Kationische Polymere mit D-Fructose-Substituenten

Die Erfindung betrifft neue kationische Polymere, die mit D-Fructose-konjugiert sind, wodurch sie selektiv mit spezifischen Strukturelementen an Zelloberflächen wechselwirken können.

Bekannte kationische Polymere, wie Poly(ethylenimin) (PEI) oder Poly(L-Lysin) (PLL), weisen wesentliche Nachteile auf (H. Lv et al. (2006): "Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery" Journal of Controlled Release 114: 100-109):

- allgemeine und unspezifische Zytotoxizität gegenüber Zellen, - Auslösen von Aggregation und Hämolyse von Blutzellen.

Kationische Polymere weisen aufgrund ihrer hohen Dichte an positiven Ladungen die Fähigkeit auf, negativ geladenes, genetisches Material, wie beispielsweise siRNA (small interfering ribonucleic acid) oder pDNA (plasmid desoxyribonucleic acid), zu komplexieren. Die so entstehenden Addukte zwischen kationischen Polymeren und genetischem Material werden Polyplexe genannt, mit deren Hilfe der Transport von genetischem Material (z.B. siRNA) in Zellen erreicht werden kann.

Kationische Polymere konnten bereits erfolgreich als Zusatzstoff bei Zuckertensiden zur Verbesserung der sensorischen Eigenschaften und des Schaumgefühls bei kosmetischen Anwendungen eingesetzt werden (Patentanmeldung: Verwendung von kationischen Biopolymeren zur Verbesserung der sensorischen Eigenschaften zuckertensidhaltiger Zubereitungen, DE19605355A1, Joerg Kahre, Rolf Wächter).

Weiterhin können kationische Polymere mit kleinen Proteinsequenzen (z.B.: RGD Peptide) funktionalisiert und damit die Selektivität beeinflusst werden (C. L. Waite et al. (2009): "PAMAM-RGD Conjugates Enhance siRNA Delivery Through a Multicellular Spheroid Model of Malignant Glioma" Bioconjugate Chemistry: 20: 1908-1916). Der genaue Mechanismus ist hierbei unklar und das Vorhandensein von Integrin (Transportmembranprotein in tierischen Zellen) ist notwendig.

Eine kovalente Verknüpfung von kationischen Polymeren mit Zuckern ist ebenfalls bekannt geworden. Poly(propylenimin)-Polymere konnten mit D-Mannose funktionalisiert und deren Eigenschaften im erfolgreichen Einsatz gegen HIV untersucht werden. Dabei dient dieser Ansatz ausschließlich für das gezielte Ansteuern von Immunzellen, sogenannten Makrophagen, mit Lectin-Rezeptoren. (T. Dutta et. al (2007): "Targeting potential and anti-HIV activity of lamivudine loaded mannosylated poly (propyleneimine) dendrimer" Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects: 1770, 681-686).

Die Synthese von D-Galactose-konjugierten Poly(ethylenglycol)-poly(ethylenimin)- Copolymeren für die Transfektion genetischen Materials in Hepatozyten wurde beschrieben. Dieser Ansatz ist nur für Leberzellen mit ASGP-Rezeptoren geeignet (Patentanmeldung: Cellular targeting poly(ethylene glycol)-grafted polymeric gene carrier, WO2003008555A2, Kazyyoshi Sagara; Publikation: K. Sagara et al. (2002). "A new synthesis of galactose-poly(ethylene glycol)-polyethylenimine for gene delivery to hepatocytes" Journal of Controlled Release 79(1-3): 271-281).

Lactose und α-Cyclodextrin wurden an ein kationisches, sternförmiges Poly(amidoamine) (PAMAM) Dendrimer gekoppelt zur Behandlung von familiärer, amyloidotischer Polyneuropathie. Dabei zielt der Ansatz lediglich auf die Transthyretin-Genexpression in Hepatozyten ab (Y. Hayashi et. al (2012): "Potential Use of Lactosylated Dendrimer (G3)/a-Cyclodextrin Conjugates as Hepatocyte-Specific siRNA Carriers for the Treatment of Familial Amyloidotic Polyneuropathy" Molecular Pharmaceutics: 9, 1645-1653).

