Kartusche für ein rotationsbasiertes und einen einseitigen Wärmeeintrag nutzendes Analyseverfahren, rotationsbasiertes Analyseverfahren und Verwendung einer Kartusche

Die Erfindung betrifft eine Kartusche für ein rotationsbasiertes und einen einseitigen Wärmeeintrag nutzendes Analyseverfahren. Außerdem betriff die Erfindung ein rotationsbasiertes Analyseverfahren. Ferner betrifft die Erfindung eine Verwendung der erfindungsgemäßen Kartusche.

Rotationsbasierte Analyseverfahren werden im medizinischen Bereich unter Nutzung sogenannter Kartuschen, die eine insbesondere mikrofluidische Kanal- und Kammerstruktur aufweisen, angewendet. Meist kommen sie zum Einsatz, um Erbgut, meist in Form von DNA (Desoxyribonukleinsäure oder englisch: desoxyribonucleic acid) oder RNA (Ribonukleinsäure bzw. ribonucleic acid), - neben wissenschaftlichen Erbgutanalysen und dergleichen - zur Untersuchung auf vorliegende Krankheiten zu analysieren oder zum Nachweis von Krankheitserregern überhaupt zu detektieren. Dazu müssen ausgehend von einer Probe - z. B. einem Abstrich, einer Blutprobe oder dergleichen - spezifische Bereiche darin enthaltenen Erbguts (DNA oder RNA) vervielfältigt werden. Im Fall des Nachweises oder der Analyse von RNA in einer Probe (z. B. zum Nachweis eines Virus) wird diese zunächst durch die sogenannte „reverse transcription“ in DNA umgeschrieben und anschließend vervielfältigt.

Zur Vervielfältigung der DNA wird üblicherweise die sogenannte Polymerase- Kettenreaktion (kurz: PCR) in einem flüssigen Reaktionsansatz angewendet. Die DNA liegt typischerweise in Form einer Doppelhelix-Struktur, bestehend aus zwei komplementären DNA Einzelsträngen, vor. Bei der PCR wird die DNA zunächst durch eine erhöhte Temperatur des flüssigen Reaktionsansatzes zwischen typischerweise 90-96 Grad Celsius in zwei Einzelstränge aufgetrennt („Denaturierungs-Phase“).

Anschließend wird die Temperatur wieder gesenkt („Annealing-Phase“, typischerweise in einen Bereich von 50-70 °C), um eine spezifische Anlagerung von sogenannten Primer-Molekülen an die Einzelstränge zu ermöglichen. Die Primer- Moleküle sind komplementäre, kurze DNA-Stränge, die an einer definierten Stelle an den Einzelsträngen der DNA anbinden. Die Primer-Moleküle (auch kurz: „Primer“) dienen als Startpunkt für ein Enzym, der sogenannten Polymerase, das in der sogenannten Elongations-Phase die Grundbausteine („dNTPs“) komplementär zur vorliegenden DNA-Sequenz des Einzelstranges auffüllt. Dabei entsteht ausgehend von dem Primer Molekül wieder eine doppelsträngige DNA. Die Elongation wird typischerweise bei der gleichen Temperatur wie bei der Annealing-Phase oder bei einer leicht erhöhten Temperatur, typischerweise zwischen 65 und 75 °C, durchgeführt. Nach der Elongation wird die Temperatur wieder für die Denaturierungsphase erhöht.

Dieses Zyklieren der Temperatur im flüssigen Reaktionsansatz zwischen den zwei bis drei Temperaturbereichen wird „PCR-Thermocycling“ genannt und typischerweise in 30 und 50 Zyklen wiederholt. In jedem Zyklus wird der spezifische DNA- Bereich vervielfältigt. Typischerweise wird das Thermocycling des flüssigen Reaktionsansatzes in einem Reaktionsgefäß durch die Kontrolle der äußeren Temperatur umgesetzt. Das Reaktionsgefäß befindet sich dabei z. B. in einem Thermoblock, in dem das PCR-Thermocycling durch Heizen und Kühlen eines sich mit dem Reaktionsgefäß in thermischen Kontakt befindlichen Festkörper umgesetzt wird und dabei Wärme aus der Flüssigkeit zu- und abführen. Alternative Heiz- und Kühlkonzepte zur Umsetzung des PCR-Thermocyclings sind unter anderem die Temperaturkontrolle von Fluiden (insbesondere Luft und Wasser), welche das Reaktionsgefäß umströmen sowie strahlungsbasierte Konzepte, z. B. durch Einbringung von Wärme durch IR-Strahlung oder Laserstrahlung. Im Fall der rotationsbasierten Verfahren wird als Reaktionsgefäß bspw. eine Kammer in der vorstehend genannten Kartusche eingesetzt und entsprechend aufgeheizt. Zusätzlich wird die Kartusche, die meist etwa scheibenartig ausgebildet ist, rotiert.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein rotationsbasiertes Analyseverfahren weiter zu verbessern.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Kartusche mit den Merkmalen des Anspruchs 1 . Des Weiteren wird diese Aufgabe gelöst durch ein Analyseverfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 9. Außerdem wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Verwendung der Kartusche mit den Merkmalen des Anspruchs 11 . Vorteilhafte und teils für sich erfinderische Ausführungsformen und Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüche und der nachfolgenden Beschreibung dargelegt.

Die erfindungsgemäße Kartusche ist zur Verwendung in einem rotationsbasierten und einen einseitigen Wärmeeintrag nutzenden Analyseverfahren eingerichtet und vorgesehen. Dazu weist die Kartusche einen flächig, d. h. insbesondere im Wesentlichen zweidimensional, erstreckten Grundkörper auf, in dem eine mikrofluidische Kanal- und Kammerstruktur ausgebildet ist, wobei mehrere Prozesskammern mittels Kanälen untereinander verbunden sind. Insbesondere wird während des Analyseverfahrens eine zu analysierende Flüssigkeit zwischen mehreren dieser Prozesskammern durch jeweils wenigstens einen Kanal übertragen. Des Weiteren weist die Kartusche eine Anzahl von in dem Grundkörper ausgebildeten Positionier- und/oder Befestigungselementen zum Positionieren und/oder Befestigen des Grundkörpers an einer Trägerplatte eines Analysegeräts auf, das zur Durchführung des Analyseverfahrens eingerichtet und vorgesehen ist. Außerdem umfasst die Kartusche einen an dem Grundkörper befestigten Abdeckkörper, der einseitig auf einer einer Wärmeeintragsseite abgewandten Oberseite des Grundkörpers angeordnet ist und zumindest eine (Prozess-) Kammer der Kanal- und Kammerstruktur überdeckt.

Unter „im Wesentlichen zweidimensional“ wird hier und im Folgenden insbesondere verstanden, dass die Abmessungen in Ebenenrichtung der zwei Dimensionen um ein Vielfaches, vorzugweise mehr als das 5-fache, über gegebenenfalls vorhandenen (Dicken-) Variationen quer zu dieser Ebene liegen. Unter dem Begriff „mikrofluidisch“ oder „mikrofluidische Kanal- und Kammerstruktur“ wird hier und im Folgenden insbesondere verstanden, dass die Abmessungen der Strukturelemente, vorzugsweise zumindest der Kanäle, zumindest in eine Richtung - insbesondere in Tiefen- oder Breitenrichtung - zumindest zum Großteil im Bereich von 30 bis 700 Mikrometer liegen. Im Fall der Kanäle liegen die Abmessungen vorzugsweise in zwei Richtungen - nämlich in Tiefen- und Breitenrichtung - in dieser Größenordnung. Kammern können dabei zum Teil auch größere Abmessungen aufweisen.

