CHINEA SANTIAGO GLAY (CU)
GUIROLA CRUZ OSMANY (CU)
VERA ALVAREZ ROBERTO (CU)
HUERTA GALINDO VIVIAN (CU)
FLEITAS SALAZAR NORALVIS (CU)
MUSACCHIO LASA ALEXIS (CU)
MAZOLA REYES YULIET (CU)
CHINEA SANTIAGO GLAY (CU)
GUIROLA CRUZ OSMANY (CU)
VERA ALVAREZ ROBERTO (CU)
HUERTA GALINDO VIVIAN (CU)
FLEITAS SALAZAR NORALVIS (CU)
MUSACCHIO LASA ALEXIS (CU)
| WO1998031814A1 | 1998-07-23 | |||
| WO2003008571A2 | 2003-01-30 | |||
| WO2009032975A1 | 2009-03-12 |
| EP2022506A2 | 2009-02-11 |
MARRERO-PONCE, YOVANI ET AL: "Ligand-Based Virtual Screening and in Silico Design of New Antimalarial Compounds Using Nonstochastic and Stochastic Total and Atom-Type Quadratic Maps", JOURNAL OF CHEMICAL INFORMATION AND MODELING , 45(4), 1082-1100 CODEN: JCISD8; ISSN: 1549-9596, 2005, XP008114058
CUSHION, MELANIE T. ET AL: "A cytotoxicity assay for evaluation of candidate anti-Pneumocystis carinii agents", ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY , 41(2), 379-384 CODEN: AMACCQ; ISSN: 0066-4804, 1997, XP008114068
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REIVINDICACIONES - Uso de compuestos químicos para Ia preparación de una composición farmacéutica para atenuar o inhibir Ia infección por el virus Dengue, donde dichos compuestos contengan dos subestructuras funcionalmente distintivas de acuerdo a Ia fórmula siguiente:
[C]-[A]
Donde,
[A] es definida como ancla y corresponde a una subestructura química capaz de unirse al surco asociado al lazo "ij" de Ia proteína E definido en
Ia presente invención, y dicha subestructura ancla adopta una conformación que comprende al menos tres de los siguientes elementos: a) un elemento donor de puente de hidrógeno (Dr 4 ), y/o b) un elemento aceptor de puente de hidrógeno y/o portador de carga negativa (A 1 -, A 2 -, A 3 ), y/o c) un elemento hidrofóbico (H- 1 . 3 ), y/o d) un elemento aceptor y/o donor de puente de hidrogeno (OIA), y/o e) un elemento simultáneamente donor-aceptor de puente de hidrogeno (D+A), y dichos elementos (a) - (e) son seleccionados entre los elementos que constituyen el modelo farmacofórico 3D siguiente: D 1 , D 2 , D 3 , D 4 , A 1 " , A 2 " , A 3 , D/A, H 1 , H 2 , H 3 y D+A, donde:
Las distancias interatómicas entre los elementos Di, D 2 , D 3 , D4, A 1 " , A 2 " , A 3 , D/A, H 1 , H 2 , H 3 y D+A del modelo farmacofórico de Ia presente invención son las siguientes: [D 1 J-[D 2 ] = 2.9 ± 1A, [Di]-[D 3 ] = 4.2 ± 1A, [Di]-[D 4 ] = 17.4 ± 1 A, [Di]-[A 1 -] = 3.9 ± 1A, [Di]-[A 2 -] = 7.0 ± 1A, [Di]-[A 3 ] = 10.6 ± 1A, [Di]- [D+A] = 10.2 ± 1A, [D 1 HDZA] = 12.9 ± 1A, [D 1 HHi] = 5.1 ± 1A, [D 1 HH 2 ] =
9.3 ± 1A, [Di]-[H 3 ] = 7.2 ± 1A 1 [D 2 ]-[D 3 ]= 3.0 ± 1A, [D 2 ]-[D 4 ] = 15.5 ± 1A, [Dz]-[A 1 -]= 5.8 ± 1A, [D 2 HA 2 -] = 6.0 ± 1A, [D 2 ]-[A 3 ] = 8.4 ± 1A, [D 2 ]-[D+A] = 11.6 ± 1A, [D 2 ]-[D/A] = 8.6 ± 1A, [D 2 HH 1 ] = 5.0 ± 1A, [D 2 HH 2 ] = 8.0 ± 1A, [D 2 HH 3 ] = 5.2 ± 1A, [Ds]-[D 4 ] = 14.8 ± 1A 1 [D 3 HAi " ] = 7.1 ± 1A, [D 3 HA 2 " ] = 3.4 ± 1 A, [Ds]-[A 3 ] = 7.0 ± 1 A, [D 3 ]-[D+A]= 10.5 ± 1 A, [D 3 ]-[D/A] = 6.0 + 1 A,
[Ds]-[H 1 ] = 4.4 ± 1A, [Ds]-[H 2 ] = 6.0 ± 1A, [D 3 ]-[H 3 ] = 3.2 ± 1A, [D 4 HA 1 " ] = 17.3 ± 1A, [D 4 J-[A 2 -] = 16.0 ± 1A, [D 4 HA 3 ] = 9.0 ± 1A, [D 4 ]-[D+A]= 5.2 ± 1á, [D 4 ]-[D/A] = 13.4 ± 1A, [D 4 HH 1 ] = 13.0 ± 1A, [D 4 HH 2 ] = 9.7 ± 1A, [D 4 J-[H 3 ] =
12.4 ± 1 A, [A 1 -J-[A 2 -] = 10.0 ± 1A, [Af]-[A 3 ] = 12.4 ± 1A 1 [A 1 I-[DM] = 12.7 ± 1 A, [Ai>[D/A] =12.8 ± 1A 1 [Af]-[H 1 ] = 5.1 ± 1A, [A 1 I[H 2 ] = 10.4 ± 1A 1 [A 1 I- [H 3 ] = 9.6 ± 1A 1 [A 2 I-[A 3 ] = 7.3 ± 1A, [A 2 >[DM] = 11.8 ± 1A, [A 2 " J-[D/A] = 4.0 ± 1A, [A 2 I-[H 1 ] = 7.1 ± 1A, [A 2 I-[H 2 ] = 6.6 ± 1A, [A 2 I(H 3 ] = 3.9 ± 1A 1 [A 3 ]-[D+A] = 6.5 ± 1A, [A 3 ]-[D/A] = 4.9 ± 1A, [A 3 J-[H 1 ] = 7.7 ± 1A 1 [A 3 J-[H 2 ] =
3.7 ± 1A, [As]-[H 3 ] = 3.9 ± 1A, [D+A]-[D/A] = 10.0 ± 1A, [DM]-[H 1 ] = 8.1 ± 1A, [DM]-[H 2 ] = 5.3 ± 1A, [DM]-[H 3 ] = 8.6 ± 1A, [0/A]-[H 1 ] = 8.6 + 1A, [D/A]-[H 2 ] = 5.2 ± 1A, [D/A]-[H 3 ] = 3.8 ± 1A, [H 1 J-[H 2 ] = 5.3 ± 1A, [H 1 J-[H 3 ] = 5.5 ± 1A, [H 2 ]-[H 3 ] = 3.9 ± 1A; Di, D 2 , D 3 y D4 corresponden cada uno a un átomo o grupo de átomos donores de puentes de hidrógeno; A 1 " y A 2 " corresponden cada uno a un átomo o grupo de átomos caracterizados por ser aceptares de puente de hidrógeno y/o portadores de carga negativa; D/A corresponde a un átomo o grupo de átomos aceptares y/o donores de puentes de hidrógeno; A 3 corresponde a un átomo o grupo de átomos aceptares de puente de hidrógeno; Hi 1 H 2 , H 3 se corresponde cada uno con un átomo o grupos de átomos no polares ; DM se corresponde con un átomo o grupos de átomos simultáneamente aceptares y donores de puentes de hidrógeno;
[C] definida como cabeza corresponde a una subestructura química unida covalentemente a Ia subestructura ancla [A] y dicha subestructura aporta o favorece Ia capacidad de las moléculas de Ia presente invención de inhibir Ia infección por virus Dengue afectando o modulando una o más de las interacciones intermoleculares que involucran a Ia proteína E. - Uso de compuestos químicos de acuerdo a Ia reivindicación 1 , donde dichos elementos farmacofóricos Di, D 2 , D 3 y D 4 de Ia subestructura ancla
[A], corresponden cada uno a un átomo o grupo de átomos donores de puentes de hidrógeno seleccionados independientemente de cualquiera de los grupos siguientes: -OH, -NH, -NH 2 , -NH 3 + , =NH y -SH; D 1 establece enlace por puentes de hidrógeno con Ia proteína E donando: a) uno o más átomos de hidrógeno al átomo de oxígeno del grupo carbonilo de Ia cadena principal del residuo Asp-98 y/o b) uno o más átomos de hidrógeno al átomo de oxígeno del grupo carboxiamida de Ia cadena lateral del residuo Asn-103; D 2 establece enlace por puentes de hidrógeno donando: a) uno o más átomos de hidrógeno al átomo de oxígeno del grupo carbonilo de Ia cadena principal del residuo Asp-98 y/o b) uno o más átomos de hidrógeno al átomo de oxígeno del grupo carbonilo de Ia cadena principal del residuo Ala-245 y/o c) uno o más átomos de hidrógeno al átomo de oxígeno del grupo carbonilo de Ia cadena principal del residuo Lys-246; D 3 establece enlace por puentes de hidrógeno donando uno o más átomos de hidrógeno al átomo de oxígeno del grupo carbonilo de Ia cadena principal del residuo Lys-246; D4 establece enlace por puentes de hidrógeno donando: a) uno o más átomos de hidrógeno a uno o ambos átomos de oxígeno del grupo carboxilato de Ia cadena lateral del residuo Asp-249 y/o b) uno o más átomos de hidrógeno al átomo de oxígeno del grupo carbonilo de Ia cadena principal del residuo Val-250.- Uso de compuestos químicos de acuerdo a Ia reivindicación 1 , donde dichos elementos farmacofo ricos A 1 " y A 2 " de Ia subestructura ancla [A] corresponden cada uno a un átomo o grupo de átomos caracterizados por ser: a) aceptores de puente de hidrógeno seleccionados independientemente de cualquiera de los grupos siguientes: -C=O, -N=O, -S=O, -P=O y -O- y/o b) portadores de carga neta (y/o parcialmente) negativa, seleccionados independientemente de cualquiera de los grupos siguientes: átomos de oxígeno de los grupos oxo e hidroxilo presentes en -
C(O)OH, -S(O)OH, RR 1 P(O)(OH), RROP(O)(OH), ROP(O)(OH) 2 , RP(O)(OH) 2 , (RO) 2 P(O)(OH), RS(O) 2 OH, ROS(O) 2 OH, átomo de nitrógeno presente en Ia trifluorometilsulfonamida, átomos de nitrógeno no sustituidos presente en grupo tetrazol; Ai " interactúa con el residuo Lys- 246 mediante: a) puente de hidrógeno con el grupo amonio de Ia cadena lateral y/o b) interacciones electrostáticas con el grupo amonio portador de carga positiva; A 2 " se caracteriza por: a) aceptar el átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Ser-72 y/o b) establecer interacciones electrostáticas con el grupo guanidinio portador de carga positiva del residuo Arg-99. - Uso de compuestos químicos de acuerdo a Ia reivindicación 1 , donde dicho elemento farmacoforico D/A de Ia subestructura ancla [A] corresponde a: a) un átomo o grupo de átomos aceptores de puentes de hidrógeno seleccionados de cualquiera de los grupos siguientes: -C=O, - N=O, -S=O, -P=O y -O- o b) un átomo o grupos de átomos donores de puentes de hidrógeno seleccionados de cualquiera de los grupos siguientes: -OH, -NH 1 -NH 2 , -NH 3 + , =NH y -SH o c) un átomo o grupos de átomos simultáneamente aceptores y donores de puentes de hidrógeno seleccionados de cualquiera de los grupos siguientes: -OH, -CONHR, - CONH 2 '; D/A interactúa con Ia proteína E por medio de una de las siguientes maneras: a) D/A establece enlace por puentes de hidrógeno aceptando: a) el átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Ser-72 y/o b) el átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Thr-70; b) D/A establece enlace por puentes de hidrógeno donando uno o más átomos de hidrógeno al: a) átomo del oxígeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Ser- 72 y/o b) átomo de oxígeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Thr-70; c) D/A establece enlaces por puentes de hidrógeno: a) aceptando el átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Ser-72 y b) donando uno o más átomos de hidrógeno al átomo de oxígeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Thr-70; d) D/A establece enlaces por puentes de hidrógeno: a) donando uno o más átomos de hidrógeno al átomo de oxígeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Ser-72 y b) aceptando el átomo de oxígeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Thr-70. - Uso de compuestos químicos de acuerdo a Ia reivindicación 1 , donde dicho elemento farmacoforico A 3 de Ia subestructura ancla [A] corresponde a un átomo o grupo de átomos aceptores de puente de hidrógeno seleccionados de cualquiera de los grupos siguientes: -C=O, - N=O, -S=O, -P=O y -O-; A 3 establece enlace por puente de hidrógeno con Ia proteína E aceptando: a) un átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Thr-115 y/o b) un átomo de hidrógeno del grupo amino de Ia cadena principal del residuo Gln-248. - Uso de compuestos químicos de acuerdo a Ia reivindicación 1 , donde dichos elementos farmacoforicos Hi, H 2, H 3 de Ia subestructura ancla [A] se corresponde cada uno con un átomo o grupos de átomos no polares seleccionados independientemente de cualquiera de los radicales siguientes: a) radical alquilo o heteroalquilo CrC-I 5 con no más de siete heteroátomos de cadena lineal o ramificada opcionalmente no sustituido o sustituido; b) radical cicloalquilo o heterocicloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos, cada uno de 3-7 miembros y no más de tres heteroátomos, fusionados o enlazados, opcionalmente no sustituidos o sustituido; c) radical arilo o heteroarilo compuesto por uno, dos o tres anillos, cada uno de 5-7 miembros y no más de tres heteroátomos, fusionados o enlazados, opcionalmente no sustituido o sustituido; d) radical ariloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos arilo, donde uno o más sustituyentes corresponde a grupos alquilo Ci-C 5 de cadena lineal o ramificada opcionalmente no sustituido o sustituido; e) radical heteroariloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos arilo o heteroarilo, cada uno de 5-7 miembros y no más de tres heteroátomos, fusionados o enlazados, donde uno de los sustituyentes corresponde a grupos alquilo
Ci-C 5 o heteroalquilo CrC 5 de cadena lineal o ramificada con no más de 3 heteroátomos, opcionalmente no sustituido o sustituido; f) radical alquilocicloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos cicloalquilo de 3-7 miembros, fusionados o enlazados donde uno o más sustituyentes corresponde a grupos alquilo CrC 5 de cadena lineal o ramificada opcionalmente no sustituido o sustituido; g) radical heteroalquilocicloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos cicloalquilo o heterocicloalquilo, cada uno de 3-7 miembros y no más de tres heteroátomos, fusionados o enlazados, donde uno o más sustituyentes corresponde a grupos alquilo Ci-C 5 o heteroalquilo Ci-C 5 de cadena lineal o ramificada con no más de 3 heteroátomos opcionalmente no sustituido o sustituido; h) radical arilocicloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos arilo unido a uno o más radicales cicloalquilo de 3-7 miembros, opcionalmente sustituidos o no sustituidos; i) radical heteroarilocicloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos arilo o heteroarilo, cada uno de 5-7 miembros y no más de tres heteroátomos, unido a uno o más anillos cicloalquilo o heterocicloalquilo, cada uno de 3-7 miembros y no más de tres heteroátomos, opcionalmente no sustituidos o sustituidos; j) radical seleccionado entre los radicales (a) - (i), donde dicho radical contiene el elemento del modelo farmacofórico Hi y dichos sustituyentes y/o heteroátomos constituyentes comprenden los elementos farmacofóricos D 1 y/o D 2 y/o D 3 y/o Ai " ; k) radical seleccionado entre los radicales (a) - (i), donde dicho radical contiene el elemento del modelo farmacofórico H2 y dichos sustituyentes y/o heteroátomos constituyentes comprenden los elementos farmacofóricos A 3 y/o D/A y/o
D+A; I) radical seleccionado entre los radicales (a) - (i), donde dicho radical contiene el elemento del modelo farmacofórico H 3 y dichos sustituyentes y/o heteroátomos constituyentes comprenden los elemetos farmacofóricos D 3 y/o A 2 y/o A 3 y/o D/A; Hh establece interacciones hidrofóbicas con Ia porción alifática de Ia cadena lateral de butilamonio de: a) el residuo Lys-246 o b) los residuos Lys-246 y Lys-247; H 2 establece interacciones hidrofóbicas con: a) Ia porción alifática de Ia cadena lateral de butilamonio del residuo Lys-247 o b) con Ia porción alifática de Ia cadena lateral de butilamonio del residuo Lys-247 y el grupo metilo de Ia cadena lateral del residuo Thr-70; H 3 establece interacciones hidrofóbicas con las cadenas laterales de los residuos Val-97 y lle-113.
7- Uso de compuestos químicos de acuerdo a Ia reivindicación 1 , donde dicho elemento farmacofórico D+A de Ia subestructura ancla [A] se corresponde con un átomo o grupos de átomos simultáneamente aceptares y donores de puentes de hidrógeno seleccionados de cualquiera de los grupos siguientes: -OH 1 -CONHR, -CONH 2 ; D+A establece puentes de hidrógeno con Ia proteina E al: a) aceptar uno o más átomos de hidrógeno del grupo amonio de Ia cadena lateral del residuo Lys-247 y/o b) compartir uno o más átomos de hidrógeno con uno o ambos átomos de oxígeno del grupo carboxilato de Ia cadena lateral del residuo Asp-249.
8- Uso de compuestos químicos de acuerdo con Ia reivindicación 1 , donde dichas distancias interatómicas están comprendidas en el rango de ± 2A.
