Zellkulturen enthaltend Poly(oxazolin)-Stabilisatoren und Verwendung von Poly- (oxazolin)en zur Stabilisierung von Zellkulturen

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Kultivierung von Zellen in einem Zellkultur- medium und die Verwendung von Poly(oxazolin)en zur Stabilisierung von

Zellkulturen.

Beschrieben werden Zellkulturen enthaltend in einem Zellkulturmedium ein oder mehrere wasserlösliche Poly(oxazolin)e. Das wasserlösliche Poly(oxazolin) wirkt als Stabilisator für die Zellen und verringert den mechanischen Stress, der durch das Bewegen des Zellkulturmediums auf die Zellen ausgeübt wird. Dieses führt zu einer gegenüber dem unstabilisierten Zustand verbesserten Überlebensrate der Zellen.

Die Kultivierung von Zellen in Zellkulturmedien außerhalb eines Organismus ist bekannt. Zellkulturen finden breite Verwendung in Forschung, Entwicklung und Produktion.

Bei der Kultivierung von Zellen werden Suspensionen von Zellen in einem Zellkulturmedium oder von auf Oberflächen anhaftenden Zellen in einem Zellkulturmedium wachsen gelassen.

Dabei ist man bestrebt, eine möglichst hohe Volumendichte an Zellen im Zellkulturmedium oder auf der Oberfläche zu erreichen. Dieses verspricht eine erhöhte Ausbeute an Zellen und an gewünschten Stoffwechselprodukten, kann aber auch zu Problemen führen. Infolge der hohen Zellaktivität kann es zu einer erschwerten Versorgung der Zellen mit lebensnotwendigen Agenzien, beispielsweise mit

Nährstoffen oder mit Sauerstoff, kommen. Dieses versucht man unter anderem

BESTÄTIGUNGSKOPIE durch starkes Rühren des Nährmediums zu verhindern. Dabei entstehen

zwangsläufig im Zellkulturmedium oder in der Nähe der Oberflächen Turbulenzen, welche wiederum die Zellen mechanisch belasten und damit schädigen können. Aus dem Stand der Technik ist der Zusatz ausgewählter wasserlöslicher Polymerer zu-Zellkulturmedien bereits bekannt und erprobt. Typische Additive in diesem Zusammenhang sind Polyethylenglykol-polypropylenglykol-Blockcopolymere, die z.B. als Kolliphor ^® P188 oder als Pluronic ^® F68 erhältlich sind. Durch den Einsatz dieser Stabilisatoren lässt sich die Belastung der Zellen verringern.

S. Lueck et al. und M. Platen et al. synthetisierten hydrogelbasierte„Microbeads" ausgehend von Methacrylatmonomeren, die mit Poly(oxazolin)en quervernetzt wurden. Diese Polymere dienen als bioabbaubare Hydrogeltransportsysteme für Stammzellkulturen. Hierbei wurden wasserunlösliche Matritzen mittels Polymere aufgebaut, um die wenigen Stammzellen schonend und„artgerecht" zu kultivieren. Die Polymere liegen also nicht in Lösung vor. Dies unterscheidet sich damit grundlegend von einem Ansatz, bei dem Polymere zum Zellkulturmedium gegeben werden und diese Polymere damit in diesem Medium gelöst vorliegen und für eine Kultivierung von Zellen unter Stress eingesetzt werden. Die Zellen werden dabei nicht fest in eine Matrize eingebettet (Biomaterials, 2016, 79, 1 -14, S, Lueck, R. Scubel, J. Rueb, D. Hahn, E. Mathieu, H. Zimmermann, D. Schwarnweber, C.

Werner, S. Pautot, R. Jordan, Tailored and biodegradable poly(2-oxazoline) microbeads as 3D matrices for stem cell culture in regenerative therapies;

Biomacromolecules, 2015, 16, 1516-1524, M. Platen, E. Mathieu, S. Lueck, R. Schubel, R. Jordan, S. Pautot, Poly(2-oxazoline)-based microgel particles for neuronal cell culture).

A. Dworak et al., A. Utrata-Wesolek et al. und P. I. Haris et al. funktionalisierten Oberflächen, indem die reaktive Spezies der Ringöffnungspolymerisation auf eine Amin-funktionalisierte Oberfläche gebracht wurde, um die Polymere so kovalent an die Oberfläche zu binden, während die Polymerisation terminiert wird. Diese funktionalisierten Oberflächen wurden dann in Fibroblasten-Zellkulturen genutzt, um diese reversibel anzuheften. Y. Chen et al. verglichen diesbezüglich die Eigenschaften von Poly(2-methy-2-oxazolin-g-L-lysin) mit Poly(ethylenglycol-g-lysin) und gehen zusätzlich auf die Serumstabilität der Polymere ein. Sie fanden heraus, dass das Poly(2-oxazolin) basierte System eine höhere Serumstabilität aufweist als das Poly(ethylenglycol) basierte System. A. Tait et al. nutzten für eine Oberflächen- beschichtung nach einem ähnlichen Prinzip Poly(2-methyl-2-oxazolin), Poly(2-ethyl- 2-oxazolin), Poly(2-propyl-2-oxazolin) und Poly(2-butyl-2-oxazolin) und verwendeten die so modifizierten Oberflächen zur Züchtung von Geweben. Bei diesen Ansätzen wurden also jeweils immobilisierte Polymere eingesetzt und es wurden sowohl hydrophile also auch hydrophobe Polyoxazoline eingesetzt (J. Mater Sei. Mater. Med., 2014, 25, 1 149-1 163, A. Dworak, A. Utrata-Wesolek, N. Oleszko, W. Walach, B. Trzebicka, J. Aniol, A. L. Sieron, A. Klama-Baryla, M. Kawecki. Poly(2-substituted- 2-oxazoline) surfaces for dermal fibroblasts adhesion and detachment; EP 2 574 664 A1 , A. Utrata-Wesolek, W. Walach, N. Oleszko, A. Dworak, B. Trzebicka, A.

Kowalczuk, J. Aniol, M. Lesiak, A. Sitkowska, A. L. Sieron, M. Kawecki, J. Glik, A. Klama-Baryla, M. Nowak, Method forpreparation-a-thermosensitive coating on a Substrate, the Substrate with a thermosensitive coating and its application; Bio- Medical Materials and Engineering, 2004, 14, 419-425. P. I Haris, M. Dahm, J.

Ruehe, B. Berchthold, D. Pruefer, O. Prucker, B.-J. Chang, A. Wallrath, H. Oelert, Ultrathin polymer monolayers for promotion of cell growth on bioprosthetic materials - Evolution of a new coneept to improve long term Performance of biologic heart vales; Biointerphases, 2014, 9, Y. Chen, B. Pidhatika, T. von Erlach, R. Konradi, M. Textor, H. Hall, T. Luhmann doi: 10.1 1 16/14878461 ; Biomaterials, 2015, 61, 26-32, A. Tait, A. L. Fisher, T. Hartland, D. Smart, P. Glynne-Jones, M. Hill, E. J. Swindle, M. Grossei, D. E. Davies, Biocompatibility of poly(2-alkyl-2-oxazoline) brush surfaces for adherent lung cell lines).

R. Himmelreich, S. Werner und M. N. Leiske et al. nutzen Poly(2-oxazolin)e, um Nukleinsäuren aus biologischen Proben aufzureinigen. Dazu wurden in diese zusätzliche funktionelle Gruppen, wie Amine eingeführt. Die genannten Quellen nutzten funktionalisierte Poly(2-oxazoline) zur Aufreinigung von Nukleinsäuren und nicht als Zellkulturzusatz (EP 2 163 621 A1 entsprechend WO 2010/026167 A1 , R. Himmelreich, S. Werner, Method and reagents for isolating and purifying nucleic acids from biological samples or from biochemical reactions by lysis, adhesion, washing, and elution; Adv. Func. Mater., 2015, 25, 2458-2466, M. N. Leiske, M. Hartlieb, C. Paulenz, D. Pretzel, M. Hentschel, C. Englert, M. Gottschaidt, U. S. Schubert, Lab in a tube: Purification, amplification, and detection of DNA using poly(2-oxazoline) multilayers).