Der Abdeckkörper verhindert bei dem rotationsbasierten und vor allem einen einseitigen Wärmeeintrag nutzenden Analyseverfahren einen vergleichsweise hohen Wärmeaustrag an der der Wärmeeintragsseite abgewandten (Ober-) Seite, insbesondere aufgrund von Konvektion. Dadurch kann wiederum die Temperaturverteilung innerhalb der Kammer vergleichsweise homogen gehalten werden, was wiederum für den innerhalb der Kammer stattfindenden Reaktionsablauf vorteilhaft ist. Des Weiteren ermöglicht die Rotation eine vergleichsweise schnelle Erwärmung der in der Kammer enthaltenen Flüssigkeit, da - insbesondere bei einseitigem Wärmeeintrag - die erwärmte Grenzschicht an der Wärmeeintragsseite der Kammer ständig durch sich bewegende Flüssigkeit „durchspült“ wird und somit das erwärmte Teilvolumen in die übrige Flüssigkeit eingemischt wird. Dadurch wird auch eine vergleichsweise schnelle Denaturierung von Erbgutsträngen begünstigt. Die vorstehend beschriebene Durchmischung ermöglicht abgesehen von der homogenen Temperaturverteilung auch sonst homogene Reaktionsbedingungen. Denn regelmäßig sind in spezifischen Kammern, in denen Reaktionen ablaufen sollen, Reaktionspartner, insbesondere spezifische Zuschlagstoffe - im Fall einer Polymerase-Kettenreaktion, englisch kurz: „PCR“, sogenannte „PCR-Primer“ - vorgelagert, deren Auflösung und Durchmischung somit begünstigt wird. Auch die während der Reaktion lokal gebildeten Produkte oder Zwischenprodukte können somit vorteilhafterweise mit den übrigen Reaktionspartnern homogen durchmischt werden. Außerdem ermöglicht eine besonders homogene Temperaturverteilung (insbesondere im Fall einer PCR) auch eine vergleichsweise spezifische (d. h. insbesondere genaue oder „korrekte“) Primer-Hybridisierung (auch als „primer annealing“ bezeichnet), vorteilhafterweise über die gesamte Kammer hinweg. Die Anlagerung der Primer an die „richtigen“ DNA-(Ziel-)Sequenzen ist erkanntermaßen temperaturabhängig, wobei die Anlagerung an die Zielsequenz spezifischer wird, je näher der vorliegende Temperaturwert an die Schmelztemperatur der Verbindung der DNA heranreicht. Schwanken also die Temperaturwerte innerhalb der Kammer stark, erfolgt regelmäßig in „kühleren“ Bereichen eine unspezifische Primer-Hybridisierung, wohingegen in wärmeren Bereichen der Kammer eine spezifischere Primer-Hybridisierung erfolgt.

In einer bevorzugten Ausführung handelt es sich bei der von dem Abdeckkörper überdeckten Kammer um eine Amplifikationskammer, insbesondere eine sogenannte Voramplifikationskammer, zur Vervielfältigung von Erbgut. In einer solchen Voramplifikationskammer wird in einer Probe enthaltenes Erbgut vervielfältigt, um in einem späteren Verfahrensschritt eine ausreichende Menge an Erbgut für unterschiedliche Testverfahren oder für eine statistisch hinreichend absicherbare Untersuchung auf einen Zweck hin zur Verfügung zu haben.

Die Kartusche ist dabei vorzugsweise derart gestaltet, dass die Kanal- und Kammerstruktur als abgeschlossenes System eine Mehrzahl von aufeinanderfolgenden und mittels Kanälen verbundenen Kammern aufweist, in denen das Material einer Probe behandelt, zur Untersuchung vorbereitet und auch untersucht wird. Dies hat den Vorteil, dass das zu untersuchende Material, bspw. Erbgut, nicht aus dem System entnommen werden braucht, was Verunreinigungen einbringen könnte.

Zur (Vor-) Amplifikation von Erbgut wird insbesondere eine Temperaturbehandlung, vorzugsweise gemäß dem eingangs beschriebenen PCR-Thermocycling, durchgeführt. Somit wird das Erbgut in der entsprechenden Kammer auf mehrere unterschiedliche Ziel-Temperaturwerte erwärmt und abgekühlt. Aufgrund der Rotation der Kartusche wird ein künstliches, radial zur Rotationsachse stehendes Schwerefeld innerhalb der Kammer erzeugt. Der einseitige Wärmeeintrag führt dabei zu einer innerhalb der Kammer rotierenden Strömung - von der erwärmten Kammerseite etwa senkrecht zur Radialrichtung in Richtung Oberseite des Grundkörpers, aufgrund der abkühlungsbedingten Dichtezunahme entlang der Oberseite (und somit in Richtung der „künstlichen Gravitation“) radial nach außen und dann wieder in Richtung auf die Wärmeeintragsseite. Die zusätzliche wirkende Corioliskraft führt außerdem zusätzlich zu einer senkrecht zu dieser wärmeeintragsbedingt rotierenden Strömung stehenden Kraftkomponente, was wiederum zu einer vorteilhaften Durchmischung innerhalb der Kammer und damit einer Homogenisierung der Temperatur sowie der vorstehend beschriebenen Reaktanzen (d. h. Probenmaterial, Reaktionspartner, (Zwischen-) Produkte etc.) führt. Dadurch, dass aufgrund des Abdeckkörpers oberseitig weniger Wärme ausgetragen oder abgeführt werden kann, führt dies zu einer weiteren Homogenisierung der Temperatur innerhalb der Kammer. Außerdem kann die Temperatur innerhalb der Kammer vergleichsweise stabil und genau (sowie aufgrund der Durchmischung vorteilhafterweise auch vergleichsweise schnell) mittels der Temperatur des Heizelements vorgegebenen oder geregelt werden. Dies ist wie vorstehend beschrieben insbesondere bei einer PCR, vorzugsweise während einer sogenannten Annealing- Phase (während der insbesondere die Primer-Hybridisierung erfolgt) vorteilhaft, da hierdurch eine möglichst einheitliche und spezifische Bindung der Primer ermöglicht wird.

In einer zweckmäßigen Ausführung deckt der Abdeckkörper die Oberseite des Grundkörpers zumindest näherungsweise (d. h. nahezu, bspw. mit einer Abweichung von maximal 10 Prozent) vollständig ab. Dadurch kann der vorstehend beschriebene Effekt auch in anderen Kammern zum Tragen kommen. In einer optionalen Variante weist der Abdeckkörper eine Aussparung oder ein transparentes Fenster auf, durch die bzw. das ein Auslesen von Testergebnissen aus einer oder mehreren „Auslesekammern“ ermöglicht wird. Optional ist in letzterem Fall die Aussparung mit einem transparenten Aufkleber überdeckt, dessen die Aussparung überspannende Fläche aber vorzugsweise frei von Klebstoff ist.

In einer vorteilhaften Ausführung weist der Abdeckkörper einen in Richtung auf die Oberseite des Grundkörpers vorstehenden und die überdeckte Kammer umrandenden Rahmensteg auf. Dadurch wird die Konvektion parallel zur Oberfläche des Grundkörpers, insbesondere also ein zwischen der Oberfläche des Grundkörpers und dem Abdeckkörper verlaufender Luftstrom zumindest über die zu überdeckende Kammer, vorzugsweise die vorstehend genannte (Vor-) Amplifikationskammer, hinweg unterbunden oder weitestgehend verringert. Dadurch lässt sich eine besonders hohe Homogenität der Temperatur (oder anders ausgedrückt eine besonders geringe Temperaturabweichung) innerhalb der Kammer (bei einem „quasistationären“ Zustand, insbesondere nach vergleichsweise langer Haltezeit der Prozessparameter, d. h. Heiztemperatur und Rotationsgeschwindigkeit, von bspw. 30 Sekunden aufwärts) erreichen. Insbesondere können Temperaturunterschiede unter 10 Kelvin, vorzugsweise unter 5, insbesondere um etwa 2 Kelvin) erreicht werden.

Vorzugsweise liegt der Rahmensteg im bestimmungsgemäßen Einsatzzustand auf dem Grundkörper auf. Alternativ ist der Rahmensteg (im bestimmungsgemäßen Einsatzzustand) mit geringfügigem Abstand, insbesondere von weniger als 0,5 Millimeter, vorzugsweise von etwa oder weniger als (d. h. also kleiner oder gleich) 0,1 Millimeter, zu dem Grundkörper angeordnet.

