Die Erfindung betrifft ein neues Peptidhormon und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Aus elektronenmikroskopischen Untersuchungen war es bekannt, daß der rechte Herzvorhof (Atrium) des Schweines zwei verschiedene Zelltypen enthält, von denen einer die Morphologie endokriner Zellen (Sekret- granular) aufweist. Durch morphologische und histo- chemisσhe Untersuchungen des rechten Atriums konnte jedoch keine Hormonsubstanz, wie die des bereits bekannten Typus in myoendokrinen Zellen des Herzvor¬ hofes (Aurikel) bestimmt werden. Dagegen wurden viele der bekannten Neuropeptidhormone in Herznerven fest¬ gestellt.

Es wurde nun gefunden, daß Atrium-Extrakte (Herzvor- kammer) neben einer schon beschriebenen diuretischen Aktivität (vgl. J.-P. Marie, H. Guillemont, P.Y. Hatt, Pathol. Biol. 4 (1976) 549-554) , überraschenderweise Effekte auf die Ionotropie des Herzmuskels selbst bzw. Einflüsse auf die glatte Gefäßmuskulatur, sowie Ein¬ flüsse auf die SchweißSekretion aufweisen. Weiter wurde gefunden, daß diese biologischen Wirkungen durch ein neues. Peptidhormon verursacht werden, dem im Hinblick auf seine Wirkungen eine große klinische und therapeu¬ tische Bedeutung zukommt, insbesondere im Hinblick auf die Diagnostik und Therapie der Hypertonie.

Gegenstand der Erfindung ist deshalb, das neue Peptid¬ hormon Cardiodilatin mit der N-terminalen Aminosäurese¬ quenz:

Asn>-Pro-Val-Tyr-Gly-Ser-ValτSer-Asn-Ala-Asp-Leu-Met- Asp-Phe-Lys-Asn-Leu-Leu-Asp-His-Leu-Glu-Asp-Lys-Met-

Pro-Leu-Glu-Asp-Glu-Ala-Met-Pro-Pro-Gln-Val-Leu-Ser- Gl-

U-Gln-Asp-Glu-Val-Leu-Ser-Glu-Gln-Asn-Glu-Glu-Val-Gly— Ala-Pro-Leu-Pro-Leu-Leu-Glu-Glu-Val-Pro-Pro-Trp-Thr-Gl- y-Glu-Val-Asn-Pro, der Zusammensetzung:

Asp/Asn 14, Thr 3, Ser 15, Glu/Gln 12, Pro 10, Gly 12, Ala 10, Val 7, Met 4, Ile 1, Leu 15, Tyr 2, Phe 3, Lys 4, His 2, Arg 10, Trp 2 einer Länge von 126 Aminosäure¬ resten und einem isoelektrischen Punkt I.P. 6 bis 6,5.

Außerdem wurde gefunden, daß auch Fragmente, insbeson¬ dere C-terminale Fragmente und die sich zwischen zwei Met-Resten der Peptidkette befindlichen Fragmente des Peptidhormons Cardiodilatin die biologischen Akti¬ vitäten des Cardiodilatins, wenn auch zum Teil in abge¬ schwächter Form, aufweisen.

Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch die sich zwischen zwei Met-Resten der Peptidkette befindlichen Fragmente des Peptidhormons Cardiodilatin, wie z. B. das Fragment mit der Aminosäuresequenz Asp-Phe-Lys-Asn- Leu-Leu-Asp-His-Leu-Glu-Asp-Lys-Hse (1) oder das Fragment mit der Aminosäuresequenz Pro-Leu-Glu-Asp-Glu- Ala-Hse (2) , und das N-terminale Fragment Asn-Pro-Val- Tyr-Gly-Ser-Val-Ser-Asn-Ala-Asp-Leu-Hse sowie die jeweils C-terminal verbleibenden RumpfSequenzen des Cardiodilatin-126, verkürzt um die aufgeführten Hömo- serin-Peptide. Diese Fragmente erhält man durch par¬ tielle Bromcyanspaltungen, wobei die N- terminale Verkürzung des Cardiodilatin zu abgelösten Fragmenten führt, die jeweils C-terminal mit Homoserin (Hse) enden. Auch die durch Spaltung mit Arginin-spezifischer

Endopeptidase gebildeten, N-terminal verkürzten Frag¬ mente des Cardiodilatin wiesen qualitativ die gleiche biologische Wirksamkeit wie das Stamm-Molekül auf, wenn auch in abgeschwächter Form.

