Die Erfindung betrifft chirale nicht-partikuläre Sorbentien und deren Verwendung für die Enantiomerentrennung.

Chirale Trennmaterialien für die Trennung von Enantiomeren sind in großer Anzahl im Stand der Technik bekannt. Es handelt sich ausschlie߬ lich um partikuläre Trennmaterialien. Die bekannten chiralen Trenn¬ materialien bestehen entweder aus der chiralen Verbindung selbst (zum Beispiel Cellulosetriacetat) oder aber ein chiraler Separationseffektor ist auf einen Träger aufgezogen oder chemisch an einen Träger gebunden. Außerdem ist es möglich, chirale Separationseffektoren, die mit einer stationären Phase in Wechselwirkung treten, dem Elutionsmittel zuzu¬ setzen (dynamische Belegung).

Chirale Separationseffektoren sind in großer Zahl bekannt; die wichtigsten Gruppen bekannter chiraler Separationseffektoren sind: a) Aminosäuren und ihre Derivate, z.B. L-Phenylalanin, oder D-Phenyl- alanin, Ester oder Amide von Aminosäuren oder acylierte Aminosäuren oder Oligopeptide; b) natürliche und synthetische Polymere mit einer Asymmetrie oder Dis- symmetrie in der Hauptkette; dazu gehören Proteine (z.B. saures αi- Glycoprotein, Rinderserumalbumin, Cellulase; siehe J. Chrom. 264, Seiten 63 -68 (1983), J. Chrom. 269, Seiten 71 - 80 (1983), WO 91/12 221 ), Cellulose und Cellulosederivate, sowie andere Polysaccharide und deren Derivate (z.B. Cellulosetribenzoat, Cellulosetribenzylether, Cellulose-trisphenylcarbamat, Cellulose-tris-3-chlorobenzoat, Amylose- tris-(3,5-dimethylphenylcarbamat), Cellulose-tris-(3,5-dimethylbenzoat), Cellulose-tris-(3,5-dimethylphenylcarbamat); siehe EP 0 147 804, EP 0 155 637, EP 0 718 625);

c) Cyclodextrine und Cyclodextrinderivate (z.B. J. High Resol. Chrom. & Chromat. Comm. 3, Seiten 147 - 148 (1984); EP 0407 412; EP 0445 604); d) Polymere mit Asymmetriezentren in der Seitenkette (z.B. EP 0249 078; EP 0282 770, EP 0 448 823); e) Polymere, die um chirale Strukturen polymerisiert werden ("inprint"- Polymere (z.B. J Chromat. 707, Seiten 199 - 203 (1995); J. Chromat. 694, Seiten 3 - 13 (1995)).

Chirale Trennmateπalien des Standes der Technik sind partikuläre Sorbentien und werden vorzugsweise in der Säulenchromatographie verwendet Die dabei verwendeten Säulenpackungen erfordern einen erheblichen Betriebsdruck, damit akzeptable Flußraten erreicht werden. Auch ist die mechanische Stabilität der partikularen Sorbensbetten nicht sehr gut

Es stellt sich also die Aufgabe, Verfahren zur Enantiomerentrennung unter Verwendung von stabileren Sorbenspackungen, die auch höhere Fluß- geschwindigkeiten erlauben, sowie stabilere chiral deπvatisierte Sorben- tien bereitzustellen

Es wurde gefunden, daß nicht-partikulare Sorbentien für die Enantiomeren¬ trennung eingesetzt werden können, wobei hohe Elutionsgeschwindig- keiten erreicht werden können. Die Aufgabe wird durch die Bereitstellung von nicht-partikularen Sorbentien, die chirale Separationseffektoren auf¬ weisen, gelost Nicht-partikuläre Sorbentien sind insbesondere Sorbentien auf der Grundlage von monolithischen Grundkorpern und auch auf der Grundlage von porösen Membranen

Gegenstand der Erfindung ist ein chirales nicht-partikuläres Sorbens auf der Grundlage eines porösen Formkörpers, insbesondere auf der Grundlage eines porösen keramischen Formkörpers, der untereinander verbundene Makroporen sowie Mesoporen in den Wänden der Makro- poren aufweist, wobei der Durchmesser der Makroporen einen Medianwert größer als 0,1 μm aufweist, und wobei der Durchmesser der Mesoporen einen Medianwert von 2 und 100 nm aufweist, oder auf der Grundlage eines porösen Formkörpers aus Polyamid.

