantes selon la présente invention peuvent être des plantes agricoles et horticoles, des arbustes, des arbres et des herbes, ci-après parfois appelés collectivement plantes.

On entend par cardénolides, les molécules sous-type de cardanolides, qui sont eux-mêmes une classe de stéroïdes, notamment les stéroïdes cardioactifs.

On entend par matière sèche, la matière comprenant des matières minérales et des matières organiques que l'on obtient lorsqu'on retire l'eau d'un produit. La matière sèche quantifie la biomasse totale d'une culture produite sur la base du poids sec.

Tout au long de cette description, à moins que le contexte ne l'exige autrement, le mot « comprennent » ou « inclure », ou des variantes telles que « comprend », « comprenant », « inclut », sera compris comme impliquant l'inclusion d'un élément déclaré ou étape de méthode ou groupe d'éléments ou étapes de méthode, mais pas l'exclusion de tout autre élément ou étape de méthode ou groupe d'éléments ou étapes de méthode. Les mots « comprendre » et « inclure », et leurs variantes peuvent également inclure la notion de « consistant exclusivement en ».

Telles qu'utilisées dans cette description, les formes au singulier « un », « un » et « le » incluent des aspects au pluriel à moins que le contexte ne dicte clairement le contraire.

Le terme « et/ou » comprend les significations « et », « ou » ainsi que toutes les autres combinaisons possibles des éléments liés à ce terme.

Le terme "entre" doit être compris comme incluant les limites.

Les rapports, concentrations, quantités et autres données numériques peuvent être présentés dans un format de plage de valeurs. Il doit être entendu qu'un tel format de plage est utilisé uniquement pour des raisons de commodité et de concision et doit être interprété de manière flexible pour inclure non seulement les valeurs numériques explicitement énoncées comme limites de la plage, mais également pour inclure toutes les valeurs numériques individuelles, ou des sous-plages englobées dans cette plage comme si chaque valeur numérique et sous-plage était explicitement mentionnée. Extraits

L’invention concerne ainsi un extrait, préférentiellement un extrait d’au moins une plante contenant des cardénolides, comprenant au moins :

- 0,5 à 4 % en poids de cardénolides, par rapport au poids total dudit extrait,

- 10 à 85 % en poids de matière sèche, par rapport au poids total dudit extrait,

- 1 à 8 % en poids de cardénolides, par rapport au poids total de ladite matière sèche, avec ledit extrait présentant une viscosité comprise entre 1 et 10000 mPa.s.

Cet extrait peut comprendre de 0,5 à 4 % en poids de cardénolides, par exemple de 0,7 à 4 % en poids de cardénolides, par exemple de 1 à 4 % en poids de cardénolides, par rapport au poids total dudit extrait.

Cet extrait peut comprendre au moins 25 % en poids de matière sèche, par exemple au moins 50 % en poids de matière sèche, par rapport au poids total dudit extrait. Cet extrait peut comprendre jusqu’à 80 % en poids de matière sèche, par exemple jusqu’à 70 % en poids de matière sèche, par rapport au poids total dudit extrait. Particulièrement, l’extrait comprend de 10 à 85 % en poids de matière sèche, préférentiellement de 25 à 85% en poids de matière sèche, par rapport au poids total dudit extrait.

Cet extrait peut comprendre de 1,25 à 4,75 % en poids de cardénolides, par exemple de 1,5 à 4,5 % en poids, notamment de 1,5 à 3,5 % en poids, particulièrement de 1,5 à 2 % en poids, par rapport au poids total de sa matière sèche.

Préférentiellement, l’extrait comprend au moins :

- 1,5 à 3,5 % en poids de cardénolides, par rapport au poids total dudit extrait, et

- 10 à 70 % en poids de matière sèche, par rapport au poids total dudit extrait.

L’extrait selon l’invention n’est pas, de manière avantageuse, un broyât brut d’Asclépias ou de feuilles d’Asclépias.

Cet extrait peut comprendre une quantité en poids de cardénolides, par rapport au poids total dudit extrait, supérieure d’au moins 10 %, par exemple d’au moins 20 %, par exemple d’au moins 50 %, par rapport à la quantité en poids en cardénolides dans ladite plante.

Les cardénolides ont généralement une structure qui intègre le motif suivant (I) avec différentes substitutions possibles.

Selon l’invention les cardénolides peuvent être choisis dans le groupe constitué par : la calotoxine, l’uscharidine, l’asclépine, calactine, la calotropagénine, la coroglaucigénine, la xysmalogénine, la voruscharine, le gofruside, l’uzarigénine, la 12p-hydroxycoroglaucigénine, la 12p~ hydroxycalotropine, la 6’-O-féruloyl-desglucouzarine, le 12p, 14p-dihydroxy-3p, 19-epoxy-3a- methoxy-5a-card-20(22)-énolide, la xysmalogénine, la coroglaucigénine, la 6-O-(E-4- hydroxycinnamoyl)-desglucouzarine 6-O-sinapinoyl-desglucouzarine, la calactine, la 16a- acetoxy calactine, la calotropine 16a-acetoxycalotropine, la 16a-hydroxyasclépine, la 16a- acetoxyasclépine uscharine, la 16a-hydroxyuscharine, la 19-nor-16a-acetoxy-10p- hydroxyasclépine, la desglucouzarine, la 6'-O-féruloyl-desglucouzarine, et la calotropine. Un ou plusieurs types de cardénolides peuvent être utilisés ensemble.

Préférentiellement, les cardénolides sont choisis parmi la calotoxine, l’uscharidine, l’asclépine et la calactine.

En tant qu’exemples de cardénolides typiques contenus dans les plantes du genre Asclépias, figurent essentiellement, la calotoxine, l’uscharidine, l’asclépine et la calactine.

La matière sèche peut comprendre notamment des composés ligno-cellulosiques, des sucres, des sels, des polyphénols, des cardénolides, des acides organiques, et des protéines.

La viscosité de l’extrait peut être mesurée de la manière suivante : dans un bêcher de 600 mL (hauteur 12,4 cm et diamètre 9 cm), on pèse 300 g d’extrait ou de formulation et un viscosimètre Brookfield type RVDV à 20 rpm (tours par minute) avec une aiguille est utilisé pour obtenir une mesure fiable. Une fois le palier de stabilisation atteint, la valeur exprimée en mPa.s est notée. La température doit être à 25 °C +/- 1 °C ou à 30 °C +/- 1 °C.

Procédé d’obtention d’un extrait d’au moins une plante

L’invention concerne également un procédé d’obtention d’un extrait d’au moins une plante contenant des cardénolides, comprenant au moins les étapes successives suivantes : a) réaliser une mise en contact d’une matière première d’au moins une plante contenant des cardénolides, dans un solvant d’extraction S de cardénolides, b) optionnellement réaliser une séparation du résultat de la mise en contact de l’étape a), pour en récupérer sa partie liquide Ll, c) réaliser une précipitation sélective des constituants autres que les cardénolides du mélange obtenu à l’étape a) ou de la partie liquide Ll obtenue à l’étape b), d) réaliser une ou plusieurs séparations du résultat de l’étape c) pour en récupérer sa partie liquide L2, et e) réaliser une concentration de la partie liquide L2 pour récupérer un extrait concentré en cardénolides.

Les plantes contenant des cardénolides sont préférentiellement choisies parmi : les apocynacae : Asclepias curassavica, Asclepias eriocarpa, Asclepias incarnate, Asclepias labriformis, Asclepias syriaca, Asclepias tuberosa, Asclepias fruticosa, Cryptostegia grandiflora, Oxysterlma esculentum, Pergularia tomentosa, Periploca graeca, Periploca nigrescens, Periploca forrestii, Calotropis procera, Calotropis gigantea, et les brassicaceae: Erysimum cheiri, Erysimum canescens, et Erysimum cheiranthoides.

