以下に、本発明の一実施形態に係る細胞� ��養器具及びこれを用いた細胞培養方法につ� ��て図面を参照しながら説明する。まず、本� ��施形態に係る細胞培養器具(以下、「器具1� �という)について説明する。

 図1~図4は、器具1の一例についての説明図 である。図1~図4に示すように、器具1は、基� �材2と、当該基部材2とは別体に形成され当該 基部材2に着脱可能な枠部材3と、を備えてい� ��。図1は、基部材2から枠部材3が取り外され� ��状態(以下、「分離状態」という)の器具1の� ��視図である。図2は、図1に示すII-II線を通る 面で切断した分離状態の器具1の断面図であ� �。図3は、基部材2に枠部材3が取り付けられ� �状態(以下、「装着状態」という)の器具1の� �視図である。図4は、図3に示すIV-IV線を通る� ��で切断した装着状態の器具1の断面図である 。

 図1~図4に示すように、基部材2には、一つ のウェル群(以下、「マイクロウェル群20」と いう)が形成されている。すなわち、本実施� �態において、基部材2は、厚さが一定の平板� ��状に形成された第一基板部10を有している� �そして、第一基板部10の上方側の平坦な表面 (以下、「上面11」という)の一部にマイクロ� �ェル群20が形成されている。

 マイクロウェル群20は、細胞を保持可能� �複数の第一のウェル(以下、「マイクロウェ� ��21」という)を含んで構成されている。各マ� ��クロウェル21は、基部材2の上面11に開口す� �有底の穴として形成されている。すなわち� �各マイクロウェル21は、円形の平坦な底面22� ��、当該底面22の周囲に立設する所定高さの� �筒内壁として形成された内壁23と、を有して いる。複数のマイクロウェル21は、第一基板� ��10の上面11の所定範囲内に、所定の間隔で規 則的に配置されている。

 基部材2は、目的に応じて選択される任意 の材料を用いて形成することができる。すな わち、基部材2を構成する材料としては、例� �ば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプ� �ピレン、ポリカーボネート、ポリアミド、� �リアセタール、ポリエステル(ポリエチレン� ��レフタレート等)、ポリウレタン、ポリスル ホン、ポリアクリレート、ポリメタクリレー ト(ポリメチルメタクリレート(PMMA)等)、ポリ� ��ニル等の合成樹脂、PDMS(Poly-Dimethylsiloxane)等� ��シリコン系樹脂、EPDM(Ethylene Propylene Diene M onomer)等の合成ゴム、天然ゴム、ガラス、セ� �ミック、ステンレス鋼等の金属材料、から� �る群より選択される1つの材料を単独で用い� ��又は2以上の材料を組み合わせて用いること ができる。

 また、基部材2を構成する材料、特に、マ イクロウェル群20が形成されている部分を構� ��する材料としては、例えば、当該マイクロ� ��ェル群20内で培養された細胞を顕微鏡等の� �学的な手段により観察する場合の利便性の� �から、上述した材料のうち、透光性の材料� �好ましく用いることができる。すなわち、� �実施形態において、第一基板部10は、例えば 、透光性の合成樹脂やガラスを用いて形成す ることができる。

 具体的に、例えば、第一基板部10を透光� �の合成樹脂から成形し、当該第一基板部10の 上面11の一部に、当該第一基板部10の厚さよ� �小さい所定深さの複数の有底孔を複数のマ� �クロウェル21として形成することができる。 また、例えば、透光性の合成樹脂から成形さ れた第一の平板の一部に複数の貫通孔を形成 し、当該第一の平板の当該貫通孔が開口する 表面の一つに、ガラスから成形された第二の 平板を接着することにより、当該第一の平板 と当該第二の平板とから構成される第一基板 部10を形成することができる。この場合、第� ��の平板の各貫通孔の内壁が各マイクロウェ� ��21の内壁23となり、各貫通孔を塞ぐ第二の平 板の表面の一部が各マイクロウェル21の底面2 2となる。なお、この場合、第一の平板及び� �二の平板としては、同一の材料から成形さ� �たものを用いることもできる。

 マイクロウェル21の形成には、目的に応� �て選択される任意の加工方法を用いること� �できる。すなわち、例えば、マシニングセ� �タ等を用いた穿孔加工、レーザー等を用い� �光微細加工、エッチング加工、エンボス加� �等により、予め成形された第一基板部10の一 部にマイクロウェル21を形成することができ� ��。また、例えば、射出成形、プレス成形、� ��テレオリソグラフィー等により、第一基板� ��10の成形と同時に、当該第一基板部10の一部 にマイクロウェル21を形成することができる� ��

 マイクロウェル21は、目的に応じた任意� �サイズで形成することができる。マイクロ� �ェル21を比較的小さな所定範囲のサイズで形 成することにより、例えば、数cm角の基部材2 に微小なマイクロウェル21を多数形成するこ� ��ができる。この場合、数の限られた希少な� ��胞を多数のマイクロウェル21で培養するこ� �ができる。また、適切なサイズの細胞組織� �(細胞が三次元的に集合し互いに結合するこ� ��で形成される細胞塊)を各マイクロウェル21� ��形成することが可能となる。

 すなわち、各マイクロウェル21のうち、基� �材2の表面(本実施形態においては、第一基板 部10の上面11)に開口する部分(以下、「開口部 24」という)の面積は、例えば、100~1×10 ⁶ μm ² の範囲とすることができ、好ましくは7×10 ³ ~5×10 ⁵ μm ² の範囲とすることができる。具体的に、例え ば、図1~図4に示すように、マイクロウェル21� ��開口部24が円形である場合には、その直径� �10~1000μmの範囲とすることができ、好ましく� ��100~800μmの範囲とすることができる。

 また、各マイクロウェル21の底面22の面積は 、例えば、100~1×10 ⁶ μm ² の範囲とすることができ、好ましくは7×10 ³ ~5×10 ⁵ μm ² の範囲とすることができる。具体的に、例え ば、図1~図4に示すように、マイクロウェル21� ��底面22が円形である場合には、その直径は10 ~1000μmの範囲とすることができ、好ましくは1 00~800μmの範囲とすることができる。

 開口部24又は底面22の面積が上記範囲内で ある場合には、1つの基部材2に多数のマイク� ��ウェル21を形成することができる。このた� �、稀少な細胞であっても互いに離隔された� �数のマイクロウェル21の各々で培養すること ができる。また、この場合、多数のマイクロ ウェル21の各々で、所定範囲の均一なサイズ� ��細胞組織体(例えば、球状のスフェロイド)� �1つずつ形成することができる。すなわち、� ��胞組織体が所定のサイズより大きくなると� ��当該細胞組織体の内部に含まれる細胞に対� ��て、周囲の培養液から酸素や栄養が十分に� ��給されなくなる。この点、各マイクロウェ� ��の開口部24及び底面22の面積が上記範囲の上 限値又はそれより小さい場合には、内部の細 胞を良好な状態に維持できる適切なサイズの 細胞組織体を大量且つ確実に形成することが できる。これに対し、開口部24又は底面22の� �積が上記範囲の上限値より大きい場合には� �各マイクロウェル21で形成される細胞組織体 のサイズが大きくなりすぎることがある。ま た、この場合、1つのマイクロウェル21内に複 数個の細胞組織体が形成されてしまうことが ある。一方、開口部24又は底面22の面積が上� �範囲の下限値より小さい場合には、各マイ� �ロウェル21内に細胞を確実に保持させること が容易でない。また、この場合、増殖した細 胞によりマイクロウェル21が塞がれることが� ��る。また、隣接するマイクロウェル21間を� �ぐように細胞が増殖してしまうこともある� �

 各マイクロウェル21の深さ(本実施形態に� ��いては、図2及び図4に示す内壁23の高さ)は� �例えば、2.5~2000μmの範囲とすることが好まし い。マイクロウェル21の深さが上記範囲の上� ��値より大きい場合には、当該マイクロウェ� ��21の底面22に保持された細胞や細胞組織体に 対して、当該マイクロウェル21外の培養液か� ��酸素や栄養素を十分に供給できないことが� ��る。一方、マイクロウェル21の深さが上記� �囲の下限値より小さい場合には、当該マイ� �ロウェル21内に保持された細胞又は細胞組織 体が、培養の操作中に当該マイクロウェル21� ��に脱離してしまうことがある。

 また、各マイクロウェル21の開口部24又は 底面22の代表長さ(開口部24及び底面22が円形� �は多角形に形成されている場合には、それ� �れ当該円の直径又は当該多角形の対角線長� �)に対する、当該マイクロウェル21の深さの� �率(以下、「アスペクト比」という)は、0.5~2. 0の範囲とすることが好ましい。具体的に、� �えば、開口部24及び底面22が直径5μmの円形で ある場合には、マイクロウェル21の深さを2.5� �m~10μmとすることが好ましい。また、例えば� ��開口部24及び底面22が直径1000μmの円形であ� �場合には、マイクロウェル21の深さを500μm~20 00μmとすることが好ましい。アスペクト比が� ��記範囲の上限値より大きい場合には、各マ� ��クロウェル21の底面22に保持された細胞又は 形成された細胞組織体に対して、当該マイク ロウェル21外の培養液から酸素や栄養素を十� ��に供給できないことがある。一方、アスペ� ��ト比が上記範囲の下限値より小さい場合に� ��、マイクロウェル21内に保持された細胞又� �細胞組織体が、培養の操作中に当該マイク� �ウェル21外に脱離してしまうことがある。

 なお、各マイクロウェル21の開口部24の面 積、底面22の面積、深さがそれぞれの上記範� ��の上限値又はそれより小さい場合には、各� ��イクロウェル21に保持できる溶液が微量と� �る。このため、例えば、基部材2の全体を気� ��中に曝した状態で、各マイクロウェル21に� �して溶液の注入や回収等の操作を行うと、� �作中に当該各マイクロウェル21内の溶液が蒸 発して、当該溶液の組成や当該溶液中の細胞 に不都合が生じる場合がある。したがって、 この場合、基部材2のうち、少なくともマイ� �ロウェル群20が形成されている表面部分(本� �施形態においては、第一基板部10の上面11の� ��ちマイクロウェル群20が形成されている部� �)の全体を溶液中に浸漬した状態で操作を行� ��ことが好ましい。