Eine Reihe von Cardiodilatinfragmenten wurde darüber- hinaus entweder synthetisch durch Merrifield-Synthese oder durch Spaltung des Cardiodilatins mit spezifisch spaltenden Proteasen hergestellt und untersucht. Die Merrifield-Synthese wurde dabei so durchgeführt, daß beginnend am C-terminalen Ende die Aminosäurekette um jeweils zwei Aminosäuren verlängert, abgespalten, untersucht, und nach dem gleichen Prinzip um weitere zwei Aminosäuren verlängert wurde. Dieses Verfahren wurde so oft wiederholt, wie es für die gewonnenen und weiter unten näher definierten Fragmente erforderlich war.

Die hergestellten Fragmente weisen eine interessante biologische Aktivität auf und zwar eignen sie sich zur Bildung von Antikörpern, welche das gesamte Cardio¬ dilatin zu erkennen vermögen und daher auch zu dessen Nachweis im Rahmen eines Immunassays verwendet werden können. Geeignet sind sowohl die zahlreichen bekannten Ausführungsformen des RIA (Radio-Immun-Assay) als auch des EIA (Enzym-Immun-Assay) . Außerdem zeigte sich, daß einige der Fragmente die vasodilatorische Wirksamkeit des Cardiodilatins ebenfalls aufweisen, insbesondere das die Aminosäuren 39 bis 126 umfassende Fragment und die entsprechenden, N-terminal bis zur Aminosäure 7 verlängerten Fragmente.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher die nachstehend aufgeführten Fragmente, die durch die HPLC- Daten charakterisiert sind:

Fragmente, die Aminosäurepositionen 1 bis 7 umfassend:

Asn-Pro-Val-Tyr-Gly-Ser-Val, sowie dessen Strukturvariation Met (Position 3) , Asn (Position 5) und Ala (Position 6) , beide auch N-terminal verlängert um die Sequenz Lys-Lys; z. B. Lys-Lys-Asn-Pro-Val-Tyr- Gly-Ser-Val.

Fragment 8 bis 19:

Ser-Asn-Ala-Asp-Leu-Met-Asp-Phe-Lys-Asn-Leu-Leu. (siehe Fig. 3)

Fragment 23 bis 28:

Glu-Asp-Lys-Met-Pro-Leu sowie dessen Strukturvariation

Glu (Position 24) .

(siehe Fig. 4)

Fragment 29 bis 37:

Glu-Asp-Glu-Ala-Met-Pro-Pro-Gln-Val, sowie dessen Variante mit Val (Pos. 32 und 33) und Glu (Pos. 37) .

Fragment 38 bis 44:

Leu-Ser-Glu-Gln-Asp-Glu-Glu, sowie dessen Variante mit

Pro (Position 41) , Asn (Position 42) .

(Fig. 5)

Fragment 63 bis 70:

Asp-Pro-Ser-Gln-Arg-Asp-Gly-Gly, sowie dessen Variante mit Ser (Position 63) , Ala (Position 65) . (Fig. 6)

Fragment 73 bis 79:

Gly-Arg--Gly-Pro-Trp-Asp-Pro, sowie dessen Variante mit

Phe (Position 77) , Ser (Position 79) .

Fragment 78 bis 84:

Asp-Pro-Ser-Asp-Arg-Ser-Ala, sowie dessen Variante mit

Ser (Position 79) .

(Fig. 7)

Fragment 86 bis 92:

Leu-Lys-Ser-Lys-Leu-Arg-Ala.

Fragment 96 bis 104:

Gly-Pro-Art-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser, sowie dessen Variante mit Ala (Position 96) . (Fig. 8)

Fragment 108 bis 114: mit einem zusätzlichen Tyr (Position 107) , Tyr-Gly-Arg-

Met-Asp-Arg-Ile, sowie dessen cyclische Form

^Tyr-Glu-Arg-Met-Asp-Arg'-Ile-Gly^ (Fig. 9)

Fragment 117 bis 126:

Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr und sein dimeres Disulfid.

Fragment 120 bis 126:

Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr und sein dimeres Disulfid.

Fragment 39 bis 126:

Ser-Glu-Gln-Asri-Glu-Glu-Val-Gly-Ala-Pro-Leu-Pro- Leu-Leu-Glu-Glu-Val-Pro-Pro-Trp-Thr-Gly-Glu-Val-Asp- Pro-Ser-Gln-Arg-Asp-Gly-Gly-Ala-Leu-Gly-Arg-Gly-Pro- Trp-Asp-Pro-Ser-Asp-Arg-Ser-Ala-Leu-Leu-Lys-Ser-Lys-

Leu-Arg-Ala-Leu-Leu-Ala-Gly-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg- Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala- Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-C s-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr, sowie dessen Strukturvariante im Bereich der Positionen 39 bis 65 Ser-Glu-Pro-Asn-Glu-Glu-Ala-Gly-Ala-Ala-Leu- Ser-Pro-Leu-Pro-Glu-Val-Pro-Pro-Trp-Thr-Gly-Glu-Val- Ser-Pro-Ala.

