LEISHMANIOSES E USOS

[001 ] A presente invenção refere-se a uma composição vacinai baseada em uma quimera polipeptídica recombinante composta por epitopos específicos de linfócitos T CD4+ e CD8+ de humano e de camundongo derivados de quatro proteínas (LiHypl , LiHyp6, LiHyV e HRF) de Leishmania, que foi capaz de induzir proteção contra a leishmaniose visceral e tegumentar e seu uso.

[002] As leishmanioses são doenças infecciosas endémicas em diversas regiões tropicais e subtropicais em diferentes continentes. Estima-se que 380 milhões de pessoas encontram-se expostas ao risco de contrair a doença e que haja uma incidência aproximada de 0,5 a 1 ,0 e 1 ,5 a 2,0 milhões de novos casos por ano de leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar (LT), respectivamente, em todo mundo. O Brasil é o principal sítio de incidência de LV no continente americano, sendo responsável por 95% dos casos (Alvar J, et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 7: e35671 , 2012).

[003] A gravidade da doença no hospedeiro mamífero, no qual se enquadram o homem e o cão, alcança desde uma lesão cutânea única, no local da picada, até a forma visceral da doença, que pode ser fatal quando na forma aguda e não tratada (Grimaldi, G. e Tesh, R.B. Leishmaniasis of the New World: current concepts and implications for future research. Clin. Microbiol. Rev. 6; 230 ^" 50, 1993). Devido à ineficácia das medidas de controle utilizadas, da dificuldade para um diagnóstico correto e dos problemas de toxicidade relacionados aos tratamentos convencionais; o desenvolvimento de vacinas que sejam capazes de induzir imunidade protetora contra a doença torna-se desejável (Tesh RB. Control of zoonotic visceral leishmaniasis: is it time to change strategies? Am J Trop Med Hyg. 52;287-92, 1995).

[004] Em modelos murinos, após a cura da leishmaniose causada pela espécie Leishmania major, os animais adquirem imunidade duradoura contra a reinfecção (Afonso LC e Scott P. Immune responses associated with susceptibility of C57BL/10 mice to Leishmania amazonensis. Infect. & Immun. 61 ; 2952 ^" 59, 1993). Tal fato tem estimulado o desenvolvimento de pesquisas visando à obtenção de antígenos vacinais que possam ser utilizados como uma medida efetiva de controle da doença. Existem antígenos que vêm sendo avaliados e que preenchem, parcialmente, requisitos para serem empregados como candidatos à vacina (Stãger S, et al. Immunization with a recombinant stage-regulated surface protein from Leishmania donovani induces protection against visceral leishmaniasis. J Immunol. 165; 7064 ^" 71 , 2000; Dondji B, et al. Heterologous prime ^" boost vaccination with the LACK antigen protects against murine visceral leishmaniasis, //7/ecf Immun 73;5286 ^" 89, 2005).

[005] Preferencialmente, uma vacina efetiva deveria conter antígenos imunogênicos e conservados em diferentes espécies de Leishmania, além de apresentar um custo acessível à população e seus governos. Entretanto, a maioria dos estudos realizados utiliza antígenos únicos, que são expressos em apenas uma das formas morfológicas do parasita (Fernandes AP, et al. Making an anti-amastigote vaccine for visceral leishmaniasis: rational, update and perspectives. Curr Opin Microbiol. 15:1 -10, 2012). Porém, devido às dificuldades relacionadas à obtenção de antígenos que sejam eficazes contra mais de uma espécie dos parasitas, que sejam de fácil e rápida produção e que não estimulem a produção de anticorpos específicos ao parasita nos animais imunizados, como por outros motivos; ainda não há disponível no mercado uma vacina completamente eficaz no combate às diferentes espécies do parasita Leishmania.