 マイクロウェル21の底面22の全体又は一部 は、基板部10を構成する材料の選択や、当該� ��面22に対する表面修飾処理によって、細胞� �着性又は細胞非接着性とすることができる� �また、マイクロウェル21の底面22で細胞を培� ��する場合には、内壁23は、細胞非接着性と� �ることが好ましい。ここで、細胞接着性の� �面とは、例えば、培養に用いる溶液中にお� �て、細胞が当該表面上に沈降した場合に、� �該細胞が、その形状を球形から変化させて� �比較的扁平な形状で接着することができる� �面である。一方、細胞非接着性の表面とは� �例えば、培養に用いる溶液中において、細� �が当該表面上に沈降した場合に、当該細胞� �、その形状を球状からほとんど変化させず� �極めて弱く接着する表面である。この場合� �細胞非接着性表面上の細胞は、当該表面に� �く接着できず球形のまま溶液中で浮遊状態� �維持し、又は培養液の流れ等によって当該� �面から容易に脱離する。

 マイクロウェル21の底面22及び内壁23は、� ��えば、第一基板部10を構成する材料の表面� �のものとすることができ、又は当該第一基� �部10を構成する材料表面に細胞接着性物質又 は細胞非接着性物質が物理的又は化学的に固 定された表面として形成することができる。

 細胞接着性物質としては、用いる細胞の� ��胞膜に存在するたんぱく質等の細胞表面分� ��(例えば、インテグリンや糖鎖受容体等)の� �ち特定のものに対して結合し得る物質であ� �ば特に限られず用いることができる。すな� �ち、例えば、生体から取得されたタンパク� �(コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン� ��)や、細胞接着性を示す特定のアミノ酸配列 (アルギニン・グリシン・アスパラギン酸(い� ��ゆるRGD)配列等)や、特定の糖鎖配列(ガラク� ��ース側鎖等)を有する合成された細胞接着性 物質を、細胞の種類に応じて適宜選択して用 いることができる。

 細胞非接着性物質としては、用いる細胞� ��細胞膜に存在するたんぱく質や糖鎖等の細� ��表面分子に対して結合しない物質であれば� ��に限られず用いることができる。すなわち� ��例えば、生体から取得されたタンパク質(ア ルブミン等)や、溶液中で極めて高い親水性� �示す高分子(ポリエチレングリコール及びそ� ��誘導体等)や、MPC(2-メタクリロイルオキシエ チルホスホリルコリン)、poly―HEMA(ポリヒド� �キシエチルメタクリレート)、SPC(セグメント 化ポリウレタン)等の化合物を、細胞の種類� �応じて適宜選択して用いることができる。

 これら細胞接着性物質又は細胞非接着性� ��質は、例えば、これらを含む水溶液をマイ� ��ロウェル21の底面22及び内壁23上で乾燥させ� ��ことにより、又は当該水溶液中において、� ��該物質が有する官能基と当該底面22及び内� �23に結合している官能基との間で化学反応(� �えば、カルボキシル基やアミノ基等の間の� �合反応等)を起こさせて共有結合を形成させ� ��ことにより、又は当該水溶液中において、� ��該物質が有するチオール基と当該底面22及� �内壁23に予め形成された金属(プラチナ、金� �)薄膜とを結合させることにより、当該底面2 2及び内壁23上に固定化することができる。

 マイクロウェル21の底面22の全体を細胞非 接着性とした場合には、当該マイクロウェル 21内で、当該底面22に接着していない細胞組� �体を形成することができる。また、例えば� �マイクロウェル21の底面22の中央部分に細胞� ��着性の第一領域を形成し、当該第一領域を� ��む周辺部分を細胞非接着性の第二領域とす� ��ことにより、当該マイクロウェル21内で、� �該底面22のうち第一領域に接着した細胞組織 体を形成することができる。このようなマイ クロウェル21内における細胞組織体の形成は� ��マイクロウェル21の開口部24又は底面22の面� ��が上述した範囲内である場合に、特に簡便� ��つ確実に達成することができる。なお、こ� ��ように各マイクロウェル21内で細胞組織体� �形成する場合には、内壁23を細胞非接着性と することが好ましい。また、当然ながら、マ イクロウェル21の底面22の全体を細胞接着性� �することにより、当該底面22の全体に細胞を 二次元的に接着させて培養することができる 。

 枠部材3には、図1~図4に示すように、基部 材2に形成された一つのマイクロウェル群20に 対応する貫通穴として一つの窓部40が形成さ� ��ている。すなわち、本実施形態において、� ��部材3は、厚さが一定の平板形状に形成され た第二基板部30を有しており、当該第二基板� ��30を貫通する矩形の穴が窓部40として形成さ れている。この窓部40は、第二基板部30のう� �、基部材2のマイクロウェル群20に対応する� �置に、当該マイクロウェル群20の全体を収容 可能な開口面積で形成されている。

 また、枠部材3は、基部材2に着脱可能に� �成されている。すなわち、この枠部材3は、� ��部材2のマイクロウェル群20が窓部40内に配� �されるように、当該基部材2に取り付け可能� ��構成され、且つ、取り付け後に再び当該基� ��材2から取り外し可能に構成されている。さ らに、この枠部材3は、基部材2への取り付け� ��び基部材2からの取り外しを複数回、繰り返 し行うことができるように構成されている。

 そして、図3及び図4に示すように、枠部� �3が基部材2に取り付けられた装着状態の器具 1において、当該枠部材3は、当該基部材2のマ イクロウェル群20の周囲に立設される。より� ��体的には、装着状態において、窓部40の内� �41は、対応する一つのマイクロウェル群20の� ��囲に立設される。この結果、器具1において は、窓部40に対応する、溶液を保持可能な第� ��のウェル(以下、「マクロウェル50」という) が形成される。

 すなわち、マクロウェル50は、一つのマ� �クロウェル群20が形成された底面51と、窓部4 0の内壁41と、を有する有底の穴として形成さ れる。このマクロウェル50の底面51は、基材� �2のうち、一つのマイクロウェル群20が形成� �れている表面部分(本実施形態においては、� ��一基板部10の上面11のうち、マイクロウェル 群20が形成されている部分)である。そして、 例えば、装着状態の器具1を気相中に載置し� �状態でマクロウェル50内に溶液を注入した場 合には、当該マクロウェル50は、当該溶液を� ��該マクロウェル50外に漏洩させることなく� �底面51と内壁41とに囲まれたその内部に保持� ��ることができる。

 マクロウェル50の底面51の面積は、例えば、 1~2500mm ² の範囲とすることができ、好ましくは10~1000mm ² の範囲とすることができる。また、マクロウ ェル50の深さ(すなわち、底面51を囲む窓部40� �内壁41の高さ)は、例えば、50μm以上とするこ とができ、好ましくは500μm以上とすることが でき、より好ましくは1000μm以上とすること� �できる。底面51の面積及びマクロウェル50の� ��さがそれぞれ上記範囲内である場合には、� ��クロウェル50内に溶液を安定して保持する� �とができる。

 枠部材3は、目的に応じて選択される任意 の材料を用いて形成することができる。すな わち、枠部材3を構成する材料としては、例� �ば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプ� �ピレン、ポリカーボネート、ポリアミド、� �リアセタール、ポリエステル(ポリエチレン� ��レフタレート等)、ポリウレタン、ポリスル ホン、ポリアクリレート、ポリメタクリレー ト(PMMA等)、ポリビニル等の合成樹脂、PDMS等� �シリコン系樹脂、EPDM等の合成ゴム、天然ゴ� ��、ガラス、セラミック、ステンレス鋼等の� ��属材料、からなる群より選択される1つの材 料を単独で用い、又は2以上の材料を組み合� �せて用いることができる。

 また、枠部材3のうち、少なくとも窓部40� ��周囲の表面部分を、基部材2のうち、マイク ロウェル群20の周囲の表面部分と密着可能な� ��料で形成した場合には、当該枠部材3を当該 基部材2に取り付けるための特別な部分を器� �1に形成することなく、当該枠部材3を当該基 部材2に取り付け可能に構成することができ� �。また、この場合、さらに、器具1の装着状� ��において溶液を保持可能なマクロウェル50� �簡単且つ確実に形成することもできる。こ� �ような密着性の高い材料は、基部材2を構成� ��る材料との組み合わせにより適宜選択する� ��とができる。すなわち、例えば、上述の枠� ��材3の形成に用いられる材料のうち、PDMS等� �シリコン系樹脂、合成ゴム、天然ゴム等の� �縮性のある樹脂(エラストマー樹脂)を好まし く用いることができる。

 具体的に、例えば、第一基板部10を透光� �の合成樹脂により形成する一方で、第二基� �部30の全体、又は第二基板部30の下方側の平� ��な表面(以下、「下面31」という)のうち窓部 40を囲む部分をシリコン系樹脂で形成するこ� ��ができる。この場合、枠部材3を基部材2に� �り付ける際に、窓部40内にマイクロウェル群 20が収容されるよう、当該枠部材3と基部材2� �を位置合わせするとともに、当該枠部材3の� ��面31と当該基部材2の上面11とを圧接するこ� �により、当該窓部40の内壁41を、当該マイク� ��ウェル群20の周囲の上面11に密着して立設さ せることができる。

 窓部40は、目的に応じて選択される任意� �加工方法を用いて形成することができる。� �なわち、例えば、マシニングセンタ等を用� �た穿孔加工、レーザー等を用いた光微細加� �、エッチング加工、エンボス加工等により� �予め成形された第二基板部30の一部に窓部40� ��形成することができる。また、例えば、射� ��成形、プレス成形、ステレオリソグラフィ� ��等により、第二基板部30の成形と同時に、� �該第二基板部30の一部に窓部40を形成するこ� ��ができる。

 図5には、器具1の他の側面を説明するた� �、図4に示したものと同一の器具1の断面を示 す。図5に示すように、マイクロウェル群20は 、その辺縁を構成する、枠部材3に最も近い� �置に形成されたマイクロウェル(以下、「辺� ��ウェル21i」という)と、その中央部分を構成 する、当該枠部材3から比較的遠い位置に形� �されたマイクロウェル(以下、「中央ウェル2 1ii」という)と、を含んでいる。

