R-a-Liponsäure ist in einer Vielzahl von Pro-und Eukaryonten ein essentieller Cofaktor bestimmter Multienzymkomplexe. Dabei ist die R-a-Liponsäure mit seiner Carboxylgruppe unter Bildung eines so genannten Lipoamids jeweils kovalent an die s-Amino- gruppe eines spezifischen Lysin-Rests des entsprechenden En- zyms gebunden. Auf diese Weise ist die R-a-Liponsäure ein Teil der E2-Untereinheit der Pyruvat-Dehydrogenase (PDH) [EC 2.3. 1.12] bzw. der a-Ketoglutarat-Dehydrogenase (KGDH) [EC 2.3. 1.61] und spielt dort als Redoxpartner und Acylgruppen- überträger eine entscheidende Rolle bei der oxidativen Decar- boxylierung von a-Ketosäuren. Außerdem fungiert R-a-Liponsäure als Aminomethyl-Carrier in Glycin-Cleavage Enzymsystemen.

Die physiologisch und genetisch am besten charakterisierte a- Ketosäure-Dehydrogenase ist der Pyruvat-Dehydrogenase-Multi- enzymkomplex von Escherichia coli. Die drei Untereinheiten E1 (Pyruvat-Dehydrogenase), E2 (Dihydrolipoamid-Acetyltrans- ferase) und E3 (Dihydrolipoamid-Dehydrogenase) werden von ei- nem Operon bestehend aus den Genen aceE, aceF und lpd codiert und formen einen Multienzymkomplex, welcher sich aus 24 E1-, 24 E2-und 12 E3-Untereinheiten zusammensetzt. Dabei bilden die 24 E2-Untereinheiten das Kernstück des Komplexes.

Das E2-Monomer der PDH (E2p) ist wiederum modular aus ver- schiedenen Domänen aufgebaut, die über flexible Linkerregionen miteinander verbunden sind (s. Fig. 1). Der N-Terminus des Proteins enthält drei so genannte Lipoyl-Domänen bestehend aus jeweils ca. 80 Aminosäureresten, wobei jede dieser Domänen ge- nau ein Molekül R-a-Liponsäure wie oben beschrieben binden kann. Diese drei Lipoyl-Domänen der PDH weisen untereinander jeweils eine sehr hohe Sequenzidentität (> 66 %) auf. An die N-terminale Region des Proteins schließt sich die kleine zent- rale E3-Bindedomäne an, die wiederum mit dem C-terminalen Be-

reich, der die katalytischen Domäne (Acetyl-Transferase) ent- hält, verbunden ist.

Die E2-Untereinheit der a-Ketoglutarat-Dehydrogenase (E2o) wird vom sucB-Gen codiert und ist ebenfalls modular aufgebaut, besitzt aber im Gegensatz zum E2-Protein der PDH nur eine Li- poyl-Domäne. Die Sequenz der E2o-Lipoyl-Domäne zeigt mit nur etwa 22 % eine relativ schwache Identität zu den E2p-Lipoyl- Domänen, die räumliche Struktur der Lipoyl-Domänen beider E2- Proteine ist allerdings sehr ähnlich (Reche und Perham, 1999, EMBO J. 18 : 2673-2682).

Ein bezüglich der Sequenz zu den Lipoyl-Domänen der E2- Proteine auch nur mäßig homologes, strukturell aber ebenfalls sehr ähnliches Protein ist die Biotinyl-Domäne des Biotin- Carboxyl-Carrier-Proteins (BCCP). Das BCCP wird normalerweise posttranslational mittels der Biotinyl-Protein-Ligase BirA an einem spezifischen Lysin-Rest biotinyliert. Es gibt allerdings verschiedene spezifisch mutierte BCCP-Varianten, die mittels einer Lipoyl-Protein-Ligase an diesem speziellen Lysin-Rest nun auch alternativ oder sogar ausschließlich lipoyliert wer- den können (Reche und Perham, 1999, EMBO J. 18 : 2673-2682). a-Liponsäure ist ein optisch aktives Molekül mit einem Chira- litätszentrum am Kohlenstoffatom C6. Dabei stellt die R-Konfi- guration der a-Liponsäure das natürlich vorkommende Enantiomer dar. Nur diese Form zeigt physiologische Aktivität als Cofak- tor der entsprechenden Enzyme. a-Liponsäure kann sowohl in ei- ner oxidierten (5- [1, 2] -Dithiolan-3-yl-Pentansäure) als auch in einer reduzierten Form (6, 8-Dimercapto-Oktansäure) vorkom- men. Im Folgenden sind unter der Bezeichnung"a-Liponsäure" beide Formen sowie die jeweiligen Salze der a-Liponsäure, wie z. B. das Calcium-, Kalium-, Magnesium-, Natrium-oder das Am- moniumsalz zu verstehen.

Die Biosynthese von R-a-Liponsäure wurde besonders an dem Bak- terium Escherichia coli intensiv untersucht (s. Fig. 2). Hier dient Oktansäure, die an das Acyl-Carrier-Protein (ACP) kova-

lent gebunden ist, als spezifische Vorstufe bei der Lipon- säure-Synthese. In einer komplexen Reaktion werden zwei Schwe- felatome auf die derart aktivierte Oktansäure (Oktanoyl-ACP) übertragen, wobei R-a-Lipoyl-ACP entsteht. Diese Reaktion wird <BR> <BR> von der Liponsäure-Synthase [EC 2.8. 1. -], dem lipA-Genprodukt, katalysiert. Als Schwefeldonor dient dabei letztendlich die Aminosäure L-Cystein. Der anschließende Transfer der R-a- Liponsäure von R-a-Lipoyl-ACP auf die E2-Untereinheit der a- Ketosäure-Dehydrogenasen wird von der Lipoyl-Protein-Ligase B [EC dem dem lipB-Genprodukt, katalysiert, ohne dass da- bei jedoch R-a-Lipoyl-ACP oder R-a-Liponsäure als freie Zwi- schenprodukte auftreten (Miller et al., 2000, Biochemistry 39 : 15166-15178).