9- Uso de compuestos químicos de acuerdo con Ia reivindicación 1 donde [C] corresponde a un átomo de hidrógeno. 10- Uso de compuestos químicos de acuerdo con Ia reivindicación 1 donde
[C] corresponde a cualquiera de las siguientes subestructuras químicas: a) radical alquilo o heteroalquilo C- 1 -C 10 con no más de tres heteroátomos opcionalmente no sustituido o sustituido; b) radical cicloaquilo o heterocicloalquilo compuesto de uno, dos o tres anillos, cada uno de 3-7 miembros y no más de tres heteroátomos, fusionados o enlazados, opcionalmente no sustituidos o sustituidos; c) radical arilo o heteroarilo compuesto de uno, dos o tres anillos, cada uno formado de 5-7 miembros y no más de tres heteroátomos, opcionalmente sustituido o no sustituido; d) radical ariloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos arilo, donde uno o más sustituyentes corresponde a grupos alquilo CrC 5 de cadena lineal o ramificada opcionalmente no sustituido o sustituido; e) radical heteroariloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos arilo o heteroarilo, cada uno de 5-7 miembros y no más de tres heteroátomos, fusionados o enlazados, donde uno de los sustituyentes corresponde a grupos alquilo C 1 -C 5 o heteroalquilo C 1 -C 5 de cadena lineal o ramificada con no más de 3 heteroátomos, opcionalmente no sustituido o sustituido; f) radical alquilocicloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos cicloalquilo, cada uno de 3-7 miembros fusionados o enlazados donde uno o más sustituyentes corresponde a grupos alquilo C- 1 -C 5 de cadena lineal o ramificada opcionalmente no sustituido o sustituido; g) radical heteroalquilocicloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos cicloalquilo o heterocicloalquilo, cada uno 3-7 miembros y no más de tres heteroátomos, fusionados o enlazados donde uno o más sustituyentes corresponde a grupos alquilo CrC 5 o heteroalquilo CrC 5 de cadena lineal o ramificada con no más de 3 heteroátomos opcionalmente no sustituido o sustituido; h) radical arilocicloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos arilo unido a uno o más radicales cicloalquilo, cada uno de 3-7 miembros, opcionalmente sustituidos o no sustituidos; i) radical heteroarilocicloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos arilo o heteroarilo, cada uno de 5-7 miembros y no más de tres heteroátomos, unido a uno o más anillos cicloalquilo o heterocicloalquilo, cada uno de 3-7 miembros y no más de tres heteroátomos, opcionalmente no sustituidos o sustituidos; j) radical seleccionado entre los radicales (a) - (i), donde dicho sustituyentes comprenden uno o más grupos portadores de carga positiva; k) radical seleccionado entre los radicales (a) - (i), donde dicho sustituyentes comprenden uno o más grupos portadores de carga negativa. 11- Uso de compuestos químicos de acuerdo con Ia reivindicación 1 donde dicha subestructura [C] contiene sustituyentes portadores de carga positiva y dichos sustituyentes son seleccionados entre los grupos siguientes: RNH 2 , RNHR', RNR'R", RC(NRR')=NR", C(NR'R") 2 =NR'"; RNHC(NR 1 R") =NR" f ; C(RNH) 2 =NR'; RC(R 1 NH)=NR".
12- Uso de compuestos químicos de acuerdo con Ia reivindicación 1 donde dicha subestructura [C] contiene sustituyentes portadores de carga negativa y dichos sustituyentes son seleccionados entre los grupos siguientes: C(O)OH; S(O)OH; RR 1 P(O)(OH); RR'OP(O)(OH); ROP(O)(OH)2; RP(O)(OH)2;(RO)2P(O)(OH); RS(O)2OH; ROS(O)2OH; grupo tetrazol.
13- Uso de compuestos químicos de acuerdo a las reivindicaciones 1-12 para atenuar e inhibir Ia infección por un virus del género Flavivirus, y dicho virus se refiere a uno de los virus siguientes: Dengue tipo 1 , Dengue tipo 2, Dengue tipo 3, Dengue tipo 4, virus del NiIo Occidental, Virus de encefalitis de St Louis, virus de Ia encefalitis japonesa, virus de Ia fiebre amarilla, virus kunjin, virus de Ia enfermedad de Ia selva Kyasanur, virus de Encephalitis Trasmitida por Garrapata, virus del Valle Murray, virus LANGAT, virus de Ia enfermedad Louping y virus Powassan. 14- Uso de compuestos químicos de acuerdo a las reivindicaciones 1-12, donde Ia subestructura cabeza [C] interactúe con al menos uno de los residuos siguientes: a) residuos que forman el péptido de fusión: Gly-100, Trp-101 , Gly-102 y Phe-108, b) residuos correspondientes al monómero vecino presente en Ia estructura dimérica de los viriones maduros: Arg-2, Gly-5, lle-6, Ser-7, Asn-8, His-27, Gly-28, Glu-44 y Asp-154, c) residuo His-
244 presente en el lazo "ij", d) residuos Ala-245 y Asp-98 pertenecientes a Ia cavidad asociada al lazo "ij".
15- Uso de compuestos químicos de acuerdo a las reivindicaciones 1-12, donde Ia subestructura ancla [A] corresponde a uno de los siguientes radicales: A-Sl J001 , A-Sl J002, A-Sl J006, A-SIJ011 , A-SIJ015, A-Sl J016, A-
SIJ020, A-SIJ021 , A-SIJ022, A-SIJ023, A-SIJ028, A-SIJ030, A-SIJ044, A-
SIJ052, A-Sl J053, A-SIJ072, A-SIJ078, A-SIJ085, A-Sl J086, A-Sl J111, A- SIJ115, A-SIJ118, A-SIJ116, A-SIJ117, A-SIJ121 , A-SIJ122, A-SIJ123, A- SIJ124, A-SIJ125, A-SIJ126, A-SIJ127, A-SIJ128, A-SIJ130, A-SIJ131 , A- SIJ132, A-SIJ133, A-SIJ134, A-Sl J135, A-Sl J136, A-Sl J137, A-Sl J138, A- SIJ140, A-Sl J141 , A-Sl J142, A-Sl J144, A-Sl J145, A-SIJ146, A-SIJ147, A- SIJ149, A-SIJ150, A-SIJ151, A-SIJ152, A-SIJ153, A-Sl J154, A-SIJ155, A-
SIJ156, A-Sl J157, A-Sl J158, A-SIJ160, A-SIJ161 , A-SIJ162, A-Sl J163, A- SIJ164, A-SIJ165, A-Sl J166, A-Sl J167, A-SIJ 168, A-Sl J169, A-Sl J170, A- SIJ171 , A-Sl J172, A-Sl J173, A-Sl J174, A-SIJ179, A-Sl J180, A-SIJ181 , A- SIJ182, A-Sl J183, A-Sl J184, A-SIJ185, A-SIJ186 yA-SIJ188. 16- Uso de compuestos químicos de acuerdo a las reivindicaciones 1-12, donde dichos compuestos químicos se corresponden con cualquiera de los siguientes: C-Sl J01001 hasta C-Sl J01070, C-SIJ02071 , C-SIJ03072 hasta C-SIJ03076, C-SIJ04077 hasta C-SIJ04084, C-SIJ05085, C-SIJ-06086 hasta C-SIJ06114, C-SIJ07115, C-SIJ08116, C-SIJ09117, C-SIJ10118 hasta C-SIJ10120, C-SIJ11121 hasta C-SIJ11139, C-SIJ012140 hasta C-
SIJ12149, C-SIJ013150 hasta C-SIJ013156, C-SIJ14157 hasta C- SIJ14159, C-SIJ15160 hasta C-SIJ15165, C-SIJ17166 hasta CSIJ17167, C-SIJ18168 hasta C-SIJ18169, C-SIJ19170 hasta C-SIJ19172, C- SIJ20173 hasta C-SIJ20179, C-SIJ21180 hasta C-SIJ21181 , C-SIJ22182, C-SIJ23183, C-SIJ24184, C-SIJ25185, C-SIJ26186, C-SIJ27187, C-
SIJ28188, C-SIJ29189, C-SIJ30190, C-SIJ31191 , C-SIJ32192, C- SIJ33193, C-SIJ34194, CSIJ-35195, C-SIJ36196, C-SIJ37197 y C- SIJ38198.
17- Uso de compuestos químicos de acuerdo con Ia reivindicación 16 donde se utilizen tautómeros, isómeros geométricos, formas ópticamente activas como enantiómeros, diastereoisomeros, formas racémicas así como las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos químicos descritos en Ia presente invención.
18- Uso de compuestos químicos para Ia para Ia preparación de una composición farmacéutica para Ia prevención y/o tratamiento de las infecciones provocadas por virus Dengue y otros flavivirus de compuestos químicos de acuerdo a las reivindicaciones 1-12, 15 y 16. - Método para diseñar compuestos químicos que atenúen o inhiban infección del virus Dengue, utilizando el modelo farmacofórico descrito en Ia reivindicación 1. - Método para identificar y/o diseñar compuestos químicos según Ia revindicación 19, para Ia preparación de una composición farmacéutica que inhiba o atenué Ia infección por virus Dengue, donde dichos compuestos interfieran o modulen una o varias de las siguientes etapas del ciclo de replicación viral: a) interacciones que involucran la formación del heterodímero preM-E; y/o b) interacciones entre heterodímeros preM-E necesarias para el ensamblaje-brote de los viriones inmaduros; y/o c) maduración de los viriones producto del cambio de estructura cuaternaria de heterodímeros preM-E a homodímeros de proteína E; y/o d) asociación y/o disociación de los dímeros de proteína E característicos de los viriones maduros; y/o e) anclaje de Ia proteína E a Ia membrana endosomal de Ia célula infectada que inicia el proceso de fusión de membranas. |
COMPUESTOS QUíMICOS CON ACCIóN ANTIVIRAL CONTRA VIRUS DENGUE Y OTROS FLAVIVIRUS.
Campo de Ia Técnica
La presente invención está relacionada con Ia industria farmacéutica, específicamente describe el uso de compuestos químicos que contienen dos subestructuras funcionalmente distintivas [C]-[A] para afectar o inhibir diferentes eventos del ciclo de replicación viral del virus Dengue relacionados con Ia entrada del virus a las células dianas y el ensamblaje de los viriones progenie. Dichos compuestos químicos son útiles para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de Ia infección causada por los cuatro serotipos del virus de Dengue y por otros flavivirus.
Arte previo
El género flavivirus comprende alrededor de 70 virus incluyendo patógenos importantes responsables de elevadas tasas de morbilidad y mortalidad en animales y humanos como son el virus Dengue, el virus del NiIo occidental, el virus de Ia encefalitis transmitida por garrapatas, el virus de Ia encefalitis japonesa, el virus de Ia fiebre amarilla, el virus de Ia encefalitis de St Louis y el virus del Valle Murray. Sin embargo, no existe una terapia específica disponible para el tratamiento de Ia infección por flavivirus y hasta Ia fecha, solo se han aprobado vacunas para uso humano contra tres virus de dicho género.
Entre los flavivirus, el virus Dengue constituye uno de los mayores problemas de salud a nivel mundial, especialmente en áreas tropicales y sub-tropicales. El virus Dengue se agrupa en cuatro serotipos: DEN1 , DEN2, DEN3 y DEN4 y se transmite a los humanos a través de vectores, fundamentalmente, mosquito Aedes aegypti. El paciente infectado con virus Dengue puede ser asintomático o mostrar varios síntomas clínicos que incluyen desde fiebre indiferenciada (Fl), fiebre del dengue (FD) hasta formas más graves y ocasionalmente fatales de Ia enfermedad, conocidas como fiebre hemorrágica del dengue (FHD) y síndrome de choque por dengue (SCD) (Guha-Sapir, D. y Schimmer, B. (2005) Dengue fever: new paradigms for a changing epidemiology. Emerg.Themes.Epidemiol. 2:1-10).
A pesar de Ia relevancia del Dengue para Ia salud pública, en Ia actualidad no existen vacunas ni drogas antivirales disponibles contra esta enfermedad (Chaturvedi, U. C, Shrívastava, R., y Nagar, R. (2005) Dengue vaccines: problems and prospects. lndian J Med Res. 121:639-652). Tampoco existe un tratamiento específico; Ia terapia se basa en controlar los síntomas y compensar adecuadamente los efectos de Ia deshidratación y de las hemorragias, mientras el organismo genera anticuerpos neutralizantes contra el virus. El control de vectores es Ia única vía para prevenir Ia infección sin embargo, por Io general resulta poco eficaz (Rico-Hesse, R. (2003) Microevolution and virulence of dengue viruses. Adv. Vtrus Res. 59:315-341).
Los mayores impedimentos para el desarrollo de vacunas contra el Dengue son Ia falta de una comprensión más completa de Ia patogénesis de FHD y Ia ausencia de un modelo animal satisfactorio. Además, Ia infección con uno de los serotipos no confiere inmunidad protectora de larga duración contra las reinfecciones con los tres serotipos restantes (SABIN, AB. (1952) Research on dengue duríng World War II. Am J Trop.Med Hyg. 1:30-50); peor aún, las infecciones heterólogas secundarias o terciarias han sido asociadas con FHD/SCD (Halstead, S.B., Nimmannitya, S., y Cohén, S.N. (1970) Observations related to pathogenesis of dengue hemorrhagic fever. IV. Relation of disease severity to antibody response and virus recovered. YaIe J BIoI Med. 42:311-328. Halstead, S. B. (1988) Pathogenesis of dengue: challenges to molecular biology. Science. 239:476-481). En Ia patogénesis de FHD/SCD juega un papel importante el efecto conocido como amplificación dependiente de anticuerpos (ADA) (Mady, BJ. , Erbe, D.V., Kurane, L 1 Fanger, M.W., y Ennis, F.A. (1991) Antibody-dependent enhancement of dengue virus infection mediated by bispecific antibodies against cell surface molecules other than Fc gamma receptors. J Immunol. 147:3139-3144). Por Io tanto, una vacuna eficaz tiene que ser tetravalente y ser capaz de inducir respuesta protectora de anticuerpos neutralizantes contra los cuatro serotipos del virus Dengue simultáneamente. Las vacunas tetravalentes de virus vivos atenuados constituyen los candidatos vacunales más promisorios (Chaturvedi, U.C., Shrívastava, R., y Nagar, R. (2005) Dengue vaccines: problems and prospects. lndian J Med Res. 121: 639-652. Edelman, R. (2007) Dengue vaccines approach the finish Une. Clin Infecí. Dis.
45:56-60). Los mismos han sido desarrollados combinando los cuatro serotipos atenuados del virus Dengue en una formulación tetravalente; los virus atenuados han sido obtenidos mediante pases seriados en células primarias de riñon de perro (Bhamarapravati, N. y Sutee, Y. (2000) Uve attenυated tetravalent dengue vaccine. Vaccine. 18:44-47) o por tecnología de ADN recombinante mediante Ia introducción de mutaciones específicas en un clon de ADNc viral infeccioso (Durbin, A.P. , Karron, R.A., Sun, W., Vaughn, D.W., Reynolds, MJ. , Perreault, J.R., Thumar, B., Men, R., Lai, CJ. , Elkins, W.R., Chanock, R.M., Murphy, B.R., y Whitehead, S. S. (2001) Attenuation and immunogenicity in humans of a Uve dengue virus type-4 vaccine candidate with a 30 nucleotide deletion in its 3'- untranslated región. Am J Trop.Med Hyg. 65:405-413) o insertando genes que codifican proteínas estructurales (proteína premembrana y proteína envoltura) en cepas de virus Dengue atenuadas o en Ia cepa vacunal atenuada del virus de Ia fiebre amarilla 17D (Guirakhoo, F., Pugachev, K., Arroyo, J., Miller, C, Zhang, Z.X., Weltzin, R., Georgakopoulos, K., Catalán, J., Ocran, S., Draper, K., y Monath, TP. (2002) Viremia and immunogenicity in nonhuman primates of a tetravalent yellow fever-dengue chimeric vaccine: genetic reconstructions, dose adjustment, and antibody responses against wild-type dengue virus isolates. Virology. 298:146-159). Los candidatos vacunales tetravalentes de virus vivo atenuado que se encuentran en ensayos clínicos (fase 1 y fase 2) han probado ser seguros e inmunogénicos (Edelman, R., Wasserman, S. S., Bodison, S.A., Putnak, RJ. , Eckels, K.H., Tang, D., Kanesa-Thasan, N., Vaughn, D.W., Innis, B.L., y Sun, W. (2003) Phase I tria! of 16 formulations of a tetravalent //Ve- attenuated dengue vaccine. Am J Trop.Med Hyg. 69:48-60. Sabchareon, A., Lang, J., Chanthavanich, P., Yoksan, S., Forrat, R., Attanath, P., Sirivichayakul, C, Pengsaa, K., Pojjaroen-Anant, C, Chambonneau, L, Saluzzo, J.F., y Bhamarapravati, N. (2004) Safety and immunogenicity of a three dose régimen of two tetravalent live-attenuated dengue vaccines in //Ve- to twelve-year-old Thai children. Pediatr.Infect.Dis.J. 23:99-109. Sabchareon, A., Lang, J., Chanthavanich, P., Yoksan, S., Forrat, R., Attanath, P., Sirivichayakul, C, Pengsaa, K., Pojjaroen-Anant, C, Chokejindachai, W., Jagsudee, A., Saluzzo, J. F., y Bhamarapravati, N. (2002) Safety and immunogenicity of tetravalent live- attenuated dengue vaccines in Thai adult volunteers: role of serotype concentration, ratio, and múltiple doses. Am J Trop.Med Hyg. 66:264-272.
Kanesa-Thasan, N., Sun, W., Kim-Ahn, G., Van Albert, S., Putnak, J.R., King, A., Raengsakulsrach, B., Chríst-Schmidt, H., Giison, K., Zahradnik, JM. , Vaughn, D.W., Innis, B.L., Saluzzo, J. F., y Hoke, CH. , Jr. (2001) Safety and immunogenicity of attenuated dengue virus vaccines (Aventis Pasteur) in human volunteers. Vaccine. 19:3179-3188) al igual que las formulaciones monovalentes (ChimericVax-DEN 2 y rDEN4δ30) de dos candidatos tetravalentes quiméricos (Guirakhoo, F., Kitchener, S., Morrison, D., Forrat, R., McCarthy, K., Nichols, R., Yoksan, S., Duan, X., Ermak, T.H., Kanesa-Thasan, N., Bedford, P., Lang, J., Quentin-Millet, MJ. , y Monath, T.P. (2006) Uve attenuated chimehc yellow fever dengue type 2 (ChimeriVax-DEN2) vaccine: Phase I clinical tríal for safety and immunogenicity: effect of yellow fever pre-immunity in induction of cross neutralizing antibody responses to all 4 dengue serotypes. Hum. Vaccin. 2:60-67. Durbin, A.P., Whitehead, S.S., McArthur, J., Perreault, J.R., Blaney, J.E., Jr., Thumar, B., Murphy, B. R., y Karron, R. A. (2005) rDEN4delta30, a Uve attenuated dengue virus type 4 vaccine candidate, is safe, immunogenic, and highly infectious in healthy adult volunteers. J Infect.Dis. 191:710-718). Otros candidatos vacunales han sido desarrollados utilizando estrategias diferentes que incluyen vacunas de virus inactivado, vacunas de subunidades proteicas y vacunas de ADN (Hombach, J. (2007) Vaccines against dengue: a review of current candidate vaccines at advanced development stages. Rev Panam.Salud Pública. 21:254- 260). Varios de estos candidatos inducen respuesta inmune protectora en modelos animales (Eckels, K.H. y Putnak, R. (2003) Formalin-inactivated whole virus and recombinant subunit flavivirus vaccines. Adv.Virus Res. 61:395-418. Hermida, L, Bernardo, L, Martin, J., Alvarez, M., Prado, i, López, C, Sierra, B.L., Martínez, R., Rodríguez, R., Zulueta, A., Pérez, A.B., Lazo, L, Rosario, D., Guillen, G., y Guzman, M. G. (2006) A recombinant fusión protein containing the domain III of the dengue-2 envelope protein is immunogenic and protective in nonhuman primates. Vaccine. 24:3165-3171. Raviprakash, K., Apt, D., Brinkman, A., Skinner, C 1 Yang, S., Dawes, G., Ewing, D., Wu, SJ. , Bass, S., Punnonen, J., y Poner, K. (2006) A chimeric tetravalent dengue DNA vaccine elicits neutralizing antibody to all four virus serotypes in rhesus macaques. Virology. 353:166-173).