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen chiralen nicht-partikulären Sorbens für die chromatographischen Trennung von Enantiomeren.

Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zur chromatographischen Trennung von Enantiomeren, wobei ein erfindungsgemäßes chirales nicht¬ partikuläres Sorbens verwendet wird.

Die Abbildungen 1 bis 3 stellen Elutionsdiagramme von verschiedenen Anwendungen dar; die experimentellen Einzelheiten sind in den Anwendungsbeispielen A - C beschrieben.

Es zeigte sich überraschenderweise, daß bei der Verwendung von nicht- partikulären, insbesondere monolithischen Sorbentien die H/u-Kurven flach sind. Weiterhin werden bei nicht-partikulären Sorbentien, die einen gerin¬ gen Druckabfall verursachen, niedrige Trennstufenhöhen gefunden. Da¬ durch lassen sich präparativ-chromatographische Trennverfahren unter Verwendung von nicht-partikulären Sorbentien wesentlich besser als bei Verwendung von partikuläre Sorbentien optimieren; die Wirtschaftlichkeit dieser Prozesse kann bedeutend verbessert werden.

Der erfindungsgemäß verwendete Begriff "nicht-partikuläre" Sorbentien stellt den Gegensatz zu bekannten oben gekennzeichneten partikulären Sorbentien dar, bei denen das Sorbensbett aus einzelnen diskreten Partikeln besteht. Sowohl monolithische Sorbentien als auch mit Separa- tionseffektoren derivatisierte Membranen werden von dem Begriff nicht¬ partikuläre Sorbenzien umfaßt.

Monolithische Sorbentien sind grundsätzlich aus der Literatur bekannt; dazu gehören vor allem poröse keramische Formkörper, wie sie in WO 94/19687 und in WO 95/03256 offenbart sind. Von dem Begriff mono¬ lithische Sorbenzien werden im weiteren Sinn auch Formkörper aus Poly¬ merisaten umfaßt, wie sie von F. Svec und J.M. Frechet (1992) Anal. Chem. 64, Seiten 820 - 822, und von S. Hjerten et al. (1989) J. Chromatogr. 473, Seiten 273 - 275, beschrieben wurden.

Als Grundträger werden die in WO 95/03 256 offenbarten porösen kerami¬ schen Formkörper, die untereinander verbundene Makroporen sowie Mesoporen in den Wänden der Makroporen aufweisen, wobei der Durch¬ messer der Makroporen einen Medianwert größer als 0,1 μm aufweist, und wobei der Durchmesser der Mesoporen einen Medianwert von 2 und 100 nm aufweist, besonders bevorzugt. Diese Grundträger lassen sich nach grundsätzlich bekannten Verfahren modifizieren, wobei für die erfindungs¬ gemäße Enantiomerentrennung geeignete Sorbentien erhalten werden. Geeignete Modifikationsverfahren sind dem Fachmann bekannt und in Handbüchern beschrieben, z.B. in Unger, K.K. (ed) Porous Silica, Elsevier Scientific Publishing Company (1979) oder in Unger, K.K. Packings and Stationary Phases in Chromatographie Techniques, Marcel Dekker (1990).