E. coli kann aber auch freie R-a-Liponsäure aus dem umgebenden Medium aufnehmen und für die Bildung funktioneller a-Keto- säure-Dehydrogenasen verwenden. Dazu wird R-a-Liponsäure zu- nächst mittels ATP zu R-a-Lipoyl-AMP aktiviert und anschlie- ßend auf die entsprechenden Enzym-Untereinheiten übertragen (s. Fig. 3). Beide Aktivitäten werden von der Lipoyl-Protein- Ligase A [EC 6.-.-.-], dem IplA-Genprodukt, katalysiert. Diese LplA-Aktivität ist für Wildtypstämme von E. coli allerdings nicht essentiell, wenn die endogene Liponsäure-Synthese und der Transfer der Lipoyl-Gruppe über den LipA/LipB-Weg erfolgt.

So wurden beispielsweise lplA-Mutanten beschrieben, die keine nachweisbare Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität mehr besitzen, deren Phänotyp aber unter normalen Wachstumsbedingungen nicht von einer Wildtyp-Zelle zu unterscheiden ist (Morris et al., 1995, J. Bacteriol. 177 : 1-10).

Über die Biosynthese von R-a-Liponsäure in Eukaryonten ist we- nig bekannt. Es wird aber vermutet, dass die R-a-Liponsäure- Synthese sowie der Transfer auf die entsprechenden Enzyme in den Mitochondrien eukaryontischer Zellen auf ähnliche Weise wie in Bakterien erfolgt.

Neben ihrer Relevanz als essentieller Bestandteil von Enzymen mit einer zentralen Rolle im Stoffwechsel, wurde schon früh

die Bedeutung der a-Liponsäure für die Pharmakotherapie sowie für die Nahrungsmittelergänzung (Nutraceutical) erkannt : a-Liponsäure besitzt aufgrund ihrer beiden Thiolgruppen eine ausgeprägte Wirksamkeit als Antioxidans und kann deshalb den Organismus vor schädlichen Prozessen, die durch oxidativen Stress induziert werden, schützen. Außerdem ist a-Dihydro- liponsäure, die reduzierte Form der a-Liponsäure, aufgrund ih- rer Eigenschaft als starkes Reduktionsmittel in der Lage, an- dere oxidierte natürliche Antioxidationsmittel im Körper wie Ascorbinsäure oder a-Tocopherol direkt oder indirekt zu rege- nerieren oder bei deren Mangel diese auch zu ersetzen. Ent- sprechend kommt der a-Liponsäure im Zusammenspiel mit Ascor- binsäure, a-Tocopherol und Glutathion, dem so genannten"Netz- werk der Antioxidantien", eine zentrale Bedeutung zu. a-Liponsäure wird außerdem zur Prävention und Bekämpfung von Diabetes mellitus Typ II und dessen Folgeschäden, wie z. B.

Polyneuropathie, Cataract oder Kardiovaskularleiden einge- setzt.

Die unterschiedliche biologische Aktivität beider Enantiomere der a-Liponsäure ist derzeit Gegenstand intensiver Untersu- chungen, wobei sich allerdings immer mehr herauskristalli- siert, dass die Applikation des reinen R-Enantiomers der a- Liponsäure deutliche Vorteile gegenüber der S-Form aufweist.

So wurde im in vitro-Versuch gezeigt, dass nur die natürliche R-a-Liponsäure zur Bildung funktioneller a-Ketosäure-Dehydro- genasen führt. Das S-Enantiomer hatte dagegen sogar einen in- hibierenden Effekt auf die Stimulierung der Enzymaktivität durch R-a-Liponsäure. Die Reduktion von a-Liponsäure und damit die Regeneration der antioxidativ wirksamen a-Dihydrolipon- säure in den Mitochondrien ist für die Zelle von essentieller Bedeutung. Die mitochondriale NADH-abhängige Lipoamid- Reduktase von Säugern zeigt mit dem R-Enantiomer eine fast 20- fach höhere Aktivität als mit der S-Form. Des weiteren hat R- a-Liponsäure verglichen mit dem S-Enantiomer einen deutlich stärkeren Effekt auf die insulin-vermittelte Glucose-Aufnahme und den Glucose-Metabolismus von Skelettmuskelzellen insulin- resistenter Ratten. Im Tierversuch zeigte die R-Form außerdem

einen antiphlogistischen Effekt, während die S-Form eher eine analgetische Wirkung hatte. Um unerwünschte Nebeneffekte zu vermeiden, ist es daher äußerst wünschenswert, a-Liponsäure jeweils nur in der enantiomerenreinen Form zu applizieren.

Derzeit erfolgt die großtechnische Herstellung von a-Lipon- säure ausschließlich mittels chemischer Verfahren, wobei immer das Razemat aus R-und S-Form als Endprodukt gebildet wird (Y- adav et al., 1990, J. Sci. Ind. Res. 49 : 400-409). Zur Gewin- nung von enantiomerenreiner R-a-Liponsäure wurden verschiedene Verfahren entwickelt. Beispielsweise kann das Razemat der a- Liponsäure oder eines der Syntheseintermediate entweder che- misch mittels chiraler Hilfssubstanzen (Walton et. al, 1954, J. Amer. Chem. Soc. 76 : 4748 ; DE 4137773) oder enzymatisch (Adger et al., 1995, J. Chem. Soc., Chem. Commun. : 1563-1564) aufgespalten werden. In anderen Verfahren unterbleibt die Ent- stehung eines Razemats aufgrund eines enantioselektiven Syn- theseschritts, wobei das neue Chiralitätszentrum entweder che- misch (DE 3629116 ; DE 19533881 ; Bringmann et al., 1999, Z. Na- turforsch. 54b : 655-661 ; DE 10036516) oder durch eine stereo- spezifische Biotransformation mittels Mikroorganismen einge- führt werden kann (Gopalan und Jacobs, 1989, Tetrahedron Lett.

30 : 5705-5708 ; Dasaradhi et al., 1990, J. Chem. Soc., Chem.

Commun. : 729-730 ; DE 10056025). Andere Prozesse wiederum star- ten die chemische Synthese von enantiomerenreiner a-Liponsäure mit einem natürlich vorkommenden chiralen Edukt wie z. B. S- Maleinsäure oder D-Mannitol (Brookes und Golding, 1988, J.