Las vacunas de virus vivos atenuados constituyen las vacunas virales más ventajosas porque a diferencia de las vacunas no replicativas inducen respuesta
de anticuerpos a largo plazo, requieren de un menor número de inoculaciones y generalmente son más baratas. Sin embargo, el desarrollo de Ia formulación tetravalente de estos candidatos vacunales presenta varios inconvenientes como son, lograr el nivel apropiado de atenuación de cada serotipo para garantizar mínimo de reactogenicidad y máximo de inmunogenicidad (Edelman, R., Wasserman, S.S., Bodison, S.A., Putnak, RJ. , Eckels, K.H., Tang, D., Kanesa- Thasan, N., Vaughn, D.W., Innis, B.L., y Sun, W. (2003) Phase I trial of 16 formulations of a tetravalent live-attenuated dengue vaccine. Am J Trop.Med Hyg. 69:48-60); evitar Ia interferencia entre los diferentes serotipos de virus Dengue que constituyen Ia formulación tetravalente (Raviprakash, K., Apt, D., Brinkman, A., Skinner, C, Yang, S., Dawes, G., Ewing, D., Wu, SJ. , Bass, S., Punnonen, J., y Porter, K. (2006) A chimeric tetravalent dengue DNA vaccine elicits neutralizing antibody to all four virus serotypes in rhesus macaques. Virology. 353: 166-173) para garantizar niveles de protección similares contra todos los serotipos y confirmar que Ia vacuna es segura e ¡nmunogénica en individuos infectados previamente con otros flavivirus. Estudios recientes demostraron que Ia inmunización con el candidato monovalente quimérico ChimericVax- DEN 2 en individuos con inmunidad previa al virus de Ia fiebre amarilla no produce interferencia (Talarico, LB., Pujol, C.A., Zibetti, R.G., Paria, P.C., Noseda, M.D., Duarte, M.E., y Damonte, E.B. (2005) The antiviral activity of sulfated polysaccharides against dengue virus is dependent on virus serotype and host cell. Antiviral Res. 66:103-110). Existen otras limitaciones en el desarrollo de vacunas de virus vivo atenuado, ya que no se puede descartar Ia posibilidad de que ocurra recombinación entre Ia cepa vacunal y el virus salvaje dando lugar a un nuevo virus con propiedades no deseadas o que ocurra Ia reversión al fenotipo virulento. Por otro lado, generalmente estas vacunas están contraindicadas para las personas inmunodeprimidas e infectadas con Virus de Ia Inmunodeficiencia Humana (Edelman, R. (2007) Dengue vaccines approach the finish Une. Clin Infect.Dis. 45:56-60). Además, Ia formulación tetravalente requiere un régimen de inmunización con múltiples dosis.
La terapia antiviral representa una buena alternativa para el tratamiento de Ia enfermedad del Dengue, especialmente cuando existen varios obstáculos (anteriormente mencionados) que imposibilitan Ia obtención de una vacuna
efectiva a corto plazo. Los inhibidores están dirigidos a bloquear procesos claves dentro del ciclo de replicación viral como son Ia entrada del virus a Ia célula hospedero (Talaríco, L.B., Pujol, C.A., Zibetti, R.G., Faría, P.C., Noseda, M. D., Duarte, M. E., y Damonte, E. B. (2005) The antiviral activity of sulfated polysaccharides against dengue virus is dependent on virus serotype and host cell. Antiviral Res. 66:103-110. Ono, L, Wollinger, W., Rocco, IM., Coimbra, T.L., Gorin, P.A., y Sierakowski, M. R. (2003) In vitro and in vivo antiviral properties of sulfated galactomannans against yellow fever virus (BeH111 strain) and dengue 1 virus (Hawaii strain). Antiviral Res. 60:201-208. Pujol, C.A., Estevez, JM., Carlucci, MJ. , Ciancia, M., Cerezo, A.S., y Damonte, E.B. (2002) Novel DL- galactan hybríds from the red seaweed Gymnogongrus torulosus are potent inhibitors of herpes simplex virus and dengue virus. Antivir.Chem Chemother. 13:83-89), el procesamiento de Ia poliproteína viral (Chanprapaph, S., Saparpakorn, P., Sangma, C, Niyomrattanakit, P., Hannongbua, S., Angsuthanasombat, C, y Katzenmeier, G. (2005) Competitive inhibition of the dengue virus NS3 serine protease by synthetic peptides representing polyprotein cleavage sites. Biochem Biophys Res Commun. 330:1237-1246), Ia replicación de genoma viral (Migliaccio, G., Tomassini, J.E., Carroll, S. S., Tomei, L, Altamura, S., Bhat, B., Bartholomew, L, Bosserman, M. R., Ceccacci, A., Colwell, LF. , Córtese, R., De Francesco, R., Eldrup, A.B., Getty, K.L., Hou, X.S., LaFemina, R.L., Ludmerer, S.W., MacCoss, M., McMasters, D.R., Stahlhut, M.W., Olsen, D.B., Hazuda, DJ. , y Flores, O.A. (2003) Characterization of resistance to non- obligate chain-terminating ribonucleoside analogs that inhibít hepatitis C virus replication in vitro. J Biol Chem. 278: 49164-49170) y el ensamblaje de Ia partícula viral (Courageot, M.P., Frenkiel, M.P., Dos Santos, CD. , Deubel, V., y Despres, P. (2000) Alpha-glucosidase inhibitors reduce dengue virus production by affecting the initial steps of virion morphogenesis in the endoplasmic reticulum. J Virol. 74: 564-572. Whitby, K., Pierson, T.C., Geiss, B., Lañe, K., Engle, M., Zhou, Y., Doms, R.W., y Diamond, M.S. (2005) Castanospermine, a potent inhibitor of dengue virus infection in vitro and in vivo. J Virol. 79: 8698-8706). Los mismos se han sido identificados utilizando diferentes métodos que incluyen, pesquizaje de alto flujo (Novartis Institute for Tropical Diseases. (2005) New technologies for high-throughput screening and lead discovery of anti-viral compounds. Dengue Digest. 2:1-2), diseño racional basado en Ia estructura
cristalográfica de proteínas virales (Hrobowski, Y.M., Garry, R.F., y Michael, S. F. (2005) Peptide inhibitors of dengue virus and West NiIe virus infectivity. Virol.J. 2: 49-59), pesquizaje virtual de grandes librerías de compuestos químicos (Yang, J.M., Chen, Y.F., Tu, Y.Y., Yen, K.R., y Yang, YL. (2007) Combinatorial computational approaches to identify tetracycline derivatives as flavivirus inhibitors. PLoS. ONE. 2: 428-437), evaluación de inhibidores conocidos para otros flavivirus (Migliaccio, G., Tomassini, J.E., Carroll, S. S., Tomei, L., Altamura, S., Bhat, B., Bartholomew, L, Bosserman, M. R., Ceccacci, A., Colwell, LF. , Córtese, R., De Francesco, R., Eldrup, A.B., Getty, K.L., Hou, X.S., LaFemina, R.L., Ludmerer, S.W., MacCoss, M., McMasters, D.R., Stahlhut, M.W., Olsen, D.B., Hazuda, DJ. , y Flores, O.A. (2003) Characterization of resistance to non- obligate chain-terminating ribonucleoside analogs that inhibit hepatitis C virus replication in vito. J Biol Chem. 278: 49164-49170), terapia ARN antisentido (Snapp, M. B. (1992) Occupational stress, social support, and depression among black and white professional-managerial women. Women Health. 18: 41-79. Holden, K.L., Stein, D.A., Pierson, T.C., Ahmed, A.A., Clyde, K., Iversen, P.L., y Harrís, E. (2006) Inhibition of dengue virus translation and RNA synthesis by a morpholino oligomer targeted to the top of the terminal 3' stem-loop structure. Virology. 344: 439-452), inmunización pasiva (Goncalvez, A.P., Men, R., Wernly, C, Purcell, R.H., y LaI, CJ. (2004) Chimpanzee Fab fragments and a derived humanized immunoglobulin G1 antibody that efficiently cross-neutralize dengue type 1 and type 2 viruses. J Virol. 78: 12910-12918) y otros. Entre las proteínas virales utilizadas como blanco se encuentran: proteínas estructurales como Ia proteína de Ia envoltura y no estructurales con actividad proteasa/helicasa y polimerasa/metil-transferasa conocidas como NS3 y NS5 respectivamente.
El bloqueo de Ia entrada del virus a Ia célula resulta una estrategia antiviral muy atractiva porque impide el inicio de Ia infección. En el caso del virus Dengue, el blanco para atacar es Ia proteína de Ia envoltura (proteína E). Esta proteína constituye el principal determinante antigénico del virus Dengue y es responsable de los eventos esenciales requeridos durante Ia entrada del virus a Ia célula, que comprenden el reconocimiento de los receptores celulares (Crill, W.D. y Roehrig, J.T. (2001) Monoclonal antibodies that bind to domain III of dengue virus E glycoprotein are the most efficient blockers of virus adsorption to Vero cells. J
Virol. 75:7769-7773) y Ia fusión entre las membranas virales y hospederas (Allison, S.L, Schalich, J., Stiasny, K., Mandl, C.W., y Heinz, F.X. (2001) Mutational evidence for an internal fusión peptide in flavivirus envelope protein E. J Virol. 75:4268-4275). La proteína E pertenece al grupo de proteínas virales de fusión clase Il y está formada por tres dominios I, Il y III. El dominio I comprende Ia región amino terminal (residuos 1-51 , 133-192 y 281-295 en virus Dengue DEN2) pero se localiza en el centro del monómero en Ia estructura tridimensional. El dominio Il o dominio de dimerización (residuos 52-132 y 193-280) está compuesto por dos elongaciones que emanan del dominio I donde cada elongación contiene un lazo en Ia punta, en un caso el péptido de fusión (lazo "cd" residuos 100-108) y en el otro el lazo "ij" (residuos 243-248), otra región interesante presente en dicho dominio se conoce como "bisagra" y se localiza en Ia ¡nterfase dominio I-I I. El dominio III (residuos 296-395) presenta un plegamiento similar a las inmunoglobulinas y contiene sitios de unión para receptores celulares. La región "tallo" (residuos 396-447) conecta el dominio III al dominio transmembrana.
En el virión inmaduro (forma intracelular del virus, anterior a Ia exocitosis) Ia proteína E se asocia con Ia proteína premembrana (proteína preM) formando heterodímeros (Zhang, Y., Corver, J., Chipman, P. R., Zhang, W., Pletnev, S.V., Sedlak, D., Baker, T.S., Strauss, J.H., Kuhn, RJ., y Rossmann, M.G. (2003) Structυres of immature flavivirus partióles. EMBO J. 22:2604-2613). Una porción considerable de Ia proteína preM cubre a Ia proteína E protegiéndola de una fusión prematura mientras pasa a través del ambiente ácido de Ia red trans del complejo Golgi (Guirakhoo, F., Bolín, R.A., y Roehrig, J.T. (1992) The Murray Valley encephalitis virus prM protein confers acid resistance to virus partióles and alters the expression of epitopes within the R2 domain of E glycoprotein. Virology. 191:921-931). El procesamiento de Ia proteína preM por proteasas celulares desestabiliza Ia interacción preM-E y promueve Ia formación de los dímeros de proteína E presentes en el virión maduro infeccioso; seguidamente los viriones maduros son liberados al medio extracelular. Después que el virus entra a Ia célula por endocitosis mediada por receptores, queda expuesto al pH ácido del endosoma Io cual provoca Ia disociación reversible de los dímeros de proteína E que cambian irreversiblemente a trímeros (Allison, S.L, Schalich, J., Stiasny, K.,
Mandl, C.W., Kunz, C, y Heinz, FX. (1995) Oligomeríc rearrangement of tick- borne encephalitis virus envelope proteins induced by an acidic pH. J Virol. 69: 695-700). La transición de dímero a trímero que experimenta Ia proteína E está estrechamente relacionada con el proceso de fusión. El desarrollo de inhibidores de entrada del virus Dengue a Ia célula puede estar basada en al menos una de los siguientes estrategias: interferencia de Ia interacción entre Ia proteína E y los receptores celulares o Ia inhibición del proceso de fusión de Ia membrana viral con Ia membrana endosomal.
La primera estrategia antiviral ha sido poco explotada debido al poco conocimiento acerca del mecanismo de unión del viurs Dengue a Ia célula, aunque en los últimos años, han sido propuestas algunas moléculas como posibles receptores en ciertos tipos celulares (Chen, Y.C., Wang, S.Y., y King, CC. (1999) Bacterial lipopolysaccharide inhibits dengue virus infection of primary human monocytes/macrophages by blockade of virus entry via a CD14-dependent mechanism. J Virol. 73: 2650-2657. Tassaneetrithep, B., Burgess, T.H., Granelli- Piperno, A., Trumpfheller, C, Finke, J., Sun, W., Eller, M.A., Pattanapanyasat, K., Sarasombath, S., Birx, D.L., Steinman, R.M., Schlesinger, S., y Marovich, M.A. (2003) DC-SIGN (CD209) mediates dengue virus infection of human dendritic cells. J Exp Med. 197: 823-829. Hilgard, P. y Stockert, R. (2000) Heparan sulfate proteoglycans initiate dengue virus infection of hepatocytes. Hepatology. 32:1069- 1077). Una de estas moléculas es el heparan sulfato (HS) (Chen, Y., Maguire, T., Hileman, R.E., Fromm, J.R., Esko, J.D., Linhardt, R.J., y Marks, RM. (1997) Dengue virus infectivity depends on envelope protein binding to target cell heparan sulfate. Nat Med. 3:866-871), cuyo descubrimiento permitió identificar compuestos análogos que interfieren in vitro el reconocimiento del virus a Ia célula (Talarico, L.B., Pujol, C.A., Zibetti, R.G., Faria, P.C., Noseda, M.D., Duarte, M. E., y Damonte, E. B. (2005) The antiviral activity of sulfated polysaccharides against dengue virus is dependent on virus serotype and host cell. Antiviral Res. 66:103-110. Pujol, C.A., Estevez, JM., Carlucci, MJ. , Ciancia, M., Cerezo, A.S., y Damonte, E.B. (2002) Novel DL-galactan hybrids from the red seaweed Gymnogongrus torulosus are potent inhibitors of herpes simplex virus and dengue virus. Antivir.Chem Chemother. 13:83-89. Ono, L, Wollinger, W., Rocco, IM., Coimbra, T. L, Gorin, P. A., y Sierakowski, M. R. (2003) In vitro and in vivo antiviral
properties of sulfated galactomannans against yellow fever virus (BeH111 strain) and dengue 1 virus (Hawaii strain). Antiviral Res. 60:201-208. Shigeta, S., Morí, S., Kodama, E., Kodama, J., Takahashi, K., y Yamase, T. (2003) Broad spectrum anti-RNA virus activities of titanium and vanadium substituted polyoxotungstates. Antiviral Res. 58:265-271). Recientemente se demostró que uno de los miméticos polisulfatados del HS (PI-88), induce efecto protector en ratones infectados con virus Dengue. Sin embargo, el uso in vivo de los miméticos del HS como antivirales está restringido principalmente, debido a su actividad anticoagulante y también, su baja biodisponibilidad como resultado de su unión a proteínas plasmáticas (Lee, E., Pavy, M., Young, N., Freeman, C, y Lobigs, M. (2006) Antiviral effect of the heparan sulfate mimetic, PI-88, against dengue and encephalitic flaviviruses. Antiviral Res. 69:31-38).
El segundo enfoque antiviral ha progresado considerablemente durante los últimos años gracias a Ia determinación de Ia estructura cristalográfica de Ia proteína E del virus Dengue antes (Modis, Y., Ogata, S., Clements, D., y Harrison, S.C. (2003) A ligand-binding pocket in the dengue virus envelope glycoprotein. Proc.Natl Acad.Sci U.S.A. 100: 6986-6991. Zhang, Y, Zhang, W., Ogata, S., Clements, D., Strauss, J.H., Baker, T.S., Kuhn, RJ. , y Rossmann, M. G. (2004) Conformational changes of the flavivirus E glycoprotein. Structure. 12: 1607-1618) y después de ocurrir Ia fusión (Modis, Y, Ogata, S., Clements, D., y Harrison, S. C. (2004) Structure of the dengue virus envelope protein after membrane fusión. Nature. 427: 313-319). La información estructural proveniente de otros flavivirus también ha contribuido favorablemente al desarrollo de inhibidores de fusión. (Rey, F.A., Heinz, F.X., Mandl, C, Kunz, C, y Harrison, S.C. (1995) The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution. Nature. 375: 291-298. Bressanelli, S., Stiasny, K., Allison, S.L., Stura, E.A., Duquerroy, S., Lesear, J., Heinz, F.X., y Rey, F.A. (2004) Structure of a flavivirus envelope glycoprotein in its low-pH-induced membrane fusión conformation. EMBO J. 23:728-738). Modis y col., determinaron Ia estructura del fragmento soluble (residuos 1-394) de Ia proteína E dimérica del virus Dengue DEN2 en presencia y ausencia del detergente β-octil glucósido (BOG) (Modis, Y.; Ogata, S.; Clements, D.; Harrison, S.C. (2003) A ligand-binding pocket in the dengue virus envelope glycoprotein.
Proc.Natl Acad.Sci U.S.A. 100: 6986- 6991). La diferencia clave entre ambas estructuras consiste en Ia redisposición local de Ia horquilla-beta "kl" (residuos 268-280) Io cual hace accesible un bolsillo hidrofóbico donde se acomoda una molécula de BOG. La horquilla-beta "kl" fue identificada como un elemento estructural importante para Ia iniciación de los cambios conformacionales a pH ácido que conducen a Ia formación de los trímeros post-fusogénicos.
Los cambios estructurales detectados en Ia proteína E pre-fusogénica corroboraron observaciones previas realizadas por Rey y col., (Rey, F.A.; Heinz, F.X.; Mandl, C; Kunz, C; Harήson, S.C. (1995) The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution. Nature. 375: 291-298) quienes propusieron por primera vez, que Ia base del dominio Il podía funcionar como una posible bisagra o articulación, cuyos movimientos elevarían el extremo del dominio Il por encima de Ia membrana viral y realzarían el péptido de fusión. Su hipótesis se basó en el análisis de Ia estructura cristalográfica del fragmento soluble de Ia proteína E del virus de Ia encefalitis transmitida por garrapatas y las mutaciones en residuos de Ia interfase dominio l-ll de varios flavivirus que afectan Ia virulencia y el umbral de pH fusogénico. La estructura del complejo proteína E- BOG revela que dichas mutaciones corresponden en su mayoría a residuos cuyas cadenas laterales forman el bolsillo hidrofóbico (Modis, Y.; Ogata, S.; Clements, D.; Harríson, S.C. (2003) A ligand-binding pocket in the dengue virus envelope glycoprotein. Proc.Natl Acad.Sci U.S.A. 100: 6986- 6991).
Modis y col., proponen a Ia horquilla-beta "kl" y el bolsillo asociado a Ia misma que comprende los residuos de Ia interfase dominio l-ll (residuos 47-54, 128-137 y 187-207) y además, el núcleo hidrofóbico situado por debajo de Ia horquilla- beta "kl" como blancos para el desarrollo de candidatos terapéuticos contra virus Dengue y otros virus que contengan proteínas de envoltura clase II, en caso de que se utilicen los residuos correspondientes a los citados en Ia proteína E del virus Dengue (Aplicación de patente: Children's Medical Center Corporation Modis Y, Harríson S, Arnold B, WO/2005/002501 , 2003). El sitio donde se une Ia molécula de BOG en Ia interfase dominio l-ll en el dímero E fue utilizado recientemente como blanco para el diseño de inhibidores de fusión mediante pesquizaje virtual (Yang, JM, Chen, YF., Tu, Y.Y., Yen, K.R., y Yang, Y. L. (2007) Combinatorial computational approaches to identify tetracycline
derívatives as flavivirus inhibitors. PLoS.ONE. 2:428-437). Se identificaron dos compuestos derivados de Ia tetraciclina con actividad inhibitoria contra virus Dengue (valores de IC50 de 67.1 μM y 55.6 μM respectivamente).