Bei N-terminaler Verlängerung des Fragments 39 bis 126 durch eine oder mehrere Aminosäuren der Sequenz 7 bis 38 des kompletten Cardiodilatins in der Weise, daß stets ein Fragment entsteht, welches in der Sequenz 7 bis 126 identisch enthalten ist, erhält man Fragmente, welche ebenfalls die dilatorische Wirksamkeit des kompletten Cardiodilatins aufweisen.

Erfindungsgemäß wird Cardiodilatin gewonnen, indem man Atriumextrakt als Ausgangsmaterial verwendet und das mit wässrigen Lösungsmitteln extrahierbare Material nach üblichen biochemischen Reinigungsmethoden fraktio¬ niert unter Anwendung eines Tests, bei dem die aktive Fraktion durch die relaxierende Wirkung auf glatte Muskulatur bestimmt wird. Vorzugsweise erfolgt die Reindarstellung des Peptidhormons Cardiodilatin aus Atrium-Extrakten, z. B. von Schweineatrien (V. Mutt, Arkiv Kemi 15, 69-74 (1959). Vorzugsweise wird Cardio¬ dilatin hergestellt, indem man gekochtes Atriummaterial mit verdünnter Säure extrahiert. Als verdünnte Säure eignen sich vor allem die Carbonsäuren, aber auch Mineralsäuren können eingesetzt werden. Bevorzugt verwendet man Essigsäure, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 0,1 bis 0,3 M.

Die weitere Reinigung kann erfindungsgemäß so erfolgen, daß man den Säureextrakt an Alginsäure adsorbiert, die Peptide mit verdünnter Mineralsäure wieder von der Algensäure eluiert, das Eluat einer Salzfällung unter¬ wirft, den dabei gebildeten Niederschlag auflöst und erneut mit Ethanol fällt. Der Ethanolniederschlag wird dann aufgelöst und über Carboxymethylcellulose chro- matographiert. Ein so gewonnenes Material ist in der Regel für pharmazeutische oder analytische Zwecke aus¬ reichend rein. Der oben beschriebene, durch Salzfällung gewonnene Niederschlag- kann alternativ auch direkt entsalzt und gereinigt werden durch Gelchromatographie, vorzugsweise an Sephadex G 25.

Eine Feinreinigung ist möglich mittels Hochdruck-Flüssig¬ keits-Chromatographie (HPLC) an einem Umkehrphasen-Kiesel¬ gel (Gradientenelution: 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser gegen Acetonitril, 0 bis 60%) und Abtrennen der aktiven Fraktionen.

Zweckmäßigerweise wird der HPLC an einem Umkehrphasen- Kieselgel eine HPLC an einer Ionenaustauschersäule vor¬ geschaltet und/oder die HPLC an Umkehrphasen-Kieselgel ein- oder mehrmals, vorzugsweise zweimal, wiederholt.

Die N-terminalen Fragmente, welche entweder synthetisch oder durch Spaltung am N-terminalen Methioninrest oder Argininrest erhalten werden, bewirken nach Konjugation mit einer Trägerprotein Antikörperbildung bei Verab¬ reichung an andere Tierarten wie Kaninchen oder Mäuse (Balb C) , weisen also auch Hapteneigensσhaften auf. Diese Antikörper können als spezifischer Ligand in der Affinitätschromatographie zur Anreicherung (Isolierung) und zum Nachweis des Peptidhormons Cardiodilatin einge¬ setzt werden. Die Affinitätschromatographie mit einem

N-terminalen Fragment-Antikörper als spezifischer Ligand stellt somit ein weiteres geeignetes Verfahren zur Anreicherung (Isolierung) des Peptidhormons dar, mit dem Cardiodilatin meist schon in ausreichend reiner Form erhalten werden kann. Die Affinitätschromatographie kann auch mit einer der vorstehend angeführten chro¬ matographischen Verfahren zur Isolierung des Peptid¬ hormons angewendet werden,'- oder aber es kann sich an eine der chromatographischen Methoden eine weitere Reinigung nach einem oder mehreren dafür geeigneten Verfahren anschließen; geeignete Verfahren sind z. B. Elektrophorese, Fällung, Adsorptions-Chromatographie, lonenaustausch- Chromatographie, Affinitäts-Chromato¬ graphie, isoelektrische Fokusierung, oder eine Kombi¬ nation einer oder mehrerer gleicher oder verschiedener dieser Schritte.