 上述のように、マイクロウェル群20にお� �て、互いに結合を形成可能な細胞を培養す� �ことにより、これら辺縁ウェル21i及び中央� �ェル21iiの各々に、当該細胞が三次元的に集� ��した細胞組織体を1つずつ形成することがで きる。

 この場合、辺縁ウェル21iと中央ウェル21ii とが同一の形状及びサイズで形成されている にもかかわらず、当該辺縁ウェル21iで形成さ れた細胞組織体(以下、「辺縁組織体」とい� �)のサイズと、当該中央ウェル21iiで形成され た細胞組織体(以下、「中央組織体」という)� ��サイズと、が異なってしまうことがある。� ��なわち、例えば、辺縁組織体のサイズは、� ��央組織体に比べて大きくなる傾向がある。

 この点、本発明の発明者は、鋭意検討を� ��ねた結果、辺縁ウェル21iと枠部3との距離D(� ��5に示す例においては、辺縁ウェル21iの枠部 材3側の端部と、当該枠部材3の内壁41と、の� �離D)を所定の微小な閾値以下とすることによ り、辺縁組織体のサイズを中央組織体のサイ ズに限りなく近づけることができることを独 自に見出した。

 すなわち、この距離Dは、5.0mm以下とする� ��とが好ましく、2.0mm以下とすることがより� �ましく、1.0mm以下とすることが特に好ましい 。距離Dを上記の範囲とすることにより、中� �組織体のサイズに対する辺縁組織体のサイ� �の比を、例えば、1.25以下とすることができ� ��さらに1.20以下とすることもできる。

 距離Dを低減すると、辺縁ウェル21iと枠部 材3とが近接するため、当該辺縁ウェル21iに� �ける細胞培養を行う上での操作や観察の難� �度が高くなる。しかしながら、枠部材3は、� ��部材2に対して着脱可能となっている。この ため、例えば、必要に応じて、枠部材3を基� �材2から取り外し、この分離状態で操作や観� ��を行うことができる。

 したがって、着脱可能な基部材2と枠部材 3とを備えた器具1を用い、当該器具1における 上記距離Dを微小な上記範囲内に低減するこ� �により、辺縁ウェル21i及び中央ウェル21iiの� ��々において、極めて均一なサイズの細胞組� ��体を1つずつ形成し、培養することが可能と なる。

 また、基部材2には複数のマイクロウェル 群20を互いに離間して形成することもできる� ��この場合、枠部材3には、その各々が複数の マイクロウェル群20のうち一つに対応する窓� ��40を少なくとも一つの形成することができ� �。図6~図9は、この場合の器具1の一例につい� ��の説明図である。図6は、分離状態の器具1� �斜視図である。図7は、図6に示すVII-VII線を� �る面で切断した分離状態の器具1の断面図で� ��る。図8は、装着状態の器具1の斜視図であ� �。図9は、図8に示すIX-IX線を通る面で切断し� ��装着状態の器具1の断面図である。なお、以 下の例に係る器具1については、上述の図1~図 4に示した例と同様の部分には同様の符号を� �し、重複する点については詳細な説明を省� �する。

 図6~図9に示すように、基部材2には、4つ� �マイクロウェル群20a~20dが互いに離間して形� ��されている。各マイクロウェル群20a~20dは、 細胞を保持可能な複数のマイクロウェル21を� ��んで構成されている。

 一方、枠部材3には、その各々が基部材2� �4つのマイクロウェル群20a~20dのうち一つに対 応する4つの窓部40a~40dが形成されている。す� ��わち、4つの窓部40a~40dの各々は、4つのマイ� ��ロウェル群20a~20dのうち互いに異なる一つに 対応する位置に形成されている。この結果、 枠部材3は、4つの窓部40a~40dの間を仕切る十字 状に形成された仕切部32を有している。

 そして、図8及び図9に示すように、装着� �態の器具1においては、各窓部40a~40d(図6及び� ��7参照)の内壁41a~41dが、4つのマイクロウェル 群20a~20dのうち対応する一つの周囲にそれぞ� �立設される。この結果、器具1には、枠部材3 の仕切部32によって仕切られた4つのマクロウ ェル50a~50dが形成される。各マクロウェル50a~5 0dの底面51a~51dには、4つのマイクロウェル群20 a~20dのうち対応する一つがそれぞれ形成され� ��。

 そして、枠部材3の下面31のうち少なくと� ��4つの窓部40a~40dの各々の周辺部分と、基部� �2の上面11のうち少なくとも4つのマイクロウ� ��ル群20の各々の周辺部分と、は互いに密着� �ている。この結果、4つのマクロウェル50a~50d は、互いに独立に溶液を保持できるように形 成されている。

 また、基部材2と枠部材3とには、対応す� �位置に互いに結合可能な第一結合部と第二� �合部とをそれぞれ形成することができる。� �10は、図6~図9に示す例に係る器具1に第一結� �部及び第二結合部を形成した場合の一例に� �いて、その分離状態を示す斜視図である。

 図10に示す器具1においては、第一基板部1 0の上面11のうち、4つのマイクロウェル群20a~2 0dの全体を囲む外周部分の一部に、当該上面1 1に所定高さで突出する凸形状の4つの第一結� ��部(以下、「嵌合突起60」という)が形成され ている。一方、第二基板部30の下面31のうち� �4つの窓部40a~40dの全体を囲む外周部分の一部 であって、第一基板部10の4つの嵌合突起60に� ��応する位置には、所定深さの凹形状の4つの 有底穴(以下、「嵌合穴61」という)が形成さ� �ている。

 これら嵌合突起60と嵌合穴61とは、対応す る形状で形成され、嵌合可能となっている。 そして、対応する基部材2の嵌合突起60と枠部 材3の嵌合穴61とをそれぞれ嵌合させることに より、当該基部材2に当該枠部材3を取り付け� ��、図8及び図9に示すような装着状態の器具1� ��構成することができる。この場合、基部材2 と枠部材3とを、予め定められた位置関係で� �簡便且つ確実に結合させることができる。

 また、基部材2に複数のマイクロウェル群 20が互いに離間して形成されている場合には� ��当該基部材2の当該複数のマイクロウェル群 20の各々の周囲に、枠部材3の一部と結合可能 な結合部を形成することもできる。図11及び� ��12は、この場合の器具1の一例について、そ� ��分離状態及び装着状態をそれぞれ示す斜視� ��である。

 図11及び図12に示す器具1においては、第� �基板部10の上面11のうち、4つのマイクロウェ ル群20a~20dの各々の外周部分に嵌合突起60が4� �ずつ形成されている。一方、枠部材3には、� ��部材2の4つのマイクロウェル群20a~20dのうち� ��つに対応する一つの窓部40のみが形成され� �いる。そして、この枠部材3の下面31のうち� �部40の周囲部分には、基部材2の各マイクロ� �ェル群20a~20dの周囲に形成された4つの嵌合突 起60に対応する位置に、当該4つの嵌合突起60� ��嵌合可能な形状で4つの嵌合穴61が形成され� ��いる。

 そして、図12に示すように、装着状態の� �具1においては、4つのマイクロウェル群20a~20 dのうち、一つのマイクロウェル群20bの周囲� �のみ、一つの窓部40の内壁41が立設される。� ��の結果、基部材2上に一つのマクロウェル50� ��形成される。このマクロウェル50の底面51に は一つのマイクロウェル群20bが形成される。

 なお、4つのマイクロウェル群20a~20dの各� �の外周には、同一の配置で4つの嵌合突起60� �それぞれ形成されているため、枠部材3は、� ��該4つのマイクロウェル群20a~20dのいずれに� �対応して構成されている。すなわち、枠部� �3を、4つのマイクロウェル群20a~20dのうち、� �意の一つの周囲に取り付けることにより、� �該4つのマイクロウェル群20a~20dのうちいずれ か一つが底面51に形成された一つのマクロウ� ��ル50を形成することができる。

 また、例えば、上述の図10に示すような� �4つの窓部40が形成された枠部材3において、� ��該4つの窓部40の各々の周囲に、図11及び図12 に示す嵌合突起60に対応する嵌合穴61を4つず� ��形成することもできる。そして、対応する� ��部材2の嵌合突起60と枠部材3の嵌合穴61とを� ��れぞれ嵌合させることにより、当該基部材2 に当該枠部材3を取り付けて、図8及び図9に示 すような装着状態の器具1を構成することが� �きる。この場合、基部材2と枠部材3とを、予 め定められた位置関係で、簡便且つより確実 に結合させることができる。

 また、図11及び図12には、枠部材3に、1つ� ��貫通穴40が形成されている例を示したが、� �部材3には、複数のマイクロウェル群20のう� �一部に対応する2以上の貫通穴40を形成する� �ともできる。すなわち、例えば、枠部材3に� ��、図11及び図12に示すような4つのマイクロ� �ェル群20a~20dのうち、2つのマイクロウェル群 20a,20bの各々に対応する2つの貫通穴40を形成� �ることもできる。この場合、装着状態の器� �1においては、4つのマイクロウェル群20a~20d� �一部である、2つのマイクロウェル群20a,20bの 各々の周囲にのみ窓部40の内壁41を立設させ� �、2つのマクロウェル50を形成することがで� �る。

 図13は、第一結合部及び第二結合部を備� �た器具1の他の例について、その分離状態を� ��す斜視図である。図13に示す器具1において� ��、第一基板部10の上面に、4つのマイクロウ� ��ル群20a~20dの全体を囲む所定深さの堀状に第 一結合部(以下、「堀部62」という)が形成さ� �ている。一方、第二基板部30の下面31には、� ��一基板部10の堀部62に対応して、4つの窓部40 a~40dの全体を囲む所定高さの堤防状の第二結� ��部(以下、「堤防部63」という)が形成されて いる。これら堀部62と堤防部63とは、対応す� �形状で形成され、嵌合可能となっている。

 そして、基部材2の堀部62と枠部材3の堤防 部63とを嵌合させることにより、当該基部材2 に当該枠部材3を取り付けて、図8及び図9に示 すような装着状態の器具1を構成することが� �きる。この場合、基部材2と枠部材3とを、予 め定められた位置関係で、簡便且つ確実に結 合させることができる。

 また、基部材2に複数のマイクロウェル群 20を互いに離間して形成している場合には、� ��該基部材2の当該複数のマイクロウェル群20� ��各々の周囲に、枠部材3の一部と結合可能な 結合部を形成することもできる。図14は、こ� ��場合の器具1の一例について、その分離状態 を示す斜視図である。

