本発明に係る細胞培養容器には凹凸パタ� ��ンすなわち複数のマイクロ容器すなわち培� ��空間が形成されている。このマイクロ容器� ��仕切る側壁(凸部)の幅及び高さを最適化す� �ことで、マイクロ容器内のみで細胞を培養� �、細胞間のネットワークを効率的に構築さ� �ることができる。

 側壁により囲まれたマイクロ容器の寸法� ��、細胞を培養するために最適な範囲とする� ��要がある。マイクロ容器の底面面積が大き� ��ぎると、平板上での培養と同様、細胞は薄� ��伸び、立体構造とならない。一方、マイク� ��容器の底面面積が小さすぎると、細胞を収� ��できなくなる。従って、空間の寸法は、培� ��する細胞種に応じて、一又は複数個が収容� ��きる範囲とすることが好ましい。細胞が複� ��個集積した細胞塊を形成させる場合、その� ��胞塊が収納できる範囲とすることが好まし� ��。

 また、マイクロ容器の側壁も細胞を培養� ��るために最適な範囲とする必要がある。側� ��の幅が広すぎると、側壁の上面へ細胞が接� ��してしまい、培養に適さない。側壁の幅が� ��すぎると、作製が困難となる。側壁の高さ� ��低すぎると、細胞が側壁を乗り越えてしま� ��、培養に適さない。側壁の高さが高すぎる� ��、作製が困難な上、物質拡散がしにくくな� ��培養環境が悪化してしまう。

 さらに、側壁に開口部を設け、複数のマ� ��クロ容器を連通した構造とするにより、細� ��への酸素や栄養分の供給及び細胞からの老� ��物の除去を効率良く行うことができる。な� ��、培養する細胞種に応じ、側壁の高さ、マ� ��クロ容器寸法、開口部の幅を適宜設定する� ��とにより、多様な培養系に適用することも� ��きる。

 以下に、本発明の実施の形態について説� ��する。ただし、本発明が以下の実施の形態� ��限定される訳ではない。また、説明を明確� ��するため、以下の記載及び図面は、適宜、� ��略化されている。

実施の形態
 実施の形態に係る細胞培養容器の構成につ� ��て図1、2を用いて説明する。図1は、本実施� ��形態に係る細胞培養容器の構成を示す平面� ��であり、図2は図1のII-II断面図である。図1� �示すように、細胞培養容器10はマイクロ容器 11、側壁12、開口部13を備える。細胞培養容器 10の培養面には、複数の側壁12が網目状に形� �されており、この側壁12に四方を囲われた空 間がマイクロ容器11となる。また、矩形状の� ��マイクロ容器11の四辺に形成された側壁12の 各辺の中央部に、開口部13が形成されている� ��

 図1において、マイクロ容器11の底面の幅a 、マイクロ容器11を区画するための側壁12の� �b、高さc、隣接するマイクロ容器11が互いに� ��通するための開口部13の幅dを示した。ここ� ��、0.5μm≦b≦15μm、かつ、c/b≧3とする必要が ある。側壁12の幅bが15μmを越えると、側壁の� ��面へ細胞が接着してしまい、培養に適さな� ��。一方、側壁12の幅bが0.5μm未満では、作製� ��困難となる。側壁の高さは低すぎると、細� ��が側壁を乗り越えてしまい、培養に適さな� ��。側壁12の高さcが側壁12の幅bの2倍未満であ ると、マイクロ容器11で培養する細胞が乗り� ��げ隣接するマイクロ容器11へ移動してしま� �。また、側壁12の高さcは、30μm~300μmの範囲� �にあるのが好ましい。具体的には、相当直� �100μmの細胞塊を形成させる場合、側壁12の高 さcは50μm~150μmが好ましい。ここで、側壁の� �さcが高すぎると、作製が困難な上、物質拡� ��がしにくくなり培養環境が悪化してしまう� ��側壁12は多段階形状であってもよい。

