Titre : Gel gonflant à base de chitosane

Domaine technique

[0001 ] La présente invention relève du domaine des compositions comprenant un polymère porteur d’un groupe chélatant pouvant chélater un ou plusieurs métaux, et leurs utilisations diverses. En particulier, la présente invention concerne des compositions pouvant être sous forme de gel, comprenant un polysaccharide porteur d’un groupe chélatant, ainsi que les fils obtenus à partir de ces gels.

Technique antérieure

[0002] Les polysaccharides sont des polymères issus de la biomasse végétale, fongique, animale ou bactérienne. Ces polymères possèdent des propriétés physicochimiques très variées et peuvent être mis en forme pour un large éventail d’applications biomédicales car ils sont souvent résorbables, biocompatibles voire bioactifs. La modification chimique des polysaccharides permet d’adapter leurs propriétés physicochimiques, en particulier leur solubilité en milieu aqueux à des pH proches de la neutralité. Leur fonctionnalisation par des agents chélatants hautement spécifiques permet également des applications particulières dans le domaine biomédical. Par exemple, après greffage de ces motifs sur la structure de polysaccharides, le polymère pourrait être utilisé dans la composition d’un dispositif biomédical détoxifiant pour purifier les organismes vivants de métaux pathogènes comme dans le cadre du maintien de l’homéostasie.

[0003] Le maintien de l’homéostasie du milieu intérieur de l’organisme, c’est-à-dire de l’ensemble des liquides ou fluides biologiques de l’organisme, est nécessaire au bon fonctionnement de ce dernier. Dans de nombreuses pathologies, des dysrégulations systémiques ou locales de l’homéostasie des métaux ont été mises en évidence. Des thérapies de chélation, visant à diminuer la concentration en ions métalliques sont déjà utilisées depuis de nombreuses années dans les cas d’intoxications aigues. Ainsi, un certain nombre de chélatants sont déjà acceptés chez l’homme, chacun étant associé à un groupe de métaux particuliers (G. Crisponi et al., Coordination Chemistry Reviews, 2015).

[0004] De plus en plus d’études scientifiques mettent en avant le rôle important que pourraient avoir les métaux dans nombre d’atteintes neurologiques, notamment le fer, mais également le cuivre, le zinc, le manganèse et même l’aluminium et le plomb (E. J. McAllum et al., J. Mol. Neurosci., 2016). [0005] Ainsi, il existe déjà des dispositifs médicaux pouvant être utilisés pour la captation des métaux. Néanmoins, il est toujours bénéfique d’améliorer les résultats obtenus à ce jour, notamment pour diminuer les effets secondaires desdits traitements.

[0006] Par ailleurs, il est également souhaitable d’avoir une diversité de forme pour les dispositifs médicaux, par exemple un fil mono ou multibrin pouvant être tissé ou tricoté sous forme d’un textile et permettant d’obtenir un dispositif médical de type pansement ou implant pariétal. Un fil seul peut également être avantageux dans le cas où l’implantation doit être combinée avec une stratégie mini-invasive. La fourniture d’un fil permettant de capter des cations métalliques pour restaurer localement l’homéostasie métallique lorsque qu’il y a accumulation de métaux dans l’organisme serait donc particulièrement intéressante.

[0007] Ainsi, un objectif de l’invention est de proposer une composition pouvant chélater un ou plusieurs métaux. Un autre objectif de l’invention est de fournir un fil pouvant chélater un ou plusieurs métaux. Un autre objectif de l’invention est de fournir un fil ayant de bonnes propriétés mécaniques, et qui peut ainsi être tissé ou tricoté sous forme d’un textile.

Résumé

[0008] L’invention concerne en premier lieu une composition comprenant : a. Au moins un chitosane A, et b. Au moins un copolysaccharide statistique B de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 100 kDa et 1000 kDa de formule I :

Formule I dans laquelle :

- chaque Rc représente indépendamment un groupement comportant un agent chélatant,

- chaque Z représente indépendamment un liant pouvant être une simple liaison ou une chaine hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaine pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisis parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes,

- x est compris entre 0,01 et 0,5,

- y est compris entre 0,05 et 0,5,

- le rapport y/x étant supérieur à 0,2, de préférence supérieur à 1 ,

- la somme x + y étant supérieure à 0,1 , et moins de 10% des groupements comportant un agent chélatant de type Rc étant chélatés par un cation d’un élément de transition choisi parmi les éléments du bloc d ou f, et c. éventuellement, de l’eau.

[0009] La présence de groupement chélatant de type Rc dans le copolysaccharide B permet à cette composition de capter un ou plusieurs métaux de façon efficace, et en particulier de capter des cations métalliques. De plus, l’utilisation de chitosane A et de polysaccharide B, qui est produit à partir de chitosane, permet d’obtenir une composition qui présente des propriétés intéressantes. En effet, cette composition peut être biodégradable, biocompatible et biorésorbable. L’utilisation d’une telle composition permettant de chélater des métaux a donc de nombreuses applications possibles au niveau médical.