[006] Em relação à resposta imune, a resistência frente a infecções de espécies de Leishmania está relacionada a um perfil de resposta Th1 , primada pela produção de IFN-γ por macrófagos ativados. Por outro lado, o perfil de resposta Th2, com produção de IL-4 e IL-10, é associado à susceptibilidade à doença (Scott P. Development and regulation of cell-mediated immunity in experimental leishmaniasis. Immunol Res. 27; 489-98, 2003). Diante disso, espécies de Leishmania podem evadir do mecanismo imune através da indução de IL-4 e inibição de IFN-γ nas fases iniciais da infecção. Sendo assim, células T CD4+ e CD8+ são importantes não só para combater e eliminar o parasita do organismo hospedeiro, mas também para a geração de uma memória imunológica voltada ao combate de futuras infecções pelo parasita (Souza VL, et al. Immune and inflammatory responses to Leishmania amazonensis isolated from diferent clinicai forms of human Leishmaniasis in CBA mice. Mem Inst Oswaldo Cruz, v106(1 ):23- 31 , 201 1 ).

[007] Por meio da utilização da imunoproteômica, recentemente, proteínas de Leishmania infantum foram reconhecidas por anticorpos presentes nos soros de cães com LV sintomática e/ou assintomática (Coelho VT, et al. Identification of proteins in promastigote and amastigote-like Leishmania using an immunoproteomic approach. PLoS Negl Trop Dis. 6(1 ):e1430, 2012). Dentre elas, novos alvos diagnósticos, vacinais e/ou terapêuticos foram identificados. Três dessas proteínas, denominadas LiHypl (XP_001468941 .1 ), LiHyp6 (XP_001568689.1 ) e HRF (CAJ05086.1 ), quando utilizadas sob a forma recombinante e associadas à saponina, como adjuvante, foram capazes de induzir proteção em camundongos BALB/c contra a infecção experimental por L. infantum (Martins VT, et al. Antigenicity, Immunogenicity and Protective Efficacy of Three Proteins Expressed in the Promastigote and Amastigote Stages of Leishmania infantum against Visceral Leishmaniasis. PLoS One. 10(9):e0137683, 2015). Também, em outro estudo realizado, a proteína LiHyV (XP_001462854.1 ) ofertou proteção sob a forma recombinante e associada à saponina, contra a infecção com essa mesma espécie do parasita (Martins VT, et al. A Leishmania- specific hypothetical protein expressed in both promastigote and amastigote stages of Leishmania infantum employed for the serodiagnosis of, and as a vaccine candidate against, visceral leishmaniasis. Parasit. Vectors, 8; 363, 2015); demonstrando assim a factibilidade de utilização de tais antígenos como candidatos vacinas contra a LV.

[008] Atualmente, são encontrados no estado da arte alguns documentos descrevendo o desenvolvimento de antígenos para tratamento de leishmanioses. O documento de patente BR132013001 271 , intitulado Proteína quimérica, composição vacinai e kit para teste imunodiagnóstico de leishmaniose visceral , refere-se a uma proteína quimérica para uso em composição para vacina e teste imunodiagnóstico de LV canina e humana, desenvolvida através da seleção, identificação, produção e teste de novos antígenos por meio de análise proteômica, bioinformática, síntese de peptídeos, imunoensaio, construção de gene sintético e produção e purificação de proteína. Essa tecnologia se difere da presente invenção por compreender outros componentes imunogênicos, os quais são diferentes dos aqui apresentados.

[009] O documento de patente P 10609847, intitulado ^{^} Composition comprising the n-terminal region of Leishmania histone h2b, use thereof for inducing an immune response _ trata de uma composição imunogênica que compreende um peptídeo antigênico que consiste de fragmento da proteína histona H2B de Leishmania e um adjuvante que estimula a resposta imunológica. Essa tecnologia se difere da presente invenção por compreender apenas um composto antigênico. Além do mais, o antígeno em questão se difere de qualquer um dos descritos na presente invenção.