Kationische Liposome wurden mit D-Fucose modifiziert und auf ihren Einfluss auf Adenovirus-induzierte Immunantworten untersucht. Dieser Ansatz dient ausschließlich der gezielten Lieferung des spezifischen Transkriptionsfaktors NF-κΒ ZU Milz- und Lebermakrophagen. (H. Huang et al. (2009): "Suppressive effects of sugar-modified cationic liposome/NF-κΒ decoy complexes on adenovirus vector-induced innate immune responses" Journal of Controlled Release: 133, 139-145). Acrylat- bzw. Methacrylat-basierte kationische Polymere mit glykosidisch gebundenen Sacchariden wurden beschrieben. Dabei beschreibt der Ansatz lediglich die chemische Zusammensetzung solcher Polymere und erwähnt in keinerlei Hinsicht eine mögliche biologische Anwendung. Mit den dort beschriebenen, glykosidisch gebundenen Zucker- Resten kann eine Wechselwirkung mit Zucker-Transportern in Zellmembranen auch nicht erreicht werden (Patentanmeldung: Novel Glycopolymers, Uses Thereof, and Monomers Useful for Preparation Thereof, US20080281064A1 , Stephanie Chiron, Marie-Pierre LaBeau, Etienne Fleury, David Viet, Sylvain Cottaz, Hugues Driguez, Sami Haiila).

Nucleinsäuren und deren Polyplexe mit kationischen Polymeren wurden beschrieben. Bei diesem Ansatz waren Zucker-Moleküle bei der Polypl ex-Bildung in Lösung anwesend, sind jedoch nicht kovalent am kationischen Polymer gebunden. Damit erfüllen sie keine direkten Targeting-Funktionen. (Patentanmeldung: Nucleic acid-cationic polymer compositions and methods of making and using the same, WO2016178233A1 , Abraham Hochberg, Jennifer Gallula). Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neuartige, biokompatible, einfach herstellbare, D-Fructose-konjugierte kationische Polymere zu schaffen, die eine erhöhte Selektivität gegenüber bestimmten Zellarten aufweisen.

Dabei bezieht sich der Begriff Selektivität zum einen auf die Wechselwirkung der neuartigen D-Fructose-konjugierten, kationischen Polymeren mit bestimmten Strukturelementen an der Zelloberfläche und zum anderen auf die zytotoxische Wirkung auf bestimmte Zelltypen. Hierbei ist als nichtbeschränkendes Beispiel insbesondere die selektive, zytotoxische Wirkung auf GLUT5-überexprimierende Zelltypen, wie z.B. ein Großteil der Brustkrebszelltypen, von Interesse.

Erfindungsgemäß werden zur Lösung dieser Aufgabe kationische Polymere mit D-Fructose-Substituenten gefunden, die aus einer Grundstruktur der allgemeinen Formel (I) bestehen. Kationisches Polymer ist dabei eine makromolekulare Verbindung aus n Wiederholungseinheiten (bevorzugt n = 10 bis 1000) mit einer oder mehreren positiven Ladungen.

Nichtbeschränkende Beispiele für bevorzugte kationische Polymere können hierbei Poly-L-Lysin (PLL), Polyethylenimin (PEI) oder Dextrane, wie Diethylaminoethyl- Dextran (DEAE-D) oder Dextran-Spermin (D-SPM) oder Polymethacrylate, wie Poly-(2-dimethylamino)ethyl-methacrylat (PDMAEMA) und Poly-dimethyl-aminoethyl- methacrylat (PDAMA) sein.

Linker sind hierbei ein oder mehrere Atome oder funktionelle Gruppen, die das kationische Polymer mit der D-Fructose-Einheit verbinden. Geeignet dafür sind z.B. ein beliebiger Alkyl- oder Aryl-Rest, ein beliebiger Alkenyl oder Alkinyl-Rest, ein Ether oder Thioether, ein Amin, ein Ester-, Amid- oder ein anderes Carbonsäure-Derivat, ein Heterozyklus (z.B. Triazol oder Maleimid), ein Disulfid, ein Imin bzw. ein Imid.