 マイクロ容器11の底面形状は特に制限され� �ものではなく、正方形、円、多角形以外に� �種々の形状を採用することができる。この� �面面積は、6.25×10 ^-4 mm ² ~0.563mm ² が好ましい。具体的には、生体内での肝機能 を再現する細胞培養には、この底面面積は0.0 1mm ² ~0.1mm ² が好ましい。この場合、底面の長径が短径の 1~1.5倍であることが好ましい。さらに、等方� ��形状が好ましく、正方形であれば、例えば� ��相当直径100μmの細胞塊を形成させる場合、� ��辺の長さが100μm~300μmが好ましい。

 また、生体内での神経ネットワークを再� ��するために神経細胞の配向を行う培養には� ��長方形や開口部を有するマイクロ容器を採� ��することができる。例えば、マイクロ容器� ��辺幅が20μmで、長辺の長さが100μm以上であ� �こと好ましい。すなわち,底面の長径が短径� ��5倍以上が好ましい。

 生体内での細胞の機能を調べるために細� ��の遊走性評価を行う場合には、長方形の形� ��を採用することができる。例えば、マイク� ��容器短辺幅が15μmで、長辺の長さ22.5~750μmが 好ましい。すなわち、底面の長径が短径の1.5 ~50倍が好ましい。

 マイクロ容器11の水平面と側壁12とがなす 角度は、細胞が乗り上げない角度でなければ ならないため、側面の上部から50%以上の部分 は80~90°が好ましく、特に、85°~90°であるこ� �が好ましい。

 隣接するマイクロ容器11を互いに連通す� �ための開口部13の幅dは、培養細胞が最初に� �種されたマイクロ容器11から隣接するマイク ロ容器11に移動できない程度でが好ましい。� ��えば、培養細胞の相当直径が20μmであれば� �5~15μmであることが好ましい。また、図11、12 に示す凹凸パターン形状のように、開口部13� ��、マイクロ容器11の中央ではなく、コーナ� �部分(矩形の角の部分)であってもよい。ここ で、図11は、本実施の形態に係る他の細胞培� ��容器の構成を示す平面図であり、図12は図11 のXI-XI断面図である。なお、開口部13は必須� �はなく、図3及び図4に示すように、マイクロ 容器11の四辺が側壁12により完全に囲まれて� �てもよい。ここで、図3は、本実施の形態に� ��る他の細胞培養容器の構成を示す平面図で� ��り、図4は図3のIV-IV断面図である。

 また、図5及び図6に示すように、円形状� �マイクロ容器11が第1の側壁121により完全に� �まれ、さらに第1の側壁121上に第2の側壁122が 形成されていてもよい。すなわち、第1の側� �121及び第2の側壁122から多段階の側壁(凸部)12 が形成されている。ここで、図5は、本実施� �形態に係る他の細胞培養容器の構成を示す� �面図であり、図6は図5のVI-VI断面図である。

 本発明の細胞培養容器上の凹凸パターン� ��作製する方法としては、特に限定されない� ��、例えば、モールドを用いた転写成形、3次 元光造形、精密機械切削、ウェットエッチン グ、ドライエッチング、レーザー加工、放電 加工等の方法が挙げられる。細胞培養容器の 用途、要求される加工精度、コスト等を考慮 してこれらの製造方法を適宜選択することが 好ましい。

 モールドを用いて転写成形方法の具体例� ��しては、金属構造体を型として樹脂成形で� ��凸パターンを形成する方法が挙げられる。� ��の方法は金属構造体の形状を高い転写率で� ��脂へ凹凸パターンに再現することが可能で� ��り、また汎用の樹脂材料を使用することに� ��り材料コストを低くできるので好ましい。� ��のような金属構造体の型を用いる方法は、� ��コストであり、高い寸法精度を満足できる� ��で優れている。

