Die vorliegende Erfindung betrifft ein Konjugat, das sich zur Induktion zellulärer Im¬ munität eignet, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Konjugats.

Eine der Hauptaufgaben des Immunsystems ist die Abwehr von Viren. Hierfür werden neben Antikörpern insbesondere CD8 ⁺ T Lymphozyten (nachstehend mit CD8 ⁺ T Zellen bezeichnet) als wichtig erachtet. Diesen wird eine wesentliche Rolle in der Erlangung zellulärer Immunität gegen Viren zugeschrieben.

Seit langer Zeit wird versucht, eine Immunität gegen Viren zu induzieren. Hierfür wird oftmals Vaccinia-Virus als Vektor verwendet. In sein Genom werden Gene von Viren integriert, gegen die eine zelluläre Immunität induziert werden soll. Das erhaltene rekombinante Vaccinia-Virus wird dann zur Expression der angesproche¬ nen Gene sowie der Prozessierung ihrer Genprodukte in Versuchspersonen injiziert.

Hierbei hat sich jedoch häufig gezeigt, daß Vaccinia-Virus Neuropathien auslöste. Seine Verwendung zur Induktion zellulärer Immunität stellt daher ein nicht zu vertretendes Risiko dar.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu¬ stellen, mit dem zelluläre Immunität gegen Viren induziert werden kann, ohne daß vorstehendes Risiko auftritt.

Erfindungsgemäß wird dies durch ein Konjugat erreicht, das einen im Körper nicht immunogen wirkenden Träger und ein CD8 ⁺ -T Zell-Epitop umfaßt.

Der Ausdruck "im Körper nicht als immunogen wirkender Träger" umfaßt eine Verbindung jeglicher Art, die im Körper eines Tieres oder Menschen keine Immun¬ reaktionen hervorruft. Eine solche Verbindung kann ein körpereigenes oder körper¬ fremdes Protein bzw. ein Teil davon (Peptid) sein. Bevorzugt ist die Verbindung

Serumalbumin, Fibrinogen oder Transferrin bzw. ein Peptid davon.

Der Ausdruck CD8 ⁺ -T Zell-Epitop betrifft eine Verbindung jeglicher Art, die ein von CD8 ⁺ -T Zellen erkennbares, d.h. MHC Klasse I-Molekül restringiertes, Epitop eines Antigens enthält. Solche Epitope sind bekannt. Beispielhaft wird auf nachstehende Epitope des LCM Virus (lymphocytic choriomeningitis virus) in Bezug auf BALB/c (H-2 ^d )- bzw. B6 (H-2 ^b )-Mäuse verwiesen:

L restringiertes Nonapeptid [RPQASGVYM]

(Aminosäuren 1 18-126 von LCM Virus-Nukleoprotein)

(vgl. Schutz, M. et al., Eur. J. Immunol. 19 ( 1989), 1657

D ^b -restringiertes Nonapeptid [AVYNFATCG]

(Aminosäuren 34-42 von LCM Virus-Glycoprotein C)

(vgl. Klavinskis, L.S. et al., Virology 178 (1990), 393; Gairin, J.E. et al.,

J. Virol. 66 (1992), 6755).

Darüberhinaus sind dem Fachmann Verfahren bekannt, erfindungsgemäß ver¬ wendbare Epitope zu identifizieren und bereitzustellen. Er wird sie vorzugsweise auf Antigenen von Viren, Bakterien, Einzellern oder Tumoren suchen. Auch sind für ihn Epitope von in Autoimmunreaktionen beteiligten Proteinen besonders inter¬ essant.

Ein erfindungsgemäßes Konjugat kann ein oder mehrere Epitope enthalten. Diese können gleich oder verschieden sein. Im letzteren Fall können z. B. Epitope von verschiedenen Antigenen eines oder mehrerer Viren bzw. von viralen und bakteriel¬ len Antigenen gleichzeitig vorliegen.

Erfindungsgemäß können ein oder mehrere Epitope des Konjugats direkt oder über einen üblichen Linker an den Träger gebunden sein. Eine solche Bindung kann an einer beliebigen Stelle des Trägers sein. Bei mehreren Epitopen können diese zumindest teilweise getrennt voneinander oder als Einheit aneinander gereiht gebunden sein.

In bevorzugter Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Konjugat ein Fusions¬ protein. In einem solchen können ein oder mehrere Epitope an beliebiger Stelle des Träger-Proteins vorliegen. Bei mehreren Epitopen können diese zumindest teilweise in getrennter Form oder als Einheit aneinander gereiht sein. Besonders bevorzugt ist ein Fusionsprotein, in dem ein oder mehrere Epitope am N- und/oder C-Termi- nus des Träger-Proteins vorliegen.