[0010] O documento de patente WO20131 10824, intitulado ^{^} Multi-component Chimera for use as a vaccine against infection by leishmania spp. In mammals_ refere-se a uma quimera, HISA70, composta por diferentes proteínas (H2A, H2B, H3, H4, A2 e HSP70) de Leishmania infantum na composição de uma vacina contra Leishmania spp. Essa tecnologia se difere da presente invenção por compreender proteínas diferentes das relacionadas na presente invenção.

[001 1 ] Dessa forma, a presente invenção se refere a uma vacina quimérica polipeptídica composta por epítopos específicos de linfócitos T CD4+ e CD8+ de humano e camundongo, derivados das quatro proteínas (LiHypl , LiHyp6, LiHyV e HRF) que foram descritas como capazes de induzir proteção, quando administradas isoladamente, contra a infecção por L. infantum, para a indução de proteção contra a infecção pelas espécies L. infantum e L. amazonensis, espécies causadoras de leishmaniose visceral e tegumentar, respectivamente, no mundo. A quimera polipeptídica apresentou resultados promissores na indução de proteção contra a infecção desafio com ambas as espécies de parasitas e, dessa forma, coloca-se como um novo candidato para a proteção contra distintas espécies de Leishmania. A proteção conferida pela vacina quimérica foi superior àquela induzida pelas proteínas administradas isoladamente nos animais de experimentação, no que tange à imunogenicidade induzida antes e após a infecção experimental, bem como na redução da carga parasitária em diferentes órgãos dos animais avaliados.

[0012] No estado da técnica, não foi encontrada nenhuma tecnologia desenvolvida para composição vacinai que compreenda os epítopos descritos na presente invenção, o que a torna inovadora e com possiblidade para aplicação industrial. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0013] A Figura 1 representa a antigenicidade da quimera recombinante. A quimera recombinante (10 μg, indicada pela seta preta na figura) foi submetida à eletroforese em um gel desnaturante de SDS-PAGE a 12%, corada com Coomassie brilhante blue G-250 e transferida para uma membrana de nitrocelulose, a qual foi colocada em incubação com os diferentes pools de soros. Para tal, um padrão de peso molecular foi utilizado como marcador (A). As reações com os pools de soros dos animais imunizados com as proteínas recombinantes LiHypl (B), LiHyp6 (C), LiHyV (D), HRF (E) ou com soros de animais imunizados com a própria quimera (F) são mostradas. Também, foram utilizados pools de soros de camundongos experimentalmente infectados com L. infantum (G) ou L. amazonensis (H), bem como pool de soros de animais não infectados e não imunizados (I), usado como controle negativo da reação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

[0014] A presente invenção refere-se a uma composição vacinai contendo quimera polipeptídica composta por epítopos específicos de linfocitos T CD4+ e CD8+ de humano e camundongo provenientes de quatro proteínas imunogênicas de Leishmania e seu uso para a proteção e/ou tratamento contra as leishmanioses tegumentar e visceral.

[0015] Mais especificamente, a proteína quimérica proposta na presente invenção está definida pela SEQ ID No 1 . A composição vacinai contra leishmanioses compreende a proteína quimérica definida pela SEQ ID No 1 , além da associação de adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

[0016] Os adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, de acordo com a presente invenção, podem ser selecionados, sem qualquer limitação, dentre aqueles citados na seguinte literatura: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing, Farmacopéia Européia ou Brasileira ou novos excipientes a serem desenvolvidos, sendo preferencialmente as saponinas. Preferencialmente, os adjuvantes devem ser indutores de resposta imune Th1 , como as saponinas, ou compostos que sejam capazes de estimular uma resposta imune celular primada pela produção de IFN-γ e IL-12.

[0017] A presente invenção ainda refere-se ao uso da proteína quimérica em composições vacinais contra a leishmaniose tegumentar e visceral.

[0018] A composição vacinai proposta pode ser administrada pelas vias intradérmica, intramuscular, oral, nasal, intravenosa, subcutânea e/ou como dispositivo que possa ser implantado e/ou injetado.

[0019] A presente invenção pode ser mais bem compreendida através dos exemplos que se seguem, não limitantes.