Préférentiellement, les extraits végétaux produits dans le cadre de l’invention peuvent être issus de tout type de plantes du genre Asclépias, et en particulier de plantes de l’une des espèces A. (Asclépias) curassavica, A. tuberosa, A. asperula, A. incamata, A. fructicosa, A. viridis, A. speciosa, A. verticillata ou A. sullivanti. L’espèce A. curassavica est particulièrement préférée, dans le cadre de l’invention.

Les plantes utilisées pour la production d’un extrait selon l’invention, peuvent, de manière classique, être cultivées dans des conditions de culture standardisées et, dans un environnement contrôlé. Ceci permet de faciliter la reproductibilité et l’optimisation du procédé selon l’invention.

La matière première d’au moins une plante contenant des cardénolides correspond préférentiellement aux feuilles d’au moins une plante, à un ensemble de feuilles et de tiges d’au moins une plante, aux parties aériennes complètes d’au moins une plante, ou à au moins une plante entière. Pour améliorer l’extraction, la plante entière ou des parties de la plante peuvent être broyées au préalable. Avant le broyage, la plante est de préférence séchée. Avant ou après broyage, la matière première brute peut être soumise à une déshydratation, voire à une lyophilisation. Une déshydratation est réalisée au moyen de tout dispositif adapté bien connu de l’homme du métier, tel qu’un dispositif à flux d'air chaud, un séchoir à cylindre(s), un dispositif à zéolithes ou un lyophilisateur, dans le cas d’une lyophilisation.

L’étape a) consiste ainsi, de manière avantageuse, à réaliser une mise en contact d’une matière première d’au moins une plante contenant des cardénolides, dans un solvant d’extraction S de cardénolides. L’étape a) peut être réalisée de différentes manières comme par exemple par macération ou extractions, notamment par extraction Soxhlet ou extraction continue contre- courant par exemple.

Pour ce qui concerne la macération, la plante entière ou certaines parties de la plante sont mises en contact avec au moins un solvant d’extraction S de cardénolides. Un ou plusieurs solvants peuvent être utilisés. Selon l’invention, un solvant d’extraction S de cardénolides se réfère à un solvant capable d’extraire, tout ou partie, préférentiellement au moins un ou plusieurs types de cardénolides d’une matière première d’au moins une plante contenant des cardénolides. Le solvant utilisé peut être n’importe quel solvant polaire, par exemple l’eau, l’éthanol, le méthanol, le chloroforme, le diéthyl éther, le dichloromethane, l’acétate d’éthyle, le DMSO. Des solutions aqueuses ou des mélanges eau/solvant organique peuvent être envisagés. Plusieurs solvants polaires peuvent être mélangés dans des proportions variées, par exemple un mélange eau/ éthanol ou eau/méthanol. Le solvant d’extraction S est préférentiellement de l’eau ou une solution aqueuse. De tels solvants permettent de solubiliser les cardénolides d’intérêt, et, en particulier, la calotoxine, l’uscharidine, l’asclépine et la calactine.

Le solvant d’extraction peut, notamment, être une solution aqueuse contenant un solvant alcoolique, tel que le méthanol ou l’éthanol, de préférence présent à hauteur de moins de 20 % v/v.

Pour des raisons de praticité à l’échelle industrielle, le solvant d’extraction est, de préférence, de l’eau ou une solution aqueuse constituée d’eau et d’un tampon tel qu’un phosphate.

Plusieurs niveaux de dilution peuvent être utilisés ; par exemple 5-12 g d’eau peuvent être utilisés pour extraire 1 g de biomasse . La mise en contact se fait de préférence à une température inférieure ou égale au point d’ébullition du solvant, notamment entre 20 et 95 °C. L’utilisation d’une telle température permet notamment de minimiser les risques de dégradation, et notamment d’hydrolyse, des cardénolides d’intérêt. Ainsi, d’une manière générale, toutes les étapes du procédé selon l’invention sont, de préférence, réalisées à une température inférieure à 85 °C, et de préférence inférieure à 60 °C.

La macération peut durer entre 30 minutes et 3 heures.

La biomasse peut être extraite plusieurs fois en renouvelant le solvant afin de récupérer le plus de cardénolides possible.

De manière avantageuse, la macération est réalisée avec un rapport masse de matière première végétale en grammes / volume de solvant d’extraction en litres de 66,7 à 300, de préférence de 100 à 200.

L’étape b), optionnelle, consiste à réaliser une séparation du résultat de la mise en contact de l’étape a), pour en récupérer sa partie liquide LL

Cette séparation peut se faire en utilisant les méthodes de séparation, par exemple par filtration, centrifugation ou décantation. Une séparation par filtration est préférée à ce stade. En particulier, le résultat de la macération peut être acheminé pour passer au travers d’un filtre, qui va retenir la matière végétale. Ainsi, la partie liquide Ll, qui est déjà riche en cardénolides, est récupérée.

Par exemple, un décanteur centrifuge, type Flottweg Z4D4 peut être utilisé. Le mélange entre dans le décanteur avec un taux de matière sèche par exemple compris entre 7 et 17 % en poids. Après la décantation, une phase liquide Ll est récupérée avec un taux de matière sèche de préférence compris entre 1 et 5 % en poids, notamment entre 2 et 4 % en poids. Par exemple par filtration, le mélange arrive sur un filtre papier ayant préférentiellement des pores de 5-50 pm ; le jus L1 peut être aspiré sous vide et la biomasse humide reste sur le filtre. La phase liquide L1 peut être à un taux de matière sèche compris entre 1 et 5 % en poids, notamment entre 2 et 4 % en poids.

De manière avantageuse, l’étape c) consiste à réaliser une précipitation sélective des constituants autres que les cardénolides du mélange obtenu à l’étape a) ou de la partie liquide L1 obtenue à l’étape b).

Une telle étape peut être réalisée de différentes manières comme par exemple par une floculation de matières solides. Avantageusement, cette étape de précipitation sélective, par exemple une floculation, va permettre d’éliminer les molécules qui sont en suspension ou sous la forme d’une dispersion colloïdale, et va ainsi permettre d’abaisser la quantité de matière sèche, classiquement appelée extrait sec, de l’extrait, tout en conservant les cardénolides qui, eux, sont solubles dans le solvant d’extraction. Ainsi, le procédé selon l’invention conduit à un extrait qui est encore plus concentré en cardénolides à l’issue de l’étape c). En effet, l’étape c) va permettre d’augmenter la part que représentent les cardénolides dans l’extrait sec de l’extrait produit.

L’étape c) consiste préférentiellement à introduire dans le mélange obtenu à l’étape a) ou, en particulier si l’étape b) est réalisée, dans la partie liquide L1 obtenue à l’étape b) au moins un agent conduisant à la floculation de matières solides, et est préférentiellement suivie d’une étape d’élimination des matières solides résultant de ladite floculation.

Plusieurs approches peuvent être utilisées pour éliminer sélectivement une partie des molécules indésirables de la phase liquide et enrichir la teneur en cardénolides de la matière non volatile transférées de la biomasse au solvant. Les composés indésirables peuvent être enlevés par un traitement acide en ajustant le pH du milieu à une valeur inférieure à 7, préférentiellement inférieure à 4, en utilisant des acides comme l’acide sulfurique, l’acide chlorhydrique, l’acide phosphorique ; un traitement basique, en ajustant le pH à une valeur inférieure à 10, en utilisant par exemple de l’hydroxyde de calcium, de l’hydroxyde de potassium, de l’hydroxyde de baryum, de l’hydroxyde de sodium, notamment en présence de chlorure de calcium; et/ou en utilisant des agents floculant tels que le sulfate d’aluminium, le sulfate de fer, le chlorure d’aluminium, le chlorure de Per (III); ou encore en utilisant des résines.