Chem. Soc. Perkin Trans. I : 9-12 ; Rama Rao et al., 1987, Tetrahedron Lett. 28,2183-2186). Wegen z. T. aufwendiger Syn- theseschritte, geringer Ausbeuten und hoher Materialkosten sind alle bekannten Methoden zur Herstellung von enantiomeren- reiner R-a-Liponsäure derzeit nicht wirtschaftlich.

Die großtechnische Herstellung vieler niedermolekularer Natur- stoffe, wie z. B. Antibiotika, Vitamine oder Aminosäuren er- folgt heute oftmals mittels eines fermentativen Verfahrens un- ter Verwendung verschiedener Stämme von Mikroorganismen.

Die Patentanmeldungen am Deutschen Patent-und Markenamt mit den Aktenzeichen 10235270,10245993 und 10258127 beschreiben verschiedene Zellen, die enantiomerenreine R-a-Liponsäure sekretieren sowie Verfahren, bei denen die Produktion von e- nantiomerenreiner R-a-Liponsäure ausschließlich in einem Fer- mentationsprozeß erfolgt. Dabei werden Zellen eingesetzt, die entweder ein Liponsäure-Synthase-Gen bzw. ein Lipoyl-Protein- Ligase B-Gen einzeln oder auch in Kombination überexprimieren oder Zellen, die eine verminderte Lipoyl-Protein-Ligase A- Aktivität aufweisen. Die Produktion von enantiomerenreiner R- a-Liponsäure mit Hilfe dieser Zellen erfolgt allerdings in noch sehr beschränktem Ausmaß, so dass diese fermentativen Verfahren derzeit noch nicht mit der chemischen Synthese kon- kurrieren können.

Nur in seltenen Fällen führt eine einzige genetische Manipula- tion im Zuge des so genannten"metabolic engineering"eines Wildtypstammes zur Überproduktion der gewünschten Verbindung in ausreichendem Umfang. Vielmehr ist dazu eine Kombination von mehreren gezielten genetischen Manipulationen notwendig, oftmals noch ergänzt durch klassische Mutagenese/Screening-An- sätze.

Entsprechend ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, leistungsfähige Zellen, welche enantiomerenreine R-a-Lipon- säure in ein Kulturmedium sekretieren, bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Zelle, die enantiomeren- reine R-a-Liponsäure in ein Kulturmedium sekretiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine gegenüber einem Wildtyp-Stamm erhöhte Lipoyl-Protein-Ligase B Aktivität besitzt und gleich- zeitig eine im Vergleich zu dem Wildtyp-Stamm erhöhte Konzent- ration eines lipoylierbaren Polypeptids aufweist.

Aus physiologischen und biochemischen Daten geht hervor, dass Liponsäure in Wildtyp-Zellen nahezu ausschließlich in gebunde- ner Form vorkommt, da bereits die Synthese der R-a-Liponsäure vollständig proteingebunden erfolgt (vgl. Fig. 1) (Herbert und

Guest, 1975, Arch. Microbiol. 106 : 259-266 ; Miller et al., 2000, Biochemistry 39 : 15166-15178). Erstaunlicherweise ist die Verstärkung einer Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität einer Wildtyp-Zelle ausreichend, damit es zur Ausscheidung von R-a- Liponsäure in das Kulturmedium kommt (DE 10245993). Im Rahmen dieser Erfindung wurde nun völlig überraschend gefunden, dass eine Verstärkung der Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität kombi- niert mit einer Erhöhung der intrazellulären Konzentration ei- nes lipoylierbaren Polypeptids zu einer deutlich gesteigerten Anhäufung enantiomerenreiner R-a-Liponsäure im Kulturmedium dieser Zellen führt.

In einem E. coli Wildtyp-Stamm sind normalerweise alle Lipoyl- Bindestellen der E2-Proteine (spezifische Lysinreste) mit R-a- Liponsäure abgesättigt, d. h. mit Liponsäure modifiziert, (Packman et al., 1991, Biochem. J. 277 : 153-158), da die de novo-Synthese der R-a-Liponsäure und der anschließende Trans- fer vom R-a-Lipoyl-ACP auf die entsprechenden Lipoyl-Domänen gut aufeinander abgestimmt sind. Die vermehrte Präsenz eines lipoylierbaren Polypeptids in einer Zelle hat nun verschiedene Konsequenzen : - Es kommt zur Akkumulation von unmodifizierten, d. h. nicht- lipoylierten Lipoyl-Akzeptorproteinen, da die Liponsäure- Synthese-Kapazität der Zelle nicht mehr für eine vollständi- ge Beladung aller potentiell lipoylierbaren Polypeptide aus- reicht (Miles und Guest, 1987, Biochem. J. 245 : 869-874 ; Ali und Guest, 1990, Biochem. J. 271 : 139-145).

-Zellen mit einer erhöhten Konzentration von unmodifizierten Lipoyl-Akzeptorproteinen können im Vergleich zu Wildtyp- Zellen extern supplementierte R-a-Liponsäure vermehrt auf- nehmen und an Lipoyl-Akzeptorproteine binden (Morris et al., 1995, J. Bacteriol. 177 : 1-10).

-Die Exkretion von R-a-Liponsäure wird bei einem Liponsäure- Produktionsstamm drastisch vermindert (siehe Stamm W3110A1plA pGS331 in Beispiel 3), wahrscheinlich deshalb, weil die de novo synthetisierte R-a-Liponsäure nun an die vermehrt zur Verfügung stehenden Lipoyl-Akzeptorproteine fi-

xiert werden kann, wodurch eine Ausscheidung verhindert wird.

Entsprechend dieser Befunde würde der Fachmann a priori vermu- ten, dass durch eine erhöhte Präsenz eines unmodifizierten li- poylierbaren Polypeptids in der Zelle die Exkretion von R-a- Liponsäure auch bei anderen Liponsäure-Produktionsstämmen, wie z. B. dem Stamm W3110 pBAD-lipB, der eine erhöhte Lipoyl- Protein-Ligase B-Aktivität aufweist (DE 10245993), vermindert wird. Durch die Überexpression des lipB-Gens verfügen die er- findungsgemäßen Zellen zwar über eine erhöhte Lipoyl-Protein- Ligase B-Aktivität, aber durch eine gleichzeitige Bereitstel- lung von unbeladenen lipoylierbaren Polypeptiden wäre ausrei- chend Substrat für die Lipoyl-Protein-Ligase-Reaktion vorhan- den, so dass die gesamte de novo gebildete R-a-Liponsäure an diesen Proteinen intrazellulär fixiert werden können sollte.