Insbesondere um die möglichen Temperaturänderungsraten für die überdeckte Kammer weiter zu erhöhen, ist deren Fläche vergleichsweise (insbesondere im Vergleich zu anderen Kammern und/oder Kanälen) groß gewählt. Bspw. weist die überdeckte Kammer eine Fläche von 2 x 5 mm ² bis zu 11 x 16 mm ² auf, bei einer „Tiefe“ von etwa 1 ,1 mm. Dadurch steht erkanntermaßen für den Wärmeeintrag eine - im Vergleich zu den üblichen Abmessungen der mikrofluidischen Kanalund Kammerstruktur - große Fläche zu Verfügung, so dass vergleichsweise große Temperaturänderungsraten möglich sind.

In einer zweckmäßigen Weiterbildung steht die überdeckte Kammer auf der Oberseite des Grundkörpers erhaben vor. D. h. diese Kammer bildet auf der Oberseite des Grundkörpers eine Auswölbung, insbesondere ein gestuftes (d. h. ein rechtwinklige oder zumindest näherungsweise rechtwinklige Seitenwände aufweisendes) Plateau. Die Kammer, insbesondere dieses Plateau, konkret dessen Seiten- wände (die insbesondere auch zumindest einen Teil der Seitenwände der Kammer bilden), überlappt dabei mit dem Rahmensteg.

In einer zweckmäßigen Variante ist der Rahmensteg aus dem gleichen Material und insbesondere einstückig (d. h. monolithisch) mit dem Abdeckkörper gefertigt. Alternativ, bspw. für den Fall, dass der Rahmensteg auf dem Grundkörper aufliegt und ein besonders wirksamer Luftabschluss des Volumens oberhalb der Amplifikationskammer (d. h. innerhalb des von der Grundkörper und dem Abdeckkörper mit Rahmensteg eingeschlossenen Raums) erreicht werden soll, ist der Rahmensteg aus einem nachgiebigen Material, bspw. einem thermoplastischen Elastomer gefertigt, bspw. in einem Zweikomponenten-Spritzgießverfahren.

Vorzugsweise ist der Abdeckkörper aus einem, insbesondere thermoplastischen, Kunststoff ausgebildet, sowie vorzugsweise in einem Spritzgießverfahren hergestellt. Dadurch lässt sich eine besonders wirtschaftliche Fertigung der Kartuschen erreichen.

Der Grundkörper der Kartusche ist dabei vorzugsweise aus einem insbesondere thermoplastischen Substrat, in das die Kanal- und Kammerstruktur eingeformt ist, und einer Siegelschicht, insbesondere einer Siegelfolie, die nach einem Siegelschritt fest mit dem Substrat verbunden ist und somit die Kanal- und Kammerstruktur verschließt, gebildet.

Das erfindungsgemäße rotationsbasierte Analyseverfahren nutzt die vorstehend beschriebene Kartusche. Diese wird zunächst an einer Trägerplatte, insbesondere einer Art Drehteller, eines Analysegeräts befestigt. Anschließend wird die Trägerplatte unter Mitnahme der Kartusche in Rotation versetzt. Mit anderen Worten wird die Kartusche rotiert, vorzugsweise in einer Ebene parallel zu ihrer Oberseite. In Abhängigkeit von einem jeweiligen Verfahrensschritt wird mittels einer Anzahl (vorzugsweise einer Mehrzahl) von an der Trägerplatte angeordneten Heizelementen einseitig (und vorzugsweise lokal begrenzt auf eine einzelne Kammer oder nur einen Teil der Kammern) Wärme in den Grundkörper der Kartusche eingebracht. Ferner wird in Abhängigkeit von dem jeweiligen Verfahrensschritt die Drehzahl der Rotation zwischen einem niedrigen Drehzahlbereich von bis zu 20 Hz, einem mittleren Drehzahlbereich zwischen 20 und 40 Hz und einem hohen Drehzahlbereich ab 40 Hz aufwärts variiert.

Mittels des Wärmeeintrags und/oder der unterschiedlichen Drehzahlen kann dabei gesteuert werden, wie in dem jeweiligen Verfahrensschritt Flüssigkeit mit Probenmaterial und/oder Analysestoffen durch das Kanal- und Kammersystem transportiert bzw. in der jeweiligen Kammer beeinflusst wird. Unter „Beeinflussen“ des Probenmaterials wird dabei hier und im Folgenden insbesondere eine unterschiedliche „Behandlung“, bspw. eine mechanische Bearbeitung oder ein Hervorrufen einer biochemischen Reaktion, eine Durchmischung oder auch ein Abmessen eine Flüssigkeitsmenge für nachfolgende Schritte verstanden.

Unter „Analysestoff“ wird hier und im Folgenden insbesondere ein Stoff (insbesondere Moleküle) verstanden, der eine Reaktion vorzugsweise der DNA oder RNA unterstützt, bspw. spezifische Enzyme, Aminosäuren, Proteine und dergleichen, oder der die der Reaktion nachgelagerte Analyse unterstützt, bspw. Moleküle, die zu einer spezifischen Lumineszenz oder Fluoreszenz bestimmter Reaktionsprodukte führen. Derartige Analysestoffe sind insbesondere bei mehreren vorhandenen Kammern zweckmäßigerweise in manchen dieser Kammern vorgelagert.

Bspw. handelt es sich bei den vorstehend genannten Zuschlagstoffen um solche Analysestoffe.

Da in dem Verfahren die vorstehend beschriebene Kartusche verwendet wird, weist das Verfahren auch alle Vorteile der Kartusche gleichermaßen auf.

In einer bevorzugten Verfahrensvariante wird in der von dem Abdeckkörper überdeckten Kammer, insbesondere also in der Amplifikationskammer eine PCR durchgeführt. Dazu werden mittels zyklischen Wärmeeintrags Flüssigkeitstemperaturen innerhalb der Kammer von 50 bis 75 Grad Celsius einerseits und 80 bis 100 Grad Celsius andererseits eingestellt. D. h. in einem ersten Zyklusschritt wird zunächst der eine Temperaturbereich und in dem anderen Zyklusschritt der entsprechend andere Temperaturbereich eingestellt. Vorzugsweise wird dabei eine mittlere bis hohe Drehzahl (d. h. wenigstens 20 Hz, vorzugsweise größer als 40 Hz) angewendet.

Gemäß der erfindungsgemäßen Verwendung wird die hier und im Folgenden näher beschriebene Kartusche in dem rotationsbasierten Analyseverfahren eingesetzt.

Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand einer Zeichnung näher erläutert. Darin zeigen:

Fig. 1 in einer schematischen Explosionsdarstellung eine Kartusche zur Verwendung in einem rotationsbasierten Analyseverfahren,

Fig. 2 in einer schematischen Draufsicht auf eine Wärmeeintragsseite einen Grundkörper der Kartusche,

Fig. 3, 4 in einer schematischen Draufsicht bzw. Seitenansicht eine Trägerplatte eines Analysegeräts, mit dem die Kartusche bestimmungsgemäß verwendet wird,

Fig. 5 in Ansicht gemäß Fig. 3 die Trägerplatte mit einer teilmonierten Kartusche,

Fig. 6 in Ansicht gemäß Fig. 4 die Trägerplatte mit der Kartusche im bestimmungsgemäßen Einsatzzustand,

Fig. 7 in einer schematischen Ansicht auf eine Unterseite einen Abdeckkörper der Kartusche,

Fig. 8-11 jeweils in Ansicht gemäß Fig. 2 den Grundkörper der Kartusche zur Veranschaulichung von Teilschritten des Analyseverfahrens,

Fig. 12 in einer schematischen Detailansicht eine ausschnitthaft dargestellte Kammer der Kartusche,

Fig. 13-15 in einer ausschnitthaften und schematischen Teilschnittansicht die Kammer der Kartusche, und

Fig. 16-19 jeweils in Ansicht gemäß Fig. 2 den Grundkörper der Kartusche zur Veranschaulichung von weiteren Teilschritten des Analyseverfahrens. Einander entsprechende Teile sind in allen Figuren stets mit gleichen Bezugszeichen versehen.