 図14に示す器具1においては、第一基板部1 0の上面11のうち、4つのマイクロウェル群20a~2 0dの各々の外周を囲む堀部62が形成されてい� �。一方、枠部材3は、基部材2の4つのマイク� �ウェル群20a~20dのうち一つに対応する一つの� ��部40が形成されている。そして、この枠部� �3は、基部材2の4つのマイクロウェル群20a~20d� ��うち一つの周囲に形成された堀部62の一部� �嵌合可能な形状で形成されている。そして� �装着状態の器具1においては、図12に示した� �と同様に、4つのマイクロウェル群20a~20dのう ち一つの周囲にのみ、枠部材3の一つの窓部40 の内壁41が立設されて、一つのマクロウェル5 0が形成される。

 なお、4つのマイクロウェル群20a~20dの各� �の外周には、同一の配置で堀部62がそれぞれ 形成されているため、枠部材3は、当該4つの� ��イクロウェル群20a~20dのいずれにも対応して 構成されている。すなわち、枠部材3を、4つ� ��マイクロウェル群20a~20dのうち、任意の一つ の周囲に取り付けることにより、当該4つの� �イクロウェル群20a~20dのうちいずれか一つが� ��面51に形成された一つのマクロウェル50を形 成することができる。

 また、例えば、基部材2において、図14に� ��すような堀部62が形成される場合には、上� �の図13に示すような、4つの窓部40が形成され た枠部材3を用いることもできる。この場合� �枠部材3の堤防部63(図13参照)は、図14に示す� �部材2の堀部62に対応して、当該枠部材3の4つ の窓部40の各々の周囲に突出して形成された� ��子状とすることもできる。そして、これら� ��部材2の堀部62と枠部材3の堤防部63とを嵌合� ��せることにより、当該基部材2に当該枠部材 3を取り付けて、図8及び図9に示すような装着 状態の器具1を構成することができる。この� �合、基部材2と枠部材3とを、予め定められた 位置関係で、簡便且つより確実に結合させる ことができる。

 また、器具1は、基部材2と、当該基部材2� ��取り付けられた枠部材3と、を一体的に保持 する保持部材をさらに備えることもできる。 この場合、保持部材は、基部材2及び枠部材3� ��それぞれの外周の少なくとも一部に当接し� ��当該基部材2及び当該枠部材3の相対的な位� �を固定する当接部を有する。図15~図17は、こ の場合の一例に係る器具1ついての説明図で� �る。図15及び図16は、この例に係る器具1につ いて、その分離状態及び装着状態をそれぞれ 示す斜視図である。図17は、図16に示すXVII-XVI I線を通る面で切断した装着状態の器具1の断� ��図である。

 図15~図17に示すように、この器具1は、基� ��材2と、枠部材3と、保持部材4と、を備えて� ��る。保持部材4は、厚さが一定の平板形状に 形成された第三基板部70を有している。この� ��三基板部70の上方側の平坦な表面には、基� �材2及び枠部材3を収容するための矩形の有底 穴(以下、「収容部71」という)が形成されて� �る。この収容部71は、矩形の平坦な底面72と� ��当該底面72の周囲に立設する所定高さの内� �73と、を有している。

 そして、図16及び図17に示す装着状態の器 具1において、基部材2は、収容部71の底面72上 に載置される。さらに、枠部材3は、基部材2� ��取り付けられた状態で収容部71に収容され� �。すなわち、基部材2と枠部材3とは積層され た状態で、保持部材4の収容部71に嵌め入れら れている。このため、基部材2の外周22と、当 該基部材2に取り付けられた枠部材3の外周33� �、は収容部71の内壁73に当接している。この� ��果、器具1においては、基部材2と枠部材3と� ��、予め定められた位置関係で、簡便且つ確� ��に保持することができる。

 また、図15~図17に示すように、この例に� �る枠部材3の一部には、上方に突出した凸形� ��の取手部30aが形成されている。このため、� ��作者は、例えば、ピンセットにより取手部3 0aをつまむことによって、枠部材3の基部材2� �の取り付けや取り外しを簡単に行うことが� �きる。この取手部30aは、枠部材3の成形時に� ��体的に形成することができ、また、予め形� ��された枠部材3に新たに形成することもでき る。また、このような凸形状の取手部30は、� ��述の又は後述の例に係る枠部材3も含め、本 発明に係る任意の枠部材3に任意の形状で形� �することができる。

 次に、本実施形態に係る細胞培養方法(以 下、「本方法」という)について説明する。� �方法においては、器具1のマイクロウェル群2 0で細胞を培養する。ここで、細胞としては� �由来とする動物種や臓器・組織の種類等を� �わず、目的に応じた任意のものを用いるこ� �ができる。具体的に、この細胞としては、� �えば、ヒト又はヒト以外の動物(サル、ブタ� ��イヌ、ラット、マウス等)の任意の臓器又は 組織(肝臓、膵臓、腎臓、神経、皮膚等)に由� ��する初代細胞(幹細胞やES細胞(Embryonic Stem c ell)を含む)、樹立されている株化細胞、又は� ��れらに遺伝子操作等を施した細胞を用いる� ��とができる。また、細胞としては、一種類� ��細胞を単独で用いることもできるし、二種� ��以上の細胞を任意の比率で混在させて用い� ��こともできる。また、細胞組織体を形成す� ��場合には、細胞同士の間で互いに結合を形� ��できる細胞を好ましく用いることができる� ��

 また、細胞の培養に用いる溶液としては� ��用いる細胞の生存状態や機能等を維持する� ��とができるよう、必要な塩類や栄養成分等� ��適切な濃度で含む任意の水溶液を用いるこ� ��ができる。具体的に、この溶液としては、� ��えば、DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)� �の基礎培地に抗生物質等を添加した培養液� �、いわゆる生理食塩水等を用いることがで� �る。

 図18は、本方法に含まれる主な工程を示� �フロー図である。図18に示すように、本方法 は、器具1のマイクロウェル群20に細胞を播種 する播種工程S100と、当該マイクロウェル群20 で細胞を培養する培養工程S200と、当該ウェ� �群20で培養された細胞に対して所定の処理を 施す処理工程S300と、を含む。

 播種工程S100においては、例えば、図3及� �図4に示すような枠部材3を基部材2に取り付� �た装着状態で、器具1のうちマクロウェル50� �細胞を含む溶液を注入することによって、� �該マクロウェル50に対応する一つのマイクロ ウェル群20に細胞を播種することができる。� ��体的に、この場合、例えば、まず、装着状� ��の器具1を、クリーンベンチ等の無菌的な培 養操作空間内において気相(空気)中に載置す� ��。そして、操作者は、ピペットを用いて、� ��胞を分散した培養液を、器具1のマクロウェ ル50内に注ぎ入れる。この結果、マクロウェ� ��50の底面51に形成された複数のマイクロウェ ル21の各々に細胞を播種することができる。� ��のような播種工程S100においては、播種に必 要な細胞や溶液の量を、マクロウェル50の容� ��に対応する量に低減することができ、且つ� ��マイクロウェル21に細胞を確実に播種する� �とができる。

 また、例えば、図8及び図9に示すように� �器具1に複数のマクロウェル50a~50dが形成され る場合には、当該複数のマクロウェル50a~50d� �各々に、互いに異なる条件で細胞を播種す� �こともできる。すなわち、例えば、マクロ� �ェル50a~50dごとに、互いに異なる種類の細胞� ��播種することができ、互いに異なる密度で� ��胞を播種することができ、又は互いに異な� ��培養液を用いて細胞を播種することができ� ��。

 培養工程S200においては、例えば、播種工 程S100で装着状態の器具1に細胞が播種された� ��合には、基部材2から枠部材3を取り外して� �分離状態の器具1のマイクロウェル群20で当� �細胞を培養することができる。すなわち、� �えば、枠部材3が取り外された基部材2のみ(� �離状態の器具1)を、所定の培養容器(例えば� �細胞培養に汎用されている数cm径のプラスチ ックディッシュ)内に載置し、その全体を培� �液中に浸漬した状態で細胞を培養する。

 また、培養工程S200においては、基部材2� �ら枠部材3を取外すことなく、装着状態の器� ��1で細胞の培養を行うこともできる。この場 合もまた、器具1は、所定の培養容器内に載� �される。そして、その全体が培養液中に浸� �された器具1のマイクロウェル群20で細胞が� �養される。

 図19は、分離状態の器具1(枠部材3が取り� �された基部材2)の全体を培養液M中に浸漬し� �培養を行う場合の一例を示す説明図である� �また、図20は、装着状態の器具1の全体を培� �液M中に浸漬して培養を行う場合の一例を示� ��説明図である。

 図19及び図20に示すように、器具1を用い� �細胞の培養においては、当該器具1の全体を� ��容可能な培養容器5を用いることができる。 この培養容器5は、器具1を収容可能な培養部5 aを有している。そして、この培養部5a内の底 面5bに器具1を載置するとともに、当該培養部 5aに培養液Mを満たす。この結果、器具1は、� �養液M中に沈降した状態で培養容器5の底面5b� ��に保持される。この培養容器5に収容された 器具1の各マイクロウェル21内で細胞を培養す ることができる。なお、この培養容器5とし� �は、例えば、細胞培養に汎用されているプ� �スチックディッシュを用いることができる� �

 また、装着状態の器具1においては、例え ば、顕微鏡等の光学的な手段により各マイク ロウェル21に保持されている細胞を観察する� ��合に、枠部材3によって光が散乱して、観察 に不都合が生じることがある。このため、培 養工程S200においては、例えば、マイクロウ� �ル21内の細胞を顕微鏡で観察する場合に、枠 部材3を基部材2から取外して器具1を分離状態 とすることが好ましい。そして、観察後には 、再び枠部材3を基部材2に取り付けて、細胞� ��培養を継続することもできる。このように� ��器具1においては、枠部材3が基部材2に取り� ��け可能であり、且つ当該基部材2から取り外 し可能に構成されているため、装着状態と分 離状態とを必要に応じて任意のタイミングで 任意の回数だけ切り替えることができる。