L’étape c) peut être ainsi réalisée en introduisant dans le mélange obtenu à l’étape a) ou dans la partie liquide L1 obtenue à l’étape b), au moins un agent conduisant à la floculation de matières solides, la précipitation sélective étant préférentiellement réalisée par floculation de matières solides, par exemple par un traitement avec des agents de floculation, par traitement acide ou par traitement basique.

Pour cela, il est possible d’utiliser différents agents, en particulier : des agents conduisant à la formation d’un précipité inorganique qui va entrainer avec lui les matières solides en suspension ; à titre d’exemples de tels agents, on peut citer le couple chaux/acide phosphorique, et le couple hydroxyde de baryum/ acide sulfurique ; des agents de floculation par complexation ; ces agents entraînent la formation d’un complexe avec certaines molécules en suspension qui vont alors précipiter ; à titre d’exemples de tels agents, on peut citer la chaux ; des agents de floculation par modification du pH ; la modification du pH obtenue va accentuer le caractère insoluble de certaines molécules ; à titre d’exemples de tels agents, on peut citer l’acide sulfurique.

Dans le cadre de l’invention, l’utilisation d’un couple chaux/acide phosphorique, d’un couple hydroxyde de baryum/acide sulfurique, de chaux seule, de charbon actif et d’acide sulfurique sont particulièrement préférés.

Les couples chaux/acide phosphorique, hydroxydes de baryum/acide sulfurique sont des systèmes floculants performants, avantageusement à la fois au regard de l’absence de dégradation de cardénolides d’intérêt, de la réduction de l’extrait sec et de son efficacité quelle que soit la partie de la plante utilisée pour constituer la matière première végétale de départ. L’utilisation combinée notamment de chaux et d’acide phosphorique conduit à la formation d’un précipité inorganique (du phosphate de calcium) qui entraine avec lui les molécules qui sont encore en suspension ou sous forme colloïdale, dans le mélange obtenu à l’étape a) ou la partie liquide L1 obtenue à l’étape b).

L’étape c) peut être réalisée sous agitation, notamment sous une agitation mécanique dans la gamme allant de 15 à 1500 rpm.

Le temps de réalisation de l’étape c) pour obtenir une floculation satisfaisante, est notamment de 1 seconde à 30 minutes, une fois l’agent ou les agents sélectionnés introduits.

L’étape d) consiste ensuite avantageusement à réaliser une ou plusieurs séparations du résultat de l’étape c) pour en récupérer sa partie liquide L2.

La ou les séparations effectuées à l’étape d) peuvent être les mêmes que celles réalisées à l’étape b), comme par exemple une filtration, une centrifugation ou une décantation. On préfère notamment à ce stade utiliser la centrifugation.

La séparation des matières solides résultant de la floculation et de la partie liquide restante est classiquement effectuée par tout dispositif de séparation approprié. En particulier, l’ensemble matières solides floculées/liquide peut être soumis à une opération de filtration. Il est également possible de réaliser la séparation matières solides floculées/liquide, en utilisant une centrifugeuse, ou par simple décantation. A l’issue d’une telle étape de centrifugation ou décantation, le surnageant est récupéré.

Ainsi, de manière préférée, à l’issue de l’étape d) de séparation, la partie liquide purifiée L2 est récupérée et les matières solides floculées éliminées.

De manière avantageuse, l’étape e) consiste enfin à réaliser une concentration de la partie liquide L2 pour récupérer un extrait concentré en cardénolides, par exemple par évaporation ou filtration. La partie liquide purifiée L2 peut ainsi également être concentrée en extrait sec, par évaporation au moins partielle du solvant d’extraction ou de tout autre liquide présent dans l’extrait. Pour cela, tout dispositif adapté, tel qu’un évaporateur à pression réduite, peut être utilisé. L’extrait peut être concentré en enlevant une partie du solvant par exemple par évaporation, si le solvant est de l’eau ; en enlevant totalement le solvant et en le remplaçant par une certaine quantité d’eau, s’il s’agit d’un solvant organique.

Il est également possible de concentrer la partie liquide L2 pour récupérer un extrait concentré en cardénolides par fdtration, notamment filtration sur membrane, par exemple par nano filtration ou ultrafiltration.

Il est également possible que la partie liquide purifiée L2 soit ensuite totalement asséchée ou lyophilisée. Dans ce cas, l’extrait concentré en cardénolides produit est l’extrait sec ou l’extrait lyophilisé issu de cette étape de séchage ou de lyophilisation.

Ces traitements vont permettre de concentrer davantage l’extrait en cardénolides, tout en évitant d’atteindre des viscosités trop élevées.

L’invention concerne également un extrait obtenu ou susceptible d’être obtenu par le procédé tel que défini précédemment.

Formulations

L’invention concerne aussi une formulation comprenant au moins un extrait tel que défini précédemment et au moins un additif, notamment choisi dans le groupe constitué par : enrobants, liants, colorants, pigments, surfactants, agents dispersants, agents mouillants, agents anti-mousse, agents rhéologiques, agents anti-gel, plastifiants, agents pour favoriser l’écoulement des semences (comme des cires, du graphite ou des huiles), charges, adjuvants, biocides, et ingrédients actifs. La formulation de l’invention peut comprendre un ou plusieurs additifs.

Préférentiellement la formulation comprend de 10 à 99 % en poids dudit extrait, par rapport au poids total de la formulation. La formulation peut comprendre de 30 à 99 % en poids dudit extrait, par rapport au poids total de la formulation, notamment lorsque l’extrait est formulé avec un ingrédient actif. La formulation peut comprendre de 90 à 99 % en poids dudit extrait, par rapport au poids total de la formulation, notamment lorsque l’extrait est formulé avec un agent dispersant et/ou un agent mouillant.

Ces additifs, également appelés parfois pelliculants, sont utilisés pour appliquer un film microporeux à la surface de la semence. Ils permettent d’améliorer la couverture de la graine et l’homogénéité du recouvrement par la substance active. Ils peuvent également faciliter l'écoulement des semences dans le semoir.

Les enrobants peuvent modifier la forme, la taille et/ou le poids de la semence, ce qui permet d’améliorer la précision du semis. On peut effectuer un pelliculage monocouche ou répéter les étapes de pelliculage pour obtenir un pelliculage multicouche. La formulation peut également comprendre un ou plusieurs liants, notamment choisis dans le groupe constitué par la gélatine, les acétates polyvinyliques, les copolymères de monomère polyvinylacétate avec un autre monomère, les alcools polyvinyliques, les copolymères de monomère alcool polyvinylique avec un autre monomère, le styrène-butadiène, le styrène- carboxylé. butadiène, celluloses choisies dans le groupe constitué des éthylcelluloses et méthylcelluloses, hydroxypropylcelluloses, hydroxyméthylcelluloses et hydroxyméthylpropylcelluloses, polyvinylpyrolidones, dextrines, polysaccharides, graisses, huiles de calcium, protéines, gomme arabique, gomme laque, huiles de calcium, protéines, gomme arabique, gomme laque , chlorure de vinylidène, vinylidène, copolymères de chlorure, chlorures de vinylidène copolymères de monomères acryliques avec un autre monomère, amidon non dérivé, amidon dérivé, amidon cationique, acrylates de polyvinyle, zéines, carboxyméthylcellulose, chitosane, oxyde de polyéthylène, polymères d'acrylimide et copolymères de monomère d'acrylimide avec un autre monomère, acrylate de polyhydroxyéthyle, monomères de méthylacrylimide, éthylcellulose, polychloroprène, guar, guar dérivé, polyacrylamide, poly (acide méthacrylique), poly (acide acrylique), polyacrylate, poly (éthylène glycol), polymères à terminaison phosphonate, oxyde de polyéthylène, poly (alcool vinylique), polyglycérol, polytétrahydrofurane, polyamides , guar hydroxypropylique cationique, guar hydroxypropylique, guar carboxyméthylique cationique, guar carboxyméthylhydroxypropyle, amidon, amidon dérivé, amidon cationique, amidon de maïs, amidon de blé, amidon de riz, fécule de pomme de terre, tapioca, maïs cireux, sorgho, sargho cireux, sagou, dextrine, chitine , chitosane, compositions d'alginate, gomme xanthane, gomme carraghénane, gomme karaya, gomme arabique, pectine, cellulose, hydroxycellulose, hydroxyalkylcellulose, hydroxyéthylcellulose, carboxyméthylhydroxyéthylcellulose, hydroxypropylcellulose, un dérivé de l'un des précédents et une combinaison de l'un des précédent.