[0010] En outre, il est possible de former un fil à partir de cette composition, notamment par extrusion de la composition. Ce fil présente de bonnes propriétés mécaniques et peut être mis en forme. Il est possible de tresser les fils, par exemple pour former un matériau textile (tricot ou tissu) capable de capter les métaux.

[0011] Par ailleurs, de manière surprenante, les inventeurs ont démontré que cette composition pouvait gonfler au contact d’un fluide biologique dans des proportions importantes. Ce gonflement permet de favoriser la diffusion et la captation des espèces métalliques à capter, et donc d’améliorer l’efficacité du matériau.

[0012] L’invention concerne également un fil comprenant un gel ou un lyophilisât de la composition selon l’invention.

[0013] L’invention concerne également un matériau textile comprenant des fils selon l’invention.

[0014] L’invention concerne également un dispositif médical comprenant la composition selon l’invention, le dispositif médical étant de préférence un pansement, un implant ou un produit de comblement dermique.

[0015] L’invention concerne également la composition selon l’invention pour son utilisation pour la captation d’au moins un métal, de préférence pour son utilisation pour la captation d’au moins un métal dans le traitement ou la prévention de l’endométriose, des infections fongiques, des infections bactériennes, des plaies chroniques, des maladies neurodégénératives, les lésions du système nerveux, de l’hémochromatose, de la maladie de Wilson ou du saturnisme.

[0016] L’invention concerne également un procédé de préparation d’une composition selon l’invention, comprenant les étapes suivantes :

1) dispersion du chitosane A et du polysaccharide statistique B de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 100 kDa et 1000 kDa de formule I dans de l’eau,

2) ajout d’un acide, de préférence de l’acide acétique,

3) mélange puis centrifugation de la solution obtenue pour récupérer une solution comprenant la composition de l’invention,

4) éventuellement, traitement de la solution obtenue à l’étape 3 dans un bain aqueux basique pour obtenir la composition sous forme d’un gel, et

5) éventuellement, lavage, séchage et/ou stérilisation du gel obtenu à l’étape 4, de préférence par autoclave.

Brève description des dessins

[0017] D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :

Fig. 1

[0018] [Fig. 1] montre une photo des hydrogels sous forme de disque obtenus selon l’exemple 4, en haut à gauche : composition 9 selon l’invention (HG-5-5), en bas à gauche : composition 12 selon l’invention (HG-8-8), en bas à droite : composition 10 selon l’invention (HG-5-10), en haut à droite : composition 11 selon l’invention (HG-5- 15).

Fig. 2

[0019] [Fig. 2] montre une photo des hydrogels sous forme de cylindre obtenus selon l’exemple 4. Il s’agit de la composition comparative 2 (Ref-HG-8-0).

Fig. 3

[0020] [Fig. 3] montre une photo des hydrogels sous forme de cylindre obtenus selon l’exemple 4. Il s’agit de la composition 10 selon l’invention (HG-5-10).

Fig. 4

[0021] [Fig. 4] montre une photo au microscope optique d’un fil ayant un nœud selon l’exemple 5. [0022] [Fig. 5] montre une photo au microscope optique d’un tressage de deux fils selon l’exemple 5.

Fig. 6

[0023] [Fig. 6] montre une photo du gel séché selon l’exemple 6.

Fig. 7

[0024] [Fig. 7] montre une photo du gel gonflé selon l’exemple 6.

Fig. 8

[0025] [Fig. 8] montre une photo au microscope optique d’un fil qui a été à moitié immergé dans l’eau selon l’exemple 6.

Fig. 9

[0026] [Fig. 9] montre une photo au microscope optique d’un fil selon l’exemple 6, dont une goutte d’eau a été déposée sur une portion seulement.

Fig. 10

[0027] [Fig. 10] montre une photo de la formation d’un gel selon l’exemple 12, après injection de la composition 23 selon l’invention (IS-1 ,7-3,3) dans du PBS à 10 mM.

[0028]

Fig. 11

[0029] [Fig. 1 1] montre des images IRM (7.1T) d’un gel formé juste après injection (day 0) et après 15 jours et 30 jours selon l’exemple 14.

Fig. 12

[0030] [Fig. 12] montre des images IRM (7.1 T) du gel formé juste après injection selon l’exemple 14.

Définition

[0031] Dans la présente divulgation, tous les % et les ppm sont indiqués en en masse, sauf mention contraire.