In Fig. 1 ist schematisch ein als „Kartusche“ - oder aufgrund der flachen, einer halbierten Kreisscheibe angenäherten Geometrie kurz auch als „Disk 1“ - bezeichneter Probenbehälter dargestellt. Diese Disk 1 dient zum Einsatz in einem rotationsbasierten Analyseverfahren, das im Folgenden näher beschrieben wird. Die Disk 1 weist einen Grundkörper 2 (auch als „Substrat“ bezeichnet) auf, der eine mikrofluidische Kanal- und Kammerstruktur 4 aufweist. Diese Kanal- und Kammerstruktur 4 weist wiederum mehrere im Folgenden näher beschriebene Kammern auf, die mittels jeweils zugeordneter Kanäle untereinander verbunden sind (vgl. Fig. 2). Im unmontierten Zustand bilden die Kammern und Kanäle jeweils „offenliegende“, becken- bzw. rinnenartige Vertiefungen in dem Grundkörper 2. Die Disk 1 weist daher auch eine Siegelfolie 6 (oder auch: „Siegelschicht“) auf, die auf den mikrofluidischen Grundkörper 2 heißgesiegelt wird und damit die Kanalund Kammerstruktur 4 von einer im Folgenden als „Wärmeeintragsseite 8“ bezeichneten Seite her verschließt. Der Grundkörper 2 weist einen seitlichen Zugang 10 zur Kanal- und Kammerstruktur 4 auf, durch den hindurch Probenmaterial in die Kanal- und Kammerstruktur 4 eingebracht werden kann. Dieser Zugang 10 ist reversibel mittels einer Kapsel 12 verschließbar, um die Einbringung des Probenmaterials und ein nachfolgendes Wiederverschließen zu ermöglichen. Die Disk 1 weist außerdem einen Abdeckkörper, im Folgenden kurz als „Cover 14“ bezeichnet, auf, der auf einer „Oberseite 16“ (oder auch „rückseitig“ zur Wärmeeintragsseite 8) auf den Grundkörper 2 aufgesetzt und im vorliegenden Ausführungsbeispiel mittels Rasthaken 18 (s. Fig. 7) in korrespondierenden Aussparungen 20 des Grundkörpers 2 an diesem fixiert wird. Das Cover 14 weist ein erstes und ein zweites Auslesefenster 22 bzw. 24 auf, durch die hindurch der Inhalt darunterliegender Kammern des Grundkörpers 2 abgelesen und damit analysiert (bspw. mittels Fluoreszenzdetektion) oder zumindest kontrolliert werden kann.

In einer optionalen (hier dargestellten) Variante weist die Disk 1 auch ein (hier zweiteiliges, vorzugsweise selbstklebendes) Label 26 auf, das auf das Cover 14 aufgebracht ist. Das Label 26 ist dabei so ausgestaltet, dass es das Auslesen durch die Auslesefenster 22 und 24 ermöglicht. In einer optionalen Weiterbildung dieser Variante weist das Label 26 transparente Bereiche auf, die die Auslesefenster 22 und 24 überdecken. Zweckmäßigerweise sind diese transparenten Bereiche nicht mit Klebstoff versehen - d. h. von Klebstoff ausgespart damit die Fluoreszenzdetektion nicht durch womöglich lumineszierenden Klebstoff beeinflusst wird.

Im Cover 14 sind seitlich Rücksprünge 28 in einer Seitenwand 30 eingeformt, die eine Ausrichtung und Positionierung der Disk 1 in einem automatischen Einzug eines Analysegeräts ermöglichen.

Der Grundkörper 2 weist mehrere (hier konkret zwei) Durchbrüche 32 auf, die zur eindeutigen Ausrichtung und Positionierung der Disk 1 auf einer Trägerplatte (im Folgenden als „Drehteller 34“ bezeichnet, s. Fig. 3 bis 5) des Analysegeräts dienen. In diese Durchbrüche 32 greifen zur Positionierung und Fixierung in einer Drehebene 36, die parallel zur Oberfläche des Drehtellers 34 und zur Wärmeeintragsseite 8 (und somit zur flächigen Erstreckung) der Disk 1 liegt, Positionsstifte 38 des Drehtellers 34 ein.

Der Drehteller 34 des Analysegeräts dient zur Zentrifugation, d. h. zur Rotation der Disk 1 um eine Rotationsachse 40 (s. Fig. 4). Der Drehteller 34 ist dabei dazu eingerichtet, optional zwei Disks 1 aufnehmen zu können und ist deshalb um 180 Grad drehsymmetrisch aufgebaut (s. Fig. 3). Außerdem trägt der Drehteller 34 mehrere Heizelemente 42, die zur lokalen Erwärmung einzelner Kammern der Kanal- und Kammerstruktur 4 der Disk 1 dienen und deshalb in ihrer Außenkontur den entsprechenden Kammern angepasst sind. Die Heizelemente 42 sind vorliegend durch Widerstandsheizplatten gebildet.

In einem alternativen Ausführungsbeispiel sind die Heizelemente 42 durch Peltier- elemente, die auch eine aktive Kühlung ermöglichen, gebildet. Einzelne Kammern, Kanäle und weitere Elemente der Disk 1 werden im Folgenden anhand des nachfolgend beschriebenen Verfahrensablaufs näher beschrieben.

Zur Durchführung des Analyseverfahrens wird zumindest eine Disk 1 , in die durch den Zugang 10 als Probenmaterialträger ein Tupfer 44 bis in eine Tupferkammer 46 der Kanal- und Kammerstruktur 4 eingeführt ist, wobei der Zugang 10 anschließend mittels der Kapsel 12 verschlossen wird, in das Analysegerät eingeführt und auf dem Drehteller 34 positioniert und abgelegt. Für den Fall, dass nur eine Disk 1 eingelegt wird, ist das Analysegerät dazu eingerichtet, den Drehteller 34 automatisch auszuwuchten (insbesondere indem Gegengewichte auf dem Drehteller 34 angeordnet werden). Zur Fixierung wird die Disk 1 mittels einer Vakuumpumpe an den Drehteller 34 angesaugt. Dazu dienen die Heizelemente 34 umlaufende Dichtkonturen 48. An diesen liegt die Disk 1 an und kann somit bereichsweise an den Drehteller 34 angesaugt werden. Dadurch wir zweckmäßigerweise ein enger Kontakt zwischen den Heizelementen 42 und den lokal zu erwärmenden Bereichen der Disk 1 ermöglicht.

Die Disk 1 enthält in einem initialen Zustand (d. h. ohne bereits eingebrachte Probe bzw. ohne Tupfer 44) vorgelagerte Zuschlag- oder Analysestoffe in Form von Flüssigreagenzien in verschlossenen Stickpacks 50 in einer ersten Stickpack- Kammer 52 und einer zweiten Stickpack-Kammer 54. Des Weiteren sind als Zuschlag- oder Analysestoffe auch sogenannte Primer in Voramplifikations-Kammern 56 vorgelagert. Weitere Primer und sogenannte Sonden (auch als „Gensonden“ bezeichnet, üblicherweise in Form von Poly- oder Oligonukleotiden) sind in mehreren Auslesekammern 58 vorgelagert. Diese Auslesekammern 58 sind durch das Auslesefenster 24 des Covers 14 einsehbar. Die Primerpaare in den Voramplifika- tions-Kammern 56 sind - je nach konkretem Ziel des Analyseverfahrens und/oder des spezifischen Ablaufs - identisch oder unterschiedlich. Bspw. sind die Primer in den Auslesekammern 58 zu den Primern in den Voramplifikations-Kammern 56 paarweise identisch oder bspw. für eine im Stand der Technik bekannte „nested PCR“ („verschachtelte“ oder „geschachtelte“ PCR) vorgesehen und somit unterschiedlich ausgeführt. In einer ersten, näherungsweise runden „Lyokammer 60“ und einer zweiten, ebenfalls näherungsweise runden Lyokammer 61 sind Lyophilisate vorgelagert, die bspw. Enzyme, Polymerase, dNTPs (desoxyNukleosidTriPhosphate), Salze und/oder weitere vorgelagerte Reagenzien (z. B. PCR-Additive, Nuklease Inhibitoren, Co-Faktoren der beteiligten Enzyme etc.) enthalten. Die Tupferkammer 46 enthält im vorliegenden Ausführungsbeispiel eine Lyse und Mittel zur Prozesskontrolle, z.B. Sporen, Pilze, Phagen oder künstlich hergestellte Targets. Eine mit der Tupferkammer 46 in Verbindung stehende Lysekammer 62 enthält ein Lysepellet sowie einen Magneten und ein Mahlmedium. Bei letzterem handelt es sich z.B. um Glas- und/oder Zirkoniapartikel. Diese Partikel sind optional mit EDTA beschichtet oder dieses ist zugegeben, um bei Blut als Probenmaterial die Gerinnung zu verhindern. Um Inhibitoren zu binden wird optional (Aktiv-)Kohle zugegeben. D. h. in einem solchen optionalen Fall ist (Aktiv-)Kohle ebenfalls vorgelagert.