Les liants peuvent être par exemple des polymères acryliques composés d'un ou plusieurs des monomères suivants : acide acrylique, acrylate de méthyle, acrylate d'éthyle, acrylate de butyle, acrylate d'hydroxyéthyle acrylate d'hydroxybutyle, acrylate de carboxyéthyle, acide méthacrylique, méthacrylate de méthyle, méthacrylate d'hydroxy butyle, méthacrylate de lauryle, et le méthacrylate de stéaryle; avec aucun et/ou un ou plusieurs des monomères suivants : acrylamide, N-méthylacrylamide, N,N-diméthylacrylamide, N-octylacrylamide, anhydride maléique, acide maléique, maléate de monoéthyle, maléate de diéthyle, maléate de monooctyle, maléate de dioctyle ; et leurs sels correspondants de sodium, potassium, ammonium, isopropylamine, triéthylamine, monoéthanolamine et/ou triéthanolamine. D'autres liants appropriés de cette liste comprennent : des copolymères d'éther méthylvinylique avec de l'anhydride maléique ou des esters monoalkyliques d'anhydride maléique (par exemple la gamme de produits Agrimer® VEMA d'ISP); polyvinylpyrrolidones; des copolymères de vinylpyrrolidone avec de l'acétate de vinyle (par exemple, la gamme de produits Agrimer VA d'ISP); les copolymères de vinylpyrrolidone avec des vinylalkyles (par exemple la gamme de produits Agrimer® AL d'ISP); acétate de polyvinyle; les copolymères éthylène/acétate de vinyle (par exemple la gamme de produits Atlox® SemKote E d'Uniqema); les copolymères acryliques d'acétate de vinyle (par exemple, la gamme de produits Atlox® Semkote V d'Uniqema); les copolymères séquences A-B d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène ; les copolymères triblocs A-B-A de EO-PO-EO (par exemple la gamme Pluronic® de BASF); l'alcool polyvinylique, les polymères acryliques de styrène et les polymères d'acétate de vinyle-versatate.

Les liants peuvent également être un polymère de latex, c'est-à-dire une dispersion dans un support aqueux de particules de polymère ayant une granulométrie d'environ 0,05-0,20 micron et un poids moléculaire moyen en poids supérieur à 500 000 g/mol. Les polymères de latex peuvent être formés par polymérisation en émulsion classique.

Les liants peuvent également être choisis parmi les liants biodégradables. Les liants biodégradables peuvent être hydrosolubles ou non hydrosolubles et ils sont généralement dégradés sur une période de plusieurs semaines lorsqu'ils sont placés dans un environnement d'application. Des exemples de polymères biodégradables comprennent les polyesters biodégradables ; alliages amidon-polyester; amidon; mélanges amidon-PCL; mélanges d'amidon d'acide polylactique (PLA); l'acide polylactique; les copolymères poly (acide lactique-acide glycolique); PCL ; les polygalactomannanes, tels que les guars dérivés ou non ; esters de cellulose; acétate butyrate de cellulose; esters d'amidon; mélanges ester d'amidon-polyester aliphatique; amidon de maïs modifié; polycaprolactone; poly(méthacrylate de n-amyle); éthylcellulose; colophane de bois; polyanhydrides; alcool polyvinylique (PVOH); le valérate de polyhydroxybutyrate (PHBV); polyesters aliphatiques biodégradables; et le polyhydroxybutyrate (PHB).

Les guars peuvent être des guars ou des dérivés de guar. Les dérivés de guar comprennent, sans s'y limiter, le guar carboxyméthylique, le guar hydroxyéthylé, le guar hydroxypropylique, le guar carboxyméthylhydroxypropyle, le guar cationique, le guar hydroxypropylique cationique, le guar carboxyméthylique, le guar modifié hydrophobe, le guar carboxyméthylique modifié hydrophobe, le guar hydroxyéthylé modifié hydrophobement modifié, le guar hydroxyéthylé modifié hydrophobe le guar hydroxypropylique modifié hydrophobement cationiquement, le guar carboxyméthylhydroxypropylique modifié hydrophobe, le guar cationique modifié hydrophobement, ou toute combinaison de ceux-ci. L'amidon ou l'amylum est un glucide constitué d'un grand nombre d'unités de glucose reliées par des liaisons glycosidiques.

Les liants peuvent notamment être des huiles végétales comme l’huile de lin, l’huile de soja, l’huile de colza et l’huile de ricin. Ces huiles peuvent être utilisées telles quelles ou frigélisées et/ou raffinées. Ces huiles peuvent comprendre des triglycérides de différents acides gras majoritairement insaturés. Ces huiles peuvent éventuellement être éthoxylées.

Parmi les pigments, on peut citer par exemple : particules de mica, particules de mica recouvertes de dioxyde de titane, dioxyde de titane, phtalocyanine, oxyde de chrome, pigment rouge 112 (CAS No. 6535-46-2), pigment rouge 2 (CAS No. 6041-94-7), pigment rouge 48:2 (CAS No. 7023-61-2), pigment bleu 15:3(CAS No. 147-14-8), pigment vert 36 (CAS No. 14302-13-7), pigment vert 7 (CAS No. 1328-53-6), pigment jaune 74 (CAS No. 6358-31-2), pigment orange 5 (CAS No. 3468-63-1), pigment violet 23 (CAS No. 6358-30-1), pigment noir 7 (CAS No. 97793- 37-8), et pigment blanc 6 (CAS No. 98084-96-9).

Sont notamment utilisables à titre d'agent dispersant des phosphates tristyrylphenol ethoxylés (tels par exemple les produits Soprophor® FL, Soprophor® FL/60, Soprophor® FLK et Soprophor® 3D33), des sulfates tristyrylphenol ethoxyles (tels par exemple le produit Soprophor® 4D384), des polycarboxylates (tels par exemple les produits Geropon® SC/213, Geropon® T/36 et Geropon® TA/72), des methyl oleyl laurates (tel par exemple le produit Geropon® T/77), des phenylsulfonates (tel par exemple le produit Supragil® GN) et des copolymères acryliques.

Sont notamment utilisables à titre d'agent mouillant (liste illustrative et non limitative) des alcools gras etho-propoxyles (tel par exemple le produit Antarox® FM/33), des alcools gras ethoxylés (tel par exemple le produit Rhodasurf® CET 5, ou encore le produit Rhodasurf® 860/P), des sulfosuccinates (tels par exemple les produits Geropon® DOS/PG et Geropon® SDS), des alkylnaphtalene sulfonates (tel par exemple le produit Supragil® WP).

Les ingrédients actifs peut être par exemple l'un ou plusieurs des éléments suivants: nutriments végétaux, agents stimulant la croissance et produits phytopharmaceutiques.

Selon l'invention, le terme «nutriment végétal» comprend tout nutriment tel qu'un micronutriment ou un macronutriment. Le terme « nutriment » tel qu'il est utilisé dans ce texte peut faire référence à un additif ou à une substance utilisée par les plantes, les herbes, les arbustes pour la croissance des plantes, de l'herbe et des arbustes, respectivement. Les macronutriments peuvent être utilisés en plus grandes quantités par les plantes, les graminées, etc. en quantités proportionnellement plus importantes par rapport aux micronutriments. Les nutriments comprennent, sans s'y limiter, le manganèse, le bore, le cuivre, le fer, le chlore, le molybdène et le zinc, le potassium, l'azote, le calcium, le magnésium, le phosphore et le soufre, entre autres. Les formulations de la présente invention peuvent comprendre diverses combinaisons et quantités relatives de macronutriments individuels.