Dennoch wird erstaunlicherweise unter diesen Bedingungen die R-a-Liponsäure vermehrt ausgeschieden.

Unter der Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität ist im Rahmen die- ser Erfindung vorzugsweise die vom lipB-Gen codierte Lipoyl- Protein-Ligase-Aktivität einer Zelle zu verstehen, welche eine strikte Präferenz für R-a-Lipoyl-ACP gegenüber freier R-a- Liponsäure als Substrat aufweist (s. Fig. 2).

Unter einer gegenüber einem Wildtyp-Stamm erhöhten Lipoyl- Protein-Ligase B-Aktivität ist im Sinne der vorliegenden Er- findung vorzugsweise zu verstehen, dass diese Aktivität min- destens um den Faktor 2, bevorzugt mindestens um den Faktor 5 gesteigert ist.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem lipB-Gen um ein Gen mit der Sequenz SEQ ID NO : 1, das für ein Protein mit der Sequenz SEQ ID NO : 2 codiert oder um ein Gen codierend für eine funk- tionelle Variante des lipB-Genprodukts mit einer Sequenziden- tität zu SEQ ID NO : 2 größer 35 %.

Besonders bevorzugt sind funktionelle Varianten des lipB- Genprodukts mit einer Sequenzidentität zu SEQ ID NO : 2 größer 55 %, ganz besonders bevorzugt mit einer Sequenzidentität zu SEQ ID NO : 2 größer 80 %.

Unter einer funktionellen Variante des lipB-Genprodukts ist im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ein Protein mit einer Aminosäure-Sequenz zu verstehen, die sich durch Deleti- on, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO : 1 dargestellten Sequenz ableitet, wobei die enzymati- sche Aktivität der durch dieses Gen codierten Lipoyl-Protein- Ligase B erhalten bleibt.

Unter einem"lipoylierbaren Polypeptid"sind im Rahmen dieser Erfindung Peptide oder Proteine zu verstehen, an die mindes- tens ein Molekül R-a-Liponsäure kovalent gebunden werden kann.

Dabei erfolgt diese Bindung bevorzugt zwischen der Carboxyl- gruppe der R-a-Liponsäure und der s-Aminogruppe eines Lysin- Restes des Polypeptids unter Bildung eines so genannten Lipo- amids. Die Knüpfung einer solchen Lipoamid-Bindung wird in der Zelle vorzugsweise von einer Lipoyl-Protein-Ligase kataly- siert.

Unter einer im Vergleich zu dem Wildtyp-Stamm erhöhten Kon- zentration eines lipoylierbaren Polypeptids ist im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise zu verstehen, dass die Menge dieses Polypeptids in einer Zelle mindestens um den Fak- tor 2, bevorzugt mindestens um den Faktor 5 gesteigert ist.

Ein Gen, das für ein lipoylierbares Polypeptid codiert, um- fasst vorzugsweise ein DNA-Fragment mit der Sequenz SEQ ID NO : 3, welches für ein Polypeptid mit der Sequenz SEQ ID NO : 4 co- diert oder ein DNA-Fragment, das für eine funktionelle Varian- te dieses Polypeptids mit einer Sequenzidentität zu SEQ ID NO : 4 größer 20 % codiert.

Besonders bevorzugt sind Gene codierend für Varianten eines lipoylierbaren Polypeptids mit einer Sequenzidentität zu SEQ

ID NO : 4 größer 40 %, ganz besonders bevorzugt sind Gene co- dierend für Polypeptid-Varianten mit einer Sequenzidentität zu SEQ ID NO : 4 größer 70 %.

Als Alternativen für Gene, die für ein lipoylierbares Polypep- tid codieren, können auch Allele von Genen eingesetzt werden, die ursprünglich für ein biotinylierbares Polypeptid (z. B.

BCCP) codieren, jedoch nach geringfügiger Sequenzvariation nun auch lipoyliert werden können (z. B. BCCP-DASMEP). Ein derarti- ges Gen umfasst ein DNA-Fragment mit der Sequenz SEQ ID NO : 5, welches für ein Polypeptid mit der Sequenz SEQ ID NO : 6 co- diert oder ein DNA-Fragment das für eine funktionelle Variante dieses Polypeptids mit einer Sequenzidentität zu SEQ ID NO : 6 größer 75 % codiert.

Unter einer funktionellen Variante eines lipoylierbaren Poly- peptids ist im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Protein mit einer Aminosäure-Sequenz zu verstehen, die sich durch De- letion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus den in SEQ ID NO : 3 oder in SEQ ID NO : 5 dargestellten Sequenzen ab- leitet, wobei die Eigenschaft der Lipoylierbarkeit durch eine Lipoyl-Protein-Ligase erhalten bleibt.

In der vorliegenden Erfindung beziehen sich alle Werte zur Se- quenzidentität von DNA-und Aminosäure-Sequenzen auf Ergebnis- se, die mit dem Algorithmus BESTFIT (GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GLG) Madison, Wisconsin) erhalten werden.

Erfindungsgemäße Zellen, die neben einer verstärkten Lipoyl- Protein-Ligase B-Aktivität eine gegenüber dem Wildtyp erhöhte Konzentration eines lipoylierbaren Polypeptids aufweisen, kön- nen mit Standardtechniken der Molekularbiologie erzeugt wer- den.

Verfahren zur Steigerung der Aktivität der Lipoyl-Protein- Ligase B in einer Zelle sind im Stand der Technik bekannt und

beispielsweise in der Patentanmeldung DE 10245993 beschrieben, auf die insoweit ausdrücklich Bezug genommen wird.

Die Erhöhung des Spiegels eines lipoylierbaren Polypeptids in erfindungsgemäßen Zellen wird beispielsweise durch eine ver- stärkte Expression eines Gens, das für ein lipoylierbares Po- lypeptid codiert, erreicht. Dabei kann die Kopienzahl eines solchen Gens in den Zellen erhöht sein und/oder es kann durch geeignete Promotoren die Expression dieses Gens verstärkt sein.