Nach der Probennahme - alternativ zum Tupfer 44 (in steriler Form im medizinischen Bereich auch als „Swab“ bezeichnet) bspw. mittels einer Blutkapillare - wird mithin der Probenträger, hier also der Tupfer 44, in die Disk 1 , konkret in die Tupferkammer 46 eingeführt und der Zugang 10 mit der Kapsel 12 verschlossen. Die Kapsel 12 schließt dabei luftdicht ab, um den Austritt von gegebenenfalls in dem Probenmaterial enthaltenen Pathogenen zu vermeiden. In einem optionalen Ausführungsbeispiel weist die Disk 1 , konkret der Grundkörper 2 ein Entlüftungsloch 64 auf, dem ein Filter und ein Kondenswasserfang 66 (in Form einer vergleichsweise kleinen Kammer) vorgeschaltet ist. Letzterer ermöglicht eine Befeuchtung des Filters mit Kondenswasser. Das Entlüftungsloch 64 kann in einem alternativen Ausführungsbeispiel aber auch entfallen.

Nachdem die Disk 1 auf dem Drehteller 34 positioniert und fixiert ist, wird die Lyse des Probenmaterials gestartet, indem im Analysegerät angeordnete Magnete über die Disk 1 gefahren werden. Dadurch wird ein in Bezug auf ein Referenzsystem der Disk 1 veränderliches Magnetfeld erzeugt und der in der Lysekammer 62 angeordnete Magnet bewegt. Aufgrund der Bewegung des Magneten werden die in der Lysekammer 62 befindlichen Partikel des Mahlmediums aneinander gerieben, so dass Bakterien, Pilze, Viren, oder andere Analyten aufgeschlossen werden.

Diese mechanische Lyse wird in einem optionalen Verfahrensschritt durch Erwärmen der Lysekammer 62 mittels des entsprechende lokal zugeordneten Heizelements 42 thermisch unterstützt.

Währenddessen rotiert der Drehteller 34 und somit auch die Disk 1 , so dass vergleichsweise große Probenpartikel aufgrund der Zentrifugation absedimentiert werden. Dadurch wird sowohl eine biochemische Inhibitionstoleranz erhöht als auch das Risiko einer Verstopfung von mikrofluidischen Kanälen der Kanal- und Kammerstruktur 4 verringert.

Optional kann die Probe bereits in diesem Anfangsschritt mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder eines isothermalen Verfahrens (bspw. loop- mediated isothermal amplification, kurz: LAMP, oder Recombinase Polymerase Amplification, kurz: RPA) vervielfältigt werden. Denkbar ist auch eine unspezifische Amplifikation in diesem Anfangsschritt mittels sogenannter whole-genome amplification, z.B. basierend auf PCR oder MDA (multiple displacement amplification).

Allgemein wird aber zunächst durch die Bewegung des Magneten und der Partikel, optional unterstützt durch eine Konvektion basierend auf einem in der Lys- kammer 62 durch die optionale einseitige Erwärmung auftretenden Temperaturgradienten, das Probenmaterial homogenisiert. Sollte zusätzlich eine biochemische Reaktion in der Lysekammer 62 vorgesehen sein, werden dadurch auch gleichzeitig die Reaktionsbedingungen in der Lysekammer 62 homogen gehalten, d. h. insbesondere eine stabile Temperaturverteilung eingestellt und/oder eine hohe stoffliche Durchmischung erreicht. Dies ist besonders relevant für Proben mit sehr geringer Konzentration, oder die nur schwierig zu lysieren sind. Eine dabei ebenfalls mögliche Scherung von DNA oder RNA kann eine spätere Amplifikation unterstützen, da dadurch Sekundärstrukturen verringert werden. Aufgrund der mechanischen Einwirkung des bewegten Magneten und die dadurch auf das Pro- benmaterial aufgebrachten Kräfte können nämlich DNA- bzw. RNA-Stränge (zufällig) zerschnitten („geschert“) werden. Durch Dauer und Intensität der mechanischen Einwirkung (d. h. also der „mechanischen Lyse“), bspw. der Bewegungsgeschwindigkeit des Magneten, kann dabei gesteuert werden, wie stark die Scherung erfolgt. Dabei ist jedoch darauf zu achten, dass DNA und RNA nicht zu stark geschert werden, da sonst keine Amplifikation mehr möglich ist.

Zusätzlich werden in einem weiteren Verfahrensschritt die Stickpack-Kammern 52 und 54 lokal mittels der entsprechenden Heizelemente 42 auf etwa 90 °C aufgeheizt und anschließend (optional auch währenddessen) die Drehzahl des Drehtellers auf über 30 Hz, insbesondere in den Bereich von etwa 60 Hz erhöht. Bei dieser Zentrifugation mit mittlerer bis hoher Drehzahl werden die Stickpacks 50 aufgrund der Kombination von Erwärmung und Zentrifugalkraft innerhalb vergleichsweise kurzer Zeit von etwa 5 Sekunden geöffnet. Aufgrund der Erwärmung wird nämlich eine Aufreißnaht oder Peelnaht der aus einer sogenannten Peelfolie gebildeten Stickpacks 50 thermisch geschwächt.

Während einer Rotation mit mindestens 25 Hz, insbesondere mit den vorstehend beschriebenen mehr als 30, vorzugsweise etwa 60 Hz, baut sich aufgrund der Erwärmung der Stickpack-Kammern 52 und 54 ein Überdruck auf. Der Überdruck wird dabei durch die Ausdehnung des in der jeweiligen Stickpack-Kammer 52 bzw. 54 enthaltenen Gases (aufgrund des idealen Gasgesetzes) sowie einem von der Stickpack-Flüssigkeit und der Temperatur in der Stickpack-Kammer 52 bzw. 54 abhängigen Dampfdruck getrieben. Bei anschließender Verringerung der Drehzahl führt dieser Überdruck zu einer Verdrängung eines Großteils der Flüssigkeit (vorzugsweise von mehr als 90%) aus der Stickpack-Kammer 52 bzw. 54 durch die jeweils angebundenen Kanäle 68 zur Lysekammer 62 bzw. zur Lyokammer 61 . Diese Verdrängung findet selbst bei einer Zentrifugation bei 10 bis 30 Hz robust entgegen der Zentrifugalkräfte innerhalb der Disk 1 statt. Die aus der Stickpack- Kammer 54 verdrängte Flüssigkeit löst ein in der Lyokammer 61 befindliches Lyophilisat auf, das Teile der Reagenzien zur späteren Hauptamplifikation enthält.

Dieser Flüssigkeitstransfer in die Lysekammer 62 bzw. Lyokammer 61 erfolgt dabei vor oder während der vorstehend beschriebenen (mechanischen) Lyse in der Ly- sekammer 62, um hierbei bereits die Flüssigkeit des Stickpacks 50 der Stickpack- Kammer 52 nutzen zu können.

In Fig. 8 sind die geöffneten Stickpacks 50 sowie in der Stickpack-Kammer 54 schraffiert die aus dem Stickpack 50 ausgetretene Flüssigkeit dargestellt. Aus der Stickpack-Kammer 52 ist bereits ein Teil der Flüssigkeit in die Tupferkammer 46 und die Lysekammer 62 übergetreten. In Fig. 9 ist der Zustand der Stickpack- Kammern 52 und 54 nach Verdrängung der jeweiligen Flüssigkeit dargestellt.