Die aus dem im Stand der Technik bekannten polymerbasierten Systeme, welche Poly(2-oxazolin)e anwenden, setzten diese immobilisiert in einem Kultivierungs- gefäß, jedoch nicht als Mediumzusatz bei der Zellkultur ein. Dieses erfolgt zur Verhinderung der Adhäsion / des Wachstums der Zellen an einer Oberfläche. Zu diesem Zweck werden die Oberflächen mit biokompatiblen Polymeren beschichtet, welche auf der Oberfläche immobilisiert sind. Bekannte polymerbasierte gelöste Zusätze in Zellkulturen sind die bereits weiter oben erwähnten hydrophilen Copolymere Pluronic ^® F68-oder Kolliphor ^® P188.

Es wurde nun überraschend gefunden, dass bei Verwendung von ausgewählten Poly(oxazolin)en als Stabilisatoren in Zellkulturmedien bei der Kultivierung der Zellen bei gleicher Konzentration ein erhöhter positiver Beitrag zur Verbesserung der Überlebensrate der Zellen resultiert. Der Einsatz dieser ausgewählten

Poly(oxazolin)e als Stabilisatoren in Zellkulturmedien ist bisher nicht beschrieben worden. Teilweise hydrolysierte Poly(2-ethyl-2-oxazoline) wurden als Zusätze zu Kulturen von 3T3 Fibroblasten, ßTC3 Pankreaszellen oder P388.D1 Makrophagen eingesetzt (J. Mater Sei: Mater Med 26:157, S. 1 -12, 2015, R. Shah, Z. Kronekova, A.

Zahoranovä, L. Roller, N. Saha, P. Saha, J.Kronek, In vitro study of partially hydrolyzed poly(2-ethyl-2-oxazolines) as materials for biomedical applications). In dieser Arbeit wurde die Cytotoxizität von Polyoxazolin-Polyethylenimin-Copolymeren untersucht, da lineares Polyethylenimin aus Poly(2-ethyl-2-oxazolin) durch Hydrolyse hergestellt wird. Dabei wurden Poly(2-ethyl-2-oxazoline) als Vergleichssubstanzen eingesetzt. Zur Untersuchung der Cytotoxizität wurden die Zellen in Gegenwart von fötalem Rinderserum (FBS) oder von Pferdeserum (HS) kultiviert, sodann mit dem betreffenden Polymer und MTT Lösung versetzt und weitere 2 Stunden lang kultiviert. Danach wurden die Zellen isoliert und es wurde deren Absorbanz bei 595 nm als Maß für deren Lebenfähigkeit bestimmt.

In einer Reihe von biotechnologischen Anwendungen ist der Einsatz von Seren bei der Kultivierung von Zellen nicht gewünscht oder nicht möglich. Ein Grund dafür liegt neben ethischen Aspekten in der natürlich gegebenen Chargenschwankung und der daraus folgenden fehlenden Reproduzierbarkeit sowie potentiellen Kontaminationen und/oder Immunogenitäten von Seren, die zu Komplikationen bei Patienten führen können. Des Weiteren können Seren Verunreinigungen enthalten und Krankheiten übertragen. Daher werden bei der Zellkultivierung vermehrt serum freie Kulturmedien, besser noch chemisch definierte Medien, angestrebt, in denen somit Komponenten mit definierteren und reproduzierbaren Eigenschaften vorliegen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand in der Bereitstellung von Zellkulturen, die sich durch eine hervorragende Stabilität während und nach der

Kultivierung und durch eine gegenüber dem unstabilisierten Zustand verbesserte Überlebensrate auszeichnen.

Das technische Problem wird durch die Bereitstellung von Zellkulturen, die in einem Zellkulturmedium ein oder mehrere Poly(oxazolin)e enhalten gelöst. Wie oben erwähnt ist aus dem Stand der Technik der Zusatz ausgewählter wasserlöslicher Polymere, wie beispielsweise Pluronic ^® F68 bekannt. Wie bspw. in Abbildung 6 der Anmeldung gezeigt, sank die Viabilität einer Zellkultur enthaltend Pluronic ^® F68 innerhalb von 3 bzw. 4 Tagen auf unter 60%. Ferner wurde eine sogenannte lot-to- lot Variabilität bei dem Zusatz Pluronic ^® F68 gezeigt (Beispiel 5). Im Gegensatz dazu zeigten die Zellkulturen der vorliegenden Erfindung, die in einem Zellkulturmedium ein oder mehrere Poly(oxazolin)e enthalten, selbst unter hohen Scherbelastungen deutlich erhöhte maximale Zelldichten, erhöhte Viabilitäten und eine längere

Kulturdauer gegenüber dem Zusatz Pluronic ^® F68 (vgl. hierzu Abbildung 6 sowie die Tabellen 1 , 2 und 3). Ferner konnte kein bedeutender Unterschied verschiedener getesteter Poly(oxazolin)e Lots untereinander in Zellkulturen erkannt werden (vgl. hierzu bspw. Abbildung 9 und Beispiel 5). Somit betrifft die vorliegende Erfindung Zellkulturen, die ein oder mehrere

wasserlösliche Poly(oxazolin)e im Zellkulturmediüm enthalten. Bevorzugt betrifft die vorliegende Erfindung Zellkulturen, die ein oder mehrere wasserlösliche

Poly(oxazolin)e im Zellkulturmedium enthalten, mit der Maßgabe, dass das

Zellkulturmedium im Wesentlichen kein Serum enthält. Folglich betrifft die

vorliegende Erfindung vorzugsweise Zellkulturen, die ein oder mehrere

wasserlösliche Poly(oxazolin)e in einem Zellkulturmedium enthalten, mit der

Maßgabe, dass das eingesetzte Zellkulturmedium im Wesentlichen serum-frei ist.

Bevorzugte erfindungsgemäße Zellkulturen sind dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkulturen und insbesondere das Zellkulturmedium frei von tierischen

Bestandteilen sind. Ferner betrifft die Erfindung Zellkulturen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass das eingesetzte Zellkulturmedium protein-frei ist/ Besonders bevorzugt sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Zellkulturen, enthaltend ein Zellkulturmedium, das serum-frei und/oder protein-frei ist.

Weitere bevorzugte erfindungsgemäße Zellkulturen sind solche, die Zellkulturmedien mit nur definierteren chemischen und/oder biotechnologischen Bestandteilen enthalten. In anderen Worten sind bevorzugte Zellkulturen solche, die dadurch gekennzeichnet sind, dass das Zellkulturmedium ein chemisch definiertes Medium ist.

Unter„Zellen" sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung kleinste lebende Einheiten von Organismen zu verstehen. Dabei kann es sich um Zellen von Ein- oder Mehrzellern handeln, welche von Prokaryonten oder von Eukaryoten stammen können. Bei den Zellen kann es sich um Mikroorganismen, um einzelne Zellen oder um Gewebe handeln. Zellen können prokariontischen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs sein oder auch von Pilzen stammen. Vorzugsweise werden eukaryotische Zellen eingesetzt, insbesondere solche, die ursprünglich aus Gewebe isoliert wurden und dauerhaft kultiviert werden können, die also immortalisiert sind.

Unter„Zellkultur" werden im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Kombinationen von Zellen und Zellkulturmedium bezeichnet, wobei die Zellen in dem Zellkulturmedium außerhalb des Organismus kultiviert werden. Dabei kommen Zelllinien zum Einsatz, also Zellen einer Gewebeart, die sich im Verlauf der Kultivierung fortpflanzen können. Es können sowohl immortalisierte (unsterbliche) Zelllinien als auch primäre Zellen (Primärkultur) kultiviert werden. Unter Primärkultur ist üblicherweise eine nicht immortalisierte Zellkultur zu verstehen, die direkt aus einem Gewebe gewonnen wurde.