Unter verstärkter Expression ist dabei vorzugsweise zu verste- hen, dass das Gen für ein lipoylierbares Polypeptid im Ver- gleich zur jeweiligen Wildtyp-Zelle, aus der dieses Gen gewon- nen wurde, mindestens um den Faktor 2, bevorzugt mindestens um den Faktor 5 vermehrt exprimiert wird.

Eine Erhöhung der Kopienzahl des Gens codierend für ein lipoy- lierbares Polypeptid in Zellen kann mit dem Fachmann bekannten Methoden vorgenommen werden. So kann zum Beispiel ein solches Gen in Plasmid-Vektoren mit mehrfacher Kopienzahl pro Zelle (für Escherichia coli z. B. pUCl9, pBR322, pACYC184 oder Deri- vaten davon) kloniert und in die Zellen eingebracht werden.

Alternativ kann ein solches Gen mehrfach in das Chromosom des Wirtsorganismus integriert werden. Als Integrationsverfahren können die bekannten Systeme mit temperenten Bakteriophagen, integrative Plasmide oder die Integration über homologe Rekom- bination genutzt werden (z. B. Hamilton et al., 1989, J. Bacte- riol. 171 : 4617-4622).

Bevorzugt ist die Erhöhung der Kopienzahl durch Klonierung ei- nes Gens codierend für ein lipoylierbares Polypeptid in einen Plasmid-Vektor unter Kontrolle eines Promotors. Besonders be- vorzugt ist die Erhöhung der Kopienzahl durch Klonierung eines solchen Gens in Plasmid-Vektoren aus der pUC-Familie oder der pBR322-Familie, wie z. B. ptac85 (Ali und Guest, 1990, Bio- chem. J. 271 : 139-145).

Als Kontrollregion für die Expression eines Gens für ein li- poylierbares Polypeptid kann die natürliche Promotor-und Ope- ratorregion dieses Gens dienen, die verstärkte Expression ei- nes solchen Gens kann jedoch insbesondere auch mittels anderer Promotoren erfolgen. Entsprechende Promotorsysteme wie bei- spielsweise in Escherichia coli der konstitutive Promotor des gapA-Gens oder die induzierbaren lac-, tac-, trc-, -, ara- oder tet-Promotoren sind dem Fachmann bekannt (Makrides S. C., 1996, Microbiol. Rev. 60 : 512-538). Konstrukte, die ein Gen für ein lipoylierbares Polypeptid unter der Kontrolle eines der oben genannten Promotoren enthalten, können in an sich be- kannter Weise auf Plasmiden oder chromosomal verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten erfindungsgemä- ße Zellen ein Plasmid, das ein Gen für ein lipoylierbares Po- lypeptid unter der Kontrolle eines Promotors enthält, ausge- wählt aus der Gruppe gapA-, lac-, tac-, trc-, -, ara-oder tet-Promotor. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform befindet sich ein solches Gen unter der Kontrolle des Isopro- pyl-ß-D-Thiogalactosid/lacl-regulierbaren tac-Promotors.

Des weiteren kann eine verstärkte Expression dadurch erreicht werden, dass Translationsstartsignale, wie z. B. die Riboso- menbindestelle oder das Startcodon des Gens, in optimierter Sequenz auf dem jeweiligen Konstrukt vorhanden sind oder dass gemäß der"codon usage"seltene Codons gegen häufiger vorkom- mende Codons ausgetauscht werden.

Die Klonierung eines Gens, das für ein lipoylierbares Polypep- tid codiert, in Plasmid-Vektoren erfolgt beispielsweise durch Amplifikation des Gens mittels der Polymerase-Ketten-Reaktion unter Einsatz von spezifischen Primern, die das komplette Gen, oder zumindest den Teil des Gens, der für ein lipoylierbares Polypeptid codiert (z. B. die Lipoyl-Domäne eines Proteins), erfassen, und anschließende Ligation mit Vektor-DNA-Fragmen- ten.

Die Erzeugung eines Gens für ein lipoylierbares Hybridpolypep- tids, welches sich z. B. aus Teilen zweier verschiedener Li- poyl-Domänen des E2-Proteins zusammensetzt, sowie dessen Klo- nierung in einen Plasmid-Vektor, ist mit Standardmethoden der Molekularbiologie möglich und bei Miles und Guest (1987, Bio- chem. J. 245 : 869-874) beispielsweise beschrieben.

Als bevorzugte Vektoren für die Klonierung eines Gens codie- rend für ein lipoylierbares Polypeptid werden Plasmide verwen- det, die bereits Promotoren zur verstärkten Expression enthal- ten, beispielsweise den hitze-induzierbaren XPLPR-Promotor oder den Isopropyl-ß-D-Thiogalactosid/lacl-regulierbaren syntheti- schen tac-Promotor von Escherichia coli.

Um eine synchrone Überexpression eines lipB-Gens mit einem Gen, das für ein lipoylierbares Polypeptid codiert, zu errei- chen, können oben genannte Maßnahmen, die zur Überexpression eines Einzelgens führen, auch miteinander kombiniert werden.

So können die beiden relevanten Gene beispielsweise auf ver- schiedenen Plasmiden enthalten sein und die Expression jeweils unter der Kontrolle verschiedener Promotorsysteme liegen. Es ist aber auch möglich, dass beide Gene als künstliches Operon auf demselben Plasmid liegen und die Expression beider Gene somit synchron durch denselben Promotor reguliert wird. Des weiteren können das lipB-Gen und das Gen für ein lipoylierba- res Polypeptid auch auf demselben Plasmid lokalisiert sein, wobei jedes Gen von einem eigenen Promotor reguliert wird. Da- bei können die beiden Promotoren entweder demselben oder aber einem unterschiedlichen Typ angehören.

Plasmide, die sowohl ein lipB-Gen als auch ein Gen für ein li- poylierbares Polypeptid enthalten, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

In einer bevorzugten Ausführungsform befinden sich die beiden Gene auf demselben Plasmid jeweils unter der Kontrolle eines eigenen Isopropyl-ß-D-Thiogalactosid/lacl-regulierbaren tac- Promotors.

Die Erfindung betrifft somit auch ein Plasmid, das dadurch ge- kennzeichnet ist, dass es ein lipB-Gen sowie ein Gen, das für ein lipoylierbares Polypeptid codiert, jeweils unter Kontrolle eines Promotors trägt.