Als D-Fructose und seine Derivate werden alle chemischen Moleküle verstanden, die auf D-Fructose basieren und dabei die Stereochemie der Positionen 3, 4 und 5 in offener oder geschlossener Form beibehalten. Chemische Modifikationen, insbesondere das Einführen von funktionellen Gruppen, wie z.B. Thiol-, Azid-, Carbonsäuren- und ihre Derivate und / oder Amino-Gruppen an eine oder mehrere Positionen des Zuckers (aber nicht am glykosidischen C2-Atom der D-Fructose), unter Beibehaltung der Stereochemie der Positionen 3, 4 und 5 werden hierbei ebenfalls als D-Fructose-Derivate verstanden.

Die D-Fructose besitzt eine Keto-Funktionalität in offenkettiger Form, was die chemischen Eigenschaften gänzlich verändert. Sie wird, analog zu anderen Zuckern, über spezifische Transportproteine (GLUTs) in die Zellen eingeschleust und verstoffwechselt. Der für D-Fructose verantwortliche Transporter ist der GLUT5 -Transporter (A. Godoy et al. (2006): "Differential subcellular distribution of glucose transporters GLUT1-6 and GLUT9 in human Cancer: Ultrastructural localization of GLUTI and GLUT5 in breast tumor tissues." Journal of Cellular Physiology 207 (3): 614-627).

Überraschenderweise hat sich das D-Fructose-substituierte, kationische Polymer P3 als vorteilhaft gezeigt:

FraBuiöx*

P3

Im Vergleich zu unmodifizierten, kationischen Polymeren (z.B. L-PEI) besitzt P3:

- eine erhöhte Wasserlöslichkeit;

- Zytotoxizität gegenüber Brustkrebszellen, wie z.B. MDA-MB-231;

- keine Zytotoxizität gegenüber Nichtkrebszellen, wie z.B. HUVEC oder L929;

- stark verringerte hämolytische Aktivität gegenüber Blutzellen;

- keine Auslösung der Aggregation von Blutbestandteilen;

- sowie die Fähigkeit, Polyplexe mit negativ geladenen Biomolekülen, wie beispielsweise pDNA oder siRNA, zu bilden.

Die Erfindung soll nachstehend anhand der Synthese von D-Fructose-konjugierten, kationischen Polymeren (basierend auf linearem Poly(ethylenimin) (L-PEI, (I)) und verzweigtem Poly(ethylenimin) (B-PEI, (II)) gezeigt werden.

(I) Synthese von D-Fructose-konjugiertem (unverzweigtem) L-PEI

1. Synthese des SH-funktionalisierten D-Fructose-Derivats in einer vierstufigen Synthese

5

Schematische Darstellung der vierstufigen Synthese von l-0-(2-Mercapto-ethyl)-2,3:4,5- di-O-isopropylidene-ß-D-fructopyranosid: a) Benzyl-2-bromoethyl-ether, NaH, THF, rt; b) H ₂ /Pd (C), CH ₃ OH, rt; c) Mesylchlorid, Et ₃ N, 4-DMAP, CH ₂ C1 ₂ , 0 °C; d) 1. Thioharnstoff, Butanon, 95 °C, 2. K ₂ S ₂ 0 ₅ , CH ₂ C1 ₂ / H ₂ 0, 50 °C.

Das D-Fructose-Derivat 5 wurde vollständig charakterisiert und alle einzelnen Schritte konnten in hohen Ausbeuten durchgeführt werden. Die Einführung des Thiols dient dem Anhängen des Zuckers an das Polymer via photokatalysierter Thiol-En-Click-Reaktion.

2. Synthese des Block-Co-Polymers mit anschließendem Thiol-En-Click zwischen D- Fructose und Polymer-Precursor und Entschützung der Zucker-Einheit

PEtOx PES P(EI-sfaf-ButEnOx)

P1 P2

P{E!-sfiif-ButEr-iOx~Sfaf- Fru ButÜx)

P3

Schematische Darstellung der Synthese von P(EI-5toi-ButEnOx-5toi-FruButOx): a) 6 M HCl, 100 °C, Rückfluss; b) Pyridin, 4-DMAP, 80 °C; c) D-Fructose-Derivat (5), Methanol, 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon, 25 °C, UV = 365 nm; d) THF/H ₂ 0, 2M HCl, 40 °C.