Unter„Zellkulturmedium" oder„Nährmedium" sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung wässrige Systeme zu verstehen, die als Plattform für die Kultivierung von Zellen dienen. Diese Systeme enthalten alle benötigten Substanzen, die für das Wachstum und die Viabilität der Zellen erforderlich sind.

Unter„im Wesentlichen kein Serum enthaltende Zellkulturmedien" sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Zellkulturmedien zu verstehen, die kein Serum oder nur geringen Mengen von bis zu 1 Gew. %, vorzugsweise von weniger als 0,1 Gew. %, bezogen auf das Zellkulturmedium an Serum enthalten.

Die Verwendung von Zellkulturmedien im Bereich der pharmazeutischen Industrie, beispielsweise zur Herstellung von Arzneimitteln, wie von aktiven rekombinanten Polypeptiden, erlaubt im Allgemeinen keine Verwendung von irgendeinem Material biologischen und/oder tierischen Ursprungs aufgrund von Sicherheits- und

Kontaminationsproblemen. Daher ist das eingesetzte Zellkulturmedium gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ein serum- und/oder protein-freies Medium. Der Begriff„Proteine" bedeutet im Rahmen dieser Beschreibung Proteine aus mehr als 100 Aminosäuren. Demnach kann das Zellkulturmedium der vorliegenden Erfindung bspw. rekombinates Insulin (bestehend aus 51 Aminosäuren) enthalten. Das Zellkulturmedium gemäß der vorliegenden Erfindung ist auch nicht ergänzt mit einer hydrolysierten Proteinquelle, wie Sojabohnen-, Weizen- oder Reispepton oder Hefehydrolysat oder dergleichen. Unter„Serum" ist im Rahmen dieser Beschreibung ein Blutserum oder ein Immunserum zu verstehen. Dabei versteht man unter Blutserum jenen flüssigen Anteil des Blutes, den man als Überstand erhält, wenn eine Blutprobe zentrifugiert wird. Dieser Überstand enthält bis auf die durch die Gerinnung verbrauchten Gerinnungsfaktoren alle natürlicherweise in der Blutflüssigkeit gelösten Stoffe. Das Blutserum entspricht also dem Blutplasma abzüglich der Gerinnungsfaktoren. Unter Immunserum versteht man eine Aufreinigung spezifischer Antikörper, die aus dem Blutserum immunisierter Säugetiere gewonnen werden.

Seren bedeuten im Rahmen dieser Beschreibung in der Regel Seren von

Wirbeltieren, und insbesondere Seren von Kalb, Kuh, Rind, Pferd oder Mensch.

Unter "Zellkulturmedien im Wesentlichen frei von tierischen Bestandteilen" sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Zellkulturmedien zu verstehen, die keine oder nur geringen Mengen von bis zu 1 Gew. %, vorzugsweise von weniger als 0,1 Gew. %, bezogen auf das Zellkulturmedium an tierischen Bestandteilen enthalten. Typische tierische Bestandteile die in den erfindungsgemäßen Zellkulturen und Zellkulturmedien vermieden werden sind Serum und Serum abgeleitete Proteine, wie z.B. Albumin, Transferrin oder andere Wachstumsfaktoren sowie rekominante Formen davon oder Protein aus Pflanzen- oder Hefehydrolysaten oder ultrafiltrierte Formen davon.

Unter„chemisch definierten Zellkulturmedien" sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Zellkulturmedien zu verstehen, die neben Wasser zusätzlich chemisch und/oder biotechnologisch hergestellte Bestandteile enthalten, und insbesondere Zellkulturmedien, die neben Wasser ausschließlich aus chemisch und/oder biotechnologisch hergestellten Bestandteilen bestehen. Typischerweise ist ein„chemisch definiertes Zellkulturmedium" (auch„chemisch definiertes Medium" genannt) ein Begriff, der von dem Fachmann auf dem Gebiet der Zellkultur und Zellkulturmedien verstanden wird und dem Fachmann bekannt ist. Demzufolge bezieht sich der Begriff„chemisch definiertes Zellkulturmedium" auf eine

Nährlösung, in welcher Zellen enthalten sind und gezüchtet werden und die im Allgemeinen mindestens eine oder mehrere Komponenten aus dem Folgenden bereitstellen: eine Energiequelle (üblicherweise in Form eines Kohlenhydrats wie Glucose); alle essentiellen Aminosäuren und im Allgemeinen die zwanzig basischen Aminosäuren, Säuren, plus Cystein; Vitamine und/oder andere organische

Verbindungen, die typischerweise in geringen Konzentrationen benötigt werden; Lipide oder freie Fettsäuren, z.B. Linolsäure; anorganische Verbindungen oder natürlich vorkommende Elemente, die typischerweise in sehr geringen

Konzentrationen, üblicherweise im mikromolaren Bereich dem Zellkulturmedium enthalten sind. Zellkulturmedien können auch durch eine Vielzahl von fakultativen Komponenten, wie Salze, z. B. Calcium, Magnesium und Phosphat, und Puffer, z.B. HEPES; Nucleoside und Basen, z.B. Adenosin, Thymidin, Hypoxanthin; Antibiotika, z.B. Gentamycin ergänzt werden.

Der Begriff "chemisch definiertes Zellkulturmedium" steht also für ein vollständig chemisch definiertes Medium, das keine Zusätze aus tierischen Quellen enthält, wie Gewebehydrolysate, z.B. fetales Rinderserum oder dergleichen. Des Weiteren werden Proteine, insbesondere Wachstumsfaktoren wie bspw. Transferrin oder rekombinante Formen davon, ebenfalls nicht zu der Zellkultur gemäß der

vorliegenden Erfindung gegeben.

Im Handel erhältliche serum- und/oder protein-freie Zellkulturmedien können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden und umfassen zum Beispiel die von der Xell AG (Bielefeld) angebotenen Medien HEK TF (Bestellnr. 861 ), HEK GM

(Bestellnr. 851 ), HEK FS (Bestellnr. 871 ), BHK Medium (Bestellnr. 910), BHK FS (Bestelln. 915), MDXK Medium (Bestellnr. 1010), HYB GM (Bestelln. 890), HYB FS (Bestelln. 895), TCX6D Medium (Bestellnr. 1070), TCX10D Medium (Bestellnr. 1100), TCX7D (Bestellnr. 1080), CHO TF (Bestellnr. 886) . Unter„Bioreaktoren" oder„Fermentern" sind im Rahmen der vorliegenden

Beschreibung Gefäße für die Kultivierung von Zellen zu verstehen, in denen die Zellen in Kontakt mit einem Zellkulturmedium stehen und unter dauerhafter

Bewegung zu hohen Zelldichten kultiviert werden können. Die Zellen können dabei in dem Zellkulturmedium suspendiert vorliegen oder adhärent auf Oberflächen wachsen, die in Kontakt mit dem Zellkulturmedium stehen. Zweck der Kultivierung in einem Bioreaktor kann die Gewinnung der Zellen oder von Stoffechselprodukten sein. Letztere können z.B. als Wirkstoffe in der pharmazeutischen Industrie oder als Grundchemikalien in der chemischen Industrie eingesetzt werden. In Bioreaktoren werden in der Regel mehrere Faktoren gesteuert und/oder überwacht, die das

Wachstum der Zellen beeinflussen. Beispiele dafür sind die Zusammensetzung des Nährmediums, die Sauerstoffzufuhr, die Temperatur, der pH-Wert und die Sterilität. Es können unterschiedliche Reaktorvarianten in unterschiedlicher Ausführung verwendet werden. Beispiele dafür sind Rührkesselreaktoren, z.B. solche aus Metall, die ein Volumen von wenigen bis tausenden Litern haben können und die mit

Nährlösung gefüllt werden. Es lassen sich auch ander Varianten einsetzen, wie z.B. Festbettreaktoren, Photobioreaktoren oder Wirbelschichtreaktoren.