In einem nachfolgenden Verfahrensschritt erfolgt der Transport der Flüssigkeit (des „Lysats“) aus der Lysekammer 62 in die nachfolgende (in Fig. 8 bis 11 rechts oberhalb der Lysekammer 62 dargestellte) Lyokammer 60, in der das Lysat das darin vorgelagerte Lyophilisat auflöst (s. Fig. 10). Dieses Lyophilisat kann optional neben den vorstehend genannten Amplifikationsreagenzien auch Nuklease- Inhibitoren zur Inaktivierung spezifischer Nukleasen sowie weitere Additive oder Co-Faktoren wie Dithiothreitol (DTT) enthalten. Der Transport des Lysats wird dabei - wiederum entgegen der Zentrifugalkraft der weiter erfolgenden Rotation der Disk 1 - durch eine Erwärmung der voraus angeordneten Stickpack-Kammer 52 und/oder der Lysekammer 62 und/oder einer Abkühlung der mit der Lyokammer 60 fluidtechnisch nachfolgend verbundenen Voramplifikations-Kammern 56, der (gegenüberliegenden) Stickpack-Kammer 54 und/oder der Auslesekammern 58 getrieben. Die Abkühlung der nachfolgenden Kammern bewirkt dabei einen Saugeffekt aufgrund eines Unterdrucks, die Erwärmung der vorausliegenden Kammer oder Kammern entsprechend umgekehrt aufgrund des Überdrucks ein Voranschieben der Flüssigkeit.

Die Lyokammer 60 ist mittels eines Überiaufkanals 70 an eine Überlaufkammer 72 angebunden. Beim Transport des Lysats aus der Lysekammer 62 in die Kammer 60 fließt überschüssiges Lysat durch den Überlaufkanal 70 in die Überlaufkammer 72. An die Überlaufkammer 72 sind Kontrollkammern 74 und 76 angeschlossen, die zur Überprüfung einer korrekten Befüllung der Disk 1 dienen. In die Überlaufkammer 72 abfließendes Lysat füllt von dort aus die Kontrollkammern 74 sowie die Kontrollkammern 76 (schematisch in Fig. 10 dargestellt). Die Füllung der Kontroll- kammern 74 und 76 dient dazu, eine korrekte Befüllung der Disk 1 zu überprüfen. Insbesondere wird die Füllung der in Fig. 10 rechts dargestellten Kontrollkammer 74, die grob gesehen eine quadratische Geometrie aufweist, konkret der dieser radial außenseitig angeschlossenen Kontrollkammer 76, dahingehend aufgefasst, dass keine Unterfüllung der Disk 1 vorliegt. Die Füllung der links auf die etwa quadratische Kontrollkammer 74 strömungstechnisch nachfolgenden, etwa dreieckigen (vgl. Fig. 10) Kontrollkammer 74, konkret der dieser radial außenseitig angeschlossenen Kontrollkammer 76, wird dagegen dahingehend aufgefasst, dass eine Überfüllung der Disk 1 vorliegt. Das gesamte hier vorhandene Flüssigkeitsvolumen setzt sich aus dem Volumen des eingebrachten Probenmaterials, üblicherweise etwa 105 bis 170 Mikroliter, und des Stickpacks 50 der Stickpack- Kammer 52, etwa 140 bis 160 Mikroliter, zusammen. Die Füllung der entsprechenden Kontrollkammern 74 und 76 kann dabei durch einen Fluoreszenzdetektor durch das Auslesefenster 22 des Covers 14 zu einem spezifischen Zeitpunkt (bspw. zum Ende des gesamten Analyseverfahrens) oder auch während der Füllung der Lyokammer 60 kontinuierlich überwacht werden. Dadurch kann der Zeitpunkt, zu dem sich die Kontrollkammern 74 und 76, und somit auch Lyokammer 60, gefüllt haben, bestimmt werden. Dies ermöglicht wiederum, auf mögliche Fehlerquellen zurückzuschließen. In einem optionalen Ausführungsbeispiel ist in die Kontrollkammern 74 und/oder 76 ein eingetrockneter Fluoreszenzfarbstoff eingelagert, um ein stärkeres Signal zu erhalten.

In einem weiteren Verfahrensschritt wird anschließend mittels einer hohen Drehzahl von 40-60 Hz Flüssigkeit von der Lyokammer 60 durch einen Transferkanal 78 in die Voramplifikations-Kammern 56 transferiert. Sobald der Flüssigkeitsstand in den Voramplifikations-Kammern 56 eine Einmündung eines jeweiligen Auslasskanals 80 übersteigt, wird das eingeschlossene Luftvolumen im (radial nach innen weisenden) „Kopfraum“ der Voramplifikations-Kammern 56 und in jeweils einer über einen zugeordneten Kanal 82 nachgelagerten Kammer 84 komprimiert (s. Fig. 11 ).

Unter hoher Zentrifugation mit Drehzahlen von 40-80 Hz findet im darauffolgenden Verfahrensschritt eine Voramplifikation in den Voramplifikations-Kammern 56 statt. Der Überdruck in den Voramplifikations-Kammern 56 und den Kammern 84 bleibt aufgrund der hohen Zentrifugation während der Voramplifikation erhalten. Zunächst werden in den Voramplifikations-Kammern 56 vorgelagerte Primer, z.B. gespottet mit Trehalose, aufgelöst. Für den Fall, dass RNA detektiert werden soll, kann optional zunächst eine reverse Transkription für 30 Sekunden bis 10 oder bis 30 Minuten bei konstanten 35-70 °C durchgeführt werden, um vorhandene RNA in DNA umzuschreiben. Die Voramplifikation mittels PCR findet aber durch lokales und zyklisches Aufheizen und Abkühlen der Flüssigkeit in den Voramplifikations- Kammern 56 zwischen den Bereichen 50-75 °C und 80-100 °C statt. Die Voramplifikation umfasst 5-30 Voramplifikationszyklen. Jeder Zyklus umfasst dabei die Erwärmung auf 80-100 °C und die anschließende Abkühlung auf 50-75 °C.

Die (Voramplifikations-) Reaktion innerhalb der Voramplifikations-Kammern 56 wird durch eine hohe Konvektion unterstützt. Diese wird durch den einseitigen Wärmeeintrag in die Disk 1 , konkret in die Voramplifikations-Kammern 56 von der Wärmeeintragsseite 8 her sowie die gleichzeitig erfolgende Rotation hervorgerufen. Wie aus den Fig. 12 und 13 zu entnehmen ist, wird zunächst die Flüssigkeit in der Voramplifikations-Kammer 56 an der mittels eines Heizelements 42 geheizten Wärmeeintragsseite 8 aufgeheizt und bildet mithin eine erwärmte Grenzschicht. Dabei verringert sich die Dichte der Grenzschicht relativ zum Rest des Flüssigkeitsvolumens. Die erwärmte Flüssigkeit der Grenzschicht steigt im künstlichen, durch die Rotation der Disk 1 hervorgerufenen Schwerefeld, das in Radialrichtung R ausgerichtet ist, zunächst gegen die Radialrichtung R nach „innen“ und anschließend quer zur Radialrichtung R zur Oberseite 16 hin auf. Dort kühlt die Flüssigkeit ab und sinkt „schwerkraftbedingt“ an der Oberseite 16 entlang in Radialrichtung R nach außen und anschließend wieder zur Wärmeeintragsseite 8 hin ab (s. Fig. 13). Es kommt durch den Wärmeeintrag also zu einer Konvektion und Strömung entlang der Radialrichtung R. Die Temperatur- und Dichteverteilung ist in Fig. 12 (in Draufsicht von der Oberseite 16 her) und Fig. 13 grob schematisch durch die unterschiedlich schraffierten Bereiche angedeutet. Des Weiteren bildet sich durch die ebenfalls auftretenden Corioliskräfte eine tangentiale (d. h. senkrecht zur Radialrichtung R in Ebenenrichtung der Disk 1 stehende) Flusskomponente aus, welche die Durchmischung der Flüssigkeit zusätzlich unterstützt. Da die Konvektion durch das künstliche Schwerefeld bedingt ist, wird sie durch schnellere Rotation der Disk 1 erhöht. Die bei hohen Drehzahlen auftretende Konvektion führt so zu einer besonders effektiven Durchmischung der Reaktionskomponenten innerhalb der Voramplifikations-Kammern 56, was wiederum effiziente Amplifikationsbedingungen ermöglicht.