Mit Separationseffektoren derivatisierte adsorptiv wirksame Membranen sind in WO 91/03 506, in DE 196 27 302.1 und in WO 96/22 316, sowie in PCT/EP97/02 768 offenbart. Besonders bevorzugt ist die Verwendung der in WO 96/22 316, in DE 196 27 302.1 und in PCT/EP97/02 768 offen- harten derivatisierten Polyamidmembranen. Verfahren zur Herstellung dieser Membranen sind in diesen Druckschriften angegeben. Diese Membranen können auch mit chiralen Separationseffektoren derivatisiert werden.

Als Basispolymer insbesondere für Membranen geeignetete Polyamide sind dem Fachmann bekannt und sind auch kommerziell erhältlich. Dazu gehören z.B. die unter dem Handelsnamen NYLON® bekannten Polymere, z.B. NYLON® 66 und NYLON® 6. Die Umsetzung derartiger Membranen ist bevorzugt, da unter den Reaktionsbedingungungen, wie sie in DE 195

01 726.9 und DE 196 24 813.2 verwendet werden (Reaktionstemperatur unter 80 °C), deren Form erhalten bleibt, während andere Verfahren zur

Derivatisierung von Polyamid in der Schmelze oder in Lösung ausgeführt werden.

Neben Azlacton- und Epoxidgruppen können die in den vorgenannten An¬ meldungen offenbarten modifizierten Polyamide insbesondere Carboxyl-, Amino- oder Hydroxygruppen enthalten. Diese Gruppen erlauben es, chirale Separationseffektoren nach an sich bekannten Verfahren an die Polyamide zu binden. Auf die in den vorgenannten Anmeldungen offen¬ barten polymerisierbaren modifizierten Polyamide können optisch aktive Monomere, wie sie beispielsweise in EP 0249 078, EP 0 282 770 und EP 0 448 823 offenbart werden, nach an sich bekannten Methoden polymerisiert werden.

Die adsorptive oder chemische Bindung der chiralen Separationseffektoren kann beispielsweise erzielt werden, indem man zunächst funktionelle Gruppen, wie z.B. Amino-, Carboxy, Carbonyl-, Hydroxy- oder Epoxy- gruppen oder Azlactonreste in den Grundträger einführt. Anschließend können beispielsweise chirale Separationseffektoren, die Aminogruppen enthalten (z.B. optisch aktive Amine, wie sie z.B. in EP 0249078 offenbart werden, Aminosäuren, Aminosäureester und -amide, Oligopeptide, Proteine, Aminozucker), unter Verwendung von wasserabspaltenden Mitteln, wie z.B. Carbodiimiden, an mit Carboxylgruppen modifizierten Grundträger gebunden werden. Diese chiralen Separationseffektoren können auch unter Verwendung von mit Azlacton- oder Epoxidgruppen modifizierten Grundträger gebunden werden. Chirale Separations¬ effektoren, die Carboxylgruppen enthalten (z.B. Aminosäuren oder N- acylierte Aminosäuren, Oligopeptide, Proteine, optisch aktive Carbon- säuren), können unter Verwendung von wasserabspaltenden Mittel, wie z.B. Carbodiimiden, an mit Amino- oder Hydroxygruppen modifizierten Grundträger gebunden werden. Chirale Separationseffektoren, die Hydroxylgruppen enthalten (z.B. Polysaccharide und deren Derivate, Cyclodextrine und deren Derivate) können unter Verwendung von wasser- abspaltenden Mittel, wie z.B. Carbodiimiden, an mit Carboxylgruppen modifizierten Grundträger gebunden werden. Außerdem können chirale Separationseffektoren durch bifunktionelle Reagenzien (z.B. Diisocyanate) an entsprechend modifizierte Grundträger gebunden werden. Chirale Sorbentien, die chemisch gebundene Cyclodextrine als chiralen Separa- tionseffektor enthalten, sind ausgehend von den bevorzugten Grund¬ trägern nach den in EP 0 445 604 offenbarten Methoden zugänglich.

Diese Verfahren und gängige Varianten sind dem Fachmann bekannt und in Handbüchern und Übersichtsartikeln beschrieben.