Exemplo 1 - Construção da quimera recombinante.

[0020] Para a construção da quimera polipeptídica, as proteínas LiHypl , LiHyp6, LiHyV e HRF foram submetidas a análises de bioinformática para seleção de regiões imunogênicas ricas em epitopos de linfócitos T murinos e humanos. O programa Net CTL Pan foi utilizado, de forma que os melhores epitopos que se ligaram aos alelos de MHC de classe I humano A2, A3 e B7, os quais juntos representam mais de 90% da população humana de qualquer etnia, foram selecionados. O mesmo programa foi utilizado para que epitopos que se liguem aos alelos Η-2-Kd, Η-2-Ld e Η-2-Dd de camundongos BALB/c fossem também selecionados. Os epitopos específicos às moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de classe I que foram selecionados para a construção da quimera são mostrados nas Tabelas 1 e 2.

[0021 ] Com a finalidade de se identificar os epitopos que se liguem ao MHC de classe II, o programa Net MHC II 2.2 foi utilizado, de modo a avaliar a afinidade de ligação de peptídeos de 15 aminoácidos aos 26 alelos do homem. Apenas os epitopos com a capacidade de interagir com uma afinidade de ligação menor que 500 nM e em pelo menos 30% dos alelos foram selecionados. O programa foi também utilizado para selecionar epitopos que se ligaram aos alelos l-Ad e l-Ed de camundongos BALB/c. Os epitopos específicos às moléculas de MHC de classe II que foram selecionados para a construção da quimera são mostrados na Tabela 3 e 4. Tabela 1. Predição in silico de epitopos específicos às moléculas de MHC classe I de linfocitos T de humanos selecionados para construção da quimera recombinante.

MHC classe I de humano

Proteína Número Sequência Alelo Net CTL Score

1 69-ILNDGRFQL-77 A2 1, 125

2 156-MVPDRSVYI-164 A2 1,069

LiHypl 3 83 - ASFMPLLER-91 A3 1,090

4 77-LPPLPPASF-85 B7 1,398

5 80-LPPASFMPL-88 B7 1,390

6 37-SLATAFGLV-45 A2 1,0202

LiHypó

7 52-LLYRSTFRH-60 A3 1,2444

8 87-YMAHIRSYM-95 A2 1,0595

9 l l l-FQTNAAAFV-119 A2 1,0653

HRF 10 88-MAHIRSYMK-96 A3 1, 1722

11 112-QTNAAAFVK- 120 A3 1, 1752

12 115 - A A AF VKKVL- 123 B7 1, 1121

13 90-SMSMArTTV-98 A2 1,322

14 69-VSGNGLTIK-77 A3 1,0395

15 83-TPSSARLSM-91 B7 1,7256

LiHyV 16 97-TVAQSArTL-105 B7 1, 1648

17 109-MPANSDIRI-117 B7 1, 1793

18 116-RIVATTSSL-124 B7 1,3978

19 125 - AP AQSLFDF- 133 B7 1,5079

Tabela 2. Predição in silico de epitopos específicos às moléculas de MHC classe I de linfocitos T de camundongos selecionados para construção da quimera recombinante.

MHC classe I de camundongo Proteína Número Sequência Alelo Net CTL Score

1 77-LPPLPPASF-85 Η-2-Ld 0,27186

2 79-PLPPASFMP-87 Η-2-Ld 0,08248

LiHypl 3 165-MSGPARYV Y- 173 Η-2-Dd 0,23280

4 59-DVYTRASDR-67 Η-2-Kd 0,07271

5 83 - ASFMPLLER-91 Η-2-Kd 0,20710

LiHypó 7 29-LTYAETVVS-37 Η-2-Kd -

LiHyV 8 82-STPSSARLS-90 Η-2-Ld 0, 11316

Tabela 3. Predição in silico de epitopos específicos às moléculas de MHC classe II de linfocitos T de humanos selecionados para construção da quimera recombinante.