Ein Nebeneffekt ist allerdings, dass bei sehr hohem Wärmeaustrag auf der nicht geheizten Oberseite 16 der Disk 1 sich ein hoher Temperaturgradient von bspw.

10 °C (oder Kelvin) innerhalb des Flüssigkeitsvolumens der Voramplifikations- Kammer 56 ausbilden kann, was nachteilig sein kann. Im in Fig. 13 dargestellten Ausführungsbeispiel (bei dem das Cover 14 nicht vorhanden ist) führt eine Erwärmung mit auf 97 °C geregeltem Heizelement 42 zu einem Temperaturwert von 95 °C im linken unteren Bereich der Voramplifikations-Kammer 56 (schräg nach rechts oben schraffiert) und einem Temperaturwert von 85 °C im rechten oberen Bereich der Voramplifikations-Kammer 56.

Ein derart hoher Temperaturgradient wird im in Fig. 14 dargestellten Ausführungsbeispiel durch das Cover 14, das eine Luftabschirmung bewirkt, verringert. Bei gleichem Wärmeeintrag kann so ein Temperaturwert im linken unteren Bereich und rechten oberen Bereich von 95 bzw. 91 °C und somit eine Differenz von 4 Kelvin erreicht werden.

Zur weiteren Verringerung des Wärmeaustrags weist das Cover 14 in einem weiteren Ausführungsbeispiel einen Rahmensteg 86 auf, der die Voramplifikations- Kammern 56 ringartig umschließt und somit den Wärmeaustrag durch Konvektion auf der Oberseite 16 weiter verringert (s. Fig. 1 , 7 und 15). Der Rahmensteg 86 ist an das Cover 14 angeformt, d. h. einstückig mit diesem verbunden. Der Rahmensteg 86 steht dabei in Richtung auf den Grundkörper 2 vor und endet mit geringem Abstand von etwa 100 pm zu dem Grundkörper. Dabei umschließt der Rahmensteg 86 die Voramplifikations-Kammern 56, die plateauartig auf der Oberseite 16 erhaben sind, auch an deren Seiten. Durch diese weitergeführte Abschirmung der Voramplifikations-Kammern 56 durch das Cover 14 und den Rahmensteg 86 wird eine Temperaturdifferenz von etwa 2 Kelvin innerhalb der jeweili- gen Voramplifikations-Kammer 56, d. h. zwischen den beiden in Fig. 15 unterschiedlich schraffierten Bereichen, ermöglicht. Somit erfolgt zwar eine vergleichsweise starke Konvektion in der jeweiligen Voramplifikations-Kammer 56, unter anderem aufgrund der Rotation. Zusätzlich wird aber auch eine vergleichsweise hohe Homogenität der Reaktionstemperatur innerhalb der Voramplifikations-Kammer 56 - zumindest im statischen Fall, d. h. bei einem Halten der Temperatur des Heizelements 42 für wenigstens etwa 10 bis 30 Sekunden erreicht. Erfahrungswerte haben bei der hier und im Folgenden beschriebenen Geometrie und den dabei angewendeten Parametern gezeigt, dass sich bereits ab etwa 15 Sekunden statische Bedingungen ergeben.

Auch für den Fall, dass in den Voramplifikations-Kammern 56 eine Reaktion erfolgt, die eine Interaktion, bspw. eine Bindung von Molekülen an eine Festphase, z.B. an Mikroarrays, erfordert, oder eine Reaktion, bei der die Konzentration der jeweiligen Reaktionspartner üblicherweise gering ist und deshalb ein Kontakt der jeweiligen Reaktionspartner untereinander einer vergleichsweise geringen Wahrscheinlichkeit unterliegt, kann die hohe Konvektion (und somit vergleichsweise starke Durchmischung) sowie die homogene Temperaturverteilung vorteilhaft sein.

Nach Abschluss der Voramplifikation wird die Drehzahl auf etwa 5 bis 20 Hz, konkret auf etwa 10 Hz, verringert. Dadurch kann das komprimierte Luftvolumen im Kopfraum der Voramplifikations-Kammern 56 und in den Kammern 84 expandieren. Dies führt wiederum zu einem Absenken der Flüssigkeitsspiegel innerhalb der Voramplifikations-Kammern 56, indem Flüssigkeit, die radial innerhalb der Einmündung der Auslasskanäle 80 steht, zumindest zum Großteil durch die expandierende Luft durch die Auslasskanäle 80 in eine weitere Kammer 88 verdrängt wird. Dies wird dadurch ermöglicht, dass die Auslasskanäle 80 einen geringeren Fluidwiderstand, konkret einen größeren Kanalquerschnitt, aufweisen als der in die Voramplifikations-Kammern 56 führende Transfer-Kanal 78.

Die Disk 1 weist dabei Entlüftungskanäle 90 auf, die unter anderem mit der Kammer 88 in Verbindung stehen und eine interne Entlüftung der Disk 1 in andere Kammern hinein ermöglichen. Somit kann Luft, die durch in die Kammer 88 ein- strömende Flüssigkeit komprimiert werden würde, über die Entlüftungskanäle 90 in Richtung der Lyokammer 60 entweichen.

In einem nachfolgenden Verfahrensschritt wird die Drehzahl der Disk 1 (bzw. des Drehtellers 34) auf einen Wertebereich von 10-20 Hz, vorzugsweise auf etwa 15 Hz, eingestellt, konkret erhöht. Die Flüssigkeit aus der Kammer 88 fließt dadurch über einen Siphon 92 in eine Messkammer 94, die radial außenliegend drei „Messfinger“ oder Kammerfortsätze unterschiedlichen Volumens aufweist. Diese Messfinger werden dabei nacheinander befüllt, so dass aufgrund des vorgegebenen (Messfinger-) Volumens eine Abmessung einzelner Teilvolumina erfolgt (s. Fig. 16). Der Durchfluss der Flüssigkeit durch die radial außenseitig an die Messfinger anschließenden Kanäle 96 ist dabei durch hohe fluidische Widerstände dieser Kanäle 96 limitiert, konkret indem deren Kanaldimension in mindestens eine Raumrichtung, konkret in einer Querschnittsrichtung, kleiner als 200 pm ist. Das Teilvolumen, das im folgenden Schritt jeweils durch die Kanäle 96 fließt, wird also im Wesentlichen durch das Volumen des jeweiligen vorgeschalteten Messfingers vorgegeben. Überschüssiges Flüssigkeitsvolumen fließt zu einem Überlauf 98.

Im nächsten Verfahrensschritt (s. Fig. 17) werden durch Erhöhung der Zentrifugation, also der Drehzahl, auf einen Bereich zwischen 30 und 80 Hz, konkret auf etwa 60 Hz, die abgemessenen Teilvolumina der Flüssigkeit in die jeweils nachfolgenden Kammern, d. h. in die in Fig. 17 links der Tupferkammer 46 dargestellte Lyokammer 61 und in eine weitere Kammer 100 getrieben.

In dieser Lyokammer 61 befindet sich nun ein „Hauptamplifikationspuffer“, welcher ursprünglich im in der Stickpack-Kammer 54 angeordneten Stickpack 50 vorgelagert war, ein in dieser Flüssigkeit mittlerweile aufgelöstes Lyophilisat, welches in der Lyokammer 61 vorgelagert war und das in der Flüssigkeit aus den Voramplifi- kations-Kammern 56 enthaltene „Preamplifikat“ welches über den Kanal 96 zugeführt wurde.