 上記金属構造体の製造方法としては、例� ��ば、フォトリソグラフィによって作製され� ��レジストパターンや3次元光造形によって作 製された樹脂パターンへのメッキ処理、精密 機械切削、ウェットエッチング、ドライエッ チング、レーザー加工、放電加工等が挙げら れる。用途、要求される加工精度、コスト等 を考慮して適宜選択すればよい。

 上記で得られた金属構造体を型として用� ��て樹脂へ凹凸パターンを成形する方法とし� ��は、例えば、射出成形、プレス成形、モノ� ��ーキャスト成形、溶剤キャスト成形、ホッ� ��エンボス成形、押出成形によるロール転写� ��の方法を挙げることができる。生産性及び� ��転写性の観点から射出成形を採用すること� ��好ましい。

 本発明の細胞培養容器を構成する材料と� ��ては、自己支持性を有するものであれば特� ��制限されず、例えば、合成樹脂、シリコン� ��ガラス等が挙げられる。コスト面や顕微鏡� ��察による細胞視認性の観点から、透明な合� ��樹脂を材料とすることが好ましい。透明な� ��成樹脂としては、例えば、ポリメタクリル� ��メチル、メタクリル酸メチル-スチレン共重 合体等のアクリル系樹脂、ポリスチレン等の スチレン系樹脂、シクロオレフィン等のオレ フィン系樹脂、ポリエチレンテレフタレート 、ポリ乳酸等のエステル系樹脂、ポリジメチ ルシロキサン等のシリコーン系樹脂、ポリカ ーボネート樹脂等が挙げられる。このような 樹脂には、透明性を損なわない範囲で着色剤 、拡散剤、増粘剤等の各種添加剤を含んでい てもよい。

 本発明の細胞培養容器は、容器表面の親� ��性、生体適合性、細胞親和性等を向上させ� ��ことを目的として、凹凸パターン表面側に� ��面処理を行い、改質層及び/又はコーティン グ層が配されていてもよい。上記改質層を設 ける方法としては、自己支持性を失う方法や 10μm以上の極端な表面荒れを起こす方法でな� ��れば特に制限はないが、例えば、薬品処理� ��溶剤処理、表面グラフト重合によるグラフ� ��ポリマーの導入等の化学的処理、コロナ放� ��、オゾン処理、プラズマ処理等の物理的処� ��等の方法が挙げられる。またコーティング� ��を設ける方法としては、特に制限されるも� ��ではないが、例えば、スパッタ、蒸着等の� ��ライコーティング、無機材料コーティング� ��ポリマーコーティング等のウェットコーテ� ��ング等の方法が挙げられる。凹凸パターン� ��には、気泡の混入することなく培養液を注� ��するために親水性を付与することが望まし� ��、均一な親水性膜を形成させる方法として� ��無機蒸着が好ましい。

 また、細胞親和性を考慮した場合には、� ��えば、コラーゲン、フィブロネクチン等の� ��胞親和性タンパク質をコーティングするこ� ��がより好ましい。コラーゲン水溶液等を均� ��にコートするために、上述の親水性膜を形� ��させた後、コートすることが好ましい。通� ��、細胞培養においては、生体内環境を模倣� ��て細胞外マトリックス表面での培養が望ま� ��いため、上記のように均一な親水性無機膜� ��配した後に、培養細胞に適した細胞外マト� ��ックスからなる有機膜を配することが特に� ��ましい。

 本発明の細胞培養方法は、細胞を培養する� ��イクロ容器のみに細胞を配置させ、その空� ��内で生体内に類似した形態や機能を発現さ� ��るため、適切な細胞数を播種する必要があ� ��、細胞播種密度1.0×10 ⁴ ~1.0×10 ⁶ 細胞/cm ² が好ましい。例えば、マイクロ容器が正方形 で、1辺が200μmの場合、5.0×10 ⁴ ~5.0×10 ⁵ 細胞/cm ² が好ましい。このような条件のもと、直径が 30~200μmに及ぶ細胞塊を得ることができる。