Vorliegende Copolymere und entsprechende Zwischenstufen konnten umfangreich charakterisiert werden. Als Precursor diente ein Copolymer bestehend aus Ethylenimin (EI) und mit Doppelbindungen funktionalisiertes EI. Im letzten Schritt erfolgte das Anbringen des Zucker-Derivats 5 via photokatalysierter Thiol-En-Click-Reaktion. Saure Entschützung resultierte im wasserlöslichen Polymer P3.

(II) Die Synthese von D-Fructose konjugiertem, verzweigtem Poly(ethylenimin) (B-PEI)

1. Synthese von Epoxy-funktionalisierter D-Fructose

Ausgehend von kommerziell verfügbarer, Isopropyliden-geschützter D-Fructose kann durch eine Williamson-Veretherung mit Epichlorhydrin, die Epoxy-funktionalisierte D- Fructose hergestellt werden.

2. Kopplung von Epoxy-funktionalisierter D-Fructose mit (verzweigtem) B-PEI

Schematische Darstellung der allgemeinen Ringöffnungsreaktion zwischen Epoxiden und primären Aminen.

Schematische Darstellung einer möglichen Wiederholungseinheit von verzweigtem Poly(ethylenimin) (B-PEI).

Durch dreitägiges Rühren bei Raumtemperatur in Methanol kann B-PEI durch eine Ringöffnungsreaktion mit dem vorher synthetisierten D-Fructose-Derivat funktionalisiert werden. Es wurden D-Fructose konjugierte B-PEIs mit 14%, 23%, 28%, 39% und 76% funktionalisierten, primären Aminogruppen hergestellt. 3. Abspalten der Schutzgruppen an den Fructose-Resten

Die saure Abspaltung der Isopropyliden-Schutzgruppen in Anwesenheit von Wasser erfolgte nach mehrtägiger Erwärmung der kationischen Polymere mit gebundenen D- Fructose-Derivaten bei 40 °C unter Verwendung von 2M HCl. Dialysen (Celluloseester, MWCO: 500-1000 Da) gegen Wasser resultierten in D-Fructose funktionalisierten B-PEIs. Das Polymer P3 wurde einer intensiven, biologischen Evaluation unterworfen. a) Zytotoxizität und Hämokompatibilität

Figur 1 zeigt Zelltyp-abhängige Zytotoxizitäts Studien mittels alamarBlue-Assay der Polymere PI, P2 und P3. Unbehandelte Zellen dienten als Referenz für 100%ige Vitalität. Die Zellen wurden 24 h mit den angegebenen Polymerkonzentrationen behandelt.

Überraschenderweise zeigte das D-Fructose-konjugierte Polymer P3 eine erhöhte Toxizität gegenüber der Brustkrebszelllinie MDA-MB-231, während Nicht- Krebszellen (HUVEC und L929) keine signifikante Verringerung der Zellvitalität zeigten. Polymere P2 und PI zeigten keinerlei Selektivität (Figur 1). Figur 2A zeigt den Erythrozyt-Aggregations-Assay der Polymere mit angegebenen Konzentrationen. B-PEI diente als Positivkontrolle, PBS als Negativkontrolle. Figur 2B zeigt den Hämolyse-Assay der Erythrozyten nach Inkubation mit den Polymeren mit den angegebenen Konzentrationen. Triton X-100 diente als Positivkontrolle (100 % Hämolyse) und PBS als Negativkontrolle (1.99 %). Ein Wert kleiner als 2% Hämolyse wird klassifiziert als nicht-hämolytisch, 2 bis 5% als leicht hämolytisch und > 5% als hämolytisch. Die Werte repräsentieren den Mittelwert aus drei Messungen (+ Standardabweichung) .