Unter„Polymeren" sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung organische Verbindungen zu verstehen, die durch Wiederholung von bestimmten Einheiten (Monomereinheiten oder Wiederholungseinheiten) gekennzeichnet sind. Polymere können aus einer Art oder aus mehreren Arten verschiedener Wiederholungseinheiten bestehen. Polymere werden durch die chemische Reaktion von Monomeren unter Ausbildung von kovalenten Bindungen hergestellt (Polymerisation) und bilden durch Verknüpfen der polymerisierten Einheiten das sogenannte Polymerrückgrad. Dieses kann Seitenketten aufweisen, an denen sich funktionelle Gruppen befinden können. Homopolymere bestehen nur aus einer Monomereinheit. Copolymere bestehen hingegen aus mindestens zwei unterschiedlichen Monomereinheiten, welche statistisch, als Gradient, alternierend oder als Block angeordnet sein können.

Unter„Tensiden" sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung wasserlösliche Stoffe oder Stoffgemische zu verstehen, die der Stabilisierung von Zellkulturen dienen. Sie werden üblicherweise der wässrigen Phase bei der Kultivierung der Zellen zugegeben und dienen vor allem dazu, die Auswirkungen von Scherkräften auf die Zellen zu minimieren und damit die Viabilität der Zellen zu erhöhen. Unter„wasserlöslichen Poly(oxazolin)en" sind im Rahmen der vorliegenden

Beschreibung Polyoxazoline zu verstehen, die sich zu mindestens 10 g/L Wasser bei 25 °C lösen.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Zellen können nach Standardmethoden erzeugt und kultiviert werden.

So lassen sich z.B. Primärkulturen aus unterschiedlichen Geweben anlegen, beispielsweise aus Geweben einzelner Organe, wie Haut, Herz, Niere oder Leber, oder aus Tumorgewebe. Die Gewebezellen können durch an sich bekannte

Methoden vereinzelt werden, z.B. durch Behandlung wird mit einer Protease, wodurch die Proteine abgebaut werden, die den Zellverband aufrechterhalten. Es kann auch angebracht sein, durch Zugabe von Wachstumsfaktoren gezielt manche Zelltypen zur Teilung anzueregen oder im Fall von schlecht wachsenden Zelltypen Fütterzellen, basalmembranartige Matrices oder recombinate Bestandteile der extrazellulären Matrix zu verwenden. Die erfindungsgemäß eingesetzten Zellen können auch durch Einschleusung eines Plasmids als Vektor genetisch verändert werden.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Zellen können eine eingeschränkte Lebensdauer besitzen oder es handelt sich um unsterbliche Zelllinien mit der Fähigkeit, sich unendlich zu teilen. Diese können durch durch zufällige Mutation erzeugt worden sein, z.B. in Tumorzellen, oder durch gezielte Veränderung, beispielsweise durch die künstliche Expression des Telomerase-Gens. Bei der erfindungsgemäß eingesetzten Zellen kann es sich um adhärent (auf

Oberflächen) wachsende Zellen handeln, wie beispielsweise Fibroblasten, Endothelzellen oder Knorpelzellen, oder es kann sich um Supensionszellen handeln, die frei im Nährmedium schwimmend wachsen, wie zum Beispiel Lymphozyten.

Bevorzugt werden Zellen eingesetzt, die im Zellkulturmedium suspendiert vorliegen.

Besonders bevorzugt werden suspensions-adaptierte Zellen eingesetzt. Dabei handelt es sich um Zellen, vorzugsweise um eukaryontische Zellen, die originär adhärent wachsen und kultiviert werden, aber durch Änderung der Medienbestandteile und Kultivierung in Suspension gehen können. Dadurch lassen sich höhere Zellkulturdichten erreichen.

Kulturbedingungen und Zellkulturmedien werden in Abhängigkeit von den einzelnen kultivierten Zellen ausgewählt. Die verschiedenen Zelltypen bevorzugen dabei unterschiedliche Nährmedien, die spezifisch zusammengestellt werden. So werden beispielsweise unterschiedliche pH-Werte eingestellt und die einzelnen Nährmedien können unterschiedliche Aminosäuren und/oder andere Nährstoffe in

unterschiedlichen Konzentrationen enthalten.

Die erfindungsgemäßen Zellkulturen werden besonders auf dem Gebiet der

Biotechnologie eingesetzt. Dabei kann es sich um die Produktion von

(rekombinanten) Proteinen, Viren- und/oder Viruspartikelproduktion, Untersuchung von Stoffwechsel, Teilung und weiteren zellulären Prozessen handeln. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Zellkulturen als Testsysteme eingesetzt werden, beispielsweise bei der Untersuchung der Wirkung von Substanzen auf Zell- eigenschaften, wie die Signaltransduktion oder die Toxizität. Die erfindungsgemäßen Zellkulturen können auch für die Herstellung von biotechnischen Produkten verwendet werden. Beispielsweise zur Herstellung von chemischen Verbindungen, wie von Grundstoffchemikalien oder von Wirkstoffen für die Pharmazeutik,

beispielsweise von monoklonalen Antikörpern, Proteinen oder Impfstoffen. Die erfindungsgemäßen Zellkulturen können auch in der Pflanzenzucht eingesetzt werden, beispielsweise in der pflanzlichen Gewebekultur, bei der aus Zellkulturen komplette Pflanzen erzeugt werden können. Bevorzugt werden in den erfindungsgemäßen Zellkulturen die folgenden Zelllinien eingesetzt: 293-T: Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Niere, Morphologie Epithel A431 : Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Haut, Morphologie Epithel A549: Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Adenokarzinome der Lunge, Morphologie Epithel

BCP1 : Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Blut, Morphologie Lymphozyt bEnd.3: Ursprungsspezies Maus, Ursprungsgewebe Gehirn/Großhirnrinde,

Morphologie Endothel

BHK-21 : Ursprungsspezies Hamster, Ursprungsgewebe Niere (embryonal),

Morphologie Fibroblast

BxPC-3: Ursprungsspezies Mensch; Ursprungsgewebe Pankreas Adenokarzinom, Morphologie Epithel

BY-2: Ursprungsspezies Tabak, Ursprungsgewebe Am Keimling induzierter Kallus CHO: Ursprungsspezies Hamster, Ursprungsgewebe Ovarien, Morphologie Epithel CMT: Ursprungsspezies Hund, Ursprungsgewebe Brsutdüse, Morphologie Epithel COS-1 : Ursprungsspezies Affe, Ursprungsgewebe Niere, Morphologie Fibroblast COS-7: Ursprungsspezies Affe, Ursprungsgewebe Niere, Morphologie Fibroblast CV-1 : Ursprungsspezies Affe, Ursprungsgewebe Niere, Morphologie Fibroblast EPC: Ursprungsspezies Fisch, Ursprungsgewebe Haut, Morphologie Epithel HDMEC-T: Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Vorhaut, Morphologie Endothel

HEK oder HEK 293: Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Niere

(embryonal), Morphologie Epithel

HeLa: Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Zervixkarzinom, Morphologie Epithel

HepG2: Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Leberzellkarzinom,

Morphologie Epithel

HL-60: Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Promyeloblasten, Morphologie Blutzellen HMEC-1 : Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Vorhaut, Morphologie Endothel

HUVEC-T: Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Nabelschnurvene, Morphologie Endothel

HT-1080: Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Fibrosarkom, Morphologie Bindegewebszellen

Jurkat: Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe T-Zell-Leukämie, Morphologie Blutzellen

K562: Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Leukämie, Morphologie myeloische Blutzellen

LNCaP: Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Prostata, Morphologie Epithel

MCF-7: Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Brust Adenokarzinom, Morphologie Epithel