Vorteilhaft kann es auch sein, wenn das erfindungsgemäße Konjugat ein oder mehrere Epitope aufweist, die in ihrer Sequenz im Vergleich zu jener im Antigen modifiziert sind. Solche Modifikationen können Additionen, Deletionen und/oder Substitutionen von ein oder mehreren Aminosäuren sein. Auch können einzelne Aminosäuren in derivatisierter Form vorliegen.

Desweiteren kann es günstig sein, wenn ein oder mehrere Epitope des erfindungs¬ gemäßen Konjugats zusätzlich Aminosäuren der sie im Antigen flankierenden Sequenzen enthalten. Diese Aminosäuren können ebenfalls wie vorstehend modifi¬ ziert sein.

Darüberhinaus kann es vorteilhaft sein, wenn das erfindungsgemäße Konjugat geladene oder hydrophobe Gruppen aufweist. Dem Fachmann sind Verfahren bekannt, solche Gruppen in das Konjugat einzuführen.

Ferner ist darauf hinzuweisen, daß in dem erfindungsgemäßen Konjugat eine Homologie zwischen dem Träger und einem oder mehreren seiner Epitope bestehen kann. Bevorzugt ist allerdings ein Konjugat, indem der Träger eine Heterologie zu einem oder mehreren seiner Epitope aufweist.

Ein erfindungsgemäßes Konjugat kann in üblicher Weise hergestellt werden. Für ein Fusionsprotein erweist sich ein Verfahren mit folgenden Verfahrensschritten als günstig:

(a) Insertion einer für ein im Körper nicht immunogen wirkendes Träger-Protein

codierenden DNA und einer für ein CD8 ⁺ -T Zell-Epitop codierenden DNA im Leserahmen in einen Expressionsvektor,

(b) Transformation einer Zelle mit dem in (a) enthaltenen Expressionsvektor und Expression des Fusionsproteins, sowie

(c) Isolierung und Reinigung des in (c) erhaltenen Fusionsproteins.

Die Durchführung vorstehender Schritte ist dem Fachmann bekannt. Er kennt Vektoren und Zellen, um DNA-Sequenzen zu exprimieren. Beispielsweise wird er zur Expression in E. coli. den Vektor pH6EX3 verwenden (vgl. nachstehend). Für die Expression in Hefe wird er z.B. den Vektor pY100 und für die Expression in tierischen Zellen den Vektor pKCR einsetzen. Als geeignete Hefezellen wird er z.B. auf den Stamm Saccharomyces cerevisiae zurückgreifen und als eukaryotische Zellen z.B. CHO Zellen verwenden.

Desweiteren kennt der Fachmann auch Alternativen zu vorstehenden Verfahrens¬ schritten. Beispielsweise ist ihm eine in Schritt (a) anzuwendende PCR Mutageπese geläufig. Mit diesem Verfahren kann die Insertion des CD8 ⁺ -T Zell-Epitops in das Trägerprotein auf DNA-Ebene erfolgen (vgl. nachstehend).

Erfindungsgemäße Konjugate eignen sich zur Induktion zellulärer Immunität. Sie stellen einen neuen Typus einer Vakzine dar, die gegen die vielfältigsten Antigene prophylaktisch und therapeutisch eingesetzt werden kann. Typische Anwendungs¬ möglichkeiten der Vakzine liegen bei Viren, Bakterien und Einzellern. Besondere Bedeutung erfährt die Vakzine auch bei Tumor- und Autoimmunerkrankungen. Ihre ganz besondere Qualität zeigt sich darin, daß sie keinerlei Nebenwirkung ver¬ ursacht.

Fig. zeigt erfindungsgemäße Fusionsproteine.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 : Herstellung erfindungsgemäßer Konjugate

Zur Herstellung erfindungsgemäßer Fusionsproteine wurde der für E. coli geeignete Expressionsvektor pH6EX3 verwendet (vgl. Berthold, H. M. et al., Prot. Expr. Purif. 3 (1992), 50). In diesen Vektor wurde die für NS-1 _1-81 (Aminosäuren 1-81 des Nicht-Strukturproteins 1 von Influenza-Virus A), für TAg ₂ . ₂₇₀ (Aminosäuren 2-270 von SV 40 T-Ag) bzw. für Maus-Wildtyp p53 (Aminosäuren 2-387) codierende cDNA in üblicher weise inseriert (vgl. Yamnikova, S.S. et al., Virology 197 (1993), 558; Brown, M.M. et al., J. Virol. 60 (1986) 290; Jenkins, J. R. et al., Nucl. Ac. Res. 12 (1984), 5609; Kolzau, T. und Deppert W., Int. J. Oncol. 3 (1993), 23). Nach Transformation von E. coli wurden die Expressionsprodukte N-O, S-0, T-O und P-O erhalten (vgl. Fig.).