Selon l'invention, le terme « agents stimulant la croissance » comprend les additifs biologiques, tels que les inoculants de type bactéries ou champignons, ainsi que les biostimulants végétaux. Les biostimulants végétaux sont généralement des composants autres que les engrais qui affectent la croissance et/ou le métabolisme des plantes lors de l'application foliaire, sur la semence ou lorsqu'ils sont ajoutés au sol. Les biostimulants végétaux appartiennent généralement à l'une des trois catégories suivantes : les produits contenant des hormones, les produits contenant des acides aminés et les produits contenant des acides humiques. Les biostimulants végétaux sont utilisés pour traiter les cultures dans un cadre commercial en raison de leur capacité, par exemple, à augmenter les taux de croissance, à diminuer la croissance des plantes nuisibles, à augmenter la tolérance au stress, à augmenter le taux de photosynthèse et à augmenter la tolérance aux maladies. Les agents stimulant la croissance peuvent également être des micro-organismes par exemple. Les micro-organismes comprennent, mais sans s'y limiter, les bactéries à Gram positif, les bactéries à Gram négatif, y compris les bactéries de type rhizobium et bacille, ainsi que les champignons, y compris le trichoderma.

Les agents stimulant la croissance peuvent également être des polysaccharides comme par exemple des guars et guars cationiques, tel que décrits dans les demandes internationales W02016/101862 et WO2021/074369.

Selon l'invention, le terme «produit phytopharmaceutique» comprend tout pesticide tel que notamment les herbicides, les fongicides ou les insecticides, de préférence les fongicides ou les insecticides. Le produit pharmaceutique peut être une substance chimique, un agent biologique (tel qu'un macro-organisme, un micro-organisme), un produit sémiochimique (tel que des phéromones) ou des substances naturelles d'origine minérale, végétale ou animale utilisées contre les parasites, notamment les insectes, les phytopathogènes, les mauvaises herbes, les mollusques, oiseaux, mammifères, poissons, nématodes (vers ronds) et microbes qui rivalisent avec les humains pour la nourriture, détruisent des biens, propagent des maladies ou sont une nuisance. Les produits pharmaceutiques comprennent les biopesticides. Des exemples appropriés d'ingrédients actifs de l'invention comprennent des agents fongicides, des agents bactéricides, des agents insecticides, des agents nématicides, des agents molluscicides, des acaricides ou acaricides, des pesticides et des biocides. D'autres ingrédients actifs possibles comprennent des désinfectants, des micro-organismes, des tueurs de rongeurs, des désherbants (herbicides), des agents attractifs, des agents répulsifs (pour les oiseaux), des régulateurs de croissance des plantes (tels que l'acide gibbérellique, l'auxine ou la cytokinine), des nutriments (tels sulfate de magnésium, chélate de fer), hormones végétales, minéraux, extraits de plantes, stimulants de germination, phéromones, préparations biologiques, etc.

Les principes actifs peuvent être aussi par exemple choisis dans le groupe constitué par : les herbicides triazines, les herbicides sulfonylurées, les uraciles, les herbicides urées, les herbicides acétanilides, les herbicides organophosphonates, les sels de glyphosate, les esters de glyphosate, les fongicides nitrilo-oximes, les fongicides imidazoles, les fongicides carbamates, aromatiques chlorés, fongicides dichloroaniline, insecticides carbamates, insecticides organo thiophosphates; insecticides organiques perchlorés, méthoxychlore, acaricides, sulfite de propynyle, acaricides triazapentadiène, acaricides aromatiques chlorés, tétradifan, acaricides dinitrophénol, binapacryl, molluscicides, bactéricides, répulsifs ou tout mélange de ceux-ci.

Les additifs peuvent être ajoutés à l’extrait pour obtenir la formulation de diverses manières, comme par exemple par leur introduction dans une cuve agitée pour obtenir un mélange homogène.

Parmi les différentes formulations possibles on peut citer notamment : les formulations comprenant au moins l’extrait selon l’invention et un agent stimulant la croissance de type polysaccharide, notamment choisi parmi les guars et guars cationiques. les formulations comprenant au moins l’extrait selon l’invention et une formulation de micronutriments . les formulations comprenant au moins l’extrait selon l’invention et une formulation de pelliculant optimisée pour l’enrobage des semences. les formulations comprenant au moins l’extrait selon l’invention et une formulation de biopesticides pour la lutte contre les nuisibles.

La formulation selon l’invention comprenant au moins un extrait tel que défini précédemment peut parfaitement être une composition de répulsif pour oiseaux ou une bouille de traitement des semences. Semences enrobées

La présente invention concerne aussi une semence enrobée avec un extrait tel que défini précédemment ou une formulation telle que définie précédemment.

D’une façon générale, il convient d’appliquer de façon homogène sur toute la surface des semences les matières actives adaptées à l’effet que l’on souhaite observer. De fait, si la surface du grain n’est pas entièrement couverte par les produits, y compris dans le sillon, la protection pourrait être moins efficace voire inefficace. Dans le cas présent, toutefois, dans la mesure où l’extrait ou la formulation de l’invention a un effet répulsif, cet effet est observé même si la totalité de la semence n’est pas recouverte.

L’extrait ou la formulation de l’invention peuvent être appliqués sur les semences de diverses manières conventionnelles dans l'art du traitement des semences, y compris, mais sans s'y limiter, le mélange dans un récipient, tel qu'une bouteille, un sac ou un gobelet, une application mécanique, une pulvérisation et une immersion, éventuellement suivi d'un séchage.

Des exemples de techniques et de machines d'enrobage des semences qui peuvent être utilisées comprennent les techniques à lit fluidisé, la méthode du broyeur à cylindres, les traitements de semences rotatifs, les enrobeuses à tambour, les bacs à distribution latérale, les mélangeurs à tambour et les lits à bec.

Les graines peuvent être pré-calibrées avant enrobage. Le mélange de traitement des semences peut être appliqué sur les semences dans un dispositif de traitement des semences, tel que le dispositif de traitement des semences Hege, qui tourne au fur et à mesure que la formulation est ajoutée aux semences.

Le mélange est de préférence poursuivi jusqu'à ce que la formulation de traitement des semences soit répartie uniformément sur la semence (c'est-à-dire des enrobages uniformes sur toutes les semences à traiter et un enrobage uniforme sur chaque semence individuelle).

Le mélange de traitement de semences peut être appliqué aux semences dans un processus de traitement par lots ou dans un processus de traitement continu. Dans un procédé de traitement par lots représentatif, les graines à traiter sont introduites dans une cuve de traitement par lots et le mélange de traitement est ensuite ajouté et mélangé aux semences. En variante, un processus de traitement continu peut être utilisé pour appliquer le mélange de traitement de semences aux semences dans lequel un flux de semences est introduit dans un réceptacle contenant la suspension de traitement de semences et, après contact avec la formulation, récupéré du réceptacle pour séchage.

Des techniques d'enrobage appropriées peuvent être utilisées pour enrober les semences ou l'agglomération de semences.

Après l'application du mélange de traitement des semences (que ce soit dans un processus discontinu ou continu), les semences sont laissées sécher pendant un certain temps. Par exemple, les semences peuvent être tournées dans un bol pendant un certain temps, par exemple, au moins 15 secondes, pour permettre le séchage. Différentes périodes de temps peuvent être nécessaires pour tenir compte de la variabilité des conditions de séchage en raison des conditions météorologiques ou de différentes tailles de graines. De plus, de la chaleur peut être apportée, si on le souhaite, pour réduire les temps de séchage, par exemple, sous la forme d'un courant d'air chauffé. Après séchage, les semences enrobées peuvent subir un processus de séparation ou de classification par taille.