MCF-10A: Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Brustdrüse, Morphologie Epithel

MDCK II: Ursprungsspezies Hund, Ursprungsgewebe Niere, Morphologie Epithel MDT-1A: Ursprungsspezies Maus, Morphologie Epithel

MyEnd: Ursprungsspezies Maus, Morphologie Endothel

Neuro-2A: Ursprungsspezies Maus, Ursprungsgewebe Gehirn, Morphologie

Neuroblast

NIH-3T3-T: Ursprungsspezies Maus, Ursprungsgewebe Embryo, Morphologie Fibroblast

NTERA-2 cl.D1 : Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Hoden Lungen- metastase, Morphologie Epithel

P19: Ursprungsspezies Maus, Ursprungsgewebe embryonales Karzinom,

Morphologie Epithel

PANC-1 : Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Pankreas Adenokarzinom, Morphologie Epithel

Peer: Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe T-cell leukemia

RTL-W1-T: Ursprungsspezies Regenbogenforelle, Morphologie Fibroblast

Sf-9: Ursprungsspezies Nachtfalter, Ursprungsgewebe Ovar Saos-2: Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Osteosarkom, Morphologie Epithel

T2: Ursprungsspezies Mensch, Morphologie T-cell leukemia

T84: Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Kolorektales Karzinom Lungen- metastase, Morphologie Epithel

U-937: Ursprungsspezies Mensch, Ursprungsgewebe Burkitt-Lymphom,

Morphologie ^' monozytär.

Weitere in den erfindungsgemäßen Zellkulturen bevorzugt eingesetzte Zellen sind solche, die keine Fibroblasten, Pankreaszellen oder Makrophagen sind. In den erfindungsgemäßen Zellkulturen besonders bevorzugt eingesetze Zellen sind solche, die keine 3T3 Fibroblasten, die ßT3 Pankreaszellen und die murinen

P388.D1 Monozyten/Makrophagen sind. Weitere in den erfindungsgemäßen Zellkulturen bevorzugt eingesetzte Zellen sind Hybridomazellen. Dabei handelt es sich bekanntermaßen um Wirkstoffproduzierende Zellen, die mit Krebszellen (immortalisierten Zellen) fusioniert worden sind, wodurch unsterbliche Hybride entstehen. Weitere in den erfindungsgemäßen Zellkulturen bevorzugt eingesetzte Zellen sind Stammzellen. Dabei handelt es sich bekanntermaßen um Körperzellen, die sich in verschiedene Zelltypen oder Gewebe ausdifferenzieren können.

Besonders bevorzugt ist der Einsatz der Zelllinien CHO und HEK, vorzugsweise HEK 293.

Die erfindungsgemäßen Zellkulturen enthalten ein oder mehrere wasserlösliche Poly(oxazolin)e. Die Menge an Poly(oxazolin)en, bezogen auf die Gesamtmenge der erfindungsgemäßen Zellkultur, beträgt in der Regel 0,01 bis 15 Gew. %, 0,1 bis 5 Gew.%, vorzugsweise 0,05 bis 10 Gew. %, mehr bevorzugt 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1 , 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 1 , 1 ,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6,6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11 , 12, 13, 14 bis 15 Gew.%, ganz besonders bevorzugt 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1 , 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 bis 10 Gew. % und äußerst bevorzugt 0,1 , 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 bis 10 Gew. %.

Poly(oxazolin)e sind bekannte Verbindungen. Diese werden üblicherweise durch kationische Ringöffnungspolymerisation von Oxazolinen, vorzugsweise von 2- Oxazolinen, in Lösung und in Gegenwart eines Initiators hergestellt. Beispiele für Initiatoren sind Elektrophile, wie Salze oder Ester von aromatischen Sulfonsäuren oder Carbonsäuren oder Salze oder Ester von aliphatischen Sulfonsäuren oder Carbonsäuren oder aromatische Halogenverbindungen. Es können auch mehrfach- funktionelle Elektrophile als Initiatoren eingesetzt werden. Dabei können neben linearen Poly(oxazolin)en auch verzweigte oder sternförmige Moleküle entstehen. Beispiele für bevorzugte Initiatoren sind Ester der Arylsulfonsäuren, wie Methyl- tosylat, Ester der Alkansulfonsäuren, wie Trifluormethansulfonsäure, oder Mono- oder Dibrombenzol. Die Polymerisation wird üblicherweise in einem polaren aprotischen Lösungsmittel durchgeführt, beispielsweise in Acetonitril. Als Oxazoline zur Herstellung der erfindungsgemäß eingesetzten Poly(oxazolin)e werden 2-Oxazoline (4,5-Dihydrooxazole) mit einer C=N-Doppelbindung zwischen dem Kohlenstoffatom 2 und dem Stickstoff atom eingesetzt. Diese können am 2-, 4- und/oder 5-Kohlenstoffatom und/oder am 3-Stickstoffatom substituiert sein, vorzugsweise am 2-Kohlenstoffatom und/oder am 3-Stickstoffatom.

Bevorzugt werden 2-Oxazoline eingesetzt, welche an 2-Position einen Substituenten enthalten. Beispiele für solche Substituenten sind Methyl oder Ethyl.

Neben den 2-Oxazolinen können bei der Herstellung der erfindungsgemäß eingesetzten wasserlöslichen Poly(oxazolin)e noch geringe Mengen weiterer mit 2- Oxazolinen copolymerisierbarer Monomere eingesetzt werden. Die erfindungsgemäß eingesetzten wasserlöslichen Poly(oxazolin)e enthalten in der Regel mindestens 80 Gew. %, insbesondere mindestens 90 Gew. % und ganz besonders bevorzugt mindestens 95 Gew. %, bezogen auf deren Gesamtmasse, an wiederkehrenden Struktureinheiten der Formel I und/oder der Formel II

-NR ¹ -CR ³ H-CR H- (I), -NR ¹ -CR ³ H-CR ⁴ H-CR ⁵ H- (II), worin

R ¹ einen Rest der Formel -CO-R ² bedeutet,

R ³ , R ⁴ und R ⁵ unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl bedeuten,

R ² ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl, -C _m H _2m -X oder -(CnH2n-O)o-(CpH ₂ p-O) _q -R ⁶ ,

R ⁶ Wasserstoff oder Ci-C ₆ -Alkyl, insbesondere Methyl oder ganz besonders bevorzugt Wasserstoff ist,

m eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist,

X ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, Alkoxy, Amino, N- Alkylamino, N, N-Dialkylamino, Carboxyl, Carbonsäureester, Sulfonyl,

Sulfonsäureester oder Carbamat,

n und p unabhängig voneinander ganze Zahlen von 2 bis 4 sind, wobei n ungleich p ist, n vorzugsweise 2 ist und p vorzugsweise 3 bedeutet, und

o und q unabhängig ganze Zahlen von 0 bis 60, insbesondere 1 bis 20 und ganz besonders bevorzugt 2 bis 10 sind, wobei mindestens eines der o oder q ungleich 0 ist.

Bevorzugte erfindungsgemäß eingesetzte wasserlösliche Poly(oxazolin)e sind solche, in denen R ² Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist und R ³ bis R ⁵ Wasserstoff bedeuten oder in denen R ² Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist und zwei der Reste R ³ bis R ⁵ Wasserstoff sind ist und einer der Reste R ³ bis R ⁵ Methyl oder Ethyl ist.

Die Molmasse der erfindungsgemäß eingesetzten Poly(oxazolin)e beträgt in der Regel 2.500 bis 500.000 g/mol, insbesondere 5.000 bis 50.000 g/mol. Die Molmasse wird für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung durch ¹ H-NMR-Analyse bestimmt. Eine indirekte Bestimmung der Molmasse ist auch über Endgruppenbestimmung des Polymerisationsgrades und des Molekulargewichts des Monomers möglich, indem man die Integrale der Protonen minteinander vergleicht und so die Anzahl der Wiederholeinheiten bestimmt.