Unter dem Begriff chiral derivatisiertes nicht-partikuläres Sorbens, bezie¬ hungsweise derivatisierter nicht-partikulärer Formkörper wird erfindungs¬ gemäß ein nicht-partikulärer Grundträger verstanden, der einen chiralen Separationseffektor enthält. Dabei kann der chirale Separationseffektor chemisch gebunden oder adsorbiert oder dynamisch belegt vorliegen.

Es wurde gefunden, daß bei Verwendung dieser bevorzugten Sorbentien die Flußgeschwindigkeit über einen weiten Bereich variiert werden kann, ohne daß die Trenneigenschaften dabei verschlechtert werden. Unter Ausnutzung dieser Eigenschaft ist es möglich, die Flußgeschwindigkeit an das Elutionsprofil anzupassen, ohne daß die Trennleistung verringert wird. Dadurch kann der Zeitbedarf der Trennung stark reduziert werden. Ins¬ besondere für präparative Trennungen oder für Serienanalysen ergeben sich somit große Vorteile.

Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fachmann die obige Beschreibung in weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen sind deswegen lediglich als beschrei¬ bende, keineswegs als in irgendeine Weise limitierende Offenbarung aufzufassen.

Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen, sowie der korrespondie¬ renden Anmeldungen DE 196 29 206.9, eingereicht am 19.07.1996, sowie DE 197 26 152.3, eingereicht am 20.06.1997, sind durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.

Beispiele

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern und stellen keine Einschränkung der Erfindung dar.

Im folgenden wird unter Raumtemperatur eine Temperatur zwischen 15 und 30 °C verstanden

Beispiel 1 : Herstellung eines chiralen Sorbens, an das ß-Cyclodextrin chemisch gebunden ist

Ein poröser Formkorper, hergestellt nach EP 0710219, wird analog zu der Beschreibung von Beispiel 2 aus EP 0 445 604 mit einer Reaktionslösung aus ß-Cyclodextrin, Chlorameisensaure-p-nitrophenylester und 3-(2- Amιnoethyl)aminoproρyltπmethoxysilan zu einem chiralen Sorbens mit chemisch gebundenem ß-Cyclodextrin umgesetzt Dazu wird die Reaktionslosung durch den Formkorper gepumpt.

Es wird ein modifizierter monolithischer Formkörper erhalten, an dem ß-Cyclodextπn chemisch gebunden vorliegt

Beispiel 2: Herstellung eines C ₁₈ -RP Sorbens

Ein poröser Formkorper, hergestellt nach EP 0 710 219, wird mit Methyl- octadecyldichlorsilan chemisch derivatisiert; dazu wird die Reaktions- losung durch den Formkorper gepumpt

Es wird ein modifizierter monolithischer Formkörper erhalten, der mit Ciβ-Alkylgruppen derivatisiert ist, und der als stationäre Phase für die Enantiomerentrennung mit dynamisch belegtem Sorbens geeignet ist (siehe Anwendungsbeispiele B und C)

Beispiel 3: Umsetzung einer Polyamidhohlfasermembran mit Vinyldimethylazlacton

2,56 g 1 ,8-Diazabιcyclo[5,4,0]undec-7-en (DBU) und 32 ml Vinyldimethyl¬ azlacton werden in 160 ml Dimethylformamid gelöst. Ein Polyamidhohl¬ faserbündel (Polyamid 6, 64 Fäden; Durchmesser der Einzelfaser; innen 0,2 mm, außen 0,5 mm, mittlere Porenweite 0,5 μm) wird in eine 300 -

10 mm Chromatographiesäule SUPERFORMANCE® (Fa. Merck KGaA) gepackt und die obige Losung bei Raumtemperatur mit einem Fluß von 2 ml/min 24 Stunden durch das Hohlfaserbündel im Kreis gepumpt. An¬ schließend wird das deπvatisierte Hohlfaserbündel mit Dimethylformamid, Aceton, Essigsaureethylester und Aceton gespült und im Vakuumtrocken- schrank bei 50 °C getrocknet