[0032] Sauf indication contraire, toutes les viscosités dont il est question dans le présent exposé correspondent à une grandeur de viscosité dynamique à 25°C dite « Newtonienne », c’est-à-dire la viscosité dynamique qui est mesurée, de manière connue en soi, avec un rhéomètre à un gradient de vitesse de cisaillement suffisamment faible pour que la viscosité mesurée soit indépendante du gradient de vitesse. [0033] Au sens de la présente divulgation, par « chitosane » on entend un polymère naturel de type co-polysaccharide, constitué d'une distribution aléatoire (copolysaccharide statistique) ou non (copolysaccharides à blocs ou à séquence) de D-glucosamine (GIcN) et de N-acétyl-D-glucosamine (GIcNAc), voire exclusivement de D-glucosamine, liés par des liaisons glycosidiques de type 0(1 ->4). Le chitosane est peu présent à l'état natif dans la biomasse, il est principalement obtenu par modification chimique de la chitine, dont il est un dérivé. La chitine possède un rôle structural, on la retrouve principalement dans certains champignons dont elle constitue la paroi cellulaire (Basidiomycètes ex : agariscus campestris, agariscus bisporus, Ascomycètes, Zygomycètes, et Deutéromycètes), mais elle forme également l'exosquelette des arthropodes (crustacés, insectes) notamment chez la crevette ou le crabe et l'endosquelette des céphalopodes tels que le calamar ou la seiche. Le passage de la chitine au chitosane se fait par désacétylation, c’est-à-dire par hydrolyse alcaline des groupements acétyle pour générer des groupements amine primaire. Le chitosane est un polymère biodégradable et biocompatible, présentant des propriétés bactériostatiques et fongistatiques.

[0034] Par « gel », on entend un réseau polymère non fluide qui est gonflé par un solvant. Le réseau polymère est un réseau constitué de chaînes polymères réticulées. Les interactions responsables de la réticulation des polymères peuvent être physiques ou chimiques. De manière avantageuse, dans le cadre de l’invention, les gels sont constitués exclusivement de chitosane A, de copolysaccharide B, et, éventuellement, d’eau et/ou d’un ingrédient pharmaceutique actif.

[0035] Par « hydrogel », on entend un matériau visco-élastique comportant au moins 60% en masse d’eau, et de préférence, au moins 80% en masse d'eau. L’hydrogel selon l’invention contient, en général, de 0,1% à 40% et, de préférence de 0,5 à 20% en masse du mélange de chitosane A et de copolysaccharide B.

[0036] Dans le cadre de l’invention, l’hydrogel est dit physique, car les interactions responsables de la réticulation inter-chaînes donnant sa cohésion à l’hydrogel sont de type physique, et sont notamment des liaisons hydrogène et/ou des interactions hydrophobes, par opposition à un hydrogel dit chimique (nommé également hydrogel réticulé), dans lequel les interactions inter-chaînes sont de type liaison covalente. Aucun agent de réticulation chimique n’est présent dans un hydrogel purement physique. De manière avantageuse, dans le cadre de l’invention, les hydrogels physiques sont constitués exclusivement d’eau, de chitosane A, de copolysaccharide B, et éventuellement d’un ingrédient pharmaceutique actif, et contiennent, de préférence, plus de 80% (m/m) d’eau. En particulier, de tels hydrogels ne comportent ni collagène, ni polycaprolactone, ni agent de réticulation chimique toxique (du type glutaraldéhyde, formaldéhyde, épichlorhydrine, etc.). Le fait d’avoir un hydrogel physique présente des avantages car un hydrogel chimique est faiblement résorbable du fait de la stabilité des liaisons covalentes, alors que l’hydrogel physique de chitosane A et de copolysaccharide B selon la présente invention est résorbable en milieu physiologique, en particulier en conditions légèrement acide.

[0037] Par « xérogel », on entend un matériau obtenu par séchage, notamment séchage d’un hydrogel, comportant moins de 60% en masse d’eau, de préférence, moins de 50% en masse d'eau et plus préférentiellement, moins de 20% d’eau. Le xérogel selon l’invention contient, en général, au moins 40% en masse du mélange de chitosane A et de copolysaccharide B, de préférence entre 40 et 100%, préférentiellement entre 50 et 99,9% du mélange, et plus préférentiellement entre 80 et 99,5% du mélange.

[0038] Par « aérogel », on entend un matériau semblable structuralement à un hydrogel mais dont l’eau a été remplacé par du gaz par un procédé évitant l’impact des forces capillaires du solvant sur le matériau (cf. Mike Robitzer, Laurent David, Cyrille Rochas, Francesco Di Renzo and Françoise Quignard Nanostructure of calcium alginate aerogels obtained from multistep solvent exchange route, Langmuir 2008, 24, 12547- 12552, et Mike Robitzer, Laurent David, Cyrille Rochas, Francesco Di Renzo and Françoise Quignard, Supercritically-dried alginate aerogels retain the fibrillar structure of the hydrogels, Macromol. Symp. 2008, 273, 80-84).