Die sich zwischen zwei Met-Resten der Peptidkette be¬ findlichen Fragmente lassen sich aus dem Cardiodilatin auf an sich bekannte Weise durch Spaltung mit geeigneten Hydrolasen herstellen, die Fragmente lassen sich aber auch, wie z. B. die oben angegebenen Fragmente mit der Aminosäuresequenz (1) und (2) oder N-terminale Frag¬ mente, auf synthetischem Wege durch an sich bekannte Peptidsynthesen herstellen, wie z. B. nach der Methode von Merrifield oder Synthese mit gemischten Anhydriden in Lösung.

Als differenzierender Bioassay für die Wirkung des Peptides wird der relaxierende Effekt auf Arteria renalis (Kaninchen) , Aorta abdominalis (Kaninchen, Ratte) und Arteria mesenterica inferior (Kaninchen) im

Organbad benutzt, wobei die nach Adrenalin-Vorbehand¬ lung kontrahierten Gefäßmuskelstreifen nach Zugabe des Cardiodilatins eine deutliche Relaxation zeigen. Diese Relaxation des Muskelstreifens aus Arteria renalis ist bei geringen Dosen von ca. 10 ng bis 100 ng/10 ml Organbad nachweisbar. Bei Streifen der Aorta als Test¬ muskel zeigte sich bei einer ca. lOfach höheren Dosis eine..nachweisbare Relaxation, während an der Arteria mesenterica inferior des Kaninchens kaum eine Aktivität beobachtet wurde.

Diese biologischen Wirkungen zeigen, daß das Peptidhormon Cardiodilatin und, wie gefunden wurde, auch seine Fragmente, insbesondere die C-terminalen, die nach oder zwischen Met-Resten stehen und nach partieller Bromcyan- spaltung gewonnen werden können, eine große klinische (diagnostische) und therapeutische Bedeutung besitzen, und zwar insbesondere hinsichtlich:

1. Differenzierte Vasodilatation bestimmter Gefäßbet¬ ten,

2. Diagnostik der Hypertonie,

3. Therapie der Hypertonie,

4. Möglichkeit, Vorhofsdilatationen aufgrund der Freigabe des Hormons zu diagnostizieren, und

5. Anwendung dieses Peptidhormones als Substitution bei Patienten, denen künstliche Herzen implantiert wurden.

6. Desweiteren wird eine synchrone Regulation des Blutvolumens und der Blut-Elektrolyte vermutet, auf die das Peptid Einfluß hat.

7. Hauterkrankungen, insbesondere mit Störung der Schweißsekretation,

8. den cardiovasculären Schock,

9. Erkrankungen der Nieren und Nebennierenrinde

10. Erkrankungen des Verdauungstraktes, insbesondere von Motilitätsstδrungen.

Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch Arzneimittel zur Verwendung bei den oben angegebenen Diagnostizier- und Therapieverfahren, die das neue Peptidhormon Cardiodilatin und/oder wirksame Fragmente davon enthalten. Die Arzneimittel können in den üblichen An¬ wendungsformen zur oralen oder parenteralen Applikation vorliegen, wie z. B. als Tabletten, Suppositorien, Dragees, Lösungen usw., gegebenenfalls zusammen mit üblichen, pharmakologisch verträglichen Träger- und/oder Verdünnungsmitteln. Die Menge an Cardiodilatin beträgt vorzugsweise 10 bis 1000 ng/Dosiseinheit.

B e i s p i e l 1

Unter Verwendung konventioneller elektronenmikroskopi¬ scher Methoden wurden diejenigen Stellen im rechten Atrium von Schweineherzen bestimmt, die die höchste Dichte an myoendokrinen Zellen (endokrine Sekretgranu- lar) aufwiesen. Diese Zellen wurden hauptsächlich an den dünnwandigen Stellen des Aurikels gefunden. Im Hinblick auf ihre Größenverteilung (230 und 50 nm) und ihre Elektronendichte sind diese Schweinegranula mit den menschlichen Granula vergleichbar; die Zahl der Granula beträgt ca. 0,02 bis 0,04 Granula/um ² der Schnittfläche.

Dieses oben beschriebene Gewebe des rechten Atriums wurde 20.000 Schweineherzen entnommen und nach bekann¬ ten Verfahren extrahiert -(vgl. V. Mutt, Arkiv Kemi 15,

69-74 (1959), S.I. Said und V. Mutt, Eur. J. Biochem. 28, 199-204 (1972), V. Mutt Gut hormones, S. 21-27, S.R. Bloom(editor) Edinburgh-London-New York: Churchill Livingstone, 1978).