Otra zona de Ia proteína E dimérica que puede ser utilizada para inhibir Ia infección viral por flavivirus fue descrita por Chinea y col. (Aplicación de patente: Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, WO/2007/059715, 2005). Chinea y col. identificaron un epítope topográfico expuesto en Ia superficie de Ia proteína E y en Ia superficie de los viriones maduros, altamente conservado entre los serotipos de virus Dengue a partir de un análisis ¡n silico de Ia conservación de secuencia en Ia proteína E. El epítope está compuesto por 25 residuos y se localiza en el extremo del dominio II. Chinea y col., diseñaron moléculas neutralizantes utilizando fragmentos variables de anticuerpos que reconocen el epítope conservado. Las moléculas neutralizantes desarrolladas son capaces de unir simultáneamente de dos a tres copias de dicho epítope en Ia superficie del virión maduro. Dichas moléculas muestran un incremento en Ia afinidad de unión por el virión y una capacidad neutralizante varios órdenes más potentes comparados con los anticuerpos neutralizantes que reconocen el epítope conservado y además, logran neutralizar los cuatro serotipos del virus Dengue y otros flavivirus. Resulta interesante que Ia actividad antiviral de dichas moléculas no depende de Ia bivalencia sino de Ia unión de dichas moléculas al epítope conservado Io cual interfiere en Ia función biológica de Ia proteína E. Por Io tanto, el epítope localizado en el extremo del dominio Il pudiera emplearse para el diseño de moléculas pequeñas inhibidores de fusión.
La resolución de Ia estructura del ectodominio soluble de Ia proteína E trimérica post-fusogénica (Rey, F.A., Heinz, F.X., Mandl, C, Kunz, C, y Harrison, S. C. (1995) The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution. Nature. 375: 291-298) por Modis y col., revela notables diferencias respeto a Ia forma dimérica pre-fusogénica. En los dímeros los monómeros se disponen horizontalmente y antiparalelos mientras que los trímeros se orientan verticalmente y cada subunidad se sitúa paralela a su vecina. En Ia proteína trimérica se observa que el ectodominio de cada monómero se dobla en si mismo, dirigiendo Ia región C-terminal hacia el péptido de fusión Io cual se logra cambiando Ia orientación de los dominios Il y III. Se confirmó que en Ia formación
del trímero ocurren cambios conformacionales en Ia interfase dominio l-ll que permiten Ia rotación del dominio Il (aproximadamente 30°) respecto al dominio I. Esto último concuerda con observaciones previas realizadas por otros investigadores (Bressanelli, S., Stiasny, K., Allison, S. L, Stura, E.A., Duquerroy, S., Lesear, J., Heinz, F.X., y Rey, F.A. (2004) Structure of a flavivirus envelope glycoprotein in its low-pH-induced membrane fusión conformation. EMBO J. 23: 728-738. Zhang, Y., Zhang, W., Ogata, S., Clements, D., Strauss, J.H., Baker, T. S., Kuhn, R. J., y Rossmann, M. G. (2004) Conformational changes of the flavivirus E glycoprotein. Structure. 12: 1607-1618) aunque Ia horquilla-beta "kl" no adopta Ia conformación abierta observada en el complejo proteína E-BOG. El dominio III experimenta el desplazamiento más significativo durante Ia transición de dímero a trímero, el mismo rota cerca de 70° y se coloca (residuo 395) a 39 A del péptido de fusión.
En el extremo de cada monómero queda expuesto el péptido de fusión, los cuales se juntan para formar un ancla aromático de inserción a membrana en Ia punta del trímero que queda completamente expuesto en Ia superficie molecular. Este ancla aromático está formado por tres residuos hidrofóbicos (Trp-101 , Leu-107 y Phe-108) conservados entre todos los flavivirus. Modis y col. proponen que el péptido de fusión penetra alrededor de 6 A en Ia capa de hidrocarbonos de Ia membrana hospedero y pudiera desestabilizar Ia estructura de Ia membrana. El péptido de fusión parece mantener Ia misma conformación cuando se oculta en Ia interfase oligomérica en el dímero de proteína E previo a Ia fusión, cuando se inserta a Ia membrana lipidica o cuando queda expuesto al solvente durante Ia disociación reversible de los dímeros (Rey, F.A., Heinz, F.X., Mandl, C 1 Kunz, C, y Harríson, S. C. (1995) The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution. Nature. 375: 291-298). Las zonas de contacto entre los monómeros que forman el trímero incluyen residuos del dominio II, dominio l-lll y también, residuos que forman Ia región "tallo" de un monómero interactuando con el dominio Il del monómero vecino. Modis y col., proponen que Ia región "tallo" pudiera ocupar un canal que se origina en Ia interfase del trímero y se extiende desde Ia base hasta el extremo del dominio II.
Dichos autores dieron a conocer nuevos sitios de interés farmacológico en Ia proteína E a partir del análisis de Ia estructura post-fusogénica (Aplicación de
patente: Children's Medical Center Corporation Modis Y, Harrison S, Arnold B, WO/2005/002501 , 2003). Entre ellos se incluyen el péptido de fusión, Ia región "tallo" o fragmentos de Ia misma, por ejemplo, residuos 396-429 y residuos 413- 447; las regiones en los trímeros de proteína E involucradas en Ia unión de los residuos 396-429 de Ia región "tallo"; los residuos del dominio Il en Ia interfase del trímero que forman el canal donde se une Ia región "tallo"; Ia cadena polipeptídica que conecta dominio l-lll (residuos 294-301 ); los residuos que forman Ia interfase dominio l-lll (residuos 38-40, 143-147, 294-296 y 354-365), los residuos del dominio Il involucrados en Ia trimerización y en general todos los residuos involucrados en el cambio conformacional de Ia región "tallo" que conduce a Ia formación de Ia estructura post-fusogénica (Aplicación de patente: Children's Medical Center Corporation Modis Y, Harrison S, Arnold B, WO/2005/002501 , 2003).
En este sentido, se diseñaron péptidos inhibidores basados en Ia secuencia de Ia región "tallo" los que parecen interferir las interacciones entre esta y Ia región 1- 395 en Ia conformación trimérica. Estos péptidos actúan contra los cuatro serotipos del virus Dengue y el virus del NiIo occidental y no mostraron citotoxicidad in vitro. (Hrobowski, Y.M., Garry, R.F., y Michael, S. F. (2005) Peptide inhibitors of dengue virus and West NiIe virus infectivity. J. Virol 2: 49-59). Modis y col., propusieron también, un posible mecanismo de fusión y diferentes estrategias para inhibir dicho proceso en varios puntos que incluyen el diseño de compuestos que logren impedir (a) el movimiento de Ia horquilla-beta "kl"; (b) Ia interacción de Ia horquilla-beta "kl" con el bolsillo hidrofóbico situado por debajo de Ia misma; (c) el movimiento de los residuos de Ia región de los dominios I y III y (d) Ia terminación de los cambios conformacionales post-fusión mediante Ia interacción con los residuos del dominio Il de cada subunidad en Ia interfase del trímero (Aplicación de patente: Children's Medical Center Corporation Modis Y 1 Harrison S 1 Arnold B 1 WO/2005/002501 , 2003).
DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN
Definiciones
El término "flavivirus" se refiere a cualquiera de los virus siguientes: virus
Dengue tipo 1 (DEN1 ), virus Dengue tipo 2 (DEN2), virus Dengue tipo 3 (DEN3), virus Dengue tipo 4 (DEN4), virus del NiIo Occidental (VNO), Virus de encefalitis
de St Louis, virus de Ia encefalitis japonesa, virus de Ia fiebre amarilla, virus kunjin, virus de Ia enfermedad de Ia selva Kyasanur, virus de encephalitis trasmitida por garrapata (VETG), virus del Valle Murray, virus LANGAT, virus de Ia enfermedad Louping, virus Powassan y virus Omsk de Ia fiebre hemorrágica, incluyendo de manera general, a los virus con una identidad de genoma superior al 70% respecto a los virus anteriormente mencionados. El término "enfermedades causadas por flavivirus" se refiere a cualquier enfermedad o desorden causado por Ia infección con un flavivirus. El término "modular" cuando se aplica a una función biológica se refiere a Ia capacidad de un determinado compuesto químico y/o condición experimental, de regular (activar/estimular o inhibir/suprimir) un proceso o actividad biológica determinada. El término "afectar" cuando se aplica a una función biológica se refiere a Ia acción de provocar alteración o modificación con influencia negativa sobre un proceso biológico en particular. El término "proteína E del virus Dengue" se refiere a Ia glicoproteína de Ia envoltura perteneciente a cualquier serotipo del virus Dengue. El término "proteína E dimérica pre-fusogénica" se refiere a Ia conformación de Ia glicoproteína de Ia envoltura del virus Dengue y otros flavivirus en el virión maduro antes de ocurrir Ia fusión viral. El término "proteína E trimérica post- fusogénica" se refiere a Ia conformación de Ia glicoproteína de Ia envoltura del virus Dengue y otros flavivirus en el virión maduro después de ocurrir Ia fusión viral.
El término "dominio" cuando se aplica a un polipéptido, se refiere a una región específica dentro de ese polipéptido que comprende una estructura particular o media una función particular. El término "dominio II" se refiere al motivo estructural determinado por los residuos 52-132 y 193-280 en Ia proteína E del virus Dengue DEN2 (cepa S1 ) y los residuos correspondientes de dicha proteína en otros flavivirus. El término "subestructura" se refiere a una parte o fragmento de un compuesto químico. El término "horquilla ij" se refiere al motivo estructural determinado por los residuos 237 LVTFKNPHAKKQDVW 252 en el dominio Il de Ia proteína E del virus Dengue DEN2 (cepa S1 ) y los residuos correspondientes a dicha región en otros flavivirus. El término "lazo ij" se refiere al motivo estructural determinado por los
residuos 242 NPHAKKQ 248 en el dominio Il de Ia proteína E del virus Dengue DEN2 (cepa S1) y los residuos correspondientes a dicha región en otros flavivirυs. El término "cavidad asociada al lazo "ij" o surco asociado al lazo "ij" o hendidura asociada al lazo "ij" se refiere a Ia zona de Ia proteína de Ia envoltura que comprende los residuos 68 TTTDSRC 74 , 97 VDRG 100 , 103 NGC 105 , 111 GGIVT 115 y 245 AKKQDV 250 en el dominio Il de Ia proteína E del virus Dengue DEN2 (cepa S1 ) y los residuos correspondientes a dicha región en otros flavivirus. El término "péptido de fusión" se refiere al motivo estructural determinado por los residuos 100 GWGNGCGLF 108 en el dominio Il de Ia proteína E del virus Dengue DEN2 (cepa S1) y los residuos correspondientes a dicha región en otros flavivirus.
El término "unión o anclaje" se refiere a Ia asociación entre dos moléculas debido a interacciones electrostáticas y/o hidrofóbicas y/o iónicas y/o enlaces de hidrógeno bajo condiciones fisiológicas o simuladas in silico. El término "sitio de unión" se refiere a una zona en una proteína donde se puede acomodar un determinado compuesto o molécula de ligando. Dicha zona puede ser descrita y caracterizada de diferentes maneras, por ejemplo, por algunos o todos los aminoácidos que Ia conformen, considerando todos los átomos de cada residuo aminoácidico, o solo los átomos que forman el esqueleto carbonado o solo los átomos de las cadenas laterales de los residuos incluyendo o no los carbonos alpha.
El término "compuesto químico o ligando" se refiere a cualquier agente, molécula, complejo u otra entidad que sea capaz de unirse o interactuar con una proteína en un sitio de unión particular. El término "complejo receptor-ligando" se refiere a Ia asociación entre Ia proteína E del virus Dengue u otros flavivirus y cualquier compuesto químico bajo condiciones fisiológicas o simuladas in silico. El término "receptor o molécula blanco o molécula diana" se refiere a una molécula, por ejemplo Ia proteína E del virus Dengue, donde se desea unir un compuesto químico determinado y dicha unión o interacción pudiera modular Ia actividad de Ia misma. Por ejemplo una molécula blanco puede ser Ia proteína E del virus Dengue y el sitio de unión puede ser Ia hendidura asociada al lazo "ij".
El término "ancla o estructura de anclaje" se refiere a una subestructura química que comprende los grupos de átomos que garantizan Ia unión o anclaje del compuesto químico al sitio de unión en Ia molécula blanco.
El término "acomodar" cuando se aplica a un compuesto químico o ligando, se refiere a que Ia conformación espacial adoptada por dicho compuesto químico o ligando se ajusta geométricamente al sitio de unión en el receptor.
El término "pesquizaje virtual" se refiere a Ia identificación y diseño in silico de compuestos químicos con potencialidad para unirse y modular Ia función de una proteína blanco determinada. Existen dos variantes de pesquizaje virtual las cuales se conocen como: pesquizaje virtual basado en el receptor, si se cuenta con Ia estructura tridimensional del receptor (PVBR) o pesquizaje virtual basado en el ligando (PVBL), si se cuenta con Ia información estructural de ligandos conocidos para Ia molécula blanco de interés, aunque también es frecuente Ia combinación de ambas variantes. El término "acoplamiento molecular" se refiere a Ia orientación de un ligando en el sitio de unión de una proteína utilizando algoritmos computacionales y Ia evaluación del complejo receptor-ligando generado.
El término "grupo funcional" se refiere a estructuras submoleculares o sea grupos de átomos específicos dentro de las moléculas, caracterizados por una conectividad y composición específica elemental, que confiere reactividad a Ia molécula que los contiene.
El término "farmacóforo" se refiere a un conjunto de características esenciales (por ejemplo, estéricas y electrónicas) contenidas en una molécula o ligando que garantizan interacciones intermoleculares con una molécula blanco determinado y que Ie otorgan actividad biológica especifica a dicha molécula o ligando. En Ia química moderna computacional, se emplean "modelos de farmacóforo o modelos farmacofóricos" para definir y agrupar las características esenciales de una o más moléculas responsables de su actividad biológica y que son utilizados para Ia identificación de otras moléculas o ligandos que compartan las características señaladas y que por Io tanto, se espera que posean actividad biológica. Un modelo de farmacóforo permite agrupar diferentes ligandos con diferentes grupos químicos, donde uno o más grupos químicos corresponden a
una o más propiedades definidas en el modelo de farmacóforo y donde dichos grupos químicos se localizan a Ia distancia fijada para cada una de las propiedades en el modelo de farmacóforo. Un modelo de farmacóforo puede contener algunas de las siguientes propiedades, por ejemplo, presencia de grupos aromáticos y/o grupos hidrofóbicos y/o grupos aceptores de enlace de hidrógeno y/o grupos donores de enlace de hidrógeno y/o cationes y/o aniones.
El término "grupo apolar o no polar" se refiere a un grupo químico en el cual Ia densidad de carga electrónica es esencialmente uniforme Io cual no Ie permite interactuar con otros grupos químicos mediante enlaces por enlace de hidrógeno y/o interacciones de tipo dipolo-dipolo. Los grupos no polares o apolares interactúan entre sí a través de interacciones débiles de tipo Van der Waals. Por el contrario, el término "grupo polar" se refiere a un grupo químico en el cual Ia distribución de electrones es desigual Io cual Ie permite tomar parte en interacciones electrostáticas. El término "alquilo" se refiere un radical derivado de un hidrocarburo alifático de cadena lineal (no ramificada) o ramificada, donde dicho grupo alquilo está constituido por un número de carbonos designado (e.j., "alquilo C1-C 10 " representa a un alquilo que puede estar formado por uno hasta diez átomos de carbonos). El radical alquilo puede estar saturado, mono- o poliinsaturado y puede contener radicales di- y multivalentes. Ejemplos de radicales de hidrocarburos saturados incluyen, pero no se limitan a, grupos como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, 2,3-dimetilbutilo y otros. Ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero no se limitan a, vinilo, 2-propenilo, 2-butenilo, 1 ,4- hexadienilo, 1 ,3-pentadienilo, etinilo, 3-propinilo, 3-butinilo, 2,4-heptadiinilo y otros. Nótese, que el término "alquilo" incluye radicales divalentes derivado de un hidrocarburo alifático de cadena lineal o ramificada. Ejemplos de alquilo divalentes incluyen pero no se limitan a, -CH 2 CH2CH2CH2-; -CH 2 CH=CHCH 2 -; - CH 2 C=CCH 2 -; -CH 2 CH 2 CH(CH 2 CH 2 CH 3 )CH 2 - y otros. El término "heteroalquilo" por si solo o combinado con otros términos, se refiere a un radical derivado de un hidrocarburo alifático de cadena lineal (no ramificada) o ramificada, constituido por al menos un átomo de carbono y al menos un heteroátomo de los siguientes: O, N, P, Si y S. Los heteroátomos presentes en el radical heteroalquilo pueden ser iguales o diferentes. El heteroátomo puede ubicarse en cualquier posición
interna del grupo heteroalquilo o en Ia posición a partir de Ia cual el grupo heteroalquilo se une al resto de Ia molécula. El radical heteroalquilo puede estar saturado, mono o poliinsaturado y puede contener radicales di- y multivalentes. Ejemplos de grupos heteroalquilo incluyen, pero no se limitan a, -CH2-CH2-O- CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2-S(O)-CH3, -CH2-CH2- S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -CH2-CH=N-OCH3, -CH=CH-N(CH3)-CH3, -O- CH2-CH3 y otros. En el radical heteroalquilo puede suceder que hasta dos o tres heteroátomos se dispongan de manera consecutiva, por ejemplo, -CH 2 -NH-OCH 3 y -CH 2 -O-Si(CHs) 3 . Nótese que el término "heteroalquilo" incluye radicales divalentes derivado de un hidrocarburo alifático de cadena lineal o ramificada, constituido por al menos un átomo de carbono y al menos un heteroátomo. Ejemplos de heteroalquilo divalentes incluyen pero no se limitan a, -CH 2 -CH 2 -S- CH 2 -CH 2 - y -CH 2 -S-CH 2 -CH 2 -NH-CH 2 -.
De acuerdo a Ia definición de heteroalquilo, descrita con anterioridad, quedan incluido grupos como -C(O)R'; -C(O)NR'; -NR'R"; -OR', -SR' y/o -SO 2 R'.
En Ia presente invención, en varias ocasiones, se hace referencia a los heteroalquilo y seguidamente, a grupos particulares de heteroalquilo como los anteriormente mencionados. Nótese, que los términos heteroalquilo y cualquiera de los siguientes: C(O)R'; -C(O)NR'; -NR'R"; -OR', -SR' y/o -SO 2 R' no son redundantes ni mutuamente exclusivos. En todo caso, los grupos heteroalquilo particulares como -NR'R" y otros, se mencionan para ganar en claridad.
Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo" por si solos o en combinación con otros términos, se refiere a radicales derivados de hidrocarburos alicíclicos, constituidos por uno o más anillos fusionados o unidos covalentemente, anillos que pueden ser saturados, mono o poliinsaturados, donde en el caso de cicloalquilo están constituidos solo por átomos de carbono e hidrógeno mientras que en el caso de heterocicloalquilo, incluyen al menos un heteroátomo de los siguientes: O, N y S. Ejemplos de cicloalquilo monocíclicos incluyen, pero no se limitan a, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 2-ciclobutinilo, 1 ,3- ciclohexadienilo y otros. Ejemplos de cicloalquilo formados por varios anillos enlazados incluyen, pero no se limitan a, ciclobutilciclopentilo y otros. Ejemplos de cicloalquilo formados por varios anillos fusionados, incluyen los compuestos policíclicos que tienen dos o más átomos de carbono comunes a dos o más
anillos, por ejemplo biciclo [4,2,0] octanilo, bicilo [3,1 ,1] heptanilo, blcilo [4,4,0] decanilo y otros; y compuestos bicíclicos con un solo átomo de carbono común a ambos anillos, conocido como espíranos entre los que se encuentran por ejemplo, espiro [3,4] octanilo. Ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, dioxanilo, piperidinilo, morfolinilo, piperazinilo, pirrolidinilo, tiolanilo y otros. Nótese, que los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo" incluyen radicales divalentes derivados de hidrocarburos alicíclicos, constituidos por uno o más anillos fusionados o unidos covalentemente, anillos que pueden ser saturados, mono o poliinsaturados, donde en el caso de cicloalquilo están constituidos solo por átomos de carbono e hidrógeno mientras que en el caso de heterocicloalquilo, incluyen al menos un heteroátomo.
El término "arilo" se refiere a un radical hidrocarburo aromático poliinsaturado constituido por un anillo (e.j., fenilo) o varios anillos (preferiblemente de uno a tres anillos) fusionados (e.j., naftilo, antrilo y otros) o unidos covalentemente (e.j., bifenilo). El término "heteroarilo" se refiere a un radical hidrocarburo aromático (preferiblemente de uno a tres anillos) que contienen al menos un heteroátomo de Ia siguiente lista de átomos: N, O y S (en cada anillo simple en el caso de que se trate de varios anillos). Ejemplos de grupos arilo y heteroarilo incluyen pero no se limitan a, 1 -naftilo, 4-bifenilo, 1-pirrolil, 3-pirazolil, 2-imidazoli!, pyrazynil, 2- oxazolil, 2-thiazolil, 3-furil, 2-thienyl, 4-pyridyl, 2-benzotiazolil, purinil, 5-indolil, 6- isoquinolil y otros. Los términos "arilo" y "heteroarilo" incluyen radicales divalentes derivados de un hidrocarburo aromático constituido solo por átomos de carbono e hidrógeno en el primer caso, y radicales divalentes derivados de un hidrocarburo aromático poliinsaturado constituido por uno o más anillos constituido por átomos de carbono e hidrógeno y al menos un heteroátomo.
El término "ariloalquilo " se refiere a los radicales formados por uno o más grupos arilo unido a uno o más grupos alquilo (e.j., bencilo, fenilo, estireno y otros). El término "heteroariloalquilo" se refiere a radicales formados por uno o más grupos heteroalquilo unido a uno o más grupos arilo y/o radicales formados por uno o más grupos heteroarilo unido a uno o más grupos alquilo (e.j., 2,5- dimetilfurano) y/o radicales formados por uno o más grupos heteroarilo unido a uno o más grupos heteroalquilo.
EI término "arilocicloalquilo" se refiere a los radicales formados por uno o más grupos arilo unido a uno o más grupos cicloalquilo (e.j., bencilo, fenilo, eumeno, estireno, vinilbenceno y otros). El término "heteroarilocicloalquilo" se refiere a radicales formados por uno o más grupos heteroarilo unido a uno o más grupos cicloalquilo, y/o radicales formados por uno o más grupos heterocicloalquilo unido a uno o más grupos arilo y/o radicales formados por uno o más grupos heterocicloalquiio unidos a uno o más grupos heteroarilo.
El término "alquilocicloalquilo" se refiere a los radicales formados por uno o más anillos cicloalquilo sustituido con uno o más radicales alquilo. El término "heteroalquilocicloalquilo" se refiere a radicales formados por uno o más grupos heteroalquilo unido a uno o más anillos cicloalquilo, y/o radicales formados por uno o más grupos heterocicloalquilo sustituido con uno o más grupos alquilo y/o radicales formados por uno o más grupos heterocicloalquilo sustituido con uno o más grupos heteroalquilo. El término "oxo" se refiere a un átomo de oxígeno doblemente enlazado por ejemplo, a cualquiera de los siguientes átomos: carbono, nitrógeno, azufre y fósforo. El término "halógeno" se refiere a átomos de flúor, cloro, bromo o iodo. El término "heteroátomo" se refiere a cualquier átomo diferente de carbono o hidrógeno. Usualmente, oxígeno, nitrógeno, sulfuro, fósforo, boro, cloro, bromo o iodo.
El término "miembros" en el contexto de radicales derivados de hidrocarburos alicíclicos y radicales aromáticos se refiere al total de átomos que forman un anillo, incluyendo a los heteroátomos en el caso de heterocicloalquilo y heteroarilo. El término "opcionalmente" significa que el evento que se describe puede o no ocurrir, y que se tienen en cuenta tanto eventos que ocurran como eventos que no ocurran.
El término "constituyente" se refiere a un átomo o grupos de átomos que forman parte de Ia cadena principal (o sea átomos o grupos de átomos no sustituyentes) de un radical del tipo alquilo y/o heteroalquilo opcionalmente sustituidos o no sustituidos. También se refiere a un átomo o grupos de átomos miembros de un
radical del tipo cicloalquilo y/o heterocicloalquilo y/o arilo y/o heteroarilo opcionalmente sustituidos o no sustituidos.
En el caso de los radicales alquilo, heteroalquilo, arilo, heteroarilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo se consideran tanto las formas sustituidas como formas no sustituidas de los mismos; las formas sustituidas pueden tener uno o más sustituyentes iguales o diferentes. El término "sustituyente" se refiere a un átomo o grupo de átomos que reemplazan a un átomo de hidrógeno en Ia cadena principal de un hidrocarburo. Los sustituyentes incluyen pero no se limitan a, -OH; -NH2; -SH; -CN; -NO2; =O; halógeno; -OR'; -OC(O)R'; -C(O)R'; -NR 1 R"; =NR'; =N-OR'; -C(O)NR 1 R"; -OC(O)NR 1 R"; -NR 11 C(O)R'; -NR-C(O)NR 1 R"; - NR 11 C(O)OR'; -NR-C(NR'R")=NR'"; -S(O)R', -S(O)2R'; -SR'; -S(O)2NR'R"; - NRSO2R 1 ; -SiR 1 R 11 R'"; alquilo; heteroalquilo; cicloalquilo; heterocicloalquilo; arilo; heteroarilo; donde R', R" y R" 1 son independientemente hidrógeno, grupo alquilo sustituido o no sustituido, grupo heteroalquilo sustituido o no sustituido, grupo cicloalquilo sustituido o no sustituido, grupo heterocicloalquiio sustituido o no sustituido, grupo arilo sustituido o no sustituido, grupo heteroarilo sustituido o no sustituido. El término "sustituido" cuando se aplica a un radical se refiere a un radical que contiene uno o más de los sustituyentes anteriormente mencionados.
El término "enlace de H o puente de hidrógeno" se refiere a un enlace entre un grupo A-H y un átomo o grupo de átomos B presentes en Ia misma molécula o moléculas diferentes. El grupo funcional A-H contiene un átomo de hidrógeno electropositivo y se conoce como "donor de H"; A se corresponde con oxígeno, nitrógeno o flúor. El átomo o grupo B, contiene al menos un par de electrones libres nodelocalizados y se conoce como "aceptor de H"; B se corresponde con oxígeno, nitrógeno o flúor. El átomo de oxígeno puede estar simple o doblemente enlazado y el átomo de nitrógeno puede estar simple, doble o triplemente enlazado. Un único átomo de hidrógeno puede participar simultáneamente en Ia formación de dos puentes de hidrógeno. Por ejemplo, un grupo A-H puede formar simultáneamente puentes de hidrógeno con dos grupos B 1 a Io cual se Ie conoce como "puentes de hidrógeno bifurcados o puentes de hidrógeno con tres centros". Los grupos donores de puentes de hidrógeno débiles involucran grupos A-H, donde A puede ser un átomo de carbono (C-H) o donde A puede ser un átomo de azufre (S-H). Solamente tres tipos de C-H son Io suficientemente ácidos para
formar puentes de hidrógenos y corresponden a alquinos terminales (RC=CH), algunos aléanos halogenados como el cloroformo (CHCI 3 ) y HCN. Los grupos aceptores de puente de hidrógenos débiles involucran grupos B, donde B es igual a un átomo de cloro o a un átomo de azufre. El término "grupos portadores de carga negativa" se refiere a un átomo o grupo de átomos con carga formal negativa no adyacentes a un átomo o grupos de átomos con carga formal positiva.
El término "grupos portadores de carga positiva" se refiere a un átomo o grupo de átomos con carga formal positiva no adyacentes a un átomo o grupos de átomos con carga formal negativa.
Descripción detallada de Ia invención Racionalidad de Ia invención La presente invención describe el uso de compuestos químicos con dos subestructuras funcionalmente distintivas de acuerdo a Ia formula [C]-[A] que afectan o inhiben diferentes eventos del ciclo de replicación viral del virus Dengue relacionados con Ia entrada del virus a las células dianas y el ensamblaje de los viriones progenie. Dichos compuestos químicos se unen a un parche de Ia superficie de Ia proteína E del virus Dengue, el cual se localiza en el extremo del dominio Il y se define en Ia presente invención como surco asociado al lazo "ij". Los compuestos químicos de Ia presente invención se caracterizan por presentar dos subestructuras funcionalmente relevantes, de acuerdo a Ia fórmula siguiente:
[C]-[A] Donde,
[A], es definida como ancla, y corresponde a una subestructura química, capaz de unirse al surco asociado al lazo "ij" de Ia proteína E.
[C], se Ie denomina cabeza y corresponde a una subestructura química compuesta por 1-30 átomos, que se encuentra unida covalentemente a Ia subestructura [A], [C] es preferentemente voluminosa, de carácter polar o apolar, carga neta positiva o negativa, alifático o aromático, [C] favorece Ia capacidad de los compuestos químicos de Ia presente invención de interferir o modular una o varias de las interacciones intermoleculares que involucran al péptido fusión,
esenciales en varias etapas del ciclo de replicación viral, tales como: a) las interacciones que involucran Ia formación del heterodímero preM-E, b) las interacciones entre estos heterodímeros preM-E necesarias para el ensamblaje- brote de los viriones inmaduros, c) el proceso de maduración de los viriones producto del cambio de estructura cuaternaria de heterodímeros preM-E a homodímeros de proteína E, d) asociación y/o Ia disociación de los dímeros de proteína E característicos de los viriones maduros y e) el anclaje de Ia proteína E a Ia membrana endosomal de Ia célula infectada que inicia el proceso de fusión de membranas. La subestructura ancla descrita en Ia presente invención interactúa con al menos tres de los residuos que forman el surco asociado al lazo "ij", el cual está conformado por las regiones 68 TTTDSRC 74 , 97 VDRG 100 , 103 NGC 105 , 111 GGIVT 115 y 245 AKKQDV 250 de Ia proteína E del virus DEN2 (cepa S1 ) y los residuos correspondientes a dichas regiones en otros flavivirus. Específicamente, Ia hendidura asociada al lazo "ij" está conformada por cadenas laterales con grupos hidroxilos de los residuos Thr-68, Thr-70, Ser-72 y Thr-115; grupo carbonilo de Ia cadena principal de los residuos Asp-98, Ala-245, Lys-246, GIn- 248 y Val-250 y grupo carbonilo de Ia cadena lateral de los residuos Asn-103, Gln-248 y Asp-249; grupo amino de Ia cadena principal del residuo Gln-248; grupos alifáticos como cadenas laterales de los residuos Val-97, lle-113, grupo metilo del residuo Thr-70 y porción alifática contenida en Ia cadena lateral de butilamonio de los residuos Lys-246 y Lys-247; grupo guanidinio del residuo Arg- 99 y grupo amonio de los residuos Lys-246 y Lys-247. Por tanto, Ia cavidad está recubierta por grupos de átomos donores y/o aceptores de enlace de hidrógeno; grupos de átomos con carga positiva y negativa y grupos de átomos con carácter hidrofóbico. Esta heterogeneidad favorece Ia ocurrencia de diferentes interacciones con las moléculas de ligando como, interacciones electrostáticas, hidrofóbicas, iónicas y enlaces por puente de hidrógeno.
La subestructura ancla descrita en Ia presente invención forma enlaces puente de hidrógeno preferentemente, con alguno de los siguientes átomos donores y aceptores de las cadenas laterales de los siguientes residuos: Thr-68 y/o Thr-70, Ser-72, Asn-103, Thr-115, Lys-246, GIn-248 y Asp-249; o con alguno de los siguientes átomos donores y aceptores de Ia cadena principal de los residuos:
Asp-98, Ala-245, Lys-246, Gln-248 y Val-250. Por otro lado, Ia subestructura ancla pudiera establecer interacciones hidrofóbicas por ejemplo, con cadenas laterales alifática de los residuos Val-97, lle-113, grupo metilo del residuo Thr-70 y porción alifática contenida en Ia cadena lateral de butilamonio de los residuos Lys-246 y Lys-247 e interacciones electrostáticas con Ia cadena lateral de los residuos: Asp-98, Arg-99, Asp-249, Lys-246 y Lys-247.
La subestructura cabeza descrita en Ia presente invención interactúa con al menos uno de los siguientes residuos que forman el péptido de fusión: GIy- 100, Trp-101 , Gly-102 y Phe-108. Una representación de Ia presente invención incluye subestructuras cabeza que interactúan con al menos uno de los siguientes residuos del monómero vecino presente en Ia estructura dimérica de Ia proteína E en los viriones maduros: Arg-2, Gly-5, lle-6, Ser-7, Asn-8, His-27, GIy- 28, Glu-44 y Asp-154. En otra representación de Ia presente invención se incluyen subestructuras cabeza que interactúan con al menos uno de los siguientes residuos presentes en el lazo "ij": Ala-245 y His-244 o residuo Asp-98 localizado en Ia cavidad asociada al lazo "ij".
En Ia presente invención el término "residuos claves para el anclaje a Ia hendidura asociada al lazo "ij" se refiere a los siguientes residuos pertenecientes a Ia cavidad asociada al lazo "ij" que constituyen puntos esenciales de interacción con las subestructuras anclas descritas en Ia presente invención: Thr-70, Ser-72, Val-97, Asp-98, Arg-99, Asn-103, lle-113, ThM 15, AIa- 245, Lys-246, Lys-247, Gln-248 Asp-249 y Val-250.
Descripción del sitio de unión
La subestructura ancla de los compuestos descritos en esta invención se acomoda en el surco asociado al lazo "ij" de Ia proteína E del virus Dengue. Dicho surco se observa en las estructuras cristalográficas de Ia proteína E dimérica del virus Dengue correspondiente a los serotipos 2 y 3 (Modis, Y, Ogata, S., Clements, D., y Harríson, S.C. (2003) A ligand-binding pocket in the dengue virus envelope glycoprotein. Proc.Natl Acad.Sci U.S.A. 100:6986-6991. Zhang, Y, Zhang, W., Ogata, S., Clements, D., Strauss, J.H., Baker, T.S., Kuhn, RJ. , y Rossmann, M. G. (2004) Conformational changes of the flavivirus E glycoprotein. Structure. 12: 1607-1618. Modis, Y, Ogata, S., Clements, D., y Harríson, S.C.
(2005) Variable surface epitopes in the crystal structure of dengue virus type 3 envelope glycoprotein. J Virol. 79:1223-31). En estas estructuras, el lazo "ij" adopta una conformación "abierta" conformando Ia hendidura mencionada con anterioridad. La conformación abierta de Ia horquilla "ij' parece ser estabilizada por interacciones favorables con residuos del dominio I del monómero vecino del dímero. El surco descrito es alargado, estrecho, poco profundo y ocupa un área de aproximadamente 320 A 2 . Sin embargo, dicha conformación abierta del lazo "ij" no se observa en las estructuras cristalográficas de Ia proteína E trimérica post-fusogénica del virus Dengue serotipo 2 (Modis, Y, Ogata, S., Clements, D., y Harrison, S. C. (2004) Structure of the dengue virus envelope protein after membrane fusión. Nature. 427:313-319), Ia estructura dimérica y trimérica post- fusogénica de Ia proteína de E del VETG (Rey, F.A., Heinz, F.X., Mandl, C, Kunz, C. ,y Harrison, S.C.(1995) The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution. Nature 375: 291-298. Bressanelli, S., Stiasny, K., Allison, S.L, Stura, E.A., Duquerroy, S., Pescar, J., Heinz, FX. , Rey, FA. (2004) Structure of a flavivirus envelope glycoprotein in its low-pH-induced membrane fusión conformaron. EMBO J. 23:728-738) ni tampoco en las estructuras cristalográficas de Ia proteína E monómerica del VNO (Figura 1 ) (Kanai, R., Kar, K., Anthony, K., Gould, L.H., Ledizet, M., Fikrig, E., Marasco, W.A., Koski, R.A., y Modis, Y. (2006) Crystal structure of west nile virus envelope glycoprotein reveáis viral surface epitopes. J Virol. 80:11000-11008. Nybakken, G.E., Nelson, C.A., Chen, B.R., Diamond, M. S., y Fremont, D.H. (2006) Crystal structure of the West NiIe virus envelope glycoprotein. J Virol. 80:11467-74). En estas estructuras, el lazo "ij" adopta una conformación cerrada, que cambia radicalmente Ia topografía de esta región de Ia superficie, desapareciendo Ia hendidura descrita en Ia presente invención. Sin embargo, varias evidencias estructurales indican que esta es una región flexible, que puede adoptar conformaciones diferentes en dependencia de las interacciones en las que se encuentre involucrada. En el caso de Ia proteína E del virus DEN2, el lazo "ij" adopta una conformación abierta en los dímeros y una conformación cerrada en los trímeros post-fusogénicos, participando en diferentes interacciones intermoleculares con residuos del dominio I, en el primer caso y residuos del dominio II, en el segundo. En los viriones inmaduros los heterodímeros preM-E interactúan entre sí dando origen a proyecciones en Ia superficie de los viriones. Cada proyección constituye una unidad asimétrica del
virión y está compuesta por tres heterodímeros preM-E, en los cuales el lazo "ij" interactúa con residuos de un heterodímero vecino. Los tres heterodímeros no adoptan una orientación simétrica C3, por Io que los contactos intermoleculares entre los heterodímeros no son idénticos. Así, el lazo "ij" interactúa, en un caso, con residuos del propio lazo "ij" correspondiente a otro monómero de Ia proteína E en Ia unidad asimétrica, y en el otro caso interactúa con residuos del péptido de fusión. Por tante, el lazo "ij" participa en diferentes interacciones intermoleculares, relevantes en los diferentes estadios del ciclo de replicación viral, desde Ia morfogénesis o ensamblaje de los viriones, Ia maduración de Ia envoltura y el proceso de fusión de membranas. La flexibilidad intrínseca del lazo "ij" es evidente, bien por las diferencias estructurales (RMS) observadas en las diferentes estructuras cristalográficas resueltas de Ia proteína E del virus de DEN2 (estructuras diméricas y triméricas) y/o en los factores de temperaturas elevados en comparación con otras regiones de Ia proteína y en particular con regiones del dominio II, como es el caso de Ia estructura dimérica de Ia proteína E de DEN3 (Figuras 2 y 3). La flexibilidad de esta región, por tanto parece ser esencial para acomodarse a los diferentes entornos estructurales e interacciones intermoleculares en que participa Ia proteína E a Io largo del ciclo de replicación viral. Por tanto, una novedad relevante de Ia presente invención es Ia identificación de Ia conformación abierta del lazo "ij" como región diana para el desarrollo de moléculas antivirales contra el virus Dengue y otros flavivirus, donde dichas moléculas interfieren con las interacciones y/o cambios estructurales del lazo "ij" y dicha interferencia inhibe o modula una o varias etapas del ciclo de replicación viral. Las estructuras cristalográficas de Ia proteína E de otros flavivirus, muestran una conformación cerrada del lazo "ij", sin embargo los valores del factor de temperatura de los residuos que forman el lazo "ij" en dichas estructuras son elevados (Figura 3), como se observa en las estructuras monoméricas del VNO y Ia estructura dimérica del VETG, sugiriendo que el lazo "ij" es una zona flexible que pudiera experimentar diferentes estados conformacionales y adoptar también conformaciones abiertas como Ia observada para los virus DEN2 y DEN3.