Durch eine gängige Transformationsmethode (z. B. Elektroporati- on) werden die Plasmide, die ein lipB-Gen und/oder ein Gen für ein lipoylierbares Polypeptid enthalten, in eine Ausgangszelle eingebracht und beispielsweise mittels Antibiotika-Resistenz auf plasmid-tragende Klone selektiert.

Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstel- lung einer erfindungsgemäßen Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass in eine Ausgangszelle ein Plasmid, das ein lipB-Gen und ein Plasmid, das ein Gen für ein lipoylierbares Polypeptid enthält oder ein erfindungsgemäßes Plasmid eingebracht werden.

In einer Vielzahl von pro-und eukaryontischen Zellen bzw. Or- ganismen konnten Gene, die für lipoylierbare Polypeptide co- dieren (z. B. aceF, sucB) sowie Gene, die für die de novo- Synthese von R-a-Liponsäure benötigt werden (z. B. lipA, lipB), identifiziert werden. Erfindungsgemäße Zellen lassen sich somit vorzugsweise aus Zellen von pro-oder eukaryonti- schen Organismen herstellen, die in der Lage sind, R-a-Lipon- säure selbst zu synthetisieren (Ausgangszelle), die rekombi- nanten Verfahren zugänglich sind und die durch Fermentation kultivierbar sind. Auch pflanzliche oder tierische Zellen, die in Zellkultur züchtbar sind, sind somit zur Herstellung erfin- dungsgemäßer Zellen geeignet.

Zur Herstellung erfindungsgemäßer Zellen können solche Aus- gangszellen verwendet werden, die bisher noch keinerlei Mani- pulation unterzogen wurden. Des weiteren ist es jedoch mög- lich, die erfindungsgemäßen Zellen auch mit Maßnahmen zu kom- binieren, die bereits zu einer verbesserten Produktion von R- a-Liponsäure führen. So sind beispielsweise solche Zellen be- sonders geeignet, die durch eine verstärkte Expression des li-

pA-Gens bereits über eine erhöhte Liponsäure-Synthase-Aktiviät verfügen und/oder nur noch eine abgeschwächte, vorzugsweise völlig ausgeschaltete Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität auf- weisen. Verfahren zur Herstellung von Zellen mit einer ver- stärkten Liponsäure-Synthase-Aktivität und/oder einer abge- schwächten Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität sind in den Pa- tentanmeldungen DE 10235270 und DE 10258127 beschrieben.

Bevorzugt handelt es sich bei den Zellen um Mikroorganismen, wie zum Beispiel Hefe-oder Bakterienstämme. Besonders bevor- zugt handelt es sich um Bakterienstämme aus der Familie der Enterobacteriaceae, ganz besonders bevorzugt um Stämme der Art Escherichia coli.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von enantiomerenreiner R-a-Liponsäure. Dieses Ver- fahren ist dadurch gekennzeichnet, dass eine erfindungsgemäße Zelle in einem Kulturmedium kultiviert wird, wobei die Zelle enantiomerenreine R-a-Liponsäure in das Kulturmedium ausschei- det und die enantiomerenreine R-a-Liponsäure vom Kulturmedium abgetrennt wird.

Die Ausscheidung von R-a-Liponsäure aus den erfindungsgemäßen Zellen in das Kulturmedium erlaubt eine einfache Isolierung des Produkts aus dem Kulturmedium nach Abtrennung der Biomas- se, ohne dass die Zellen zuvor aufgebrochen werden müssen, bzw. ohne dass die R-a-Liponsäure durch einen aufwendigen und verlustreichen Hydrolyseschritt vom daran gebundenen Träger- protein (ACP oder die E2-Untereinheit der a-Ketosäure- Dehydrogenasen) abgespalten werden muss. Die Gewinnung von R- x-Liponsäure aus dem Kulturmedium kann nach dem Fachmann be- kannten Verfahren, wie beispielsweise Zentrifugation des zell- haltigen Kulturmediums zur Abtrennung der Zellen und durch an- schließende Extraktion und/oder Präzipitation des Produkts er- folgen.

Die Kultivierung der erfindungsgemäßen Zellen zur Produktion von R-a-Liponsäure erfolgt in gängigen Kulturmedien, vorzugs-

weise in einem aus der Literatur bekannten Minimalsalzmedium (Herbert und Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272).

Als Kohlenstoffquelle können prinzipiell alle verwertbaren Zu- cker, Zuckeralkohole oder organische Säuren bzw. deren Salze verwendet werden. Dabei werden bevorzugt Asparaginsäure, Äp- felsäure, Bernsteinsäure, Brenztraubensäure, Fumarsäure, Glu- taminsäure, Glucose, Glycerin oder Oxalessigsäure eingesetzt.

Besonders bevorzugt sind Bernsteinsäure und Oxalessigsäure.

Auch ist eine kombinierte Fütterung mehrerer verschiedener Kohlenstoffquellen möglich. Des weiteren können kurzkettige Fettsäuren mit einer Kettenlänge von C2-C8, bevorzugt mit ei- ner Kettenlänge von C6-C8 (Hexan-bzw. Oktansäure) als spezi- fische Vorstufen für die a-Liponsäure-Synthese dem Medium zu- gesetzt werden. Dabei beträgt die Konzentration der zugesetz- ten Kohlenstoffquelle vorzugsweise 0,1-30 g/l.

Die Inkubation der erfindungsgemäßen Zellen erfolgt vorzugs- weise unter aeroben Kultivierungsbedingungen über einen Zeit- raum von 16-150 h und im Bereich der für die jeweiligen Zel- len optimalen Wachtumstemperatur.

Als optimaler Temperaturbereich werden 15-55 °C bevorzugt.

Besonders bevorzugt ist eine Temperatur zwischen 30 und 37 °C.

Der Nachweis und die Quantifizierung der im erfindungsgemäßen Verfahren produzierten R-a-Liponsäure erfolgt beispielsweise mittels eines Bioassays unter Verwendung eines liponsäure- auxotrophen Indikatorstammes (lipA-Mutante). Diese Art der turbidimetrischen Quantifizierung von R-a-Liponsäure ist aus der Literatur bekannt (Herbert und Guest, 1970, Meth. Enzymol.