Ganz besonders bevorzugte erfindungsgemäße Zellkulturen enthalten ein wasserlösliches Poly(oxazolin), das mindestens 90 Gew. %, insbesondere mindestens 95 Gew. %, bezogen auf dessen Gesamtmasse, an wiederkehrenden Struktureinheiten der Formel I aufweist, worin R ² Methyl oder Ethyl bedeutet.

Weitere bevorzugte erfindungsgemäße Zellkulturen enthalten neben den Zellen, dem Zellkulturmedium, dem wasserlöslichen Poly(oxazolin) einen oder mehrere Wirkstoffe, insbesondere einen oder mehrere pharmazeutische Wirkstoffe. Die Kultivierung der erfindungsgemäßen Zellkulturen kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Dabei werden Bioreaktoren eingesetzt. Diese werden mit

Nährmedium und Zellen gefüllt. Die Kultivierung kann ansatzweise oder

kontinuierlich erfolgen. Der Inhalt des Bioreaktors wird bewegt, vorzugsweise durch Rühren, wobei zur Erzeugung von Turbulenzen vorteilhaft Stromstörer eingesetzt werden. Das Bewegen des Reaktorinhalts kann durch an sich bekannte

Rührvorrichtungen erfolgen und/oder durch Eindüsen von Flüssigkeiten.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Proteinproduktion, Viren- und/oder Viruspartikelproduktion, Untersuchung von Stoffwechsel, Teilung und/oder weiteren zellulären Prozessen, umfassend die Kultivierung der hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Zellkulturen.

Die hierin beschriebenen Verfahren enthalten ferner bevorzugt die folgenden Maßnahmen:

i) Befüllen eines Bioreaktors mit Zellen und einem hierin beschriebenen

Zellkulturmedium, vorzugsweise einem serum- und/oder protein-freien Zellkulturmedium, wobei das Zellkulturmedium ein oder mehrere hierin beschriebene wasserlösliche Poly(oxazolin)e enthält ; und

ii) Bewegen des Inhalts des Bioreaktors. Die Temperatur bei der Kultivierung sowie die Zusammensetzung des Nährmediums werden nach den Bedürfnissen der zu kultivierenden Zellen ausgewählt.

Vorzugsweise erfolgt die Kultivierung der Zellen bei Temperaturen zwischen 31 und 39 °C, insbesondere bei Temperaturen zwischen 36 und 37 °C. Das Kultivieren der erfindungsgemäßen Zellkulturen kann anaerob oder insbesondere aerob erfolgen. Typischerweise enthält die Atmosphäre neben Stickstoff, Sauerstoff und Edelgasen noch C0 ₂ , beispielsweise in Mengen von 0,01 bis 10 Gew. %, insbesondere in Mengen von 0,01 bis 5 Gew. %, bezogen auf die Masse der Atmosphäre. Bevorzugt besteht die Atmosphäre im Bioreaktor aus Luft.

Die Dauer der Kultivierung der Zellen kann in weitem Bereich gewählt werden und sowohl satzweise wie auch kontinuierlich mit und ohne Zufütterung von Nährstoffen erfolgen. Typische Kultivierungsdauern für satzweise Verfahren betragen 5 Stunden bis 30 Tage, vorzugsweise 5 Stunden bis 21 Tage und insbesondere 10 Stunden bis 15 Tage. Typische Kultivierungsdauern für kontinuierliche Verfahren betragen 10 Tage bis 180 Tage, vorzugsweise 10 Tage bis 60 Tage und insbesondere 15 Tage bis 35 Tage.

Je nach Teilungsrate und Dichte der Zellen können Zellverbände alle paar Tage gelöst und auf neue Gefäße verteilt werden (auch„Passage" genannt). Die

Passagenzahl gibt dabei die Häufigkeit an, mit der die Zellen bereits passagiert wurden. Bei adhärenten Zellen in kontinuierlicher Kultur werden die Zellen

vorzugsweise regelmäßig vereinzelt, um eine Konfluenz und die damit verbundene Zellkontakthemmung zu vermeiden. Die erfindungsgemäß eingesetzten Poly(oxazolin)e können dem Zellkulturmedium während der Kultivierung und/oder während einer Modifikation der Zellkultur, wie einer Transfektion, zugesetzt werden. Nach der Kultivierung der erfindungsgemäßen Zellkultur im Bioreaktor wird diese vorzugsweise aufgearbeitet. Dabei werden die Zellen und/oder die erzeugten Wirkstoffe von den übrigen Inhaltsstoffen abgetrennt. Dieses kann durch

Standardmethoden erfolgen, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der hierin beschriebenen

wasserlöslichem Poly(oxazolin)e zur Stabilisierung von Zellkulturen. Bevorzugt werden, wie hierin vorstehend beschrieben, die Poly(oxazolin)e in ein hierin beschriebenes Zellkulturmedium eingebracht. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne diese zu begrenzen.

Beispiel 1A: Herstellung von Poly(2-oxazolin)en (PO _x ) in der Mikrowelle

Die Synthese von Poly(2-oxazolin)en wurde bereits in der Literatur beschrieben (vergl. z.B. F. Wiesbrock et al. Macromolecular Rapid Communications 2004, 25, 1895-1899). Die Vorgehensweise wird deshalb beispielhaft für Poly(2-ethyl-2- oxazolin) mit einem Polymerisationsgrad (DP) von 61 (Ρ(ΕίΟ _χ )βι) beschrieben.

In einem Mikrowellenreaktionsgefäß wurden unter inerten Bedingungen 2-Ethyl- -2-oxazolin (6,06 mL, 60,0 mmol), Methyltosylat (0,15 mL, 0,1 mmol) und Acetonitril (8,79 mL) gemischt. Das Reaktionsgefäß wurde dann in einer Synthesemikrowelle für 14 min auf 140 °C erhitzt. Anschließend wurde die Reaktion mittels der Zugabe von 0,5 mL deionisiertem Wasser terminiert und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende Lösung wurde aufgereinigt, indem sie mit Dichlormethan verdünnt und dann in einem Überschuss eiskaltem Diethylether gefällt wurde. Das ausgefallene Polymer wurde dann abfiltriert und in Dichlormethan gelöst. Das Lösungsmittel wurde anschließend am Rotationsverdampfer entfernt und das Polymer bis zur vollständigen Lösungsmittelfreiheit am Hochvakuum getrocknet. Das finale Produkt lag als kristalliner, weißer Feststoff vor.

¹ H-NMR (CDCb, 300 MHz): δ = 4,34 (0,1 H, s, Rückgrat-OH), 3,44 (4,0H, s,

Rückgrat), 3,02 (0,3H, s, CH ₃ -Rückgrat), 2,4 (1 ,7H, m, CH ₂ (EtOx)), 1 ,11 (2,5H, s, CH ₃ (EtOx)) ppm.

SEC (Eluent: DMAc ¹⁾ , 0,21 % LiCI, PS ²⁾ -Standard): M _n = 11.200 g mol ^"1 ,

M _w = 12.200 g mol ^"1 , D = 1 ,09.

^{1 )} DMAc = Dimethylacetamid

²⁾ PS = Polystyrol

Abbildung 1 zeigt ein ¹ H-NMR (300 MHz, CDCI ₃ ) des aufgereinigten P(EtOx) ₆ i . Abbildung 2 zeigt ein SEC Elugramm (DMAc, 0,21 % LiCI, PS-Kalibration) des aufgereinigten P (EtOx)6i .