Descripción de las subestructuras Anclas
Los compuestos químicos descritos en Ia presente invención para atenuar o inhibir Ia infección por virus Dengue se caracterizan por presentar dos subestructuras funcionalmente distintivas, de acuerdo a Ia fórmula siguiente:
[C]-[A] Donde, el ancla [A] contiene al menos tres de los siguientes elementos: a) un elemento donor de puente de hidrógeno (Di-4), y/o b) un elemento aceptor y/o portador de carga negativa (A1-2-, A 3 ), y/o c) un elemento hidrofóbico (H- 1 . 3 ), y/o d) un elemento aceptor y/o donor de puente de hidrogeno (D/A), y/o e) un elemento simultáneamente aceptor-donor de puente de hidrogeno (D+A), y dichos elementos (a) - (e) son seleccionados entre los elementos que constituyen el modelo farmacofórico 3D definido en Ia Figura 5. Los elementos del modelo farmacofórico corresponden a un átomo o grupo de átomos designados como: D-i, D 2 , D 3 , D 4 , A 1 ' , A 2 ' , A 3 , D/A, H-i, H 2 , H 3 y D+A, donde dichos elementos se encuentran preferentemente separados a una distancia interatómica definida en Ia matriz de distancia (I). En ciertas representaciones de Ia presente invención se permiten desviaciones de Ia distancia interatómica de ± 1á con respecto al valor indicado en Ia matriz de distancia interatómica (I). En otras representaciones de Ia presente invención se admiten desviaciones de Ia distancia interatómica de ± 2á con respecto al valor indicado en Ia matriz de distancia interatómica (I).
Los elementos del modelo farmacofórico D-i, D 2 , D 3 , D 4 , A-i " , A 2 " , A 3 , D/A, H 1 , H 2 , H 3 y D+A describen interacciones potenciales entre Ia subestructura ancla [A] de Ia presente invención y residuos presentes en Ia hendidura asociada al lazo "ij" incluyendo enlaces por puente de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas e interacciones electrostáticas.
Los elementos D 1 , D 2 , D 3 y D 4 se corresponden cada uno a un átomo o grupos de átomos donores de puente de hidrógeno.
Los elementos A 1 " y A 2 " se corresponden cada uno a un átomo o grupos de átomos aceptores de puente de hidrógeno y/o portadores de carga neta (o parcialmente) negativa.
El elemento A 3 se corresponde con un átomo o grupos de átomos aceptores de puente de hidrógeno.
El elemento D/A se puede corresponder con un átomo o grupo de átomos aceptores de puentes de hidrógeno (en este caso se identifica en Ia presente invención como "D/A en condición aceptor") o el elemento D/A se puede corresponder con un átomo o grupos de átomos donores de puentes de hidrógeno (en este caso se identifica en Ia presente invención como "D/A en condición donor") o el elemento D/A se puede corresponder con un átomo o grupos de átomos simultáneamente aceptores y donores de puentes de hidrógeno (en este caso se identifica en Ia presente invención como "D/A en condición aceptor-donor").
El elemento D+A se corresponde con un átomo o grupo de átomos simultáneamente aceptores y donores de puentes de hidrógeno.
Los elementos Hh, H 2 , H 3 se corresponden con un átomo o grupos de átomos no polares.
(I) Matriz de distancias interatómicas (en A) para los elementos contenidos en el modelo farmacofórico definido en Ia Figura 5.
Distancia
(á) D 1 A 2 " D 2 D 4 D/A D+A H 1 H 2 D 3 Af A 3 H 3
Di 0 7,0 2,9 17,4 12,9 10,2 5,1 9,3 4,2 3,9 10,6 7,2
A 2 " 7,0 0 6,0 16,0 4,0 11,8 7,1 6,6 3,4 10,0 7,3 3,9
D 2 2,9 6,0 0 15,5 8,6 11,6 5,0 8,0 3,0 5,8 8,4 5,2
D 4 17,4 16,0 15,5 0 13,4 5,2 13,0 9,7 14,8 17,3 9,0 12,4
D/A 12,9 4,0 8,6 13,4 0 10,0 8,6 5,2 6,0 12,8 4,9 3,8
D+A 10,2 11,8 11,6 5,2 10,0 0 8,1 5,3 10,5 12,7 6,5 8,6
H 1 5,1 7,1 5,0 13,0 8,6 8,1 0 5,3 4,4 5,1 7,7 5,5
H 2 9,3 6,6 8,0 9,7 5,2 5,3 5,3 0 6,0 10,4 3,7 3,9
D 3 4,2 3,4 3,0 14,8 6,0 10,5 4,4 6,0 0 7,1 7,0 3,2
Af 3,9 10,0 5,8 17,3 12,8 12,7 5,1 10,4 7,1 0 12,4 9,6
A 3 10,6 7,3 8,4 9,0 4,9 6,5 7,7 3,7 7,0 12,4 0 3,9
H 3 7,2 3,9 5,2 12,4 3,8 8,6 5,5 3,9 3,2 9,6 3,9 0
En Ia presente invención los elementos D-i, D 2 , D 3 , D 4 y D/A (en este caso corresponde a "D/A en condición donor") de Ia subestructura ancla [A] corresponden cada uno a un átomo o grupos de átomos donores de puentes de hidrógeno seleccionados independientemente de cualquiera de los grupos siguientes: -OH 1 -NH 1 -NH 2 , -NH 3 + , =NH y -SH; los cuales pueden corresponder
a: a) sustituyentes de cualquiera de los siguientes radicales: alquilo y/o arilo y/o cicloalquilo y/o ariloalquilo y/o arilocicloalquilo y/o alquilocicloalquilo, b) constituyentes y/o sustituyentes de cualquiera de los siguientes radicales: heteroalquilo y/o heteroarilo y/o heterocicloalquilo y/o heteroariloalquilo y/o heteroarilocicloalquilo y/o heteroalquilocicloalquilo, c) particularmente, grupo -OH presente en grupos funcionales de fórmula ROH; grupo -NH presente en grupos funcionales de fórmula RNH 2 , RR 1 NH, R(O)NHR', R(O)NH 2 ; grupo =NH presente en grupos funcionales de fórmula RC(=NH)R'; RC(=NH)H; grupo -SH presente en grupos funcionales de fórmula RSH donde R, R' son independientemente hidrógeno, radical alquilo no sustituido o sustituido, radical heteroalquilo no sustituido o sustituido, radical cicloalquilo no sustituido o sustituido, radical heterocicloalquilo no sustituido o sustituido, radical arilo no sustituido o sustituido, radical heteroarilo no sustituido o sustituido. Una representación de Ia presente invención incluye elementos D 1 , D 2 , D 3 , D 4 y D/A (en este caso corresponde a "D/A en condición donor") de Ia subestructura ancla [A] que se corresponden cada uno independientemente con el grupo -C=CH, los cuales pueden corresponder a: a) constituyente o sustituyente de cualquiera de los siguientes radicales: alquilo y/o cicloalquilo y/o heteroalquilo y/o heterocicloalquilo y/o ariloalquilo y/o arilocicloalquilo y/o alquilocicloalquilo y/o heteroariloalquilo y/o heteroarilocicloalquilo y/o heteroalquilocicloalquilo, b) sustituyentes de radicales arilo y/o heteroarilo. Otra representación de Ia presente invención incluye elementos D-i, D 2 , D 3 , D 4 y D/A (en este caso corresponde a "D/A en condición donor") de Ia subestructura ancla [A] que se corresponden cada uno independientemente con grupo -CH presente en HCN. En Ia presente invención los elementos Di, D 2 , D 3 , D 4 y D/A (en este caso corresponde a "D/A en condición donor") en ningún caso se corresponden con: a) grupo -OH presente en grupo -C(O)OH, -S(O)OH, -P(O)OH; b) grupo -NH presente en CF3-NH-S(O) 2 -; c) grupo -NH presente en tetrazol.
En Ia presente invención los elementos A 1 " , A 2 " , A 3 y D/A (en este caso corresponde a "D/A en condición aceptar") de Ia subestructura ancla [A] se corresponden a un átomo o grupos de átomos aceptores de puentes de hidrógeno seleccionados indepedientemente de cualquiera de los grupos siguientes: -C=O y/o -N=O y/o -S=O y/o -P=O y/o -O-, los cuales pueden
corresponder a: a) sustituyentes de cualquiera de los siguientes radicales: alquilo y/o arilo y/o cicloalquilo y/o ariloalquilo y/o arilocicloalquilo y/o alquilocicloalquilo, b) constituyentes o sustituyentes de cualquiera de los siguientes radicales: heteroalquilo y/o heteroarilo y/o heterocicloalquilo y/o heteroariloalquilo y/o heteroarilocicloalquilo y/o heteroalquilocicloalquilo, c) particularmente, grupo - C=O presente en grupos funcionales de fórmula RC(O)X, RC(O)R', RC(O)H, RCOO-, RC(O)OH 1 RC(O)OR', ROC(O)OR',C(O)NR'R"; grupo -NH presente en grupos funcionales de fórmula RNO 2 ; RNO; grupo -S=O presente en grupos funcionales de fórmula RS(O) 2 OH, RS(O) 2 R', RS(O)R'; grupo -P=O presente en grupos funcionales de fórmula HOPO(OR) 2 , RP(O)(OH) 2 , ROP(O)(OH) 2 ; grupo - O- presente en grupos funcionales de fórmula ROR', RC(O)OR', ROOR' donde X igual a halógeno y R, R', R" son independientemente hidrógeno, radical alquilo no sustituido o sustituido, radical heteroalquilo no sustituido o sustituido, radical cicloalquilo no sustituido o sustituido, radical heterocicloalquilo no sustituido o sustituido, radical arilo no sustituido o sustituido, radical heteroarilo no sustituido o sustituido.
En una representación de Ia presente invención los elementos A-T y A 2 " de Ia subestructura ancla [A] se corresponden a un átomo o grupos de átomos portadores de carga neta (y/o parcialmente) negativa, por ejemplo: átomos de oxígeno de los grupo oxo e hidroxilo presentes en -C(O)OH; -S(O)OH; RR 1 P(O)(OH); RROP(O)(OH); ROP(O)(OH) 2 ; RP(O)(OH)2;(RO) 2 P(O)(OH); RS(O) 2 OH; ROS(O) 2 OH; átomo de nitrógeno presente en Ia trifluorometilsulfonamida; átomos de nitrógeno no sustituidos presente en grupo tetrazol. En Ia presente invención los elementos D+A y D/A (en este caso corresponde a "D/A en condición aceptor-donor") de Ia subestructura ancla [A] corresponden a un átomo o grupos de átomos simultáneamente donores y aceptores de puentes de hidrógeno seleccionados independientemente de cualquiera de los grupos siguientes: -OH, -CONHR, -CONH 2 . En Ia presente invención los elementos H 1 , H 2 , H 3 de Ia subestructura ancla [A] se corresponden cada uno con un átomo o grupos de átomos no polares seleccionados independientemente de cualquiera de los radicales siguientes: a) radical alquilo o heteroalquilo C 1 -Ci S con no más de siete heteroátomos de
cadena lineal o ramificada opcionalmente no sustituido o sustituido; b) radical cicloalquilo o heterocicloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos, cada uno de 3-7 miembros y no más de tres heteroátomos, fusionados o enlazados, opcionalmente no sustituidos o sustituido; c) radical arilo o heteroarilo compuesto por uno, dos o tres anillos, cada uno de 5-7 miembros y no más de tres heteroátomos, fusionados o enlazados, opcionalmente no sustituido o sustituido; d) radical ariloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos arilo, donde uno o más sustituyentes corresponde a grupos alquilo CrC 5 de cadena lineal o ramificada opcionalmente no sustituido o sustituido; e) radical heteroariloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos arilo o heteroarilo, cada uno de 5-7 miembros y no más de tres heteroátomos, fusionados o enlazados, donde uno de los sustituyentes corresponde a grupos alquilo C 1- C 5 o heteroalquilo CrC 5 de cadena lineal o ramificada con no más de 3 heteroátomos, opcionalmente no sustituido o sustituido; f) radical alquilocicloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos cicloalquilo de 3-7 miembros, fusionados o enlazados donde uno o más sustituyentes corresponde a grupos alquilo CrC 5 de cadena lineal o ramificada opcionalmente no sustituido o sustituido; g) radical heteroalquilocicloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos cicloalquilo o heterocicloalquilo, cada uno de 3-7 miembros y no más de tres heteroátomos, fusionados o enlazados, donde uno o más sustituyentes corresponde a grupos alquilo CrC 5 o heteroalquilo C 1 -C 5 de cadena lineal o ramificada con no más de 3 heteroátomos opcionalmente no sustituido o sustituido; h) radical arilocicloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos arilo unido a uno o más radicales cicloalquilo de 3-7 miembros, opcionalmente sustituidos o no sustituidos; i) radical heteroarilocicloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos arilo o heteroarilo, cada uno de 5-7 miembros y no más de tres heteroátomos, unido a uno o más anillos cicloalquilo o heterocicloalquilo, cada uno de 3-7 miembros y no más de tres heteroátomos, opcionalmente no sustituidos o sustituidos; j) radical seleccionado entre los radicales (a) - (i), donde dicho radical contiene el elemento del modelo farmacofórico H 1 y dichos sustituyentes y/o heteroátomos constituyentes comprenden los elementos farmacofóricos D-i y/o D 2 y/o D3 y/o A-i " ; k) radical seleccionado entre los radicales (a) - (i), donde dicho radical contiene el elemento del modelo farmacofórico H 2 y dichos sustituyentes y/o heteroátomos constituyentes comprenden los elementos farmacofóricos A 3 y/o D/A y/o D+A; I)
radical seleccionado entre los radicales (a) - (i), donde dicho radical contiene el elemento del modelo farmacofórico H 3 y dichos sustituyentes y/o heteroátomos constituyentes comprenden los elementos farmacofóricos D 3 y/o A 2 y/o A 3 y/o D/A. Sitios claves de interacción para los elementos Di, D 2 , D 3 y D 4 del modelo farmacofórico en Ia cavidad asociada al lazo "ij"
Una representación de Ia presente invención incluye que D 1 comparta uno o más átomos de hidrógeno con el átomo de oxígeno de Ia cadena principal correspondiente al grupo carbonilo del residuo Asp-98 y/o uno o más átomos de hidrógeno con el átomo de oxígeno de Ia cadena lateral correspondiente al grupo carboxiamida del residuo Asn-103 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij".
Una representación de Ia presente invención incluye que D 2 comparta uno o más átomos de hidrógeno con el átomo de oxígeno de Ia cadena principal correspondiente al grupo carbonilo del residuo Asp-98 y/o uno o más átomos de hidrógeno con el átomo de oxígeno de Ia cadena principal correspondiente al grupo carbonilo del residuo Ala-245 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij" y/o uno o más átomos de hidrógeno con el átomo de oxígeno de Ia cadena principal correspondiente al grupo carbonilo del residuo Lys-246 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij". Una representación de Ia presente invención incluye que D 3 comparta uno o más átomos de hidrógeno con el átomo de oxígeno de Ia cadena principal correspondiente al grupo carbonilo del residuo Lys-246 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij".
Una representación de Ia presente invención incluye que D 4 comparta uno o más átomos de hidrógeno con uno o ambos átomos de oxígeno de Ia cadena lateral correspondiente al grupo carboxilato del residuo Asp-249 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij" y/o uno o más átomos de hidrógeno con el átomo de oxígeno de Ia cadena principal correspondiente al grupo carbonilo del residuo VaI- 250 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij". Sitios claves de interacción para los elementos Ai ' y A 2 del modelo farmacofórico en Ia cavidad asociada al lazo "ij"
Una representación de Ia presente invención incluye que A-T acepte uno o más átomos de hidrógeno del grupo amonio de Ia cadena lateral del residuo Lys-246 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij" y/o Ai " sea portador de carga neta (y/o parcialmente) negativa y establezca interacciones electrostáticas con el grupo amonio portador de carga positiva del residuo Lys-246 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij".
Una representación de Ia presente invención incluye que A 2 " acepte un átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Ser-72 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij" y/o A 2 ' sea portador de carga neta (y/o parcialmente) negativa y establezca interacciones electrostáticas con el grupo guanidinio portador de carga positiva del residuo Arg-99 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij".
Sitios claves de interacción para el elemento D/A del modelo farmacofórico en Ia cavidad asociada al lazo "ij" Una representación de Ia presente invención incluye que D/A acepte el átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Ser-72 presente en la cavidad asociada al lazo "ij" y/o D/A acepte el átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Thr-70 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij". Una representación de Ia presente invención incluye que D/A comparta uno o más átomos de hidrógeno con el oxígeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Ser-72 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij" y/o D/A comparta uno o más átomos de hidrógeno con el átomo de oxígeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Thr-70 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij".
Una representación de Ia presente invención incluye que D/A acepte el átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Ser-72 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij" y/o D/A comparta uno o más átomos de hidrógeno con el átomo de oxígeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Thr-70 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij".
Una representación de Ia presente invención incluye que D/A comparta uno o más átomos de hidrógeno con el átomo de oxígeno del grupo hidroxilo de Ia
cadena lateral del residuo Ser-72 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij" y/o D/A acepte el átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Thr-70 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij".
Sitios claves de interacción para el elemento A 3 del modelo farmacofórico en Ia cavidad asociada al lazo "ij"
Una representación de Ia presente invención incluye que A 3 acepte un átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Thr-115 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij" y/o un átomo de hidrógeno del grupo amino de Ia cadena principal del residuo Gln-248 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij".
Sitios claves de interacción para el elemento D+A del modelo farmacofórico en Ia cavidad asociada al lazo "ij"
Una representación de Ia presente invención incluye que D+A acepte un o más átomos de hidrógeno del grupo amonio de Ia cadena lateral del residuo Lys-247 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij" y/o comparta uno o más átomos de hidrógeno con uno o ambos átomos de oxígeno de Ia cadena lateral de carboxilato del residuo Asp-249 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij".
Sitios claves de interacción para los elementos H 1 , H 2 y H 3 del modelo farmacofórico en Ia cavidad asociada al lazo "ij" Una representación de Ia presente invención incluye que Hi establezca interacciones hidrofóbicas con Ia porción alifática de Ia cadena lateral de butilamonio del residuo Lys-246 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij".