 処理工程S300においては、例えば、細胞が 培養された装着状態の器具1のうち、マクロ� �ェル50に所定の溶液を注入することによって 、当該マクロウェル50に対応する一つのマイ� ��ロウェル群20の細胞に当該所定の溶液を接� �させることができる。具体的に、この場合� �例えば、まず、マイクロウェル群20で細胞が 培養された装着状態の器具1を、クリーンベ� �チ等の無菌的な培養操作空間内において気� �(空気)中に載置する。そして、操作者は、ピ ペットを用いて、マイクロウェル50内の培養� ��を回収して除去した後、所定の溶液を、当� ��マクロウェル50内に新たに注ぎ入れる。こ� �結果、マクロウェル50の底面51に形成された� ��数のマイクロウェル21の各々に保持された� �胞に、当該溶液を接触させることができる� �このような処理工程S300においては、処理に� ��要な溶液の量を、マクロウェル50の容積に� �応する量に低減することができ、且つ各マ� �クロウェル21の細胞に対する当該溶液の接触 を確実に行うことができる。

 また、例えば、図8及び図9に示すように� �器具1に複数のマクロウェル50a~50dが形成され る場合には、装着状態の器具1のうち、当該� �数のマクロウェル50a~50dの各々に、互いに異� ��る溶液を注入することができる。この場合� ��複数のマクロウェル50a~50dに対応する複数の マイクロウェル群20a~20dの細胞に、互いに異� �る溶液を接触させることができる。すなわ� �、マクロウェル50a~50dごとに、互いに異なる� ��液を細胞に接触させることができる。具体� ��に、例えば、4つのマクロウェル50a~50dの各� �に、4種類の試薬のうち互いに異なる1種類の 試薬を含む溶液をそれぞれ注入することによ り、当該マクロウェル50a~50dごとに、互いに� �なる種類の試薬を細胞に接触させることが� �きる。

 このように、複数のマイクロウェル群20� �形成された基部材2と複数の窓部40が形成さ� �た枠部材3とを備えた器具1を用いることによ って、例えば、培養可能な細胞の数が非常に 少ない場合や、細胞に対する処理に使用する 溶液の量又は当該溶液に溶解させる試薬の量 が非常に少ない場合であっても、当該細胞の 培養操作を、多様な条件で、簡便且つ確実に 行うことができる。

 また、例えば、培養工程S200において、各 マイクロウェル21内で細胞組織体を形成した� ��合には、処理工程S300において、当該細胞組 織体に対して所定の処理を施すことができる 。すなわち、各マイクロウェル21の底面22の� �体を細胞非接着性に形成し、当該各マイク� �ウェル21内で細胞組織体を形成した場合には 、複数のマイクロウェル21内において当該細� ��組織体は浮遊状態で保持されている。この� ��め、処理工程S300においては、複数のマイク ロウェル21から複数の細胞組織体をまとめて� ��単且つ確実に回収することができる。

 さらに、この場合、図8及び図9に示すよ� �に、器具1の複数のマクロウェル50a~50dの各々 で細胞組織体を形成した場合には、装着状態 の器具1において、当該複数のマクロウェル50 a~50dの一部、例えば、一つのマクロウェル50a� ��みから選択的に、細胞組織体を回収するこ� ��もできる。

 また、例えば、各マイクロウェル21の底� �22の中央部分に細胞接着性の第一領域を形成 し、当該第一領域を囲む周辺部分を細胞非接 着性の第二領域として形成した場合には、当 該マイクロウェル21内で、当該底面22のうち� �一領域に接着した細胞組織体を形成するこ� �ができる。この場合、処理工程S300において� ��、各底面22に接着した状態の各細胞組織体� �、所定の溶液を接触させる等、所定の処理� �施すことができる。

 さらに、この場合、図8及び図9に示すよ� �に、器具1の複数のマクロウェル50a~50dの各々 で細胞組織体を形成した場合には、装着状態 の器具1において、当該複数のマクロウェル50 a~50dごとに、底面22に接着した細胞組織体に� �して互いに異なる溶液を接触させることも� �きる。

 図21及び図22は、器具1の他の例について� �説明図である。図21は、器具1の斜視図であ� �、図22は、図21に示すXXII-XXII線を通る面で切� ��した器具1の断面図である。

 図21及び図22に示す例に係る器具1は、上� �の例における基部材2に相当する基部80a~80dと 、上述の例における枠部材3に相当する枠部81 a~81dと、を備えている。これら基部80a~80dと枠 部81a~81dとは一体的に形成され、互いに着脱� �可能となっている。そして、対応する基部80 a~80dと枠部81a~81dとによって、溶液を保持可能 なマクロウェル50a~50dが形成されている。

 より具体的に、基部80a~80dは、図6~図9に示 す例におけるマクロウェル50a~50dの底部51a~51d� ��相当し、枠部81a~81dは、当該図6~図9に示す例 における窓部40a~40dの内壁41a~41dに相当する。� ��基部80a~80dには、一つずつマイクロウェル群 20a~20dが形成され、各枠部81a~81dは、当該各マ� ��クロウェル群20a~20dの周囲に立設されている 。また、この器具1は、4つのマクロウェル50a~ 50dの間を仕切る十字状に形成された仕切部82� ��有している。

 そして、一体的に形成された基部80及び� �部81を有する器具1においても、マクロウェ� �50が形成されていることによって、上述の例 と同様に、微小なマイクロウェル21を干上が� ��せることなく、マイクロウェル群20ごとに� �望の細胞培養操作を簡便且つ確実に行うこ� �ができる。また、複数のマイクロウェル群20 a~20dについて、互いに異なる処理を行うこと� ��できる。

 基部80a~80dと枠部81a~81dとが一体的な器具1� ��構成する材料としては、上述の基部材2や枠 部材3に用いられるものと同様の材料を用い� �ことができる。すなわち、例えば、ポリス� �レン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポ� �カーボネート、ポリアミド、ポリアセター� �、ポリエステル(ポリエチレンテレフタレー� ��等)、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリア クリレート、ポリメタクリレート(PMMA等)、ポ リビニル等の合成樹脂、PDMS等のシリコン系� �脂、EPDM等の合成ゴム、天然ゴム、ガラス、� ��ラミック、ステンレス鋼等の金属材料、か� ��なる群より選択される1つの材料を単独で用 い、又は2以上の材料を組み合わせて用いる� �とができる。

 また、器具1を構成する材料、特に、マイ クロウェル群20が形成されている部分を構成� ��る材料としては、例えば、当該マイクロウ� ��ル群20内で培養された細胞を顕微鏡等の光� �的な手段により観察する場合の利便性の点� �ら、上述した材料のうち、透光性の材料を� �ましく用いることができる。すなわち、本� �施形態において、器具1は、例えば、その全� ��又は一部が透光性の合成樹脂やガラスを用� ��て形成することができる。

 また、マイクロウェル21の形成には、目� �に応じて選択される任意の加工方法を用い� �ことができる。すなわち、例えば、マシニ� �グセンタ等を用いた穿孔加工、レーザー等� �用いた光微細加工、エッチング加工、エン� �ス加工等により、予め成形された器具1の基� ��80a~80dの一部にマイクロウェル21を形成する� ��とができる。この場合、例えば、ポリスチ� ��ン等の透光性の樹脂から成形された市販の� ��ラスチックディッシュの底面に上記のよう� ��加工方法を用いてマイクロウェル21を形成� �ることにより、器具1を製造することもでき� ��。また、例えば、射出成形、プレス成形、� ��テレオリソグラフィー等により、基部80a~80d と枠部81a~81dとが一体的な器具1の成形と同時� ��、当該基部80a~80dの一部にマイクロウェル21� ��形成することができる。

 以上説明したように、本発明に係る器具1 は、特に、稀少な細胞と稀少な試薬を用いた 簡便且つ確実な細胞培養操作を可能とする。 したがって、器具1は、培養細胞を利用した� �薬、再生医療、基礎研究等の様々な産業利� �において極めて有用なツールとして期待で� �る。

 次に、器具1を用いた本方法の具体的な実 施例について説明する。

[実施例1]
 図1~図4に示すような器具1を用い、播種工程 S100において、装着状態の器具1に細胞を播種� ��た場合と、分離状態の器具1に細胞を播種し た場合と、についてマイクロウェル群20に細� ��を保持できる効率を比較した。すなわち、P MMA製の平板(24mm×24mm、厚さ400μm)の表面のうち 、10mm×10mmの矩形範囲内に、マシニングセン� �(卓上型NC微細加工機、株式会社ピーエムテ� �ー製)を用いた穿孔加工処理により、直径300� �m、深さ200μmの円形のマイクロウェル21を1020� ��形成した。この複数のマイクロ21ウェルは� �互いにその開口部24及び底面22の円の中心間� ��離が330μmとなるように規則的に配置した。� ��に、スパッタリング装置(E―1030、日立株式� ��社製)を用いたスパッタリング処理を施すこ とにより、その表面にプラチナ(Pt)の薄膜(厚� ��6nm)を形成した。

 このようにして、図1~図4に示すような基� ��材2を作製した。すなわち、この基部材2の� �面11のうち10mm×10mmの矩形範囲内には、開口� �24及び底面22が直径300μmの円形であり、深さ� ��200μmであるマイクロウェル21を1020個含む一� ��のマイクロウェル群20が形成された。

 さらに、細胞非接着性物質である分子量3000 0のポリエチレングリコール(PEG)鎖を有する細 胞非接着性の合成高分子(化学式:CH ₃ (CH ₂ CH ₂ ) _n SH、日油株式会社製)を5mMの濃度で含むエタノ ール溶液を、各マイクロウェル21内に注入し� ��窒素雰囲気下において当該細胞非接着性高� ��子が有するチオール基と当該各マイクロウ� ��ル21の底面22のプラチナ表面との間に化学結 合を形成させることにより、当該底面22に当� ��細胞非接着性高分子を固定化した。その後� ��第一基板部10の全体をエタノール溶液によ� �て十分に洗浄して余剰の細胞非接着性高分� �を除去するとともに、当該第一基板部10をエ タノールに約10分間浸漬し、さらに当該第一� ��板10に紫外線照射を約30分間照射することに より滅菌処理を行った。このようにして形成 された各マイクロウェル21の底面22は、その� �体が細胞非接着性となった。