[0039] Dans le cadre de l’invention, les masses molaires moyennes en masse Mw du chitosane A et du copolysaccharide B sont déterminées par chromatographie d’exclusion stérique, dont les conditions expérimentales sont décrites dans la publication «Physico-chemical studies of the gelation of chitosan in a hydroalcoholic medium » A. MONTEMBAULT, C. VITON, A. DOMARD, Biomaterials, 26(8), 933-943, 2005.

[0040] Le degré d'acétylation (DA) du chitosane A et du copolysaccharide B est déterminé en utilisant la technique de RMN du proton, en suivant la méthodologie d’Hirai (A. HIRAI, H ODANI, A. NAKAJIMA, Polymer Bulletin, 26 (1 ), 87-94, 1991 ).

[0041] Dans le cadre de l’invention, le taux de cristallinité représente la proportion de matière se trouvant à l’état cristallin. Pour les polysaccharides, il est souvent déterminé par diffraction X (Alexander, L. E., 'X-ray Diffraction Methods in Polymer Science', Wiley- Interscience, New York, 1969, p. 137) car de nombreux polysaccharides se dégradent à des températures inférieures à la température de fusion de la phase cristalline, ce qui ne permet pas l’utilisation de la calorimétrie différentielle à balayage. C’est donc cette méthode qui est à considérer dans la cadre de l’invention. D’autres méthodes spectroscopiques sont possibles mais doivent être adaptées dans chaque cas (Spectrométrie Infra-Rouge à Transformée de Fourier, Spectroscopie Raman). La détermination de la densité par une colonne à gradient permet en principe de calculer le taux de cristallinité connaissant la densité de la phase amorphe et de la phase cristalline du polymère, mais de nombreux polysaccharides peuvent gonfler et absorber les solvants utilisés pour les colonnes à gradient de densité, ce qui limite là encore l’utilisation de cette méthode.

[0042] Dans le cadre de l’invention, la taille des cristallites peut être déterminée par l’étude de la largeur des pics de diffraction obtenus par la méthode des poudres, en utilisant la relation de Laue-Scherrer (Alexander, L. E., 'X-ray Diffraction Methods in Polymer Science', Wiley-lnterscience, New York, 1969, p. 137).

Description des modes de réalisation

[0043] L’invention concerne en premier lieu une composition comprenant : a. Au moins un chitosane A, et b. Au moins un copolysaccharide statistique B de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 100 kDa et 1000 kDa de formule I :

Formule I dans laquelle :

- chaque Rc représente indépendamment un groupement comportant un agent chélatant,

- chaque Z représente indépendamment un liant pouvant être une simple liaison ou une chaine hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaine pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisis parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes,

- x est compris entre 0,01 et 0,5,

- y est compris entre 0,05 et 0,5,

- le rapport y/x étant supérieur à 0,2, de préférence supérieur à 1 ,

- la somme x + y étant supérieure à 0,1 , et moins de 10% des groupements comportant un agent chélatant de type Rc étant chélatés par un cation d’un élément de transition choisi parmi les éléments du bloc d et f, et c. éventuellement, de l’eau.

[0044] Selon un mode de réalisation, le ratio massique entre A et B (A :B) est compris entre 2 :1 et 1 :10, de préférence entre 1 :1 et 1 :5.

[0045] Cette composition peut comprendre, en outre, au moins un ingrédient pharmaceutique actif, de préférence choisi parmi les anticancéreux, les antibactériens, les antifongiques, les anti-inflammatoires, les ARN messagers, les protéines, et les antigènes.

[0046] Par ingrédient pharmaceutique actif, on entend tout composé ayant un effet thérapeutique ou préventif. Le fait que cette composition ait de bonnes propriétés de gonflement permet de capter puis de relarguer efficacement les ingrédients pharmaceutiques actifs. Il est en effet possible de mettre en contact la composition avec l’ingrédient pharmaceutique actif, par exemple avec une solution comprenant l’ingrédient pharmaceutique actif, et la composition capte alors cet ingrédient. Ensuite, cet ingrédient peut être relargué, par exemple en plongeant la composition dans un autre milieu. Cela se produit avantageusement lorsque la composition est sous forme de gel.

[0047] La composition peut être sous plusieurs formes : solution aqueuse, lyophilisât ou gel.

[0048] Selon un mode de réalisation, la composition est une solution aqueuse, de préférence comprenant au moins 10 g/L, de préférence au moins 50 g/L, du mélange de chitosane A et de copolysaccharide B. Lorsque la composition est sous forme de solution aqueuse, la composition peut être injectable. La concentration du mélange de chitosane A et de copolysaccharide B peut être comprise entre 10 g/L et 500 g/L, de préférence entre 40 g/L et 160 g/L.