In diese Expressionsprodukte wurden folgende LCM Virus CD8 ⁺ T Zell-Epitope eingebaut:

L ^d -restringiertes Nonapeptid [RPQASGVYM]

(Aminosäuren 1 18-126 von LCM Virus-Nukleoprotein; vgl. vorstehend; nach¬ stehend mit (El ) bezeichnet) D -restringiertes Nonapeptid [AVYNFATCG]

(Aminosäuren 34-42 von LCM Virus-Glycoprotein C; vgl. vorstehend; nachstehend mit (E2) bezeichnet)

D ^b -restringiertes Nonapeptid [VENPGGYCL]

(Aminosäuren 278-286 von LCM Virus-Glycoprotein C; nachstehend mit (E3) bezeichnet).

1. Orthotopischer Austausch von T-Zell-Epitopen

In T-O wurde das eigene D ^b -restringierte T Zell-Epitop (Aminosäuren 207-215) durch vorstehende Epitope (E1 ) bzw. (E2) ersetzt. Es wurden die Fusionsproteine T-1 und T-3 erhalten. Hierzu wurde zunächst die für T-O codierende DNA einer üblichen PCR-Mutagenese unterzogen. Die erhaltene modifizierte DNA wurde dann kloniert und in E. coli exprimiert.

Desweiteren wurde in N-O vorstehendes Epitop (E3) eingefügt. Es wurde das Fusionsprotein N-1 erhalten (vgl. Fig.). Hierzu wurde ebenfalls vorstehendes PCR- Mutagenese-Verfahren verwendet. Die Fusionsproteine T-1 , T-3 und N-1 sind in der Fig. angegeben.

2. Heterotopische Einfügung von T-Zell-Epitopen

In T-O wurden nahe des C-Terminus vorstehende T Zell-Epitope (E1 ) bzw. (E2) eingefügt. Es wurden die Fusionsproteine T-2 und T-4 erhalten. Hierzu wurde die für T-O codierende DNA durch Insertion von Oligonukleotiden modifiziert. Die erhaltene DNA wurde kloniert und in E. coli exprimiert.

Ferner wurden in P-0 nahe des C-Terminus vorstehende T Zell-Epitope (E2) bzw. (E1 ) eingefügt. Es wurden die Fusionsproteine P-1 und P-2 erhalten.

Desweiteren wurde in S-0 nahe des C-Terminus vorstehendes T Zell-Epitop (E2) eingefügt. Es wurde das Fusionsprotein (S-1 ) erhalten.

Darüberhinaus wurde in T-O nahe des N-Terminus vorstehendes T-Zell-Epitop (E2) eingefügt. Es wurde das Fusionsprotein (T-5) erhalten.

Ferner wurden in T-O nahe des C-Terminus vorstehende T-Zell-Epitope (E2) und (E1 ) gemeinsam eingefügt. Es wurde das Fusionsprotein T-6 erhalten (vgl. Fig.). Vorstehende Fusionsproteine wurden in entsprechender Weise wie T-2 bzw. T-4 erhalten.

Beispiel 2: Immunisierung von Mäusen mit erfindungsgemäßen Konjuga¬ te n

Die in Beispiel 1 erhaltenen Fusionsproteine wurden zusammen mit SDS in BALB/c- bzw. B6-Mäuse injiziert. Den Mäusen wurde dann LCM Virus verabreicht. Im einzelnen erhielten die Mäuse 14 Tage und 7 Tage vor Verabreichung des Virus jeweils 5 g Fusionsprotein. 5 Tage nach Virus- Verabreichung wurden infektiöse Titer aus Milzen der Mäuse bestimmt.

Es zeigte sich, daß in BALB/c-Mäusen T-O und P-0 zu keinem Schutz vor LCM Virus führten. T-4 führte zu einem schwachen Schutz, während T-1 , T-2 und T-6 sowie P-2 zu einem starken Schutz vor dem Virus führten (vgl. Tab. 1 ).

Desweiteren zeigte es sich, daß in B6-Mäusen T-0, P-0 und S-0 zu keinem Schutz vor LCM Virus führten. T-3, T-4, T-5 und T-6, sowie P-1 und S-1 führten jedoch zu einem großen Schutz vor dem Virus (vgl. Tab. 2).

Aus vorstehenden Daten geht hervor, daß ein Trägerprotein mit einem oder mehre¬ ren CD8 ⁺ -T Zell-Epitopen zelluläre Immunität gegen Viren induzieren kann.