 一方、PDMS製の平板(20mm×20mm、厚さ2.2mm)に� ��第一基板部10のマイクロウェル群20を収容可 能な矩形の貫通穴(10mm×10mm)として窓部40を形� ��することにより、図1~図4に示すような枠部� ��30を作製した。すなわち、まず、直径90mmの� ��ラスチックディッシュ内に、PDMSのプレポリ マーと硬化剤とを10:1の体積比率で混ぜ合せ� �PDMS溶液(Sylgard184、Daw Corning社製)を13mL流し込 み、室温で2日間放置することにより硬化さ� �た。次に、硬化したPDMS円板をディッシュか� ��取り外し、メスを使って上記形状のPDMS製枠 部材3を切り出した。この枠部材3は、その全� ��がPDMSで形成されたため、当該枠部材3の下� �31を基部材2の上面11に押し付けることによっ て構成した装着状態の器具1においては、当� �下面31と当該上面11とを容易且つ確実に密着� ��せることができた。その結果、図3及び図4� �示すような、溶液を保持可能な一つのマク� �ウェル50が形成された器具1を構成すること� �できた。

 そして、第一の条件においては、図20に示� �ように、直径35mmのプラスチックディッシュ( 培養容器5)内に装着状態の器具1を載置し、当 該器具1のうち、マクロウェル50(10mm×10mm×2.2mm )内に、培養液(10%のウシ胎児血清を添加したW illiams medium E培地)にHepG2細胞(理化学研究所� �バイオリソースセンター)を4×10 ⁵ 個/mLの密度で分散させた細胞分散液を0.25mL入 れた。すなわち、1×10 ⁵ 個のHepG2細胞を一つのマクロウェル50に播種� �た。播種後、2時間が経過した後に、ピペッ� ��操作により、マクロウェル50内のマイクロ� �ェル群20に保持されている細胞を回収し、当 該回収した細胞に含まれるデオキシリボ核酸 (DNA)を定量した。このDNAの定量は、DAPI(4’6-di amidino-2-phenylindole)を用いた方法により行った� ��このDNAの定量結果から、播種に用いた細胞� ��総数に対する、実際にマイクロウェル21内� �保持された細胞の数の割合を細胞固定化率(% )として算出した。

 一方、第二の条件においては、図19に示す� �うに、直径35mmのプラスチックディッシュ(培 養容器5)内に分離状態の器具1(すなわち、基� �材2のみ)を載置し、当該プラスチックディッ シュ内に、上述の培養液にHepG2細胞を4×10 ⁵ 個/mLの密度で分散させた細胞分散液を2mL入れ た。すなわち、8×10 ⁵ 個のHepG2細胞をプラスチックディッシュ内に� ��種した。なお、このとき、基部材2の全体は 培養容器5内において培養液に浸漬された。� �して、上記の第一の条件と同様に、播種か� �2時間後に、マイクロウェル群20に保持され� �細胞を回収して、DNAの定量を行い、細胞固� �化率(%)を算出した。

 その結果、上記第二の条件で得られた細� ��固定化率は約15%であったのに対して、上記� ��一の条件で得られた細胞固定化率は約100%で あった。すなわち、基部材2に枠部材3を取り� ��けた装着状態で細胞の播種を行うことによ� ��て、マイクロウェル群20への細胞の保持を� �便且つ確実に行うことができることが確認� �れた。

[実施例2]
 上述の実施例1と同様に作製された器具1を� �い、播種工程S100において、装着状態の器具1 に細胞を播種した場合と、分離状態の器具1� �細胞を播種した場合と、について複数のマ� �クロウェル21の各々に保持される細胞の数の ばらつきを比較した。

 すなわち、第一の条件においては、図20に� �すように、直径35mmのプラスチックディッシ� ��内に装着状態の器具1を載置し、当該器具1� �うち、マクロウェル50(10mm×10mm×2.2mm)内に、� �養液(10%のウシ胎児血清を添加したWilliams med ium E培地)にHepG2細胞を4×10 ⁵ 個/mLの密度で分散させた細胞分散液を0.25mL入 れた。播種後、2時間が経過した後に、器具1� ��中央付近に形成された60個のマイクロウェ� �21の各々の底面22に沈降した細胞の数を位相� ��顕微鏡下で計数した。

 一方、第二の条件においては、図19に示す� �うに、直径35mmのプラスチックディッシュ内� ��分離状態の器具1(すなわち、基部材2のみ)を 載置し、当該プラスチックディッシュ内に、 上述の培養液にHepG2細胞を4×10 ⁵ 個/mLの密度で分散させた細胞分散液を2mL入れ た。そして、播種から2時間後に、上記の第� �の条件と同様の位置に形成された60個のマイ クロウェル21の各々の底面22に沈降した細胞� �数を位相差顕微鏡下で計数した。

 その結果、1つのマイクロウェル21に保持� ��れた細胞の数は、第一の条件では68.2±13.4(� �術平均±標準偏差)個であり、第二の条件で� �66.9±16.9(算術平均±標準偏差)個であった。す なわち、基部材2に枠部材3を取り付けた装着� ��態で細胞の播種を行うことによって、各マ� ��クロウェル21に保持される細胞の数のばら� �きを低減できる傾向が確認された。

[実施例3]
 上述の実施例1と同様に作製された器具1を� �いて、各マイクロウェル21内で細胞組織体を 形成した。そして、培養工程S200において、� �着状態の器具1に保持された当該細胞組織体� ��顕微鏡観察した場合と、分離状態の器具1に 保持された細胞組織体を顕微鏡観察した場合 と、について観察の明瞭さを比較した。

 すなわち、器具1の各マイクロウェル21内に� ��HepG2細胞を播種し、10日間培養することによ り、当該各マイクロウェル21内に当該HepG2細� �が三次元的に集合した球状の細胞組織体(HepG 2スフェロイド)を1つずつ形成させた。なお、 培養液としては10%のウシ胎児血清を添加した Williams medium E培地を用い、HepG2細胞は、各マ クロウェル50に2×10 ⁵ 個のHepG2細胞を播種した。そして、装着状態� ��は分離状態の器具1の各マイクロウェル21内� ��おいて、培養10日目のHepG2スフェロイドを位 相差顕微鏡下で観察した。

 図23には、装着状態の器具1において、枠� ��材3に近接した、マイクロウェル群20の端部� ��のマイクロウェル21内で形成されたHepG2スフ ェロイドT1の位相差顕微鏡写真を示す。一方� ��図24には、分離状態の器具1において、図23� �同様にマイクロウェル群20の端部分のマイク ロウェル21内で形成されたHepG2スフェロイドT2 の位相差顕微鏡写真を示す。図23に示すよう� ��、装着状態の器具1においては、マイクロウ ェル群20のうち枠部材3に近接したマイクロウ ェル21内のHepG2スフェロイドT1の一部が明瞭に 観察されなかった。これに対し、図24に示す� ��うに、分離状態の器具1においては、マイク ロウェル群20の全域にわたって各マイクロウ� ��ル21内のHepG2スフェロイドT2は明瞭に観察す� ��ことができた。すなわち、器具1の各マイク ロウェル21内の細胞又は細胞組織体を顕微鏡� ��で観察する場合には、枠部材3を基部材2か� �取り外した分離状態とすることが好ましい� �とが確認された。

[実施例4]
 上述の実施例1と同様の方法により、各マイ クロウェル21の底面22が細胞非接着性である2� ��類の器具1(以下、「第一の器具1」、「第二� ��器具1」という)を作製した。第一の器具1に� ��いては、上面11のうち10mm×10mmの矩形範囲内� ��、開口部24及び底面22が直径300μmの円形であ り、深さが200μmであり、中心間距離が440μmで 規則的に配置された572個のマイクロウェル21� ��含む一つのマイクロウェル群20を形成した� �また、第二の器具1においては、上面11のう� �10mm×10mmの矩形範囲内に、開口部24及び底面22 が直径400μmの円形であり、深さが260μmであり 、中心間距離が440μmで規則的に配置された572 個のマイクロウェル21を含む一つのマイクロ� ��ェル群20を形成した。そして、第一の器具1� ��各マイクロウェル21内及び第二の器具1の各� ��イクロウェル21内で細胞組織体を形成した� �

 すなわち、図20に示すように、直径35mmのプ� ��スチックディッシュ(培養容器5)内に装着状� ��の第一の器具1を載置した。次いで、第一の 器具1のうち、マクロウェル50内にマウスES細� ��(大日本住友製薬)を分散した細胞分散液を� �入することにより、当該マウスES細胞を各マ イクロウェル21内に播種した。そして、この� ��養容器5内に培養液をさらに2.0mL加えて、装� ��状態の第一の器具1の全体を当該培養液中に 浸漬させた状態で5日間培養を行った。その� �果、各マイクロウェル21内にマウスES細胞が� ��次元的に集合した球状の細胞組織体(胚様体 )を1つずつ形成させることができた。培養液� ��しては、15%ウシ胎児血清、1%ヌクレオシド� �1%非必須アミノ酸、1%2-メルカプトエタノー� �、1%グルタミンを含むDMEM培地を用い、第一� �器具1の一つのマクロウェル50に、1×10 ⁵ 個のマウスES細胞を播種した。一方、同様に� ��培養容器5内に載置した第二の器具1の各マ� �クロウェル21内に、マウス神経幹細胞(大阪� �療センターより提供)を播種した。そして、5 日間培養することにより、各マイクロウェル 21内にマウス神経幹細胞が三次元的に集合し� ��球状の細胞組織体(ニューロスフェア)を1つ� ��つ形成させた。培養液としては、1%N-2 supple ment、20ng/mLのHuman recombinant EGF、20ng/mLのHuman  recombinant bFGFを含むDMEM/F12培地を用い、第二� �器具1の一つのマクロウェル50に、1×10 ⁵ 個のマウス神経幹細胞を播種した。