[0049] La solution aqueuse peut avoir une viscosité Newtonienne comprise entre 0.1 et 50000 Pa.s, de préférence comprise entre 50 et 25000 Pa.s, et plus préférentiellement comprise entre 100 et 10000 Pa.s.

[0050] La solution aqueuse est une solution gélifiable. Elle peut se gélifier lorsqu’elle est mise en contact avec un bain de coagulation à pH basique. La gélification a lieu à pH basique après neutralisation des amines (NH ₂ ) initialement protonées (NH ₃ ⁺ ) présentes dans la solution. L’état d’enchevêtrement des chaînes résultant de la forte viscosité initiale est figé par la formation de sites d’interactions interchaines (cristallites, interactions hydrophobes, interactions par liaisons hydrogène) et assure ainsi l’obtention d’un hydrogel physique stable et de propriétés mécaniques suffisantes pour être manipulé ou étiré. Les hydrogels résultants sont réversibles par un traitement en solution acide et se dissocient des hydrogels chimiques où la gélification est assurée par la formation de liaisons chimiques covalentes irréversibles. Ils peuvent être séchés et réhydratés de manière réversible. La solution peut également être lyophilisée.

[0051] La composition peut également être sous la forme d’un lyophilisât ou d’un gel, de préférence sous forme d’un hydrogel, d’un xérogel ou d’un aérogel.

[0052] L’hydrogel selon l’invention peut contenir de 0,1% à 40% et, de préférence de 0,5 à 20% en masse du mélange de chitosane A et de copolysaccharide B.

[0053] Le xérogel selon l’invention peut contenir au moins 40% en masse du mélange de chitosane A et de copolysaccharide B, de préférence entre 40 et 100%, préférentiellement entre 50 et 99,9% du mélange, et plus préférentiellement entre 80 et 99,5% du mélange. Lorsque la composition est sous forme de xérogel, le xérogel peut être issu du séchage, au moins partiel, d’un hydrogel.

[0054] Le xérogel, lorsqu’il est en contact d’un milieu aqueux ou d’un tissu biologique pendant une période d’au moins 1 heure, gonfle pour former un hydrogel, ledit hydrogel ayant un volume au moins 2 fois plus important, de préférence au moins 5 fois plus important, que le volume de xérogel de référence avant contact avec le milieu aqueux ou le tissu biologique. Le gonflement peut être quantifié en mesurant la masse du xérogel initial et la masse de l’hydrogel obtenu.

[0055] Un tissu biologique est un ensemble de cellules différenciées ou non, organisées selon une architecture caractéristique, en association avec un réseau de macromolécules naturelles ou matrice extracellulaire (MEC) et concourant à exercer une même fonction. Le tissu cellulaire est naturellement hydraté, ce qui permet le gonflement du xérogel.

[0056] L’hydrogel obtenu par réhydratation d’un xérogel peut ensuite être à nouveau séché pour reformer un xérogel. Il est possible d’effectuer plusieurs cycles de séchage- gonflage avec cette composition.

[0057] Les gels selon l’invention possèdent de bonnes propriétés mécaniques. Il est ainsi possible d’en faire des fils, par exemple en extrudant la composition selon l’invention à travers une filière dans un bain de coagulation. Ces fils peuvent ensuite être utilisés pour préparer un matériau textile. Le fil peut avoir un diamètre compris entre 50 pm et 700 pm, de préférence entre 80 pm et 500 pm. [0058] La composition selon l’invention, et en particulier, les fils et/ou les matériaux textiles, peuvent être utilisés dans les dispositifs médicaux, grâce à leurs bonnes propriétés de gonflement et de captation des métaux. Avantageusement, les fils et/ou les matériaux textiles peuvent être dégradés par l’organisme ou explantés pour éliminer les métaux chelatés.

[0059] Le dispositif médical en question est de préférence un pansement, un implant ou un produit de comblement dermique. Selon un mode de réalisation, le dispositif médical comprend un fil et/ou un matériau textile selon l’invention.

[0060] Dans le cas d’un produit de comblement dermique, celui-ci peut être sous forme de fil, de préférence ledit fil étant sous forme de xérogel qui peut gonfler au contact d’un milieu aqueux ou d’un tissu biologique pour former un hydrogel. Le produit de comblement dermique peut également être une solution selon l’invention qui peut alors être injectée.

[0061] Les bonnes propriétés de captation des métaux de la composition permettent de l’utiliser pour la captation d’au moins un métal dans le traitement ou la prévention de l’endométriose, des infections fongiques, des infections bactériennes, des plaies chroniques (escarres, plaies diabétiques) des maladies neurodégénératives (maladie de Parkinson, Maladie d’Alzheimer,...), de l’hémochromatose, de la maladie de Wilson, ou du saturnisme. Le métal est de préférence un cation métallique. Selon un mode de réalisation, le métal appartient au groupe constitué du cuivre, du fer, du plomb, du zinc, de l’aluminium, du gadolinium et du manganèse et de manière plus préférentielle, dans le groupe constitué du cuivre, du fer et du plomb.