18A, 269-272). Der im Rahmen der vorliegenden Erfindung ver- wendete Indikatorstamm W14851ip2 (ATCC 25645), würde aller- dings auch ohne supplementierte R-a-Liponsäure wachsen, wenn das Medium neben Glucose auch noch Acetat und Succinat ent- hält. Um ein falschpositives Wachstum des Indikatorstammes im Bioassay bei der Bestimmung der produzierten R-a-Liponsäure zu vermeiden-beispielsweise verursacht durch einen Eintrag von

Glucose und den vom Produktionsstamm zusätzlich zur R-a-Lipon- säure ausgeschiedenen Säuren Acetat und Succinat-erfolgt be- reits die Anzucht des R-a-Liponsäure-Produzenten bevorzugt mit Succinat als einziger Kohlenstoffquelle. Dieser Stamm wird mit dem Kulturüberstand einer erfindungsgemäßen Zellanzucht supplementiert ; anhand des Wachstums des Indikatorstammes kann dann der Liponsäure-Gehalt im Kulturmedium bestimmt werden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Der Bakterienstamm Escherichia coli W3110/pKP560/pGS331, der für die Ausführung der Beispiele ver- wendet wurde, wurde bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikro- organismen und Zellkulturen GmbH, D-38142 Braunschweig) unter der Nummer DSM 15661 gemäß Budapester Vertrag hinterlegt.

Der Stamm W3110A1plA, eine Deletionsmutante im lplA-Gen, wel- ches für die Lipoyl-Protein-Ligase A codiert, ist in der Pa- tentanmeldung DE 10258127 des gleichen Anmelders beschrieben.

Das Plasmid pACYC184 ist bei Chang und Cohen (1978, J. Bacte- riol. 134 : 1141-1156), das lipB-Expressionsplasmid pBAD-lipB ist in der Patentanmeldung DE 10245993 beschrieben.

Für die Expression des Gens, das für ein lipoylierbares Poly- peptid codiert, wurde das Plasmid pGS331 verwendet (Ali et al., 1990, Biochem. J. 271 : 139-145). Dieses Plasmid enthält neben dem Ampicillin-Resistenzgen ein subgenes Fragment des aceF- (E2p) -Gens von Escherichia coli, welches für eine Lipoyl- Domäne codiert und das sich unter der Expressionskontrolle des tac-Promotors befindet. Das Gen für diese Lipoyl-Domäne ist in diesem Fall ein Hybrid, zusammengesetzt aus den Codons für die Aminosäurereste 1-33 der ersten Lipoyl-Domäne und den Resten 238-289 der dritten Lipoyl-Domäne des E2p-Proteins.

Beispiel 1 : Konstruktion des lipB-Expressionsplasmids pKP560 Der Plasmidvektor pACYC184 wurde zunächst mit der Restriktion- sendonuklease AvaI unter den vom Hersteller angegebenen Bedin- gungen geschnitten. Die dabei erzeugten 5-überhängenden Enden des restringierten Vektors wurden nach Herstellerangaben mit- tels der Klenow-Polymerase aufgefüllt, der Vektor anschließend mit der Restrikionsendonuklease ClaI geschnitten und danach

durch Behandlung mit Alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.

Der gesamte Restriktionsansatz wurde dann in einem Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Das 2,8 kb lange DNA-Fragment, das neben dem Replikationsursprung pl5A auch noch das Chlo- ramphenicol-Resistenzgen enthält, wurde anschließend mittels des QIAquick Gel Extraktion Kits (Qiagen GmbH, Hilden) nach Herstellerangaben aus dem Agarosegel isoliert und gereinigt.

Das lipB-Gen unter Kontrolle des arabinose-induzierbaren ara- BAD-Promotors (pBAD) wurde aus dem Plasmid pBAD-lipB gewonn- nen, welches zunächst mit der Restrikionsendonuklease XbaI un- ter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen geschnitten wurde. Die dabei erzeugten 5-überhängenden Enden des restrin- gierten Vektors wurden dann nach Herstellerangaben mittels der Klenow-Polymerase aufgefüllt und der Vektor wurde anschließend mit der Restrikionsendonuklease ClaI geschnitten. Der gesamte Restriktionsansatz wurde dann in einem Agarose-Gel elektropho- retisch aufgetrennt. Das 2 kb lange DNA-Fragment, das die Re- gulationssequenzen des Arabinose-Operons von E. coli (araC- Gen, araBAD-Promotorregion) und außerdem das lipB-Gen unter der Kontrolle des araBAD-Promotors enthält, wurde anschließend wie für das Vektorfragment von pACYC184 beschrieben aus dem Agarosegel isoliert und gereinigt.

Die Ligation des araC-pBAD-lipB-Fragments mit dem 2,8 kb lan- gen Vektorfragment von pACYC184 erfolgte mittels der T4-DNA- Ligase. Die Transformation von E. coli-Zellen des Stammes DH5a mit dem Ligationsansatz erfolgte durch Elektroporation in ei- ner dem Fachmann bekannten Art und Weise. Der Transformations- ansatz wurde dann auf LB-Chloramphenicol-Agarplatten (10 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 10 g/1 NaCl, 15 g/1 Agar, 20 mg/l Chloramphenicol) ausgebracht und über Nacht bei 37 °C inku- biert. Die gewünschten Transformanden wurden nach einer Plas- midisolierung mittels des GFXTM Micro Plasmid Prep Kits (Amers- ham Biosciences GmbH, Freiburg) durch eine Restriktionsanalyse identifiziert. Der so erhaltene Vektor trägt die Bezeichnung pKP560 (Fig. 4).

Beispiel 2 : Herstellung von R-a-Liponsäure-Produzenten

Das lipB-Überexpressionsplasmid pKP560 bzw. das Lipoyl- Domänen-Plasmid pGS331 wurden mittels Elektroporation in die E. coli-Stämme W3110 bzw. W3110AlplA transformiert und nach Selektion auf LB-Agarplatten mit 20 mg/1 Chloramphenicol bzw.

100 mg/1 Ampicillin wurden die Plasmide aus jeweils einer der Transformanden reisoliert, mit Restriktionsendonukleasen ge- spalten und überprüft. Mit dem Kontrollplasmid pACYC184 wurde in analoger Weise verfahren.