Les semences peuvent être séparées avant l'enrobage avec des moyens mécaniques tels qu'un tamis. Les semences séparées peuvent ensuite être introduites dans une machine d'enrobage comportant un réservoir de semences. Les semences dans le bol de mélange peuvent être combinées avec un ou plusieurs revêtements et collées avec un liant ou un adhésif.

Les semences des plantes selon la présente invention, peuvent être des plantes agricoles ou horticoles, de type monocotylédone ou dicotylédone, et peuvent être plantées pour la production d'un produit agricole ou horticole. La plante peut être par exemple une plante céréalière, notamment les graminées.

Les extraits et formulations de l’invention peuvent être appliqués à pratiquement n'importe quelle variété de plantes et de fruits. Les plantes peuvent être sélectionnées dans la liste suivante, mais sans s'y limiter :

- Les cultures vivrières : telles que les céréales dont le maïs/maïs (Zea mays), le sorgho (Sorghum spp.), le mil (Panicum miliaceum, P. sumatrense), le riz (Oryza sativa indica, Oryza sativa japonica), le blé (Triticum sativa), l'orge (Hordeum vulgare), le seigle (Secale cereale), le triticale (Triticum X Secale), le tournesol (Helianthus annuus) et l'avoine (Avena fatua).

- Les graines peuvent également être de n'importe quelle espèce végétale légumineuse, y compris, mais sans s'y limiter, les haricots et les pois. Les haricots comprennent le guar, la caroube, le fenugrec, le soja, les haricots de jardin, le niébé, le haricot mungo, le haricot de Lima, le haricot, les lentilles, le pois chiche, le pois, la fève, la fève, le haricot rouge, la lentille, le haricot sec, etc. Les légumineuses incluent, mais sont sans s'y limiter, les plantes du genre Arachis, par exemple, arachides, Vicia, par exemple, vesce couronnée, vesce velue, haricot azuki, haricot mungo et pois chiche, les plantes du genre Lupinus, par exemple, lupin, trifolium, les plantes du genre Phaseolus, par exemple, haricot commun et haricot de Lima, les plantes du genre Pisum, par exemple, féverole, les plantes du genre Melilotus, par exemple, trèfle, les plantes du genre Medicago, par exemple, luzerne, les plantes du genre Lotus, par exemple, trèfle, lentille, par exemple, lentille et faux indigo. Le fourrage et le gazon comprennent, sans s'y limiter, la luzerne, la fétuque élevée, le ray-grass vivace, l'herbe courbée rampante, la luzerne, le trèfle, le trèfle, les stylosanthes, le lotononis bainesii, le sainfoin et l’Agrostide blanche. D'autres espèces de graminées comprennent l'orge, le blé, l'avoine, le seigle, le dactyle pelotonné, la pintade, le sorgho ou le gazon.

- Les légumes à feuilles : tels que les plantes brassicacées telles que les choux, le brocoli, le bok choy, la roquette ; salades vertes telles que les épinards, le cresson, le basilic et la laitue;

- Les légumes à racine : tels que les radis, les carottes, la betterave et le céleri -rave.

- Les légumes-fruits et fleurs : tels que le maïs doux, les artichauts, les curcubits, par ex. courges, concombres, melons, pastèques, courges telles que courgettes, citrouilles; légumes/fruits solononacés, par exemple les tomates, aubergines et poivrons; - Les légumes en gousse : tels que les arachides, les pois, les haricots, les lentilles, les pois chiches et le gombo ;

- Les légumes à bulbe et à tige : tels que le céleri, les cultures d'allium, par exemple l'ail, les oignons et les poireaux ;

On peut aussi notamment effectuer l’enrobage sur des semences d’orge, de seigle, maïs, colza, de soja ou tournesol mais cette méthode s’applique également sur des espèces potagères cucurbitacée, solanacée, brassicacée ou astéracées.

Le dosage d’extraits ou de formulations sur les semences peut varier en fonction de différents paramètres tels que notamment la nature de l’extrait et le type de semences. On peut par exemple utiliser environ 0,1 à 3 kg, préférentiellement de 0,1 à 2 kg, d’extraits ou de formulations pour 1 quintal (q) de semences.

Les semences enrobées selon l’invention peuvent notamment être enrobées par un extrait ou une formulation selon l’invention et une composition comprenant au moins un agent pelliculant. Ces deux compositions peuvent être mélangées au préalable avant l’application sur les semences. Ces deux compositions peuvent être appliquées successivement ou en même temps sur les semences.

Utilisation d’un extrait ou d’une formulation

L’invention concerne aussi l’utilisation d’un extrait tel que défini précédemment ou d’une formulation telle que définie précédemment, pour traiter des semences.

L’invention concerne également l’utilisation d’un extrait tel que défini précédemment ou d’une formulation telle que définie précédemment, en tant que répulsif contre les oiseaux.

La solution présente également un effet contre les rongeurs et autres ravageurs domestiques, permettant ainsi une double protection des semences traitées. L’utilisation de cette solution pour son effet répulsif à l’encontre des volatiles et rongeurs pourra être étendue à d’autres domaines d’activité.

L’invention se rapporte aussi à l’utilisation des extraits et formulations en tant que produit phytosanitaire, ou l’utilisation des extraits et formulations pour la préparation d’un produit phytosanitaire.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée.

La présence des cardénolides d’intérêt a été confirmée :

- Par spectrométrie UV, en utilisant l’appareillage et le protocole ci-dessous : Agilent 1290,

Colonne : modèle Agilent - ZORBAX Eclips XDB Cl 8, Dimensions : 150 mm x 3,0 mm x 5 im,

Phase mobile :

A : Eau + 0,1 % v/v Acide formique et B : Acétonitrile + 0,1 % v/v Acide formique

Le gradient présenté dans le Tableau 1 ci-après :

Tableau 1 :

Débit : 0,3 mL/min,

Injection de 5 pl,

Détection UV de 190 à 600 nm (étape de 2 nm).

- Par spectrométrie de masse en phase liquide (LC-MS haute résolution) en utilisant notamment l’appareillage et le protocole ci-dessous :

Agilent QTOF,

Source Electrospray positif,

Tension du fragmenteur : 50 V,

Température gaz : 325 °C,

Débit du gaz de séchage : 8 L/min

Pression du nébulisateur : 45 psig,

Température du gaz d’absorption : 300 °C,

Débit du gaz d’absorption : 11 L/min,

Tension capillaire : 3000 V,

Tension de la buse : 0 V,

CID : Azote, Rampe 4 V et Offset 10 V.

La quantité des cardénolides d’intérêt a été déterminée par spectrométrie de masse. Pour cela, l’extrait a été dilué, à raison de 25 à 30 mg d’extrait pour 20 g d’eau. Si besoin en cas de formation d’un précipité, lors des étapes préalables de stockage de l’extrait, notamment sous forme congelée, l’extrait a été passé dans un bain aux ultrasons, pour homogénéiser l’échantillon.

En LC-MS haute résolution, les données pertinentes utilisées pour la détection de l’ion [M+H] ⁺ , d’adduits et de fragments majoritaires pour chacun des quatre cardénolides d’intérêt sont présentées dans le Tableau 2 ci-après :

Tableau 2 :

* TR = Temps de Rétention (temps au bout duquel un composé est élué et détecté)

Exemple 1 : Préparation de l’extrait, méthode 1

4,14 kg de biomasse séchée de feuilles et tiges d’Asclepias curassavica broyées ont été introduites dans une cuve contenant 41,4 kg d’eau à 30 °C. Le milieu a été maintenu sous agitation à 30 °C pendant 3 heures.

Après la macération, la phase liquide a été séparée de la biomasse par un décanteur centrifuge.

36.1 kg de jus dilué avec un extrait sec de 2,44 % ont été séparés de la biomasse. La biomasse avait un taux d’humidité de 69,77 %.