[0062] L’invention concerne également l’utilisation de la composition selon l’invention pour la captation d’au moins un métal, éventuellement pour le traitement ou la prévention d’une maladie.

[0063] L’invention concerne également une méthode de traitement ou de prévention de l’endométriose, des infections fongiques, des infections bactériennes, des plaies chroniques (escarres, plaies diabétiques) des maladies neurodégénératives (maladie de Parkinson, Maladie d’Alzheimer,...), de l’hémochromatose, de la maladie de Wilson, ou du saturnisme, ladite méthode comprenant l’utilisation de la composition selon l’invention pour la captation d’au moins un métal.

Procédé de préparation de la composition

[0064] L’invention concerne également un procédé de préparation d’une composition selon l’invention comprenant les étapes suivantes :

1 ) dispersion du chitosane A et du copolysaccharide statistique B de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 10OkDa et 10OOkDa de formule I dans de l’eau,

2) ajout d’un acide, de préférence de l’acide acétique,

3) mélange puis centrifugation de la solution obtenue pour récupérer une solution comprenant la composition,

4) éventuellement, traitement de la solution obtenue à l’étape 3 dans un bain aqueux basique pour obtenir la composition sous forme d’un gel, et

5) éventuellement, lavage, séchage et/ou stérilisation du gel obtenu à l’étape 4, de préférence par autoclave.

[0065] De préférence, l’acide est ajouté en proportion stoechiométrique par rapport aux fonctions de type amine primaire non fonctionnalisées du chitosane A et du copolysaccharide B. L’acide est de préférence organique.

[0066] La solution comprenant la composition a de préférence une viscosité comprise entre 0.1 et 50000 Pa.s.

[0067] Le bain aqueux basique à l’étape 4 est un bain de coagulation qui permet la gélification de la solution. Ce bain de coagulation est de préférence une solution alcaline, par exemple de soude, d’ammoniaque ou de potasse, à une concentration pouvant être comprise entre 0,5 et 10 M, de préférence entre 1 et 5 M. Le bain de coagulation peut également être une chambre de coagulation où des vapeurs alcalines sont utilisées, comme des vapeurs d’ammoniac.

[0068] Pour obtenir un fil, il est possible, lors de l’étape 4, d’extruder la composition selon l’invention à travers une filière (ou cône d’extrusion). L’extrudât est ensuite introduit dans le bain de coagulation. Il est également possible d’extruder directement la composition dans le bain de coagulation.

[0069] L’étape 5 peut comprendre une ou plusieurs étapes de lavage, le lavage pouvant être effectué à l’eau ou avec un tampon.

[0070] L’étape 5 peut également comprendre une ou plusieurs étapes d’échange de solvant, par exemple pour remplacer l’eau par de l’éthanol.

[0071] L’étape 5 peut comprendre une ou plusieurs étapes de séchage. Le séchage à l’étape 5 peut être effectué à l’air libre, à température ambiante, ou à une température comprise entre 30 et 250°C, par exemple sous air chaud à une température comprise entre 100 et 200°C. Selon un mode de réalisation, le séchage est effectué après échange de l’eau avec l’éthanol par bains successifs progressivement concentrés en alcool, puis après échange de l’éthanol par du CO ₂ liquide dans une enceinte pressurisée, puis après détente en milieu du CO ₂ supercrititque, ce qui permet de former un aérogel. [0072] Toute technique de stérilisation bien connue de l’homme de l’art pourra être utilisée, notamment une stérilisation à la vapeur d'eau par autoclave, irradiation gamma ou béta.

Chitosane A

[0073] La composition selon l’invention comprend un chitosane A.

[0074] La composition peut avoir ;

- un taux de cristallinité ramené au chitosane A d’au moins 10% par rapport à la masse sèche totale de la composition, et

- une taille de cristallite du chitosane A de moins de 20 nm.

[0075] Le taux de cristallinité ramené au chitosane A peut être compris entre 10 et 25%. Les cristallites du chitosane A jouent le rôle de nœuds de réticulation physique indispensables à la constitution d’un gel. La taille des cristallites peut par exemple être comprise entre 1 et 20 nm.

[0076] Avantageusement, le chitosane A possède une masse moléculaire moyenne Mw comprise entre 100 kg/mol et 1000 kg/mol, de préférence entre 200 kg/mol et 700 kg/mol.

[0077] Selon un mode de réalisation préféré, le chitosane A possède un degré d’acétylation x inférieur à 40%, de préférence inférieur à 10%, par exemple compris entre 0% et 10%.

Copolysaccharide B

[0078] La composition comprend un copolysaccharide statistique B de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 100 kDa et 1000 kDa de formule I.