Für die gemeinsame Überexpression des lipB-Gens mit dem Li- poyl-Domänen-Gen wurden die Stämme W3110 pKP560 bzw.

W3110A1p1A pKP560 mit dem Plasmid pGS331 wie oben beschrieben transformiert und die erhaltenen Transformanden mittels Re- striktionsanalyse überprüft.

Beispiel 3 : Fermentative Produktion von R-a-Liponsäure Für die fermentative Produktion von R-a-Liponsäure wurden die in Beispiel 2 durch Transformation mit den entsprechenden Plasmiden erzeugten Stämme verwendet. Als Vorkultur für die Produktionsanzucht wurden zunächst 5 ml LB-Flüssigmedium, das zur Stabilisierung von Plasmiden 100 mg/1 Ampicillin und/oder 20 mg/1 Chloramphenicol enthielt, mit dem jeweiligen Stamm be- impft und für 16 h bei 37 °C und 160 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und zweimal mit dem entsprechenden Volumen steriler Saline (0,9 % NaCl) gewaschen. Mit den auf diese Weise vorbe- reiteten Zellen wurden schließlich 15 ml BS-Medium (7 g/1 K2HP04 ; 3 g/1 KH2P04 ; 1 g/l (NH4) 2SO4 ; 0,1 g/l MgS04 x 7 H20; 0, 5 g/1 Na3Citrat x 3 H20 ; 1% säurehydrolysiertes Casein (vitamin- frei) ; 13,5 g/1 Na2Succinat x 6 H20 ; pH 6,8 mit HCl einge- stellt), das außerdem 100 mg/1 Ampicillin und/oder 20 mg/1 Chloramphenicol enthielt, im Verhältnis 1 : 100 angeimpft. Die Inkubation der Produktionskulturen erfolgte bei 37 °C und 160 rpm auf einem Schüttler. Die Expression des Lipoyl-Protein- Ligase B-Gens in den Stämmen, die das Plasmid pKP560 enthiel- ten, wurde durch Zugabe von 2 g/1 L-Arabinose nach ca. 4 h In- kubation induziert. Zum gleichen Zeitpunkt wurde auch die Ex- pression der E2-Domäne in den Stämmen mit dem Plasmid pGS331 durch Zugabe von 0,05 g/1 Isopropyl-ß-D-Thiogalactosid indu-

ziert. Nach 24 h Inkubation wurden Proben entnommen und die Zellen durch Zentrifugation vom Kulturmedium abgetrennt. Die darin enthaltene R-a-Liponsäure wurde mittels des bekannten turbidimetrischen Bioassays (Herbert und Guest, 1970, Meth.

Enzymol. 18A : 269-272) quantifiziert. Tabelle 1 zeigt die er- zielten Gehalte von R-a-Liponsäure im jeweiligen Kulturüber- stand nach 24 h Inkubation : Tabelle 1 : Stamm R-a-Liponsäure [lug/l] W3110 pACYC184 0 W3110 pKP560 20 W3110 pKP560 pGS331 50 W3110 pGS331 0 W3110AlpA pACYC18423 W3110A1p1A pKP560 119 W3110A1p1A pKP560 pGS331 220 W3110ApJA pGS3312 INTERNATIONAL FORM Consortium für elektrochem. Industrie GmbH Zielstattstr. 20-22 RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT issued pursuant to Rule 7. 1 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page I. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM Identification reference given by the DEPOSITOR : Accession number given by the W3110/pKP560/pGS331 INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY DSM 15661 19. SCIENTIFIC DESCRIPTION AND/OR PROPOSED TAXONOMIC DESIGNATION The microorganism identified under 1. above was accompanied by : (X) a scientific description (X) a proposcd taxonomic designation (Mark with a cross where applicable). III. RECEIPT AND ACCEPTANCE This International Depositary Authority accepts the microorganism identified under I. above, which was reccived by it on 2003-06-06 (Date of the original dcposit)'. IV. RECEIPT OF REQUEST FOR CONVERSION The microorganism idcntified under 1 above was rcccived by this International Depositary Authority on (datc of original deposit) and a request to convert the original deposit to a deposit under the Budapest Treaty was rcccived by it on (datc of rcceipt of requcst for conversion). V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Signature (s) ofperson (s) having the power to represent the MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH International Depositary Authority or of authorizcd official (s) : Address : MascherodcrWegtb ,.. D-38124 Braunschweig e-. '3 Datc : 2003-06-10 NVhcrc Rulc 6. 4 (d) applies, such datc is thc dato on which the Status ofintemationa) dcpositary authority was acquired. Fonn DSMZ-BP/4 (solepage) 12/2001 0-1 Formular PCT/RO/134 (SAFE) Angaben zu einem hinterlegten Mikroorganismus und/oder anderem hinterlegten biologischen Material 0-1-1 erstellt durch Benutzung von PCT-SAFE [EASY mode] Version 3. 50 (Build 0002. 162) 0-2 Internationales Aktenzeichen PCTP200 4/00787 0-3 Aktenzeichen des Anmelders oder CO 10314 Anwalts 1 Die nachstehenden Angaben betreffen den Mikroorganismus und/ oder anderes biologisches Material, der/das in der Beschreibung genannt ist 1-1 Seite 17 1-2 Zeile 10-14 1-3 Angaben betr. Hinterlegung 1-3-1 Name der Hinterlegungsstelle DSMZ DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroor- ganismen und Zellkulturen GmbH 1-3-2 Anschrift der Hinterlegungsstelle Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Germany 1-3-3 Datum der Hinterlegung 0 6. Juni 2003 (06. 06. 2003) 1-3-4 Eingangsnummer DSMZ 15661 1-5 Bestimmungsstaaten, für die alle Bestimmungsstaaten besondere Angaben gemacht werden VOM ANMELDEAMT AUSZUFÜLLEN 0-4 Dieses Formular ist mit der interna- tionalen Anmeldung eingegangen Qa oder nein) 0-4-1 Bevollmächtigter Bediensteter U G VOM INTERNATIONALEN BÜRO AUSZUFÜLLEN 0-5 Dieses Formular ist an folgendem Datum beim internationalen Büro eingegangen 0-5-1 Bevollmächtigter Bediensteter