MHC classe II de humano

Proteína Número Sequência Net MHCII Score

1 52-LLYRSTFRHAMLLRV-66 38,46

2 53-LYRSTFRHAMLLRVQ-67 38,46

LiHypó

3 54-YRSTFRHAMLLRVQR-68 38,46

4 55-RSTFRHAMLLRVQRE-69 42,31

5 56-STFRHAMLLRVQRET-70 38,46

HRF 6 108 -RKAFQTN A A AF VKKV - 122 30,77

Tabela 4. Predição in silico de epitopos específicos às moléculas de MHC classe II de linfocitos T de camundongos selecionados para construção da quimera recombinante.

MHC classe II de camundongo

Proteína Número Sequência Alelo Net MHCII Score

1 169- ARYV YFHMVLPVEAQ- 183 Η-2-IAd 394,4

LiHypl

2 170-RYV YFHMVLPVEAQR- 184 Η-2-IAd 446,9 3 171 - YV YFHMVLPVEAQRF- 185 Η-2-IAd 161,2

4 172- V YFHMVLPVEAQRFS - 186 Η-2-IAd 160,5

5 173- YFHMVLPVEAQRFSL- 187 Η-2-IAd 169,2

6 174-FHMVLPVEAQRFSLV- 188 Η-2-IAd 255,3

7 55-RSTFRHAMLLRVQRE-69 Η-2-IAd 204,8

8 56-STFRHAMLLRVQRET-70 Η-2-IAd 182,5

LiHypó 9 57-TFRHAMLLRVQRETR-71 Η-2-IAd 221,1

10 58 -FRH AMLLR VQRETRF-72 Η-2-IAd 252,0

11 59-RHAMLLRVQRETRFD-73 Η-2-IAd 484,1

12 83-TPSSARLSMSMArfT-97 Η-2-IAd 411,1

13 84-PSSARLSMSMArfTV-98 Η-2-IAd 347,9

14 85-SSARLSMSMArTTVA-99 Η-2-IAd 193,3

15 86-SARLSMSMArrTVAQ- 100 Η-2-IAd 145,8

16 87-ARLSMSMArTTV AQS- 101 Η-2-IAd 113,9

LiHyV 17 88-RLSMSMArTTVAQSA-102 Η-2-IAd 93,5

18 89-LSMSMAnTVAQSAI-103 Η-2-IAd 165,8

19 90-SMSMArTTVAQSArr-104 Η-2-IAd 231,5

20 97-TVAQSArTLSGVMPA-l 11 Η-2-IAd 382,5

21 98-VAQSAITLSGVMPAN-l 12 Η-2-IAd 391,0

Exemplo 2 - Validação da antigenicidade da quimera.

[0022] Com o objetivo de validar a antigenicidade da quimera polipeptídica, experimentos de Western-blot foram realizados utilizando soros de camundongos BALB/c que foram imunizados por via subcutânea com as proteínas rLiHypl , rl_iHyp6, rLiHyV ou rHRF mais saponina, bem como com soros de animais cronicamente infectados com L. infantum ou L. amazonensis. Nos resultados, pode-se observar que todos os pools de soros utilizados (n=8, por grupo), com exceção do controle negativo, que foi composto por soros de animais que não foram imunizados ou infectados; foram capazes de reconhecer a quimera polipeptídica (-30.0 kDa), demonstrando assim a antigenicidade da proteína recombinante nos animais vacinados e/ou infectados (Figura 1 ). Exemplo 3- Avaliação da resposta imune celular induzida pela quimera antes da infecção desafio.