Beispiel 1 B: Herstellung von PO _x im Reaktor Im Reaktor wurden unter inerten Bedingungen 2-Ethyl-2-oxazolin (4,04 L, 40,0 mol), Methyltosylat (100 mL, 0,67 mol) und Acetonitril (5,86 L) gemischt. Der Reaktor wurde dann unter Rückfluß für 6 Std erhitzt. Der Reaktionsfortschritt wurde kontrolliert, indem in regelmäßigen Abständen Proben gezogen wurden. Anschließend wurde die Reaktion mittels der Zugabe von 270 mL deionisiertem Wasser terminiert und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende Lösung wurde in fünf Portionen aufgereinigt. Dazu wurde jeweils das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Anschließend wurde das Polymer in 4 L Dichlormethan gelöst. Dann wurde die organische Phase mit 2 L einer gesättigten Natriumhydrogencarbonat Lösung und anschließend zweimal mit 2 L einer gesättigten Natriumchlorid Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer verdampft. Dann wurde das Polymer bis zur vollständigen Lösungsmittelfreiheit am Hochvakuum getrocknet. Das finale Produkt lag als kristalliner, weißer Feststoff vor. Beispiel 2: Zellwachstum in Schikanekolben

Suspensions-adaptierte HEK-F Zellen wurden mittels dynamischer Zellkultur in serum freiem Medium (Mangelvariante des HEK TF Mediums (serum und protein frei, ohne Pluronic ^® F68) (Bestellnr. 861 (Xell AG, Bielefeld)) für mindestens 5 Tage ohne Zugabe von neuem Medium kultiviert. In einem Schikanekolben (250 ml_) wurden die Zellen mit einer Zelldichte von 0,3 χ 10 ⁶ Zellen pro ml_ in 30 - 40 ml_ Minimalmedium mit entsprechend zugesetztem Tensid (750 mg L ^"1 ) angesetzt. Die Kultivierung erfolgte im Inkubator unter Schütteln bei 128 rpm, 37°C und 5% CO ₂ . Jeden Tag wurde die Zelldichte sowie Zellviabilität durch Auszählung mittels

Trypanblau ermittelt. Als Abbruchkriterium gilt eine Zellviabilität unter 60%.

Tabelle 1 : Zellkonzentrationen der lebenden Zellen angegeben in Zellen pro Milliliter

Tabelle 2: Überlebensrate der Zellen, angegeben in %

Tag Pluronic ^® F68 P(EtOx) ₆₁ ^a > P(MeOx) ₅₇ ^b)

0 100 100 100

1 96,1 97,3 93,3 2 97,2 96,8 97,7

3 95,4 98,2 98,0

4 96,5 98,3 95,8

5 96,2 95,1 94,0

6 93,6 95,1 97,7

7 89,4 95,6 96,8

8 92,7 90,4 93,3 ^a) Poly(2-ethyl-2-oxazolin) mit einem Polymerisationsgrad (DP) von 61

b ⁾ Poly(2-methyl-2-oxazolin) mit einem Polymerisationsgrad (DP) von 57 Abbildung 3 zeigt die Zellkonzentrationen und Viabilität der HEK-F Zellen bei Kultivierung mit unterschiedlichen Tensiden.

Beispiel 3: Transfektion von Suspensionszellen HEK-F Zellen wurden im entsprechenden Minimalmedium Mangelvariante des HEK TF Mediums (serum und protein frei, ohne Pluronic ^® F68) (Bestellnr. 861 (Xell AG, Bielefeld)) mit Tensid (750 mg L ^"1 ) vorkultiviert. Am Tag der Transfektion wurden die Zellen zentrifugiert und die Zelldichte mit frischem Medium auf 3 χ 10 ⁶ Zellen ml_ ^"1 eingestellt. Die Transfektion bei N/P 20 (Amin- zu Phosphatverhältnis) erfolgte in einem 2 ml_ Ansatz wie folgt: zunächst Zugabe von 15 pg ml_ ^~1 pDNA (EGFP

Reportergen) zur Zellsuspension mit anschließendem Schwenken dieser, danach Zugabe von Polyethylenimin (PEI, 1 mg ml_ ^"1 ) und wiederholtem Schwenken der Kultur. Der Ansatz wurden für 4 h unter Schütteln im Inkubator bei 37°C, 5% CO ₂ inkubiert. Nach dieser Inkubationsperiode wurden die Zellen in 6-Wellplatten überführt und mit gleichen Volumen frischen Mediums verdünnt sowie für weitere 48 h inkubiert. Die Bestimmung der Transfektionseffizienz erfolgte mittels

Durchflusszytometrie.

Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der Transfektionsexperimente an HEK-F Zellen in Minimalmedium Inkubationszeit Zellviabilität Transfizierte Durchschnittliche [Stunden] [%] Zellen [%] Fluoreszenzintensität

Negativkontrolle 48 98,4 0,7 0,775

Minimalmedium 48 95,7 11 ,7 37,700

Pluoronic ^® F68 48 96,6 49,0 267,000

P(EtOx) ₆₁ 48 96,3 60,3 344,000

P(MeOx) ₅₇ 48 97,7 74,8 482,000

Abbildung 4 zeigt die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der transfizierten HEK-F Zellen.

Abbildung 5 zeigt eine Übersicht der Anzahl der transifizierten Zellen, angegeben in %, bei der Verwendung unterschiedlicher Kulturmedien. Beispiel 4: Variation des Konzentrationsbereichs von PO _x

Um den Konzentrationsbereich einschätzen zu können, in dem POxals Surfactant in Zellkulturprozessen verwendet werden kann, wurden zusätzliche Kultivierungen durchgeführt. HEK F Zellen wurden hierzu in einer Mangelvariante des HEK TF Mediums (serum und protein frei, ohne Pluronic ^® F68) (Bestellnr. 861 (Xell AG, Bielefeld)) unter Zusatz des derzeitigen Standard-Surfactants Pluronic ^® F68 oder des P(EtOx) kultiviert. Dabei wurden für Pluronic ^® F68 Konzentrationen von 0,75 g/L und 1 g/L eingesetzt (am häufigsten verwendete Konzentrationen) und P(EtOx) wurde in einem größeren Konzentrationsbereich von 0,75 g/L bis 15 g/L getestet. Um darüber hinaus auch die protektive Eigenschaft gegenüber erhöhten

Scherkräften zu untersuchen, wurde diese Testung sowohl in Schüttelkolben ohne Schikane als auch mit Schikane durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den

untenstehenden Graphen in den Abbildungen 6 bis 8 dargestellt. In den Abbildungen 6 bis 13 wird P(EtOx) mit A60 bezeichnet. Abbildung 6 gibt einen Überblick der Wachstumskurven und des Viabilitätsverlaufs (gestrichelte Linien) der HEK F Zellen in HEK TF Medium. Als Surfactant wurden verschiedenen Konzentrationen Pluronic ^® F68 (0,75 g/L und 1 g/L) und P(EtOx) (0,75-15 g/L) eingesetzt. Je Surfactant und Konzentration wurden ein Schüttelkolben mit Schikane (baffled, gepunktete Linien) und ein Schüttelkolben ohne Schikane (piain, durchgezogene Linien) eingesetzt, um die Zellen verschiedenen Scherkräften auszusetzen Abbildung 6 zeigt eine Gesamtübersicht der Konzentrationstestung von Pluronic ^® F68 gegen P(EtOx). Generell waren die maximalen Zelldichten in den

Schüttelkolben ohne Schikane deutlich erhöht gegenüber denen in Schüttelkolben mit Schikane (9,6-12,9· 10 ⁶ Zellen/mL gegenüber 0,2-5,6- 10 ⁶ Zellen/mL). Auffällig ist hierbei, dass die Zellen in Kultivierung mit P(EtOx) durchweg höhere Zelldichten erreichten als in Kultivierungen mit Pluronic ^® F68. Besonders unter hohen

Scherbelastungen zeigten die Kulturen mit dem Surfactant PO _x deutlich erhöhte maximale Zelldichten, erhöhte Viabilitäten und eine längere Kulturdauer gegenüber dem bislang verwendeten Pluronic ^® F68. Die Viabilität der Kulturen mit Pluronic F68 sank innerhalb von 3 bzw. 4 Tagen auf unter 60 %.