B e i s p i e l 2

Hierzu wurden 40 kg Schweineartriumgekocht und mit 0,2 M Essigsäure extrahiert. Das Filtrat wurde an Alginsäure adsorbiert, die Algensäure mit Ethanol gewaschen und anschließend mit 0,2 M Salzsäure eluiert. Das die Peptide enthaltende Eluat wird dann mit Salz versetzt, bis die Peptide ausfallen und der Niederschlag abzentrifugiert. Der Niederschlag wird wieder in Phosphatpuffer, pH 7 aufgelöst und durch Zusatz von Ethanol erneut gefällt. Der Niederschlag wurde erneut aufgelöst in Phosphatpuffer, pH 6,4 und auf eine Carboxymethylcellulose aufgezogen. Die Säule war vorher mit einem Puffer, enthaltend 0,03 M NaOH, 0,025 M H ₃ P0 ₄ , 0,5 % Thiodiglycol, pH 6,4, äquilibriert worden. Nach Elution mit dem gleichen Puffer erfolgte eine weitere Elution mit einem Puffer enthaltend 0,03 M NaOH, 0,025 M H..PO. und 0,2 M NaCl pH 6,4. Hierbei wurden die aktivsten Fraktionen eluiert.

Die mit dem salzhaltigen Puffer eluierte Fraktion wird auf eine Ionenaustauschersäule (TSK-Cärboxymethyl- cellulose der Firma LKB) gegeben und mit 0,03 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,4 und einem Natriumchlorid¬ gradienten von 0 bis 0,5 M eluiert. Die aktive Fraktion wird gesammelt, über eine Molekularsiebsäule (Sephadex

G 25 (R) ) entsalzt und der präparativen Hochdruckflüs¬ sigkeitschromatographie (HPLC) mit umgekehrter Phase unterworfen, vorzugsweise unter Verwendung einer Organogen C, ₈ -5μ R - Säule.

Säule: Waters C,g-μ Bondapak, 4 x 250 nm. Gradientenelution: 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser gegen Acetonitril, 0 bis 60 % in

45 Minuten. Das Peptid Cardiodilatin tritt bei 45% Acetonitril aus der HPLC-Säule aus und zeigt eine Retentionszeit von 24,1 Minuten.

Fig. 1 zeigt eine graphische Darstellung dieser HPLC.

Die erhaltene aktive Fraktion wurde danach nochmals zweimal der gleichen HPLC unterworfen.

Der isoelektrische Punkt I.P. wurde mit 6 bis 6,5 be¬ stimmt.

Das Peptid zeigt in der Aminosäureanalyse folgende

Zusammensetzung:

Asp/Asn 14, Thr 3, Ser 15, Glu/Gln 12, Pro 10, Gly 12,

Ala 10, Val 7, Met 4, Ile 1, Leu 15, Tyr 2, Phe 3, Lys

4, His 2, Arg 10, Trp 2.

Die Aminosäuresequenz wurde vom N-Terminus her durch automatisierten Edman-Abbau wie folgt bestimmt: Asn-Pro-Val-Tyr-Gly-Ser-Val-Ser-Asn-Ala-Asp-Leu-Ket- Asp-Phe-Lys-Asn-Leu-Leu-Asp-His-Leu-Glu-Asp-Lys-Met- Pro-Leu-Glu-Asp-Glu-Ala-Met-Pro-Pro-Gln-Val-Leu-Ser- Glu-Gln-Asp-Glu-Val-Leu-Ser-Glu-Gln-Asn-Glu-Glu-Val- Gly-Ala-Pro-Leu-Pro-Leu-Leu-Glu-Glu-Val-Pro-Pro-Trp- Thr-Gly-Glu-Val-Asn-Pro:

(die gesamte Sequenz umfaßt nach der Sequenzanalyse 126 Aminosäurereste) .

Das Molekulargewicht errechnet sich aufgrund der Aminosäurezusammensetzung mit etwa 13 000 Dalton.

Für die verschiedenen Stufen des Reinigungsverfahrens wurden biologische Tests nach den untenstehenden Bio¬ assays durchgeführt, wobei sich mit fortschreitendem Grad der Reinigung ein Ansteigen der spezifischen Akti¬ vität zeigte.

Durchführung der Bioassays:

Es wurden Bioassays an glatter Gefäßmuskulatur durchge¬ führt, bei der die Entspannung in einem Organbad unter Einwirkung der zu testenden Fraktionen bestimmt wurde.