Le pH de l’extrait dilué était de 5,9. Environ 0,27 kg d’acide phosphorique à 75 % massique a été ajouté pour obtenir un pH de 2,8. La solution a été agitée et maintenue à 30 °C pendant 30 minutes et on observa la formation de flocs dans le mélange. Les produits floculés ont été enlevés par centrifugation et 35,6 kg de jus clair avec un extrait sec de 2,65 % ont été obtenus. Le pH du jus était de 2,7.

0,7 kg de lait de chaux à 30 % massique a ensuite été introduit et conduisit à la formation d’hydroxyapatite ainsi que d’autres espèces de phosphate de calcium de façon quasi instantanée. Le précipité a été enlevé par centrifugation. 33,7 kg de jus clarifié avec un extrait sec de 2.06 % a été obtenu.

80 g de lait de chaux à 3 % massique a été ajouté au jus clarifié, pour ajuster le pH à 7,1. De 1’ hydroxyapatite a été précipité une seconde fois. Le précipité a été enlevé par centrifugation. 32,9 kg de jus avec un extrait sec de 1,97 % a été obtenu. Après 12 heures de stockage à 30 °C, le jus clair redevint turbide avec une chute du pH qui passa à 4,7. Le jus a été à nouveau centrifugé. 29,34 kg de jus clarifié avec un extrait sec de 1,88 % a été récupéré après centrifugation.

Le jus dilué fut ensuite concentré par distillation de l’eau dans un évaporateur à flux tombant.

76.2 kg de jus concentré avec un extrait sec de 64,2 % a été obtenu. La teneur en cardénolides était de 1,13 % en poids de cardénolides, par rapport au poids total dudit extrait, mesurée par chromatographie en phase liquide couplée à une spectrométrie de masse. L’uscharidine, la calotoxine, l’asclépine, la calotropagénine, la calactine, l’uscharine, la 12p- hydroxycoroglaucigénine, la 12p-hydroxycalactropine, la 15 P-hydroxy calactine et la gofruside ont été détectées. Pour mesurer la viscosité, 300 g à 30 °C d’extrait ont été pesés dans un bêcher de 600 mL (hauteur 12,4 cm et diamètre 9 cm). Un viscosimètre Brookfield type RVDV a été utilisé à 20 rpm avec une aiguille permettant d’être dans la bonne gamme afin d’avoir une mesure fiable. La viscosité de l’extrait a été mesurée à 358 m.Pa.s.

Exemple 2 : Préparation de l’extrait, méthode 2

42,2 g de biomasse séchée de feuilles et tiges d’Asclepias curassavica broyées ont été introduites dans une cuve contenant 420 g d’eau à 30 °C. Le milieu a été maintenu sous agitation à 30°C pendant 3 heures.

Au bout de 3 heures, 7,8 g d’acide phosphorique à 85 % massique ont été ajouté au mélange pour obtenir faire passer le pH de 5,63 à 2,03. La solution a ensuite été maintenue sous agitation pendant 5 minutes ; puis 21 g de lait de chaux à 30% ont été ajoutés pour ajuster le pH à 7,32.

Après l’ajustement du pH, la phase liquide est séparée de la phase solide par centrifugation. 253 g de jus ayant un extrait sec de 1,71 % en poids ont été récupérés.

Le jus dilué a ensuite été concentré par distillation de l’eau dans un évaporateur rotatif. 6,8 g de jus concentré avec un extrait sec de 64 % ont été obtenus. La teneur en cardénolides de l’extrait de plante était de 1,07 % massique mesurée par chromatographie en phase liquide couplée à une spectrométrie de masse. L’uscharidine, la calotoxine, l’asclépine, la calotropagénine, la calactine, l’uscharine, la 12p-hydroxycoroglaucigénine, la 12p-hydroxycalactropine, la 15p~ hydroxy calactine et la gofruside ont été détectées.

Pour mesurer la viscosité, 300 g à 30 °C d’extrait ont été pesés dans un bêcher de 600 mL (hauteur 12,4 cm et diamètre 9 cm). Un viscosimètre Brookfield type RVDV a été utilisé à 20 rpm avec une aiguille permettant d’être dans la bonne gamme afin d’avoir une mesure fiable. La viscosité de l’extrait a été mesurée à 370 m.Pa.s.

Exemple 3: Préparation de l’extrait, méthode 3

1186 g de feuilles d’Asclepias curassavica broyées ont été introduites dans une cuve contenant 11,85 kg d’eau à 30 °C. Le milieu a été maintenu sous agitation à 30 °C pendant 3 heures.

Après la macération, la phase liquide a été séparée de la biomasse par un centrifugation. 8,15 kg de jus dilué avec un extrait sec de 2,84 % ont été séparés de la biomasse.

Le jus dilué a ensuite été concentré par distillation de l’eau sous vide. 450 g de jus concentré avec un extrait sec de 50 % ont été obtenus. La teneur en cardénolides de l’extrait de plante était de 1,6 % en poids mesurée par chromatographie en phase liquide couplée à une spectrométrie de masse. L’uscharidine, la calotoxine, l’asclépine, la calotropagénine, la calactine, l’uscharine, la 12p-hydroxycoroglaucigénine, la 12p-hydroxycalactropine, la 15 P-hydroxy calactine et la gofruside ont été détectées. Pour mesurer la viscosité, 300 g à 30 °C d’extrait ont été pesés dans un bêcher de 600 mL (hauteur 12,4 cm et diamètre 9 cm). Un viscosimètre Brookfield type RVDV a été utilisé à 20 rpm avec une aiguille permettant d’être dans la bonne gamme afin d’avoir une mesure fiable. La viscosité de l’extrait a été mesurée à 370 m.Pa.s.

Exemple 4: Préparation d’un extrait dilué, purifié

4 g de feuilles d’Asclepias curassavica broyées ont été introduites dans une cuve contenant 40 g d’eau à 30 °C. Le milieu a été maintenu sous agitation à 50 °C pendant 3 heures.

Après la macération, la phase liquide a été séparée de la biomasse par centrifugation. 30 g de jus dilué avec un extrait sec de 3.73 % ont été séparés de la biomasse.

Le pH de l’extrait dilué était de 6,1. Environ 0,8 g de FcCL en dispersion dans l’eau à 0.6 % massique a été ajouté. La solution a été agitée et maintenue à 30 °C pendant 10 minutes et on a observé la formation de flocs dans le mélange. Les produits floculés ont été enlevés par centrifugation et 27 g de jus clair avec un extrait sec de 1.96 % ont été obtenus.

Exemple 5 : Préparation d’extraits

Le tableau 3 ci-dessous présente les caractéristiques de deux extraits, l’un réalisé sans « purification » (Echantillon A), l’autre incluant une étape de purification (Echantillon B).

Pour préparer l’échantillon A, 100 g de biomasses séchées broyées ont été macérées dans 1 litre d’eau pendant 3 heures. La phase liquide a été séparée de la phase solide par centrifugation. 700 g de jus avec un extrait sec de 2,4 % a été récupéré. Le jus a ensuite été concentré pour obtenir 33 g de jus ayant taux de solide de 50 %.

Pour préparer l’échantillon B, 100 g de biomasses séchées broyées ont été macérées dans 1 litre d’eau pendant 3 heures. De l’acide phosphorique à 85 % a été ajouté pour faire baisser le pH du mélange à 2,7. Le mélange a été maintenu sous agitation pendant 10 minutes. Ensuite, du lait de chaux a été ajouté pour faire passer le pH de 2,7 à 7,2. Le mélange a été maintenu sous agitation pendant 10 minutes. Ensuite la phase liquide a été séparée de la phase solide par centrifugation. 720 g de jus avec un extrait sec de 2.0 % a été récupéré. Le jus a ensuite été concentré pour obtenir 22,5 g de jus ayant taux de solide de 64 %. Tableau 3

On observe ainsi que la purification opérée permet d’augmenter la teneur en cardénolides dans la matière sèche tout en ayant une viscosité plus faible et donc un produit plus facilement manipulable pour un même taux de matière sèche. De plus la dose à appliquer sur semences est plus faible, et par conséquent plus à mettre en œuvre à l’échelle industrielle.