Hinsichtlich des Konzentrationsbereiches, in dem P(EtOx) hier getestet wurde, zeigten sich in den Schüttelkolben ohne Schikane kaum Unterschiede in der maximalen Lebendzelldichte (10,8-12,6- 10 ⁶ Zellen/mL). Die Kulturen mit erhöhtem Scherstress zeigten maximale Lebendzelldichten von 3,5-5,6- 10 ⁶ Zellen/mL, wobei kein direkter Bezug zur jeweils eingesetzten Konzentration gesehen werden konnte.

Für einen besseren Einblick sind die Kulturen in den Abbildungen 7 und 8 nochmals nach Scherbelastung getrennt aufgeführt. Abbildung 7 zeigt Wachstumskurven (durchgezogene Linien) und Viabilitätsverlauf (gestrichelte Linien) der HEK F Zellen in HEK TF Medium in Schüttelkolben ohne Schikane. Als Surfactant wurden verschiedenen Konzentrationen Pluronic ^® F68 (0,75 g/L und 1 g/L) und P(EtOx) (0,75-15 g/L) eingesetzt.

Abbildung 8 zeigt Wachstumskurven (durchgezogene Linien) und Viabilitätsverlauf (gestrichelte Linien) der HEK F Zellen in HEK TF Medium in Schüttelkolben mit

Schikane (baffied). Als Surfactant wurden verschiedenen Konzentrationen Pluronic ^® F68 (0,75 g/L und 1 g/L) und P(EtOx) (0,75-15 g/L) eingesetzt.

Beispiel 5: Lot-Testung ΡΟχ

In einem weiteren Ansatz wurden HEK F Zellen in HEK TF Medium (serum und protein frei, ohne Pluronic ^® F68) (Bestellnr. 861 (Xell AG, Bielefeld)) unter Zugabe der verschiedenen Lots von P(EtOx) im Vergleich zu zwei Lots des Pluronic ^® F68 kultiviert, um mögliche Effekte der Hochskalierung des Produktionsprozesses erkennen zu können. Um auch hier wiederum die protektive Eigenschaft gegenüber erhöhten Scherkräften zu untersuchen, wurde diese Testung sowohl in Schüttelkolben ohne Schikane als auch mit Schikane durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Testung sind in in den Abbildungen 9 und 10 dargestellt. Abbildung 9 zeigt Wachstumskurve und Viabilitätsverlauf der HEK F Zellen in HEK TF unter Zugabe verschiedener Lots an P(EtOx) aus der Hochskalierung des Produktionsprozesses in Schüttelkolben ohne Schikane.

Abbildung 9 zeigt die Ergebnisse in Schüttelkolben ohne Schikane. Mit Ausnahme der Pluronic Lot 1 Kultur (7,8 -10 ⁶ Zellen/mL) zeigten alle Kulturen vergleichbare maximale Lebendzelldichten von 9-10,1 -10 ⁶ Zellen/mL und es konnte kein bedeutender Unterschied der verschiedenen P(EtOx) Lots untereinander erkannt werden. Abbildung 10 zeigt Wachstumskurve und Viabilitätsverlauf der HEK F Zellen in HEK TF unter Zugabe verschiedener Lots an P(EtOx) aus der Hochskalierung des Produktionsprozesses in Schüttelkolben mit Schikane. Die Kultivierungen in Schüttelkolben mit Schikane zeigten wiederum, dass Zellen unter Zugabe von P(EtOx) eine höhere Schertoleranz aufweisen als solche mit Pluronic ^® F68 als Surfactant; die Kulturen mit Pluronic ^® F68 zeigten bereits nach 24 h Viabilitätseinbrüche um 20 % (Lot 1 ) bzw. 10 % (Lot 2). Die Kulturen mit verschiedenen P(EtOx)-Lots erreichten maximale Lebendzelldichten von 6,4-9- 10 ⁶ Zellen/mL, wobei ein Lot aus dem 0,5 L Produktionsmaßstab im Vergleich zu den übrigen Lots ein höheres Wachstum zeigte. Unter erhöhtem Scherstress zeigten sich somit nur leichte Unterschiede der verschiedenen P(EtOx) Lots aus der

Hochskalierung des Produktionsprozesses, welche unter Bedingungen ohne erhöhten Scherstress in dieser Testung nicht erkennbar waren.

Beispiel 6: Transfektionseffizienz Zur Überprüfung der Transfektionseffizienz wurden zudem jeweils zwei Schüttel- röhrchen der Kulturen aus den Schüttelkolben ohne Schikane angelegt und die HEK F Zellen mittels Polyethylenimin (PEI) mit einem GFP-Plasmid transfiziert. 48

Stunden nach Transfektion wurden Zelldichten, Viabilitäten und die Transfektionseffizienz dieser Kulturen aufgenommen. Die Ergebnisse dieser Messungen sind in den Abbildungen 11 bis 13 dargestellt.

Abbildung 1 zeigt Mittelwerte der Transfektionseffizienzen der HEK F Zellen in HEK TF Medium. Als Surfactant für die Kultivierungen im Schüttelröhrchen mit

anschließender Transfektion eines GFP-Plasmids mittels PEI wurden zwei Pluronic ^® F68 Lots sowie die verschiedenen Lots des Hochskalierens der P(EtOx)-Produktion eingesetzt.

Abbildung 11 zeigt, dass die Transfektionseffizienzen der Kulturen mit den

verschiedenen P(EtOx) Lots allesamt über 90 % betrugen (93,5%-96,7%). Dabei konnten keine nennenswerten Unterschiede der Transfektionseffizienzen unter den einzelnen Skalierungsschritten festgestellt werden. Die Kulturen der beiden Pluronic ^® F68 Lots konnten in diesem Versuch nicht erfolgreich transfiziert werden, die Effizienzen lagen bei unter 1 %.

Abbildung 12 zeigt Mittelwerte der Lebendzelldichten 48 h nach Transfektion der HEK F Zellen in HEK TF Medium. Als Surfactant für die Kultivierungen im

Schüttelröhrchen mit anschließender Transfektion eines GFP-Plasmids mittels PEI wurden zwei Pluronic ^® F68 Lots sowie die verschiedenen Lots des Hochskalierens der P(EtOx)-Produktion eingesetzt. In Abbildung 12 sind die Lebendzelldichten 48 h nach Transfektion dargestellt.

Hierbei ist ersichtlich, dass sich die Mittelwerte der Lebendzelldichten der Kulturen mit den verschiedenen P(EtOx) Lots nicht nennenswert unterschieden. Die Werte variierten zwischen 4.4-10 ⁶ Zellen/mL und 5,1 -10 ⁶ Zellen/mL. Die zwei Pluronic ^® F68 Lots wiesen Lebendzelldichten von 1.8-10 ⁶ Zellen/mL (Lot 1 ) bzw. 3,5- 10 ⁶ Zellen/mL (Lot 2) auf.

Abbildung 13 zeigt Mittelwerte der Viabilitäten 48 h nach Transfektion der HEK F Zellen in HEK TF Medium. Als Surfactant für die Kultivierungen im Schüttelröhrchen mit anschließender Transfektion eines GFP-Plasmids mittels PEI wurden zwei Pluronic ^® F68 Lots sowie die verschiedenen Lots des Hochskalierens der P(EtOx) Produktion eingesetzt.

Die Mittelwerte der Viabilitäten der transfizierten Kulturen 48 h nach Transfektion sind Abbildung 13 zu entnehmen. Hierbei ist ersichtlich, dass die PO _x Kulturen eine hohe Viabilität zwischen 97,5 % und 98,2 % zeigten und kein nennenswerter Unterschied der P(EtOx) Lots untereinander erkennbar war. Die Viabilitäten der Pluronic ^® F68 Kulturen lag bei 82,4 % (Lot 1 ) und 93,6 % (Lot 2).