[0079] Il est entendu que, dans la formule I ci-dessus, plusieurs groupements Rc peuvent être présents dans le polysaccharide. Ces groupements Rc peuvent être identiques ou différents les uns des autres. Ils sont tous indépendamment choisis parmi les groupements portant un agent chélatant. Il en va de même des liants Z : plusieurs liants Z peuvent être présents, et ils peuvent être identiques ou différents les uns des autres.

[0080] Le copolysaccharide B peut être de formule II :

Formule II dans laquelle :

- Rci et RC ₂ sont différents, et sont des groupements comportant un agent chélatant, - Zi et Z ₂ , identiques ou différents, sont des liants pouvant être une simple liaison ou une chaine hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaine pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisis parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes,

- x est compris entre 0,01 et 0,5, de préférence entre 0,01 et 0,1 , et préférentiellement entre 0,05 et 0,1 ,

- y est compris entre 0,01 et 0,5, de préférence entre 0,05 et 0,2,

- z est compris entre 0 et 0,2, et moins de 10% des groupements comportant un agent chélatant de type Rc1 et Rc2 étant chélatés par un cation d’un élément de transition choisi parmi les éléments du bloc d et f.

[0081] On entend par groupement de type Rc, les groupements Rc dans le polysaccharide de formule I, et les groupements Rci et Rc ₂ , lorsque le groupement Rc ₂ est présent, dans le polysaccharide de formule II.

[0082] Selon un mode de réalisation, moins de 10% des groupements de type Rc, de préférence moins de 5%, sont chélatés par un cation, en particulier un cation métallique. Le fait que les groupements de type Rc soit sous forme libre, permet une bonne captation des métaux. Le copolysaccharide B présente également une grande hydrophilie, ce qui induit de bonnes propriétés de gonflement.

[0083] Conformément à l’invention, les groupements Rc, Rci et Rc ₂ sont des agents chélatants. En d’autres termes les groupements Rc, Rci et Rc ₂ permettent de chélater un ou plusieurs métaux en formant un complexe.

[0084] Chacun des groupements Rc, Rci et Rc ₂ peut contenir un ou plusieurs sites de coordination. De préférence, le site de coordination est un atome d’azote ou d’oxygène. De manière avantageuse, chacun des groupements Rc, Rci et Rc ₂ comporte entre 4 et 8 sites de coordination, de manière plus avantageuse entre 6 et 8 sites de coordination et de manière encore plus avantageuse chacun des groupements Rc, Rci et Rc ₂ comporte 8 sites de coordination.

[0085] On entend par site de coordination une unique fonction capable de se lier à un métal. Par exemple, une fonction amine représente un site de coordination par la formation d’une liaison dative entre l’atome d’azote et le métal et une fonction acide hydroxamique représente également un site de coordination par la formation d’une liaison dative entre l’oxygène du motif carbonyle et par une liaison covalente avec l’oxygène du motif bioxyde le site de coordination formant ainsi un cycle à cinq chainons.

[0086] Dans un mode de réalisation de l’invention, pour le polysaccharide de formule I, chaque groupement Rc est indépendamment choisi dans le groupe constitué du DOTA (acide 1 ,4,7,10-tétraazacyclododécane-N,N’,N”,N’”-téracé tique), NOTA (acide 1 ,4,7- triazacyclononane-1 ,4,7-triacétique), NODAGA (acide 1 ,4,7-triazacyclononane-1 - glutarique-4,7-acide diacétique), DOTAGA (acide 2-(4,7,10-tris(carboxymethyl)- 1 ,4,7,10-tétraazacyclododécan-1 -yl)pentanedioïque), DOTAM (1 ,4,7,10- tetrakis(carbamoylméthyl)-1 ,4,7,10 tétraazacyclododécane), NOTAM (1 ,4,7- tetrakis(carbamoylméthyl)-1 ,4,7-triazacyclononane), DOTP (1 ,4,7,10- tétraazacyclododécane 1 ,4,7,10-tétrakis(méthylène phosphonate), NOTP (1 ,4,7- tétrakis(méthylène phosphonate)-1 ,4,7-triazacyclononane), TETA (acide 1 ,4,8,1 1 - tétraazacyclotétradécane-N,N’,N”,N’”-téraacétiq ue), TETAM (1 ,4,8,1 1 - tétraazacyclotétradécane-N,N’,N”,N’”-tétrakis(ca rbamoyl méthyl), du DTPA (acide diéthylène triaminopentaacétique) et DFO (deferoxamine), de préférence dans le groupe constitué du DOTAGA, DFO, DOTAM et du DTPA et de manière plus préférée le groupement Rc est le DOTAGA.