Una representación de Ia presente invención incluye que Hi establezca interacciones hidrofóbicas con Ia porción alifática de las cadenas laterales de butilamonio de los residuos Lys-246 y Lys-247 presentes en Ia cavidad asociada al lazo "¡j".
Una representación de Ia presente invención incluye que H2 establezca interacciones hidrofóbicas con Ia porción alifática de Ia cadena lateral de butilamonio del residuo Lys-247 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij". Una representación de Ia presente invención incluye que H 2 establezca interacciones hidrofóbicas con Ia porción alifática de Ia cadena lateral de
butilamonio del residuo Lys-247 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij" y/o H 2 establezca interacciones hidrofóbicas con el grupo metilo de Ia cadena lateral del residuo Thr-70 presente en Ia cavidad asociada al lazo "ij".
Una representación de Ia presente invención incluye que H 3 establezca interacciones hidrofóbicas con las cadenas laterales de los residuos Val-97 y He- 113 ambos presentes en Ia cavidad asociada al lazo "ij".
Descripción de las subestructuras Cabezas
En Ia presente invención Ia subestructura cabeza [C] o R 0 corresponde a cualquiera de las siguientes: a) hidrógeno; b) radical alquilo o heteroalquilo CrC 10 con no más de tres heteroátomos opcionalmente no sustituido o sustituido; c) radical cicloaquilo o heterocicloalquilo compuesto de uno, dos o tres anillos, cada uno de 3-7 miembros y no más de tres heteroátomos, fusionados o enlazados, opcionalmente no sustituidos o sustituidos; d) radical arilo o heteroarilo compuesto de uno, dos o tres anillos, cada uno formado de 5-7 miembros y no más de tres heteroátomos, opcionalmente sustituido o no sustituido; e) radical ariloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos arilo, donde uno o más sustituyentes corresponde a grupos alquilo C 1 -Cs de cadena lineal o ramificada opcionalmente no sustituido o sustituido; f) radical heteroariloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos arilo o heteroarilo, cada uno de 5-7 miembros y no más de tres heteroátomos, fusionados o enlazados, donde uno de los sustituyentes corresponde a grupos alquilo C 1 -C 5 o heteroalquilo C 1 -C 5 de cadena lineal o ramificada con no más de 3 heteroátomos, opcionalmente no sustituido o sustituido; g) radical alquilocicloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos cicloalquilo, cada uno de 3-7 miembros, fusionados o enlazados, donde uno o más sustituyentes corresponde a grupos alquilo C 1 -C 5 de cadena lineal o ramificada opcionalmente no sustituido o sustituido; h) radical heteroalquilocicloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos cicloalquilo o heterocicloalquilo, cada uno 3-7 miembros y no más de tres heteroátomos, fusionados o enlazados, donde uno o más sustituyentes corresponde a grupos alquilo C 1 -C 5 o heteroalquilo C 1 -C 5 de cadena lineal o ramificada con no más de 3 heteroátomos opcionalmente no sustituido o sustituido; i) radical arilocicloalquilo
compuesto por uno, dos o tres anillos arilo unido a uno o más radicales cicloalquilo, cada uno de 3-7 miembros, opcionalmente sustituidos o no sustituidos; j) radical heteroarilocicloalquilo compuesto por uno, dos o tres anillos arilo o heteroarilo, cada uno de 5-7 miembros y no más de tres heteroátomos, unido a uno o más anillos cicloalquilo o heterocicloalquilo, cada uno de 3-7 miembros y no más de tres heteroátomos, opcionalmente no sustituidos o sustituidos; k) radical seleccionado entre los radicales b)-j), donde dicho sustituyentes comprenden uno o más grupos portadores de carga positiva seleccionados entre los grupos siguientes: RNH 2 , RNHR', RNR'R", RC(NRR')=NR", C(NR'R") 2 =NR'"; RNHC(NR 1 R") =NR'";
C(RNH) 2 =NR';RC(R'NH)=NR"; I) radical seleccionado entre los radicales b)-j), donde dicho sustituyentes comprenden uno o más grupos portadores de carga negativa seleccionados entre los grupos siguientes: C(O)OH; S(O)OH; RR 1 P(O)(OH); RROP(O)(OH); ROP(O)(OH) 2 ; RP(O)(OH) 2 ;(RO) 2 P(O)(OH); RS(O) 2 OH; ROS(O) 2 OH; grupo tetrazol.
Mecanismo de inhibición
Los compuestos químicos descritos en Ia presente invención inhiben Ia infección por el virus Dengue por uno o varios de los siguientes mecanismos: A) Afectación del proceso de morfogénesis y/o ensamblaje de los viriones,
B) Interferencia con el tráfico exocítico y el proceso de maduración de los viriones,
C) Modulación de Ia estabilidad de los viriones maduros, D) Afectación del proceso de fusión de membranas. El papel de Ia subestructura ancla de los compuestos descritos en Ia presente invención consiste en garantizar el anclaje de estos a Ia hendidura asociada al lazo "¡j" y por tanto, permitir Ia localización de dichos compuestos químicos en Ia vecindad del extremo del dominio Il de Ia proteína E. Esta región del dominio Il está involucrada en varias interacciones intermoleculares que caracterizan a esta proteína como son las interacciones preM-E, Ia formación de dímeros de proteína E de los viriones maduros y Ia interacción de Ia proteína E con Ia membrana endosomal necesaria en el proceso de fusión. Por tanto, Ia unión de estos
compuestos a Ia proteína E, interfiere y/o modifica estas interacciones intermoleculares provocando Ia afectación de Ia función biológica de Ia proteína asociada a cada interacción particular y así provocando un efecto inhibitorio de Ia o las etapas del ciclo de replicación viral relacionadas con dicha función. Tal es el caso del proceso de morfogénesis y/o ensamblaje de los viriones, una etapa caracterizada por el brote de estos en Ia membrana del retículo endoplasmatico y Ia cual es mediada por interacciones laterales que se establecen entre las proteínas preM y E. Los compuestos de Ia presente invención y Ia proteína preM compiten por Ia unión a Ia proteína E interfiriendo de esta forma con el proceso de brote. Además de Ia subestructura ancla, Ia subestructura cabeza también favorece Ia actividad de estos compuestos, contribuyendo a una mayor afinidad y/o interferencia estérica. El bloqueo de Ia interacción preM-E, provoca además que el péptido de fusión quede expuesto al solvente, desprovisto de Ia protección que aporta Ia proteína preM. Así, Ia proteína E queda expuesta a interacciones anticipadas con las membranas intracelulares o con Ia propia membrana del virión, afectando de esta forma el tráfico intracelular por Ia vía exocítica y Ia maduración de los viriones en partículas totalmente infectivas. La subestructura cabeza puede contribuir también en esta etapa, así una cabeza apolar y voluminosa aumenta Ia afinidad del complejo proteína E-ligando por Ia membrana y estéricamente interfiere con Ia formación de homodímeros de proteína E, característicos de Ia envoltura de los viriones maduros. La elección de Ia subestructura cabeza adecuada es esencial también para modular Ia estabilidad de los viriones maduros. Una posibilidad es Ia desestabilización de los homodímeros de proteína E por impedimentos estéricos y/o mediante interacciones atómicas desfavorables de Ia estructura cabeza con átomos del monómero vecino. Como resultado, estos viriones son más inestables y propensos a inactivación temprana en el ambiente extracelular e intracelular. También es posible el diseño de subestructuras cabezas que garanticen interacciones favorables con residuos del monómero vecino, contribuyendo a Ia estabilización adicional de los homodímeros. El efecto biológico en este caso también conduce a Ia atenuación de Ia infectividad de los viriones, interfiriendo con los cambios de estructura cuaternaria asociados al proceso de fusión de membranas que ocurre en las vesículas endosomales al
producirse la entrada del virus a las células. Un aumento en estabilidad de los dímeros disminuye el pH umbral del proceso de fusión, mientras que Ia desestabilización Io eleva, en ambos casos afectando el proceso. La subestructura cabeza descrita en esta invención también puede alterar las propiedades hidropáticas del péptido de fusión, modificando Ia capacidad de interacción con Ia membrana endosomal. De manera tal, que una subestructura cabeza apolar provoca un aumento de Ia afinidad de unión a membrana mientras que una subestructura cabeza polar induce el efecto contrario. En cualquier caso, Ia interacción de Ia subestructura cabeza con el péptido de fusión afecta el proceso de fusión con Ia membrana endosomal.
La invención contempla las composiciones farmacéuticas que contengan uno o más de los compuestos químicos o sus sales farmacéuticamente aceptables, así como excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables que las contengan. Además, Ia invención también incluye el uso de compuestos químicos para Ia manufactura de medicamentos para el tratamiento del virus Dengue y otros flavivirus. La invención también incluye el uso de dichos compuestos o variantes de los mismos para Ia prevención y/o tratamiento de infecciones en seres vivos provocadas por flavivirus, con Ia ocurrencia de al menos Ia reducción de un síntoma de Ia enfermedad. Un aspecto novedoso de Ia presente invención que constituye una ventaja con respecto a otras estrategias de desarrollo de compuestos antivirales enfocados en Ia inhibición y/o interferencia de etapas individuales de ciclo de replicación viral, radica en que los compuestos descritos en Ia presente invención son diseñados para interferir con varias etapas del ciclo de replicación del virus potenciando el efecto antiviral. Como estos compuestos están dirigidos a un sitio de unión biológicamente relevante el cual se conserva evolutivamente en estos virus, Ia posibilidad de generación de mutantes de escape viables también disminuye.
Metodología para Ia identificación de las subestructuras Anclas Los compuestos químicos se identificaron empleando métodos computacionales, específicamente combinando los resultados del pesquizaje virtual por acoplamiento molecular y el empleo de un modelo farmacofórico. Se utilizó un modelo de Ia proteína E del virus Dengue dimérica pre-fusogénica conforme a Ia
estructura del virión maduro y una base de datos de compuestos químicos. Dicho modelo se construyó superponiendo de manera independiente el dominio Il y los dominios MII de Ia proteína E del virus Dengue DEN2 (1TG8) con los dominios correspondientes en Ia estructura de Ia partícula viral madura del virus Dengue DEN2 (1THD) determinada por criomicroscopía electrónica (Crio-ME) utilizando el programa Whatif (Vriend, G. (1990) WHAT IF: a molecular modeling and drug design program. J Mol Graph. 8:52-56) y Ia posterior minimización de energía en Ia interfase dominio l-ll (Ejemplo 1). La región diana de Ia proteína E utilizada como sitio de unión en las simulaciones de acoplamiento molecular corresponde a Ia cavidad asociada al lazo "ij" descrita en Ia presente invención. Se utilizó el programa Dock (Kuntz, LD. , Blaney, J.M., Oatley, SJ. , Langridge, R. y Ferrín, T.E. (1982) A geometric approach to macromolecule-ligand interactions. J Mol Biol. 161:269-88) para orientar y evaluar millones de conformaciones de compuestos químicos provenientes de Ia base de datos ZINC (Irwin, JJ. y Shoichet, B. K (2005) ZINC - A Fr ee Datábase of Commercially Available Compounds for Virtual Screening. J. Chem. Inf. Model .45:177-182) en Ia cavidad asociada al lazo "ij" presente en el modelo de Ia proteína E construido. Se seleccionaron los compuestos químicos con mayores valores de energía de unión (por ejemplo, Energía <= -35 kjmol "1 de acuerdo a Ia evaluación con Ia función de energía del programa Dock versión 4) y se realizó el análisis visual del modo de unión en el receptor de dichos complejos receptor-ligando. Finalmente se seleccionaron, un grupo de compuestos químicos que además de originar complejos receptor- ligando con valores de energía de unión elevados (Energía <= -35 kjmol "1 ), los mismo adoptan conformaciones que se acomodan en Ia cavidad asociada al lazo "ij" y establecen interacciones mediante enlaces por puentes de hidrógeno y/o interacciones hidrofóbicas y/o interacciones electrostáticas según las predicciones In silico con varios de los residuos que a continuación se mencionan: a) residuos que forman dicha cavidad, por ejemplo: Thr-70, Ser-72, Val-97, Asp- 98, Arg-99, Asn-103, lle-113, Thr-115, Ala-245, Lys-246, Lys-247, Gln-248 y Asp-
249. b) residuos que forman el péptido de fusión: Gly-100, Trp-101 , Gly-102 y Phe- 108.
c) residuos correspondientes al monómero vecino presente en Ia estructura dimérica de los viriones maduros: Arg-2, Gly-5, lle-6, Ser-7, Asn-8, His-27, Gly-28, Glu-44 yAsp-154. d) residuos presentes en el lazo "ij", por ejemplo: His-244.
El análisis de las predicciones in silico del modo unión a Ia hendidura asociada al lazo "ij" de cada uno de los compuestos químicos seleccionados en el experimento de pesquizaje virtual permitió detectar Ia presencia de subestructuras con interacciones potencialmente favorables con los residuos claves para el anclaje a Ia hendidura asociada al lazo "ij" definidos en Ia presente invención. Las subestructuras identificadas permitieron Ia definición de un modelo farmacofórico 3D (Figura 5) de interacciones interatómicas favorables con los residuos claves para el anclaje a Ia hendidura asociada al lazo "ij". La construcción de dicho modelo farmacofórico se complementó con programa Pocket (Chen J. y Lai L. (2006) Pocket v.2: Further Developments on Receptor- Based Pharmacophore Modeling. J. Chem. Inf. Model. 46: 2684 -2691). Dicho modelo farmacofórico 3D fue utilizado para Ia identificación de otras subestructuras anclas y compuestos químicos utilizando el programa 3DFS (Wang, T. y Zhoυ, J. (1998) 3DFS: A New 3D Flexible Searching System for Use in Drug Design. J. Chem. Inf. Comput. ScL 38: 71-77). Los compuestos químicos obtenidos del pesquizaje virtual y del empleo del modelo de farmacóforo 3D se muestran en el Ejemplo 2. Las subestructuras anclas descritas en Ia presente invención contienen al menos tres de los siguientes elementos: a) un elemento donor de puente de hidrógeno (Dr 4 ), y/o b) un elemento aceptor y/o portador de carga negativa (A-p,A 2 -, A 3 ), y/o c) un elemento hidrofóbico (H r 3), y/o d) un elemento aceptor y/o donor de puente de hidrogeno (D/A), y/o e) un elemento simultáneamente donor-aceptor de puente de hidrogeno (D+A), y dichos elementos (a) - (e) son seleccionados entre los elementos que constituyen el modelo farmacofórico 3D y las mismas se describen en ei Ejemplo 3. Las interacciones intermoleculares entre las subestructuras anclas descritas en Ia presente invención y los residuos claves para el anclaje al surco asociado al lazo "ij" se ¡lustra en el Ejemplo 4. La capacidad de inhibir infección por virus Dengue de los compuestos químicos descritos en Ia presente invención fue
evaluada in vitro en ensayos de inhibición de formación de placas en células Vero según se describe en el Ejemplo 5.
DESCRIPCIóN DETALLADA DE LAS FIGURAS
Figura 1. Representación de Ia superposición estructural del dominio Il de uno de los monómeros de Ia proteína E de los siguientes flavivirus: virus del dengue, virus del NiIo occidental y virus de Ia encefalitis transmitida por garrapatas. Se observa la cavidad asociada al lazo "ij" en el extremo del dominio Il en las estructuras dimérica pre-fusogénicas de Ia proteína E del virus del dengue DEN2 con identificador 1OKE, 1TG8 y 1OAN y virus Dengue DEN3 con identificador 1 UZG, donde el lazo "¡j" adopta una conformación abierta. Esta conformación abierta del lazo "ij" no se aprecia en las estructuras monoméricas 2HG0 y 2I69 de Ia proteína E del virus del NiIo occidental ni en Ia estructura dimérica pre- fusogénica 1SVB del virus de Ia encefalitis transmitida por garrapatas ni tampoco en las estructuras trimérica post-fusogénicas 1OK8 del virus Dengue DEN2 y 1 URZ del virus de Ia encefalitis transmitida por garrapatas. Representación de Ia estructura secundaria con el programa Chimera (Pettersen, E.F., Goddard, T.D., Huang, CC, Couch, G. S., Greenblatt, DM., Meng, E.C, y Ferrín, T. E. (2004) UCSF Chimera - A Visualization System for Exploratory Research and Analysis. J. Comput. Chem. 25:1605-1612). Figura 2. Diferencias estructurales entre Ia horquilla "¡j" de Ia proteína E dimérica- prefusogénica 1TG8, 1OAN, 1OKE del virus Dengue DEN2, proteína E trimérica- post-fusogénica 1OK8 del virus Dengue DEN2 y proteína E dimérica pre- fusogénica 1 UZG del virus Dengue DEN3. Se utilizó Ia estructura 3D de Ia proteína E dimérica-prefusogénica del virus dengue DEN2 con identificador 1TG8 como molde para realizar Ia superposición.
Figura 3. Alineamiento de secuencias del dominio Il de los virus Dengue, virus del NiIo Occidental y virus de Ia encefalitis transmitida por garrapatas y los valores de factor de temperatura por residuo reportados para cada una de las siguientes estructuras: proteína E dimérica del virus Dengue DEN2 (1TG8, 1OAN, 1OKE), proteína E dimérica del virus Dengue DEN3 (1 UGZ), proteína E trimérica post-fusogénica del virus Dengue DEN2 (1OK8), proteína dimérica (1SVB) y trimérica postfusogénica (1URG) del virus de Ia encefalitis transmitida por
garrapatas y proteína E monomérica (2HG0 y 2169) del virus del NiIo Occidental. Los valores de factor de temperatura de los residuos que constituyen Ia horquilla "ij" están sombreados y Ia secuencia de aminoácidos que comprenden Ia horquilla "ij" está subrayada. Figura 4. Representación del modelo de Ia proteína E dimérica del virus Dengue serotipo 2 compatible con el virión maduro y el sitio de unión (cavidad asociada al lazo "ij") utilizado como blanco en los experimentos in silico de pesquizaje virtual. Se muestra el conjunto de esferas utilizadas para orientar los ligandos en el sitio de unión y los residuos de Ia proteína E que se tienen en cuenta para Ia evaluación de Ia energía intermolecular receptor-ligando aparecen contenidos en una caja. Se utilizó el programa Chimera (Pettersen, E. F., Goddard, T.D., Huang, CC, Couch, G.S., Greenblatí, DM., Meng, E.C, y Ferrin, T.E. (2004) UCSF Chimera - A Visualization System for Exploratory Research and Analysis. J. Comput. Chem. 25:1605-1612). Figura 5. Representación esquemática del modelo farmacofórico 3D descrito en Ia presente invención en el surco asociado al lazo "ij".
Figura 6. Descripción de los elementos del modelo farmacofórico contenidos en las subestructuras anclas A-Sl J023, A-Sl J118 y A-Sl J121 y Ia descripción del modo de unión. EJEMPLOS DE REALIZACIóN
Ejemplo 1. Construcción del modelo de proteína E compatible con el virión maduro.