Beispiel 4: Bindung von γ - Globulin an eine mit Vinyldimethyl¬ azlacton aktivierte Polyamidhohlfasermembran

1 g γ-Globulin wird in 100 ml Tns-Puffer (50 mM, pH 7,4) gelöst und in der in Beispiel 1 beschriebenen Apparatur durch das nach Beispiel 3 derivati- sierte Hohlfaserbundel bei Raumtemperatur im Kreis gepumpt (Fluß: 5 ml/min) Dabei wurden die Proteinkonzentration in der Lösung und deren Abnahme kontinuierlich UV-spektrophotomethsch bestimmt, nach zwei Stunden blieb die Proteinkonzentration in der umgepumpten Lösung konstant Nach Auswaschen des Hohlfaserbündels mit Tris-Puffer (50 mM, pH 7,4) und 0,1 M Essigsäure wurde das im Hohlfaserbündel kovalent ge¬ bundene Protein bestimmt' 66,5 mg

γ-Globu n ist ein Polymeres, das eine Chiralität in der Hauptkette aufweist. Es resultiert ein Hohlfasermodul mit einer chiral modifizierten Polyamid¬ membran

In ähnlicher Weise läßt sich beispielsweise Rinderserumalbumin an eine mit Aziacton- oder Epoxygruppen aktivierte Polyamidmembran binden. Es entsteht ein chirales Sorbens, das ähnlich wie in J. Chrom. 264. Seiten 63 68 (1983) beschrieben, für die Trennung von Enantiomeren geeignet ist.

Anwendunqsbeispiel A: Trennung von racemischen Cromakalim an einem chiralen Sorbens, das ß-Cyclodextrin chemisch gebunden enthält Ein entsprechend Beispiel 1 hergestellter modifizierter monolithischer Formkörper (83 x 7,2 mm) wird als Sorbens verwandt und racemisches Cromakalim unter folgenden Bedingungen aufgetrennt: Probe: Cromakalim (0,2 mg/ml in Ethanol)

Injektionsvolumen: 5 μl Eluent: Methanol/Wasser (20/80; v/v)

Temperatur: Raumtemperatur Fluß: 1 ,0 ml/min

Detektion: 254 nm

Das Elutionsdiagramm ist in Abbildung 1 dargestellt.

Anwendunqsbeispiel B: Trennung von racemischen Chlorthalidon mit dynamischer ß-Cyclodextrinbelegung

Ein entsprechend Beispiel 2 hergestellter modifizierter monolithischer Formkörper (RP-18; 83 x 7,2 mm) wird als Sorbens verwandt und racemisches Chlorthalidon unter folgenden Bedingungen aufgetrennt:

Probe. Chlorthalidon (0,44 mg/ml)

Injektionsvolumen: 5 μl Eluent: Methanol/wäßrige 25 mM Natriumphosphatlösung (pH 2) mit 10 mM ß-Cyclodextrin (20/80; v/v) Temperatur: Raumtemperatur Fluß: 1 ,0 ml/min

Detektion 254 nm

Das Elutionsdiagramm ist in Abbildung 2 dargestellt.

Anwendunqsbeispiel C: Trennung von racemischen Prominal mit dynamischer ß-Cyclodextrinbelegung

Ein entsprechend Beispiel 2 hergestellter modifizierter monolithischer Formkörper (RP-18, 83 x 7,2 mm) wird als Sorbens verwandt und racemisches Prominal unter folgenden Bedingungen aufgetrennt" Probe. Prominal (0,55 mg/ml)

Injektionsvolumen: 5 μl Eluent: Methanol/wäßrige 25 mM Natriumphosphatlösung (pH 2) mit 10 mM ß-Cyclodextrin (20/80; v/v)

Temperatur. Raumtemperatur Fluß' 1 ,0 ml/min

Detektion 254 nm

Das Elutionsdiagramm ist in Abbildung 3 dargestellt