[0023] A imunogenicidade da quimera recombinante foi avaliada em camundongos BALB/c imunizados, por meio da dosagem das citocinas IFN-γ, IL- 12, GM-CSF, IL-4 e IL-10 produzidas pelos esplenocitos dos animais, 30 dias após a administração da última dose do imunógeno. Após o estímulo in vitro com as proteínas específicas ou com uma mistura de extratos dos dois parasitas (SLA), observou-se a produção de níveis significativamente elevados de IFN-γ, IL- 12 e GM-CSF no grupo dos animais vacinados, em relação aos níveis produzidos pelos esplenocitos dos grupos controle, constituídos por animais que receberam saponina ou salina (Tabela 5). Também, o grupo imunizado com a quimera mais saponina produziu maiores níveis de IFN-γ, IL-12 e GM-CSF em relação aos níveis dessas citocinas obtidos nos grupos imunizados com as proteínas rLiHypl , rLiHyp6, rLiHyV ou rHRF mais saponina. Nenhum aumento foi observado na produção de IL-4 e IL-10 em qualquer dos grupos avaliados.

Tabela 5- Níveis de produção das citocinas IFN-γ, IL-12 e GM-CSF (em pg/ml). As citocinas foram quantificadas em sobrenadantes de cultura de esplenocitos dos animais. A média ± desvio padrão dos grupos é mostrada.

Citocinas (em pg/ml)

Estímulo IFN-gama IL-12 GM-CSF

Meio 66+8 55+5 60+5

Salina Mix proteínas 70+10 67+8 57+7

SLA 58+6 69+6 59+8

Meio 64+5 55+4 70+8

Saponina Mix proteínas 77+10 65+8 77+6

SLA 59+10 59+7 59+5

Meio 56+5 58+9 64+4 LiHyp 1/saponina LiHypl 998+98 233+55 199+33

SLA 433+35 155+22 138+16

Meio 55+5 57+7 63+6

LiHypó/saponina LiHYpó 677+57 201+21 177+26

SLA 322+20 134+15 107+10

Meio 60+10 64+4 58+5

LiHyV/saponina LiHyV 905+45 195+30 180+30

SLA 405+45 133+17 121+19

Meio 49+5 54+5 62+7

HRF/saponina HRF 877+55 178+20 160+22

SLA 377+32 125+20 121+17

Meio 59+9 63+5 58+6

Quimera/saponina Quimera 1.644+109 425+40 307+32

SLA 766+30 255+20 170+15

Exemplo 4- Avaliação da eficácia de proteção contra a infecção desafio por L. infantum ou L. amazonensis.

[0024] Dez semanas após a infecção desafio, a carga parasitária dos diversos grupos foi avaliada na pata infectada (L amazonensis), no fígado, baço, linfonodo drenante e medula óssea dos animais infectados com L. infantum (Tabela 6) ou L. amazonensis (Tabela 7). Pode-se observar que, em ambos os casos, ainda que os animais imunizados com as proteínas recombinantes individuais mais saponina tenham apresentado menor carga parasitária em relação aos grupos controles (salina e saponina), os animais imunizados com a quimera recombinante mais saponina apresentaram reduções mais significativas no parasitismo quando comparado a todos os demais grupos experimentais.

Tabela 6. Resultados da carga parasitária dos animais imunizados e desafiados com L. infantum. A carga parasitária foi determinada por uma técnica de diluição limitante, 10 semanas após a infecção desafio. A média ± desvio padrão dos grupos é mostrada.

Tabela 7. Resultados da carga parasitária dos animais imunizados e desafiados com L. amazonensis. A carga parasitária foi determinada por uma técnica de diluição limitante, 10 semanas após a infecção desafio. A média ± desvio padrão dos grupos é mostrada.

Pata infectada Baço Fígado Linfonodos Medula óssea

Salina 8,5+0,5 6,5+0,4 4,4+0,2 7,3+0,4 3,3+0,2

Saponina 8,0+0,3 6,1+0,2 4,1+0,4 6,8+0,5 3,1+0,3

LiHyp 1/saponina 3,2+0,3 2,7+0,4 2,5+0,3 3,1+0,3 1,9+0,3

LiHypó/saponina 3,7+0,4 3,1+0,3 2,9+0,4 3,7+0,3 2,3+0,3

LiHyV/saponina 3,0+0,3 2,6+0,2 2,3+0,4 3,0+0,2 1,9+0,5

HRF/saponina 4,1+0,4 3,7+0,4 3,3+0,4 3,9+0,3 2,5+0,4

Quimera/saponina 1,8+0,3 1,6+0,2 1,5+0,3 1,6+0,5 0,8+0,3 Exemplo 5- Avaliação da resposta imune celular após a infecção desafio.