Para seleccionar Ia estructura 3D de Ia proteína E del virus Dengue como molécula diana para realizar experimentos in silico se analizaron las estructuras cristalográficas de dicha proteína anotadas en Ia base de datos de estructura tridimensional de proteínas, PDB (Berman, HM., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G, Bhat, T.N., Weissig, H., Shindyalov, í.N., y Bourne, V. (2000) The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28:235-242) determinadas por cristalografía de rayos-X y Crio-ME. A pesar de que Ia estructura de Ia proteína E del virus Dengue determinada por Crio-ME posee baja resolución, Ia misma resulta útil porque aporta información acerca de Ia orientación entre los diferentes dominios, Ia separación entre los monómeros en el dímero y las regiones de Ia
proteína E que están expuestas en Ia superficie del virión maduro. Con el objetivo de comparar Ia estructura de Ia proteína E dentro y fuera del contexto del virión maduro, se realizó Ia superposición del dominio Il de Ia estructura del virión maduro determinada por Crio-ME (1THD) y las estructuras cristalográficas de Ia proteína E dimérica 1OAN, 1OKE y 1TG8. La superposición estructural se realizó con Ia opción motif del programa Whatif que se basa en tomar fragmentos de determinada longitud de una de las proteínas y tratar de superponerlo en los fragmentos de Ia otra (molde) buscando Ia mayor cantidad de aminoácidos equivalentes entre las dos estructuras con un mínimo valor de desviación cuadrática media (RMSD). La superposición estructural mostró que Ia estructura del dominio Il y del surco asociado al lazo "ij" se conserva entre todas las estructuras analizadas (1OAN, 1OKE, 1TG8) con un RMSD de los átomos CA menores a 0.7 A; sin embargo, se observan diferencias en Ia estructura 3D de los dímeros de proteína E obtenidos por cristalografía de rayos-X y por Crio-ME. Los dímeros cristalográficos son más compactos siendo Ia separación entre los monómeros menor con respecto al dímero E obtenido por Crio-ME en Ia superficie del virión maduro. Por Io tanto, se determinó no utilizar ninguna de las estructuras cristalográficas de Ia proteína E dimérica del virus Dengue anotadas en Ia base de datos PDB como receptor para las simulaciones de acoplamiento molecular in silico. En cambio, se empleó como receptor un modelo atómico de Ia proteína E del virus Dengue compatible con Ia estructura pseudo atómica del virión maduro determinada por Crio-ME. Dicho modelo se construyó combinando Ia información estructural disponible determinada por Crio-ME (1THD) y por cristalografía de Rayos-X (1TG8) de Ia proteína E dimérica. Se dividió Ia estructura de Ia proteína E dimérica 1TG8 en dos partes dominio Il y dominio l+lll, las cuales fueron superpuestas de manera independiente con sus dominios correspondientes en Ia estructura 1THD usando el programa Whatif. Seguidamente se realizó una minimización de energía para optimizar Ia geometría de las distancias y ángulos de enlace correspondientes a Ia conexión entre dominio I y Il y por último, se chequeó el modelo obtenido con Ia opción fulchk del programa Whatif. En Ia Figura 4 se muestra el modelo 3D de Ia proteína E dimérica construido compatible con el virión maduro utilizado en Ia presente invención y se muestra además, Ia región diana utilizada como sitio de unión (corresponde a Ia cavidad asociada al lazo "ij" descrita en Ia presente
invención) en los experimentos de pesquizaje virtual y para Ia obtención de información adicional para Ia construcción del modelo de farmacóforo 3D.
Ejemplo 2. Pesquizaje virtual de una librería de compuestos químicos mediante simulaciones de acoplamiento molecular. Construcción y empleo de un modelo de farmacóforo 3D.
La metodología de pesquizaje virtual se empleó para Ia identificación in silico de compuestos químicos con interacciones potencialmente favorables con residuos de Ia cavidad asociada al lazo "ij" de Ia proteína E del virus DEN2. La simulación del acoplamiento molecular consistió en Ia orientación y evaluación energética de diferentes conformaciones de los compuestos químicos contenidos en Ia base de datos ZINC (versión 5) en Ia cavidad asociada al lazo "ij" de Ia proteína E del virus DEN2 utilizando el programa Dock ( versiones 4.01 y 6.1 ). Las coordenadas del receptor, se obtienen del modelo atómico de Ia proteína E del virus DEN2 dimérica compatible con Ia estructura del virión maduro descrito en el Ejemplo 1. El sitio de unión corresponde al surco asociada al lazo "ij" formado por los residuos: 68 TTTDSRC 74 , 97 VDRG 100 , 103 NGC 105 , 111 GGIVT 115 y 245 AKKQDV 250 del modelo atómico de Ia proteína E del virus DEN2 (cepa S1 ) descrito en el Ejemplo 1. La orientación de los compuestos químicos en Ia cavidad asociada al lazo "ij" se fija mediante un conjunto de esferas, las cuales para el caso de Ia cavidad asociada al lazo "ij" se muestran en Ia Figura 4.
Se consideró en Ia evaluación energética de los complejos receptor-ligando generados Ia contribución energética de cualquier residuo del receptor que se localiza como máximo a una distancia de 5A del conjunto de esferas mencionadas con anterioridad. La evaluación energética del receptor se realizó previa a Ia simulación del acoplamiento molecular con el programa Grid (herramienta accesorio del programa Dock). Se consideró el ligando como una molécula flexible, para Io cual se desarrollaron dos iniciativas: en primer lugar, se generaron varias conformaciones de cada uno de los compuestos químicos presentes en Ia base de datos ZINC con los programas Corina y Rotate (Sadowski, J. (1997) A hybríd approach for addressing ring flexibility in 3D datábase searching. J Comput Aided Mol Des. 11:53-60) y en segundo lugar, se empleó Ia opción flexible del programa Dock (versiones 4.01 y 6.1 ). En el primer
caso, se orientaron las conformaciones obtenidas para cada compuesto en el modelo atómico de Ia proteína E compatible con Ia estructura del virión maduro utilizando Ia variante rígida del programa Dock (versiones 4.01 y 6.1 ). En ambos casos, se evaluó el modo de unión de cada complejo receptor-ligando generado empleando diferentes funciones de puntuación del programa Dock (por ejemplo, función química, función de energía y función de contacto) así como otras funciones de puntuación por ejemplo, Ia función de puntuación del programa AutoDock (Morris, G. M., Goodsell, D. S., Halliday, R.S., Huey, R., Han, W. E., Belew, R. K. y Olson, A. J. (1998) Automated Docking Using a Lamarckian Genetic Algoríthm and and Empírica/ Binding Free Energy Function. J Comput Chem. 19: 1639-1662) y Ia función de puntuación X-Score (Wang, R.; Lai, L; Wang, S. Further (2002) Development and Validation of Empiñcal Scoring Functions for Structure-Based Binding Affinity Prediction. J. Comput Aided Mol. Des. 16: 11-26). Se seleccionaron solo las mejores conformaciones de cada compuesto químico acopladas en el sitio de unión (por ejemplo, Energía >= -35 kjmol '1 caso del programa Dock versión 4.01). Para cada una de las conformaciones de los compuestos seleccionados se realizó el análisis visual del modo de unión.
Finalmente, el análisis visual permitió distinguir entre los compuestos químicos con una unión favorable desde el punto de vista energético aquellos compuestos químicos que se acomodan en Ia cavidad asociada al lazo "ij" y que además interactúan con: a) residuos que forman dicha cavidad, por ejemplo: Thr-70, Ser-72, Val-97, Asp- 98, Arg-99, Asn-103, lle-113, Thr-115, Ala-245, Lys-246, Lys-247, Gln-248 y Asp- 249. b) residuos que forman el péptido de fusión: Gly-100, Trp-101 , Gly-102 y Phe- 108. c) residuos correspondientes al monómero vecino presente en la estructura dimérica de los viriones maduros: Arg-2, Gly-5, lle-6, Ser-7, Asn-8, His-27, Gly-28, Glu-44 yAsp-154. d) residuos presentes en el lazo "ij", por ejemplo: His-244.
A continuación (Tabla 1) se muestran los compuestos químicos seleccionados mediante pesquizaje virtual y empleo del modelo farmacofórico 3D. Dicho compuestos químicos se unen a Ia cavidad asociada al lazo "ij" mediante interacciones atómicas anteriormente descritas según las predicciones realizadas ¡n silico.
Tabla 1. Estructura 2D y valor de energía de unión de los compuestos químicos con una unión potencialmente favorable de acuerdo a Ia evaluación energética obtenida con las funciones de puntuación del programa Dock (versiones 4.01 y 6.1 ) y AutoDock y con un modo de unión complementario con Ia geometría y composición química de los grupos de átomos que forman el sitio de unión. Los valores de energía que se reportan se obtuvieron con Ia función de energía del programa Dock 4.01.
C-SIJ01001 C-SIJ01002 C-SIJ01003 E=-42.95 kjmol "1 E=-42.90 kjmor 1 E = -42.87 kjmol-1
C-Sl J01004 C-SIJ01005 C-Sl J01006
E= -42.83 kjmol "1 E = -43.00 kjmor 1 E = -45.29 kjmol "
C-Sl J01007 C-SIJ01008 C-SIJ01009
E = -38.83 kjmol "1 E = -38.83 kjmol "
C-Sl J01010 C-SIJ01011 C-SIJ01012
E = -38.91 kjmol " E= -42.21 kjmol "1 E = -39.11 kjmol "1
C-SIJ03073 C-SIJ03074 C-SIJ03075
E = -39.43 kjmol "1 E = -38.89 kjmol "1 E = -38.56 kjmol "1
C-SIJ03076 C-SIJ04077 C-SIJ04078
E = -39.65 kjmol "1 E = -42.15 kjmol "1
C-SIJ04079 C-SIJ04080 C-SIJ04081
E = -41.95 kjmol "1 E = -41.87 kjmol "1
C-SIJ04082 C-SIJ04083 C-SIJ04084
E = -42.05 kjmol "1
E = -42.74 kjmol "1
C-SIJ05085 C-SIJ06086 C-SIJ06087
E = -40.84 kjmol "1
E = -40.84 kjmol "1
C-SIJ06088 C-SIJ06089 C-SIJ06090
E = -40.73 kjmol "
E = -40.24 kjmol "1
C-SIJ06091 C-SIJ06092 C-SIJ06093
E = -39.34 kjmol "1 E = -39.53 kjmol "1 E = -40.11 kjmol "1
Ejemplo 3. Descripción de subestructuras anclas.
El análisis visual de las predicciones in silico del modo unión a Ia hendidura asociada al lazo "ij"de los compuestos químicos con mayores valores de energía de unión permitió detectar Ia presencia de subestructuras con interacciones potencialmente favorables con los residuos claves para el anclaje a Ia hendidura asociada al lazo "ij" que incluyen: Thr-70, Ser-72, VaI-97, Asp- 98, Arg-99, Asn-103, lle-113, Thr-115, Ala-245, Lys-246, Lys-247, Gln-248 Asp- 249 y Val-250. Dichas subestructuras son reconocidas como subestructuras anclas en Ia presente invención. Las subestructuras anclas permitieron Ia definición de un modelo farmacofórico 3D (Figura 5) de interacciones interatómicas favorables con los residuos claves para el anclaje a Ia hendidura asociada al lazo "ij". La construcción del modelo farmacofórico 3D descrito en Ia presente invención se complementó con el programa 3DFS (Wang, T. y Zhou, J. (1998) 3DFS: A New 3D Flexible Searching System for Use in Drug Design. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 38: 71-77). Dicho modelo farmacofórico 3D fue utilizado para Ia identificación in silico de nuevas subestructuras anclas, que posteriormente fueron orientadas y evaluadas en el sitio de unión del receptor utilizando el programa Dock, de manera similar a como se describe en el Ejemplo 2. Las subestructuras anclas fueron agrupadas según similitud química y modo de unión en el surco asociado al lazo "ij". Las subestructuras anclas descritas en Ia presente invención contienen al menos tres de los siguientes elementos: a)
un elemento donor de puente de hidrógeno (Dr 4 ), y/o b) un elemento aceptor y/o portador de carga negativa (Ar, A 2 -, A 3 ), y/o c) un elemento hidrofóbico (H 1 . 3 ), y/o d) un elemento aceptor y/o donor de puente de hidrogeno (D/A), y/o e) un elemento simultáneamente donor-aceptor de puente de hidrogeno (D+A), y dichos elementos (a) - (e) son seleccionados entre los elementos que constituyen el modelo farmacofórico 3D y se describen a continuación:
Ejemplo 4. Relación modelo farmacofórico-subestructura ancla.
Cada uno de los elementos del modelo farmacofórico descrito en Ia presente invención interactúa con al menos tres de los residuos claves para el anclaje a Ia hendidura asociada al lazo "ij". Las subestructuras anclas descritas en Ia presente invención contienen al menos tres de los elementos presentes en el modelo farmacofórico. A continuación se describe el modo de unión de algunas subestructuras anclas. Ancla A-SU023
La subestructura ancla A-SIJ023 contiene los siguientes elementos del modelo farmacofórico: D 1 , A 1 " , A 2 ' , D/A, H 3 y H 2 tal como se muestra en Ia Figura 6 (a). El grupo NH que se corresponde con el elemento Di comparte el átomo de hidrógeno con el átomo de oxígeno del grupo carbonilo de Ia cadena lateral del residuo Asn-103. Los átomos de oxígeno del grupo sulfonil (más próximo a Ia
subestructura cabeza (Rc)) que se corresponden con el elemento Ai " establecen interacciones electrostáticas con el grupo amonio de Ia cadena lateral del residuo Lys-246. Los átomos de oxígeno del restante grupo sulfonil presente en Ia subestructura ancla se corresponden con el elemento A 2 " y aceptan el átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Ser-72. El grupo 0x0 que se corresponde con el elemento D/A interactúa con el grupo NH de Ia cadena principal del residuo Gln-248 mediante enlaces de hidrógeno. Dos grupos CH2 del radical piperazinil se corresponden con el elemento H 3 y establecen interacciones hidrofóbicas con las cadenas laterales de los residuos Val-97 e He- 113. El grupo CH 3 que se corresponde con el elemento H 2 mantiene interacciones hidrofóbicas con porción alifática de Ia cadena lateral de butilamonio del residuo Lys-246, particularmente con carbonos Cβ y Cδ.
Ancla A-Sl J118
La subestructura ancla A-SIJ118 contiene los siguientes elementos del modelo farmacofórico: D 1 , Ai " , A 2 " , H 3 y H 2 tal como se muestra en Ia Figura 6 (b). El grupo NH que se corresponde con el elemento Di comparte el átomo de hidrógeno con el átomo de oxígeno del grupo carbonilo de Ia cadena principal del residuo Asp-98. El átomo de oxígeno que se corresponden con el elemento A-i " forma puente de hidrógeno e interacciones electrostáticas con el grupo amonio de Ia cadena lateral del residuo Lys-246. Los átomos de oxígeno del grupo sulfonil se corresponden con el elemento A 2 " y establecen puentes de hidrógeno aceptando el átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Ser-72. Los átomos de carbono del grupo pirrol que se corresponden con el elemento H 3 establecen interacciones hidrofóbicas con las cadenas laterales de los residuos Val-97 e lle-113 y los que se corresponden con el elemento H 2 mantiene interacciones hidrofóbicas con porción alifática de Ia cadena lateral de butilamonio del residuo Lys-246, particularmente con carbonos Cβ y Cδ.
Ancla A-SIJ121
La subestructura ancla A-SIJ121 contiene los siguientes elementos del modelo farmacofórico: D 2 , A-T, A 2 " y H 2 tal como se muestra en Ia Figura 6 (c). El grupo
NH que se corresponde con el elemento D 2 comparte el átomo de hidrógeno con el átomo de oxígeno del grupo carbonilo de Ia cadena principal del residuo Lys-
246. Los átomos de oxígeno del grupo sulfonil que se corresponden con el elemento A 1 " establecen interacciones electrostáticas y puente de hidrógeno con el grupo amonio de Ia cadena lateral del residuo Lys-246. El átomo de oxígeno y/o el átomo de azufre que se corresponden con el elemento A 2 " forman puente de hidrógeno con el grupo hidroxilo de Ia cadena lateral del residuo Ser-72. Los átomos de carbono que se corresponden con el elemento H2 establecen interacciones hidrofóbicas con Ia porción alifática de Ia cadena lateral de butilamonio del residuo Lys-246, particularmente con carbonos Cβ y Cδ.
Ejemplo 5. Ensayos experimentales. Inhibición de Ia infección viral en células Vero.
Con el objetivo de demostrar Ia capacidad de los compuestos químicos descritos en Ia presente invención de inhibir Ia infección viral por el virus Dengue in vitro, los mismos fueron evaluados en ensayos de inhibición de formación de placas en células Vero. Las células Vero se crecieron en placas de 24 pozos hasta que Ia monocapa alcanzó aproximadamente 90% de confluencia y se realizaron dos lavados de Ia monocapa con medio MEM sin SFB. Preparaciones de DENV2 equivalente a una multiplicidad de infección de 0.1 fueron preincubadas en medio MEM con y sin Ia presencia de los compuestos químicos (100 uM) por espacio de 1 hora a temperatura ambiente. Luego las mezclas virus/compuesto y virus/control fueron incubadas con las monocapas durante 1 hora a 37° C. Al concluir Ia incubación las células se lavaron nuevamente y se incubaron 5 días a 37° C en medio de alta densidad (MEM suplementado con aminoácidos no esenciales, 1 % SFB, 1 % carboximetilcelulosa), para propiciar Ia formación de las placas de lisis. Para Ia tinción se empleó Naphtol Blue Black 0.1% en acetato de sodio 0.15 Mol/L. En cada experimento se ensayaron dos réplicas por cada punto y se realizaron tres determinaciones independientes. El porciento de inhibición de Ia infección fue calculado de acuerdo a Ia expresión siguiente:
No.placas
= 10Ox 1 —
No. Placas. virus. control. Como se observa en Ia Tabla 3, compuestos descritos en Ia presente invención muestran actividad antiviral (1) contra el virus Dengue DEN2 a Ia concentración
ensayada. El efecto antiviral observado para el 80% de los compuestos es moderado (30% < I < 70%) o potente (70% < I < 100%). El conjunto de compuestos activos incluye compuestos que contienen diferentes subestructuras anclas, así como diferentes subestructuras cabezas para una misma subestructura ancla, indicando Ia factibilidad del diseño de antivirales descritos en Ia presente invención a partir de "núcleos" químicos diversos.
Tabla 3. Medición del efecto antiviral in vitro contra virus Dengue DEN2 de varios de los compuestos químicos descritos en Ia presente invención.
++ indica70%≤I<100% + indica 30% < I < 70% " indica 30% < I ≤ 0%
Evaluación de Ia toxicidad de los compuestos.
Para descartar que Ia actividad antiviral observada sea producto de alteraciones celulares y citotoxicidad inducida por los compuestos, monocapas de células vero fueron expuestas por 24 horas a soluciones de estos compuestos preparadas a una concentración de 500 uM y Ia viabilidad celular fue determinada por el ensayo de MTT (ensayo de proliferación celular TACS™, R&D systems, Minneapilis, MN). No se observaron diferencias significativas de Ia viabilidad de las células tratadas con los compuestos y las células control no tratatadas o tratadas con DMSO.
Especificidad de Ia actividad inhibitoria. Con el objetivo de determinar si los compuestos inhiben específicamente Ia infección de las células por el virus de Dengue (y otros flavivirus relacionados), se testó el efecto inhibitorio de estos compuestos contra viruses no relacionados como el virus vaccinia y el virus mengo. Ninguno de estos compuestos mostró efecto inhibitorio significativo contra estos viruses.
Next Patent: METHOD OF MAKING ELECTROSTATICALLY CHARGED PATTERNS