 また、対照群として、直径35mmのプラスチッ クディッシュ(組織培養ディッシュ、日本ベ� �トン・ディッキンソン株式会社製)の底面全� ��に、上記第一の器具1及び第二の器具2の各� �イクロウェル21の底面22に固定化したものと� ��様の細胞非接着性高分子を固定化し、当該� ��養ディッシュ内でマウスES細胞又はマウス� �経幹細胞を5日間培養した。なお、マウスES� �胞については、培養液として15%ウシ胎児血� �、1%ヌクレオシド、1%非必須アミノ酸、1%2-メ ルカプトエタノール、1%グルタミンを含むDMEM 培地を用い、培養ディッシュあたり4×10 ⁵ 個の細胞を播種し、マウス神経幹細胞につい ては、培養液として1%N-2 supplement、20ng/mLのHum an recombinant EGF、20ng/mLのHuman recombinant bFGFを 含むDMEM/F12培地を用い、培養ディッシュあた� ��1×10 ⁵ 個の細胞を播種した。

 そして、器具1の各マイクロウェル21内又� ��対照の培養ディッシュ内で培養5日目に形成 されていた細胞組織体を位相差顕微鏡下で観 察するとともに、100個の胚様体又はニューロ スフェアについて、そのサイズの分布を測定 した。

 その結果、図25に示すように、マウスES細 胞を播種した器具1の各マイクロウェル21内に おいては、球状の胚様体T3が1つずつ形成され た。また、図26に示すように、マウス神経幹� ��胞を播種した器具1の各マイクロウェル21内� ��おいては、球状のニューロスフェアT4が1つ� ��つ形成された。これら胚様体及びニューロ� ��フェアは、各マイクロウェル21内において� �底面22に接着することなく、浮遊状態で保持 されていた。

 図27には、器具1の各マイクロウェル21内� �は対照の培養ディッシュ内で培養5日目に形� ��されていた胚様体の直径の分布を示す。図2 8には、器具1の各マイクロウェル21内又は対� �の培養ディッシュ内で培養5日目に形成され� ��いたニューロスフェアの直径の分布を示す� ��図27及び図28において、横軸は細胞組織体の 直径(μm)を示し、縦軸は、各直径の細胞組織� ��の数(個)を示す。また、黒丸印は器具1のマ� ��クロウェル群20で形成された細胞組織体に� �いての測定値を示し、白四角印は対照の培� �ディッシュで形成された細胞組織体につい� �の測定値を示す。図27及び図28に示すように� ��対照の培養ディッシュでは様々な直径の細� ��組織体が形成されたのに対して、器具1のマ イクロウェル群20では、均一な直径の細胞組� ��体が形成されていた。すなわち、第一の器� ��1のマイクロウェル群20でマウスES細胞を培� �することにより、各マイクロウェル21に、直 径が140μm~240μmの範囲内である胚様体を1個ず� ��、底面22に接着しない状態で形成すること� �できた。また、第二の器具1のマイクロウェ� ��群20でマウス神経幹細胞を培養することに� �り、各マイクロウェル21に、直径が120μm~200μ mの範囲内であるニューロスフェアを1個ずつ� ��底面22に接着しない状態で形成することが� �きた。

[実施例5]
 まず、PMMA製の平板(24mm×24mm、厚さ200μm)の表 面のうち、10mm×10mmの矩形範囲内に、マシニ� �グセンタ(卓上型NC微細加工機、株式会社ピ� �エムティー製)を用いた穿孔加工処理により� ��直径300μmの円形の貫通孔を672個形成した。� ��の円形貫通孔は、互いにその中心間距離が4 00μmとなるように規則的に配置した。次に、� ��の円形貫通孔が設けられたPMMA平板の一方側 の表面に、貫通孔を設けていない別体に形成 されたPMMA製の平板(24mm×24mm、厚さ200μm)を熱� �着処理(106℃、2時間)によって貼り付けた。

 このようにして、図1~図4に示すような基� ��材2を作製した。すなわち、この基部材2の� �面11のうち10mm×10mmの矩形範囲内に、開口部24 及び底面22が直径300μmの円形であり、深さが2 00μmであり、中心間距離が400μmで規則的に配� ��された672個のマイクロウェル21を含む一つ� �マイクロウェル群20が形成された。そして、 さらに、スパッタリング装置(E―1030、日立株 式会社製)を用いたスパッタリング処理を施� �ことにより、各マイクロウェル21の底面22に� ��ラチナ(Pt)の薄膜(厚さ6nm)を形成した。

 一方、直径200μm、長さ200μm、中心間距離� ��400μmの複数の円筒状突起の各々の先端にさ� ��に直径100μm、長さ70μmの円筒状突起が形成� �れたPDMS製のスタンプをモールド成形により� ��製した。そして、このスタンプを用いたマ� ��クロコンタクトプリンティングにより、各� ��イクロウェル21の底面22に細胞接着性の第一 領域を形成した。すなわち、細胞接着性のタ ンパク質であるコラーゲン(CellmatrixType I-C、� ��田ゼラチン社製)を含む水溶液に、スタンプ の各円筒状突起の先端を浸した。そして、位 相差顕微鏡下において観察しながら、各円筒 状突起の位置を、上述のプラチナが蒸着され た各マイクロウェル21の底面22の中央付近の� �置に押し当てることにより、当該各円筒状� �起の先端に塗布されていたコラーゲンを、� �該底面22の中央付近に塗布した。このように して、直径300μmの各マイクロウェル21の底面2 2の中央付近に、細胞接着性である直径約100μ mの第一領域を1つ形成した。

 さらに、底面22のうち、第一領域以外の部� �を細胞非接着性とした。すなわち、細胞非� �着性物質である分子量5000又は分子量10000のPE G鎖を有する細胞非接着性の合成高分子(化学� ��:CH ₃ (CH ₂ CH ₂ ) _n SH、日油株式会社製)を5mMの濃度で含むエタノ ール溶液を、第一領域を形成後の各マイクロ ウェル21内に注入した。そして、窒素雰囲気� ��で所定時間放置することにより、細胞非接� ��性高分子を、各マイクロウェル21の底面22の うち、第一領域の周辺部分に固定化した。

 このようにして形成した細胞接着性の第一� ��域と細胞非接着性の第二領域とからなる底� ��22を有する各マイクロウェル21内に、初代ラ ット肝細胞又はマウスES細胞(大日本住友製薬 )を播種した。そして、5日間培養することに� ��り、各マイクロウェル21内に初代ラット肝� �胞が三次元的に集合した球状の細胞組織体(� ��細胞スフェロイド)又は球状の胚様体を1つ� �つ形成させた。なお、初代ラット肝細胞は� �各マイクロウェル21の第二領域に分子量5000� �PEG鎖を有する細胞非接着性高分子が固定化� �れた器具1を用いて培養した。また、マウスE S細胞は、各マイクロウェル21の第二領域に分 子量10000のPEG鎖を有する細胞非接着性高分子� ��固定化された器具1を用いて培養した。また 、初代ラット肝細胞については、培養液とし て60mg/Lのプロリン、50μg/LのEGF、10mg/Lのイン� �ュリン、7.5mg/Lのヒドロコルチゾン、0.1μMの� ��酸銅・5水和物、3μg/Lのセレン酸、50pMの硫� �亜鉛・7水和物、50μg/Lのリノール酸、58.8mg/L� ��ペニシリン、100mg/Lのストレプトマイシン、 1.05g/Lの炭酸水素ナトリウム、1.19g/LのHEPESを� �えたDMEM無血清培地を用い、器具1に一つ形成 されたマクロウェル50に1.7×10 ⁵ 個/cm ² の密度で播種した。一方、マウスES細胞につ� ��ては、培養液として15%ウシ胎児血清、1%ヌ� �レオシド、1%非必須アミノ酸、1%2-メルカプ� �エタノール、1%グルタミンを含むDMEM培地を� �い、器具1に一つ形成されたマクロウェル50� �1×10 ⁵ 個/cm ² の密度で播種した。

 また、初代ラット肝細胞についての対照� ��として、肝細胞のスフェロイド形成に適し� ��いるとされる直径35mmのプラスチックディッ シュ(プライマリア、日本ベクトン・ディッ� �ンソン株式会社製)内で初代ラット肝細胞を5 日間培養した。また、マウスES細胞について� ��対照群として、直径35mmのプラスチックディ ッシュ(組織培養ディッシュ、日本ベクトン� �ディッキンソン株式会社製)の底面全体に、� ��イクロウェル21の底面22に固定化したものと 同様の細胞非接着性高分子を固定化し、当該 培養ディッシュ内でマウスES細胞を5日間培養 した。

 そして、器具1の各マイクロウェル21内又� ��対照の培養ディッシュ内で培養5日目に形成 されていた細胞組織体を位相差顕微鏡下で観 察するとともに、100個の肝細胞スフェロイド 又は胚様体について、そのサイズの分布を測 定した。

 その結果、図29に示すように、初代ラッ� �肝細胞を播種した器具1の各マイクロウェル2 1内においては、球状の肝細胞スフェロイドT5 が1つずつ形成された。また、図30に示すよう に、マウスES細胞を播種した器具1の各マイク ロウェル21内においては、球状の胚様体T6が1� ��ずつ形成された。これら肝細胞スフェロイ� ��及び胚様体は、各マイクロウェル21内にお� �て、底面22のうち、第一領域に接着した状態 で保持されていた。

 図31には、器具1の各マイクロウェル21内� �は対照の培養ディッシュ内で培養5日目に形� ��されていた肝細胞スフェロイドの直径の分� ��を示す。図32には、器具1の各マイクロウェ� ��21内又は対照の培養ディッシュ内で培養5日� ��に形成されていた胚様体の直径の分布を示� ��。図31及び図32において、横軸は細胞組織体 の直径(μm)を示し、縦軸は、各直径の細胞組� ��体の数(個)を示す。また、黒丸印は器具1の� ��イクロウェル群20で形成された細胞組織体� �ついての測定値を示し、白四角印は対照の� �養ディッシュで形成された細胞組織体につ� �ての測定値を示す。図31及び図32に示すよう� ��、対照の培養ディッシュでは様々な直径の� ��胞組織体が形成されたのに対して、器具1の マイクロウェル群20では、均一な直径の細胞� ��織体が形成されていた。すなわち、器具1の マイクロウェル群20で初代ラット肝細胞を培� ��することにより、各マイクロウェル21に、� �径が120μm~200μmの範囲内である肝細胞スフェ� ��イドを1個ずつ、底面22の中央付近に接着し� ��状態で形成することができた。また、器具1 のマイクロウェル群20でマウスES細胞を培養� �ることにより、各マイクロウェル21に、直径 が120μm~200μmの範囲内である胚様体を1個ずつ� ��底面22の中央付近に接着した状態で形成す� �ことができた。