[0025] A avaliação da resposta imune celular após a infecção desafio foi também realizada. As culturas de esplenócitos dos animais imunizados e infectados foram estimuladas com as proteínas específicas usadas nas imunizações ou com uma mistura de extratos dos dois parasitas (SLA) e procederam-se às dosagens das citocinas IFN-γ, IL-12, GM-CSF, IL-4 e IL-10. Nos resultados, observou-se a produção de níveis significativamente elevados de IFN-γ, IL-12 e GM-CSF no grupo dos animais vacinados, em relação aos níveis produzidos dessas citocinas nos esplenócitos dos grupos controle (Tabela 8). Como observado antes da infecção, o grupo imunizado com a quimera mais saponina produziu maiores níveis de IFN-γ, IL-12 e GM-CSF em relação aos níveis dessas citocinas obtidos nos grupos imunizados com as proteínas rLiHypl , rLiHyp6, rLiHyV ou rHRF mais saponina. Entretanto, os animais dos grupos controles (salina e saponina) produziram níveis significativamente maiores de IL-4 e IL-10, em relação aos demais grupos avaliados (Tabela 9).

Tabela 8- Níveis de produção das citocinas IFN-γ, IL-12 e GM-CSF ( pg/ml). As citocinas foram quantificadas em sobrenadantes de cultura esplenócitos dos animais. A média ± desvio padrão dos grupos é mostrada.

Citocinas (em pg/ml)

Estímulo IFN-gama IL-12 GM-CSF

Meio 77+10 66+5 57+7

Salina Mix proteínas 88+7 78+7 68+8

SLA 80+5 88+9 79+9

Meio 66+4 68+3 58+4

Saponina Mix proteínas 96+9 88+6 77+8

SLA 101+15 99+7 88+4 Meio 66+7 65+4 58+6

LiHyp 1/saponina LiHyp 1 1.211+105 343+35 266+25

SLA 776+50 257+28 199+20

Meio 60+4 55+4 58+4

LiHypó/saponina LiHYpó 977+46 255+33 199+20

SLA 554+35 199+21 166+22

Meio 48+7 55+6 63+3

LiHyV/saponina LiHyV 1.101+90 288+23 201+26

SLA 667+33 255+20 196+25

Meio 52+2 59+6 55+4

HRF/saponina HRF 933+25 233+18 177+19

SLA 477+23 177+21 155+10

Meio 63+6 65+7 68+8

Quimera/saponina Quimera 2.322+122 544+30 372+20

SLA 1.556+99 388+35 295+45

Tabela 9- Níveis de produção das citocinas IL-4 e IL-10 (em pg/ml). As citocinas foram quantificadas em sobrenadantes de cultura de esplenocitos dos animais. A média ± desvio padrão dos grupos é mostrada.

Citocinas (em pg/ml)

Estímulo IL-4 IL-10

Meio 59+7 65+6

Salina Mix proteínas 98+12 86+5 SLA 488+40 455+25

Meio 64+5 55+4

Saponina Mix proteínas 77+10 65+8

SLA 356+88 367+48

Meio 77+8 68+10

LiHyp 1/saponina LiHyp 1 70+8 67+4

SLA 79+10 83+4

Meio 65+6 68+8

LiHypó/saponina LiHYpó 77+5 77+4

SLA 80+10 86+9

Meio 59+7 66+7

LiHyV/saponina LiHyV 70+5 75+10

SLA 88+5 87+10

Meio 70+6 68+8

HRF/saponina HRF 121+11 133+25

SLA 101+9 106+12

Meio 55+6 59+4

Quimera/saponina Quimera 66+5 75+6

SLA 73+7 80+6