Das Polymer P3 verursacht keine Aggregation von Erythrozyten und zeigt keine Hämolyse im Gegensatz zu PI und P2 (Figur 2). b) Bildungsrate und Stabilität der Polyplexbildung

Die Fähigkeit genetisches Material zu komplexieren ist ein zentrales Anliegen des verwendeten, kationischen Polymers. Um dies zu überprüfen, werden verschiedene Verhältnisse (N/P- Verhältnisse) der Summe aller Stickstoff-Atome (N) des kationischen Polymers und der Phosphor-Atome (P) des genetischen Materials getestet. Figur 3A und 3B zeigt die Polyplex-Formation und Stabilität mit pDNA der Polymere PI, P2 and P3. Figur 3A zeigt hierbei im speziellen die Bindungsaffinität unter angegebenen N/P- Verhältnissen (Ethidiumbromid Quenching-Assay) und Figur 3B zeigt den Dissoziations- Assay der Polyplexe bei einem N/P Verhältnis von 20 unter Verwendung von Heparin (0 to 60 U mL ^"1 ). Die Werte spiegeln das Mittel aus drei Messungen wieder + S.D (n=3).

Das D-Fructose konjugierte Polymer P3 zeigt stabile Polyplexbildung bei einem N/P Verhältnis >15 und zeigt weiterhin eine zügige Freisetzung des genetischen Materials in Anwesenheit von Heparin (Figur 3). c) Größe der Polyplexe

Numerischer

z-Durchschnitt

Durchschnitt

Polymer PDI Zetapotential [mV]

[d/nm]

[d/nm]

P1 21 7 ± 8 0.47 71 ± 13 24.0 ± 0.4 P2 264 ± 1 1 0.35 1 09 ± 33 24.3 ± 1 .1

P3 1 65 ± 1 0.26 83 ± 29 1 7.6 ± 0.4

Die Tabelle zeigt Größe und Zeta-Potential der Polyplexe von PI bis P3 bei N/P 20 im HBG Puffer (gemessen mit Hilfe von dynamischer und elektrophoretischer Lichtstreuung). d) Zellaufnahme

Um die Resultate der Zelltoxizitäts Studien zu unterstützen, wurden die Polymere mit verschiedenen Farbstoffen (Cy-5 und Rhodamin-SCN) markiert, mit den erwähnten Zelllinien inkubiert und die Ergebnisse mittels Durchflusszytometrie (FACS) und konfokaler Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) evaluiert. Figur 4 zeigt die Zellaufnahme- Studien. Polyplexe der Polymere PI bis P3 wurden mit YOYO-1 markierter pDNA und L929-, HUVEC- und MDA-MB -231 -Zellen inkubiert. Abgebildet ist die relative, mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) aller lebenden Zellen verglichen zur pDNA-Kontrolle ohne Polymer (Punkte). Die Werte spiegeln das Mittel aus drei Messungen wieder + S.D (n=3). PI und P2 zeigen hierbei eine unspezifische Aufnahme in alle betrachteten Zelllinien (5- 60%) bei allen N/P Verhältnissen. P3 hingegen zeigt eine signifikant erhöhte Aufnahme in die Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 für N/P = 50 (60%) im Vergleich zu PI und P2 (20- 30%). Des Weiteren zeigt P3 eine deutlich verringerte Aufnahme in die Nicht- Brustkrebszelllinie L929 (20%) und die menschliche Primärzelllinie HUVEC (5%) für N/P = 50. Der deutliche Unterschied im Uptake- Verhalten in MDA-MB-231 zwischen der unmittelbaren Vorstufe P2 und dem D-Fructose-konjugierten P3 unterstreicht eine erfolgreiche Targeting-Funktion des Zucker-Moleküls. Die Säulen in Figur 4 spiegeln den prozentualen Anteil der Zellen wieder, die durch pDNA- Aufnahme überhaupt Fluoreszenz aufweisen.

Diese Ergebnisse wurden auch mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie der Zellen beobachtet, wenn diese mit den Farbstoff-markierten Polymeren inkubiert wurden. Bei N/P 50 war die Fluoreszenzintensität von P3 in L929 gering und hoch in MDA-MB-231 Zellen, wogegen Polymere PI und P2 einen reversen Trent aufzeigten. Die Resultate der Aufnahme-Studien in lebenden Zellen sind in Einklang mit den Ergebnissen der Zytotoxizitätsassays und zeigen damit eine Zelltyp Spezifität des D-Fructose-konjugierten Polymers P3.