In einem nachfolgenden Verfahrensschritt wird die Disk 1 unter vergleichsweise schnellen Richtungswechseln, jeweils mit einer Änderungsrate von 5 bis 40 Hz/s, vorzugweise um 30 Hz/s, zwischen Endwerten von -20 bis 40 und +20 bis 40 Hz rotiert. Die Vorzeichen deuten in diesem Fall die unterschiedlichen Rotationsrichtungen an. Die in der Lyokammer 61 befindlichen Komponenten werden durch die bei den Richtungswechseln auftretenden Beschleunigungen und dadurch im rotierenden System erzeugten Euler- und Corioliskräfte gemischt.

Parallel hierzu werden die Auslesekammern 58, diesen vorgelagerte Messkammern 102 und eine Überlaufkammer 104 mittels des entsprechend zugeordneten Heizelements 42 aufgeheizt. Die dadurch expandierende Luft kann über einen Ausgleichskanal 106 in die Kammer 100 entweichen. Zum Abschluss des Mischvorgangs werden die Richtungswechsel beendet und wieder eine konstante Drehzahl von etwa 20 Hz eingestellt. Anschließend werden die Auslesekammern 58, die Messkammern 102 und die Überlaufkammer 104 wieder abgekühlt. Dadurch entsteht ein relativer Unterdrück in den entsprechenden Kammern 58, 102 und 104 und der Füllstand in einem an die Lyokammer 61 nachfolgend angeschlossenen Siphonkanal 108 und dem an die Kammer 100 angeschlossenen Ausgleichskanal 104 steigt in Abhängigkeit von einem Verhältnis von Zentrifugaldruck und Luftdruckunterschied an. Sobald die Flüssigkeit den Scheitelpunkt 110 des Siphonkanals 108 übersteigt, wird die komplette Flüssigkeit aus der Lyokammer 61 in die nachfolgenden Messkammern 102 getrieben (s. Fig. 18). Ein Entlüftungskanal 112 zwischen der Lyokammer 61 und der Kammer 100 ermöglicht dabei einen Luftaustausch zwischen diesen beiden Kammern 61 und 100.

Die Flüssigkeit fließt dabei nacheinander in die einzelnen Messkammern 102 und wird dadurch abgemessen. Des Weiteren wird die Flüssigkeit in den Messkammern 102 zunächst durch jeweils ein zentrifugo-pneumatisches Ventil in Form jeweils eines Ventilkanals 114 zurückgehalten. Überschüssige Flüssigkeit fließt in die Überlaufkammer 104 ab. Die zentrifugo-pneumatischen Ventile basieren darauf, dass die Flüssigkeit durch den Gegendruck in der jeweils nachfolgenden Auslesekammer 58 im jeweiligen Ventilkanal 114 zurückgehalten wird und bei einer Drehzahl im mittleren Drehzahlbereich, hier konkret von etwa 15-25 Hz nicht in die nachfolgenden Auslesekammern 58 fließen kann. In einem nachfolgenden Verfahrensschritt wird die Drehzahl soweit erhöht, typischerweise auf über 40 Hz, dass die (Flüssigkeits-) Menisken in den jeweiligen Ventilkanälen 114 aufgrund der sogenannten „Rayleigh Taylor Instabilität“ instabil werden und somit die Flüssigkeit zumindest größtenteils in die entsprechende Auslesekammer 58 übertragen wird (s. Fig. 19).

In einem weiteren Verfahrensschritt finden in den Auslesekammern 58 nun die Hauptamplifikationen statt. Dazu werden die jeweils in den Auslesekammern 58 vorgelagerten Primer und Sonden aufgelöst. Unterstützt wird das Auflösen der Primer und Sonden und die anschließende Amplifikation dabei durch eine hohe Konvektion innerhalb der Auslesekammern 58, die wie vorstehend anhand von Fig. 12 und 13 beschrieben hervorgerufen wird. Die Reaktion wird nach jedem Zyklus bei etwa 60 °C in allen Auslesekammern 58 mittels eines Fluoreszenzdetektors ausgelesen. Dieser detektiert die Fluoreszenz in verschiedenen Wellenlängen. Das Auslesen erfolgt dabei durch das Auslesefenster 24 im Cover 14. Der Vorgang entspricht somit einer sogenannten „Real-Time PCR“. Dabei kann in jeder der zwölf Auslesekammern 58 eine Multiplex-Reaktion ablaufen, z.B. 3-plex bis 10-plex. Ein entsprechender Signalanstieg des Fluoreszenzdetektors zeigt dabei ein detektiertes Target an.

Um die optische Auswertung mittels des Fluoreszenzdetektors nicht oder möglichst gering zu beeinflussen, weisen die Auslesekammern 58 radial innenseitig, außerhalb des mittels des Fluoreszenzdetektors betrachteten Bereichs, eine nicht näher dargestellte Vertiefung auf, die dazu dient, Luftblasen „aufzufangen“ und aus dem betrachteten Bereich zurückzuhalten. Eine in dieser Vertiefung angeordnete Luftblase müsste vergleichsweise stark deformiert werden, um in den betrachteten Bereich einzutreten. Hier wirkt vorteilhafterweise die Blasengrenzfläche, insbesondere beeinflusst durch die vorliegenden Oberflächenspannungsverhältnisse, entgegen.

Weiter optional ist auch das die Auslesekammern 58 überdeckende Auslesefenster 24, das in diesem Fall transparent verschlossen ist, mit einem Rahmensteg (vgl. Fig. 1 ) vergleichbar zum Rahmensteg 86 umrandet, so dass auch hier der Wärmeaustrag aus den Auslesekammer 58 verringert werden kann.

Alternativ zur Fluoreszenzdetektion kann die Auswertung auch über eine sogenannte Schmelzkurvenanalyse erfolgen, beispielsweise einer „high-resolution melt curve analysis“ oder einer „rapid melt curve analysis“. Dies würde ein noch deutlich höheres Multiplexing erlauben. In einem optionalen Ausführungsbeispiel wird in den Auslesekammern 58 eine „real-time PCR“ auf Basis von sogenannten inter- kalierenden Farbstoffen (z. B. unter der Marke oder dem Namen „EvaGreen“, „SYBR Green“, „BoxTo“ bekannte Farbstoffe) durchgeführt, wobei die entstehenden PCR Produkte nach Amplifikation über Schmelzkurven detektiert werden. Hierbei können pro Kammer bis zu 20 PCR Produkte detektiert und unterschieden werden (20 plex).

Der Gegenstand der Erfindung ist nicht auf die vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele beschränkt. Vielmehr können weitere Ausführungsformen der Erfindung von dem Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung abgeleitet werden. Insbesondere können die anhand der verschiedenen Ausführungsbeispiele beschriebenen Einzelmerkmale der Erfindung und deren Ausgestaltungsvananten auch in anderer Weise miteinander kombiniert werden.

Bezugszeichenliste

1 Disk

2 Grundkörper

4 Kanal- und Kammerstruktur

6 Siegelfolie

8 Wärmeeintragsseite

10 Zugang

12 Kapsel

14 Cover

16 Oberseite

18 Rasthaken

20 Aussparung

22 Auslesefenster

24 Auslesefenster

26 Label

28 Rücksprung

30 Seitenwand

32 Durchbruch

34 Drehteller

36 Drehebene

38 Positionsstift

40 Rotationsachse

42 Heizelement

44 Tupfer

46 Tupferkammer

48 Dichtkontur

50 Stickpack

52 Stickpack-Kammer

54 Stickpack-Kammer

56 Voramplifikations-Kammer

58 Auslesekammer

60 Lyokammer 1 Lyokammer 2 Lysekammer 4 Entlüftungsloch 6 Kondenswasserfang 8 Kanal 0 Überlaufkanal 2 Überlaufkammer 4 Kontrollkammer 6 Kontrollkammer 8 Transferkanal 0 Auslasskanal 2 Kanal 4 Kammer 6 Rahmensteg 8 Kammer 0 Entlüftungskanal 2 Siphon 4 Messkammer 6 Kanal 8 Überlauf

100 Kammer

102 Messkammer

104 Überlaufkammer

106 Ausgleichskanal

108 Siphonkanal

110 Scheitelpunkt

112 Entlüftungskanal

114 Ventilkammer

R Radialrichtung