[実施例6]
 図6~図9に示すような4つのマクロウェル50a~50 dが形成された器具1を作製し、当該4つのマク ロウェル50a~50dの各々に互いに独立に溶液を� �持可能であることを確認した。すなわち、� �述の実施例1の場合と同様の方法により、PMMA 製の平板(24mm×24mm、厚さ700μm)の表面のうち、 互いに離間した4つの矩形の範囲(6mm×6mm)の各� ��に、直径300μm、深さ200μmの円形のマイクロ� ��ェル21を中心間距離330μmにて378個形成する� �とにより、図6~図9に示すような4つのマイク� ��ウェル群20a~20dが形成された基部材2を作製� �た。

 一方、PDMS製の平板(24mm×24mm、厚さ3mm)に、 第一基板部10の4つのマイクロウェル群20a~20d� �うち互いに異なる一つを収容可能な矩形の� �通穴(7mm×7mm)を形成することにより、図6~図9� ��示すような4つの窓部40a~40dが形成された枠� �材30を作製した。

 図33には、このようにして作製した4つの� ��イクロウェル群20a~20dが形成された基部材2� �、4つの窓部40a~40dが形成された枠部材3と、� �分離された状態の器具1の写真を示す。また� ��図34には、この基部材2に枠部材3が取り付け られて、4つのマクロウェル50a~50dが形成され� ��装着状態の器具1の写真を示す。そして、図 35には、この装着状態の器具1において、4つ� �マクロウェル50a~50dの各々に、互いに異なる� ��液を保持させた場合の写真を示す。すなわ� ��、図35に示す器具1において、第一のマクロ� ��ェル50aには、細胞が生存しているか死滅し� ��いるかを判断するために使用される、紺色� ��トリパンブルー溶液S1が保持されており、� �二のマクロウェル50bには、無色透明の緩衝� �S2が保持されており、第三のマクロウェル50c 及び第四のマクロウェル50dには、pHを判断す� ��ために赤色の色素であるフェノールレッド� ��添加されている赤色の培養培地S3が保持さ� �ている。図35に示すように、器具1の4つのマ� ��ロウェル50a~50dの各々には、互いに独立に溶 液を保持することできることが確認された。

[実施例7]
 上述の実施例1と同様に作製された器具1を� �いて、図5に示す辺縁ウェル21iと枠部材3との 距離Dと、当該辺縁ウェル21i及び中央ウェル21 iiで形成される細胞組織体のサイズと、の関� ��を検討した。

 すなわち、PMMA製の平板(24mm×24mm、厚さ400� �m)から成形された基部材2と、PDMS製の平板(20m m×20mm、厚さ1.1mm)から成形された枠部材3と、� ��備え、上記距離Dが互いに異なる5種類の器� �1を製造した。

 具体的に、上面11のうち、10mm×10mmの矩形� ��囲内に、直径300μm、深さ300μmの円形のマイ� ��ロウェル21が900個規則的に配置された基部� �2を製造した。すなわち、この基部材2には、 一定の間隔で直列的に配置された30個のマイ� ��ロウェル21からなる列が、当該一定の間隔� �並列に30列配置された。各マイクロウェル21� ��底面22は細胞非接着性とした。

 一方、基部材2に取り付けられた場合に、 距離Dが0μm、300μm、600μm、1000μm又は2000μmの� �ずれかとなるように互いに異なるサイズの� �形の窓部40が形成された5種類の枠部材3を製� ��した。これら5種類の枠部材3のいずれかと� �基部材2と、を組み合わせることにより、1つ のマクロウェル50を有し、距離Dが互いに異な る5種類の器具1を製造した。

 次いで、各器具1を直径35mmのプラスチック� �ィッシュ(組織培養ディッシュ、日本ベクト� ��・ディッキンソン株式会社製)内に入れた。 そして、各器具1のマクロウェル50内に、培養 液に分散させたHepG2細胞を2×10 ⁵ 個ずつ播種した。この培養液をマクロウェル 50内に2時間放置して細胞を培養することによ り、当該細胞を当該マクロウェル50の底面51� �に沈降させた。その後、プラスチックディ� �シュに2mLの培養液を入れて、器具1の全体を� ��養液内に浸漬した。そして、培養液中に浸� ��した器具1のマクロウェル50内において細胞� ��14日間培養した。また、枠部材3を取り付け� ��い基部材2のみからなる、分離状態の器具1� �準備した。そして、マイクロウェル群20の面 積あたりの細胞密度が上記装着状態の器具1� �等しくなるようHepG2細胞を播種し、同様に培 養した。その結果、各器具1の各マイクロウ� �ル21内にHepG2細胞が三次元的に集合した球状� ��細胞組織体(HepG2スフェロイド)を1つずつ形� �させることができた。

 そして、各器具1について、マイクロウェ ル群20の辺縁の列に含まれる辺縁ウェル21iの� ��ち50個の各々に形成された辺縁組織体Tiの直 径と、辺縁から11番目~20番目の列に含まれる� ��央ウェル21iiのうち50個の各々に形成された� ��央組織体Tiiの直径と、を位相差顕微鏡を用� ��た観察によりそれぞれ測定した。さらに、� ��央組織体Tiiの直径の算術平均値に対する、� ��縁組織体Tiの直径の算術平均値の比率を「� �径比」として算出した。

 図36は、6種類の器具1で形成された細胞組 織体の位相差顕微鏡写真である。図36(A)は距� ��Dが0μmである器具1、図36(B)は距離Dが300μmで� ��る器具1、図36(C)は距離Dが600μmである器具1� �図36(D)は距離Dが1000μmである器具1、図36(E)は� ��離Dが2000μmである器具1、図36(F)は枠部材3を� ��しない器具1についての写真をそれぞれ示す 。図36(F)の下方に示すスケールバーの長さは5 00μmを示している。

 図36に示すように、各器具1のマクロウェ� ��50の底面51において、枠部材3に隣接する辺� �ウェル21i内には球状の辺縁組織体Tiが1つず� �形成され、より内側の中央ウェル21ii内には� ��状の中央組織体Tiiが1つずつ形成された。辺 縁組織体Ti及び中央組織体Tiiはいずれも、辺� ��ウェル21i及び中央ウェル21ii内において、底 面22及び内壁23に接着することなく培養液中� �浮遊しつつ保持されていた。なお、この実� �例7においては、器具1の全体が培養液中に十 分に浸漬させるとともに、顕微鏡観察時の光 の強さを適切に調整する等、操作条件を工夫 することにより、図36に示すように、鮮明な� ��微鏡写真を得た。

 図37は、各器具1について算出された細胞� ��織体の直径比を示す。図37において、横軸� �各器具1の距離Dを示し、縦軸は各器具1にお� �る直径比を示す。なお、図37の横軸の右端に 示す「枠部材無」は、枠部材3が取り付けら� �ていない基部材2を用いた場合の結果を示し� ��いる。

 図37に示すように、距離Dを低減すること� ��よって、枠部材3が取り付けられていない場 合(「枠部材無」)に比べて、直径比を低減す� ��ことができた。すなわち、距離Dを2000μm以� �に低減することによって直径比を1.20以下に� ��減することができた。また、距離Dを1000μm� �下に低減することによって直径比を1.16以下� ��低減することができた。特に、距離Dを600μm 以下に低減した場合には、直径比を1.15以下� �低減することができた。

 このように、器具1を用いた細胞組織体の 形成においては、当該器具1の距離Dを特定の� ��小な範囲内にすることによって、辺縁組織� ��と中央組織体とのサイズのずれを効果的に� ��減して、極めて均一なサイズの多数の細胞� ��織体を簡便且つ確実に形成できることが確� ��された。

 なお、本発明に係る器具1及びこれを用い た細胞培養方法は上述の例に限られない。例 えば、基部材2のマイクロウェル21は、目的に 応じた任意の形状で形成することができる。 すなわち、マイクロウェル2の開口部24及び底 面22は、円形に限られず、例えば、多角形に� ��成することもできる。また、開口部24と底� �22とは異なる形状に形成することもできる。 また、開口部24と底面22とは異なる面積で形� �することもできる。すなわち、例えば、マ� �クロウェル21の内壁23を傾斜するように形成� ��て、開口部24より底面22の面積を小さく形成 することもできる。また、マイクロウェル21� ��、実質的に底面22を有しない、傾斜した内� �23のみを有するテーパ形状に形成することも できる。また、枠部材3の窓部40もまた、円形 や多角形等、目的に応じた任意の形状に形成 することができる。

 また、基部材2に複数のマイクロウェル群 20が形成される場合、枠部材3には1又は複数� �任意の数の窓部40を形成することができる。 また、器具1を用いた培養の過程において、1� ��の基部材2と、複数の種類の枠部材3と、を� �み合わせて使用することもできる。すなわ� �、例えば、所定数のマイクロウェル群20が形 成された基部材2と、互いに異なる数の窓部40 が形成された複数の枠部材3の各々と、を必� �に応じて組み合わせて使用することができ� �。具体的に、例えば、図6~図9に示すように� �基部材2に4つのマイクロウェル群20a~20dが形� �されている場合、播種工程S100においては、� ��6~図9に示すような4つの窓部40a~40dが形成さ� �た枠部材3を取り付けて、当該4つのマイクロ ウェル群20a~20dの各々に細胞を播種する。そ� �て、培養工程S200においては、図19に示すよ� �に枠部材3を取り外した分離状態の器具1で培 養を継続する。さらに、処理工程S300におい� �は、図11及び図12に示すような、窓部40が一� �だけ形成された枠部材3を当該基部材2に取り 付けて、当該4つのマイクロウェル群20a~20dの� ��ち、一つのマクロウェル50に対応する一つ� �マクロウェル群20b内の細胞と、その他の3つ� ��マクロウェル群20a、20c、20d内の細胞と、に� ��いに異なる組成の溶液を接触させることも� ��きる。

 また、保持部材4は、図15~図17に示すよう� ��、基部材2の外周22及び枠部材3の外周33の全� ��に当接する当接部を有するものに限られな� ��。すなわち、保持部材4は、基部材2と枠部� �3とを所定の位置関係で一体的に保持できる� ��のであれば、これらの外周22及び外周33のそ れぞれの一部に当接する当接部を有するもの とすることができる。