Exemple 6: Formulation de l’extrait

Pour préserver l’extrait des développements microbiens, 76,2 g de kathon™ CG (CIT/MIT) ont été ajoutés à l’extrait obtenu à l’Exemple 1. Pour assurer une stabilité dans le temps de la formulation, 0,57 kg d’un alcool gras ethoxylé comme le Rhodasurf® 860/P et 1,5 kg d’etho (30 EO)-propoxylé (20 PO) tristyrylphénol comme le Soprophor® TSP/461 ont été ajoutés. Le pH a été réajusté à 7 en utilisant de l’hydroxyde de potassium.

La teneur en cardénolides de la formulation ainsi obtenue était de 1,08 % en poids mesurée par chromatographie en phase liquide couplée à une spectrométrie de masse. La viscosité de la formulation est de 1000 m.Pa.s.

Pour mesurer la viscosité, 300 g à 25 °C d’extrait ont été pesés dans un bêcher de 600 mL (hauteur 12,4 cm et diamètre 9 cm). Un viscosimètre Brookfield type RVDV a été utilisé à 20 rpm avec une aiguille permettant d’être dans la bonne gamme afin d’avoir une mesure fiable. Exemple 7 : Traitement semences pour les essais en volière

Des bouillies de traitement de semences contenant un fongicide pour traitement de semences (Redigo® M de Bayer), un pelliculant, de l’eau et un extrait (obtenu suivant la méthode 1 présentée dans TExemple 1 ou suivant la méthode 3 présentée dans l’Exemple 3) sont préparées en mélangeant tous les composés par agitation mécanique. Une bouillie sans ajout de l’extrait est préparée, il s’agit du traitement “Contrôle”. Une bouillie est également préparée avec un produit répulsif pour oiseaux commercial (Korit 420 FS) afin de servir de point de comparaison, il s’agit du traitement “Référence”. Les compositions exactes des différentes bouillies de traitement de semences sont présentées dans le Tableau 4. Des semences de maïs (Zea mays, de source commerciale, PMG 275) sont traitées en multicouche, par application de plusieurs couches successives avec un temps de séchage intermédiaire (2h) avec une enrobeuse bol type SATEC. Les bouillies de traitement de semences sont pulvérisées sur les semences maintenues en rotation dans le bol pendant quelques secondes.

Tableau 4

Exemple 8 : Résultats tests volière

Des tests ont été réalisés sur des oiseaux en volière selon le protocole décrit dans WO 2020/109529 exemples 5 à 7 sur les traitements présentés dans l’Exemple 7.

L’expérimentation est réalisée sur des corneilles et freux en volières (7 individus par volière, Corneille et Freux). Le test est réalisé sur trois jours pour chaque traitement testé (TRI, T2 et T3) : En jour 1, un régime équilibré est proposé aux oiseaux. Ce régime est composé de 20 g de croquettes et de maïs traité avec le traitement Contrôle (TCI) à volonté.

En jour 2, 50 g de maïs traité avec le traitement Contrôle (TCI) sont proposés.

En jour 3, 20 g de maïs traité avec la formulation répulsive pour oiseaux (TRI, T2 ou T3) sont proposés. En jour 2 et 3, une pesée de l’aliment refusé est réalisée en fin de journée, pour calcul de la consommation moyenne par animal.

Les essais sont conduits en parallèle sur deux volières, qui constituent ainsi deux répétitions de l’expérience. Les résultats des essais pour les différents traitements testés sont présentés dans le Tableau 5. Pour chaque traitement, l’écart de consommation a été calculé de la manière suivante :

Ecart de consommation

Quantité mais contrôle consommée — Quantité mais traité consommée

Quantité mais contrôle consomée

Tableau 5

Comme détaillé dans le Tableau 5, l’utilisation de la formulation de l’extrait (T2 ou T3) dans les bouillies conduit à une réduction de la quantité de semences consommées par les oiseaux, cette réduction est en moyenne de l’ordre de 22-23 %.

Exemple 9 : Traitement semences pour les essais en champs

Des bouillies de traitement de semences contenant un fongicide pour traitement de semences (Redigo® M de Bayer), un pelliculant, de l’eau et l’extrait de l’Exemple 3 à deux doses différentes sont préparées en mélangeant tous les composés par agitation mécanique. Une bouillie sans ajout de l’extrait est préparée, il s’agit du traitement “Contrôle”. Une bouillie est également préparée avec un produit répulsif pour oiseaux commercial (Korit 420 FS) afin de servir de point de comparaison, il s’agit du traitement “Référence”. Les compositions exactes des différentes bouillies de traitement de semences sont présentées dans le Tableau 6. Des semences de maïs (Zea mays, de source commerciale, PMG 326) sont traitées en multicouche, par application de plusieurs couches successives avec un temps de séchage intermédiaire (2h) avec une enrobeuse bol type SATEC. Les bouillies de traitement de semences sont pulvérisées sur les semences maintenues en rotation dans le bol pendant quelques secondes.

Tableau 6

Exemple 10 : Résultats tests en champs

Deux essais en champs ont été conduits en Italie dans la région de Turin (Italie) pour évaluer les performances répulsives oiseaux des différents traitements présentés dans le Tableau 6. Les essais en champs sont réalisés sur des microparcelles avec 4 répétitions par traitement. La taille des microparcelles est comprise entre 30 et 40 m ² . Les essais en champs ont été réalisés en suivant les pratiques agricoles locales (application de pesticides, fertilisants et irrigation). Les intrants appliquées sont exactement les mêmes pour les différentes microparcelles d’un même essai. Au niveau des notations, le nombre de semences germées sur les deux rangs centraux ont été déterminés pour chacune des microparcelles au stade de développement BBCH 13 des plantes de maïs, correspondant au stade de 3 feuilles étalées.

Dans les Tableaux 7 et 8 sont présentés les résultats des essais en champs. Pour chaque traitement est indiqué le nombre total de semences germées. Cette valeur correspond à la moyenne des quatre microparcelles pour chaque traitement. Une analyse statistique des résultats (test de comparaison des moyennes de Student-Newman-Keuls à 5 %) a été réalisée pour déterminer si les moyennes sont statistiquement différentes. Le résultat de l’analyse statistique est indiqué dans les tableaux suivants à l’aide des lettres indiquées entre parenthèses représentant les groupes statistiques. Les moyennes qui ne partagent pas de lettre sont statistiquement différentes.

Tl Tableau 7: Résultats essai Castagnito - Nombre de semences germées

Les traitements T4 et T5 (groupe statistique (a)) entraînent une augmentation significative du nombre de semences germées par rapport au traitement contrôle (TC2, groupe statistique (b)) sans répulsif pour oiseaux. L’augmentation relative du nombre de semences germées est d’environ 18 % pour les deux traitements (T4 et T5). Finalement, pour les deux traitements le nombre de semences germées est comparable à la valeur obtenue pour le traitement avec le produit répulsif pour oiseaux de référence (TR2, Korit 420FS, groupe statistique (a)).

Tableau 8: Résultats essai Lombriasco - Nombre de semences germées Les traitements T4 et T5 (groupe statistique (a)) entraînent une augmentation significative du nombre de semences germées par rapport au traitement contrôle (TC2, groupe statistique (b)) sans répulsif pour oiseaux. L’augmentation relative du nombre de semences germées est comprise entre 15 et 20 % suivant le traitement considérés (T4 ou T5). Finalement, pour les deux traitements le nombre de semences germées est comparable à la valeur obtenue pour le traitement avec le produit répulsif pour oiseaux de référence (TR2, Korit 420 FS, groupe statistique (a)).