[0087] Dans un mode de réalisation de l’invention, pour le polysaccharide de formule II, Rci et RC ₂ sont indépendamment choisis dans le groupe constitué du DOTA, NOTA, NODAGA, DOTAGA, DOTAM, NOTAM, DOTP, NOTP, TETA, TETAM, du DTPA et DFO, de préférence dans le groupe constitué du DOTAGA, DFO, DOTAM et du DTPA.

[0088] Selon un mode de réalisation, pour le polysaccharide de formule II, le groupement Rci est le DOTAGA, et de préférence, z=0.

[0089] Selon un mode de réalisation, pour le polysaccharide de formule II, le groupement Rci est le DOTAGA et le groupement Rc ₂ est le DFO

[0090] On entend par liant de type Z, les liants Z dans le polysaccharide de formule I, et les liants Zi et Z ₂ , lorsque le liant Z ₂ est présent, dans le polysaccharide de formule II.

[0091] Le choix des liants Z, Zi et Z ₂ dans les formules I et II dépend essentiellement des groupements Rc, Rci et Rc ₂ et du métal à chélater. En effet, pour des raisons stériques notamment, les groupements Rc, Rci et Rc ₂ peuvent être plus ou moins proche du cycle à 6 chainons de l’azote de l’unité glucosamine.

[0092] De préférence, dans la formule I, chaque Z est indépendamment une simple liaison ou une chaine hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaine pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisis parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes.

[0093] Selon un mode de réalisation, dans la formule I, chaque Z est indépendamment sélectionné dans le groupe constitué par : une liaison, une chaine alkyle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, et une chaine alcényle linéaire ou ramifiée comportant entre 2 et 12 atomes de carbone, lesdites chaînes alkyle et alcényle pouvant être interrompues par un ou plusieurs groupes aryle en C ₆ -Cio, et/ou par un ou plusieurs hétéroatomes ou groupes sélectionnés dans le groupe constitué par -O-, -S-, -C(O)-, -NR’-, -C(O)NR’-, -NR’-C(O)-, -NR’-C(O)-NR’-, -NR’-C(O)-O-, -O-C(O)NR’, -C(S)NR’-, -NR’-C(S)-, -NR’-C(S)-NR’ lesdites chaînes alkyle et alcényle pouvant être substituées par un ou plusieurs groupes sélectionnés dans le groupe constitué par les halogènes, -OR’, -COOR’, -SR’, -NR’ ₂ , chaque R’ est indépendamment H ou un alkyl en Ci-C ₆ .

[0094] Avantageusement, dans la formule I, chaque Z est indépendamment sélectionné dans le groupe constitué par : une liaison et une chaine alkyle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaine alkyle pouvant être interrompue par un ou plusieurs groupes aryle en C ₆ - Cio, et/ou par un ou plusieurs hétéroatomes ou groupes sélectionnés dans le groupe constitué par -O-, -S-, -C(O)-, -NR’-, -C(O)NR’-, -NR’-C(O)-, -C(S)NR’-, -NR’-C(S)-, - NR’-C(S)-NR’, chaque R’ est indépendamment H ou un alkyl en Ci-C ₆ ,

[0095] Dans un mode de réalisation particulier chaque Z est une chaine alkyle comportant entre 1 et 12 atomes de carbone.

[0096] Dans un autre mode de réalisation particulier, chaque Z est un segment polyéthylène glycol (PEG).

[0097] De préférence, dans la formule II, Zi et Z ₂ sont indépendamment une simple liaison ou une chaine hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaine pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisis parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes.

[0098] Selon un mode de réalisation, dans la formule II, Zi et Z ₂ sont indépendamment sélectionnés dans le groupe constitué par : une liaison, une chaine alkyle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, et une chaine alcényle linéaire ou ramifiée comportant entre 2 et 12 atomes de carbone, lesdites chaînes alkyle et alcényle pouvant être interrompues par un ou plusieurs groupes aryle en C ₆ -Cio, et/ou par un ou plusieurs hétéroatomes ou groupes sélectionnés dans le groupe constitué par -O-, -S-, -C(O)-, -NR’-, -C(O)NR’-, -NR’-C(O)-, -NR’-C(O)-NR’-, -NR’-C(O)-O-, -O-C(O)NR’, -C(S)NR’-, -NR’-C(S)-, -NR’-C(S)-NR’ lesdites chaînes alkyle et alcényle pouvant être substituées par un ou plusieurs groupes sélectionnés dans le groupe constitué par les halogènes, -OR’, -COOR’, -SR’, -NR’ ₂ , chaque R’ est indépendamment H ou un alkyl en Ci-C ₆ .

[0099] Avantageusement, dans la formule II, Zi et Z ₂ sont indépendamment sélectionnés dans le groupe constitué par : une liaison et une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne alkyle pouvant être interrompue par un ou plusieurs groupes aryle en C ₆ - Cio, et/ou par un ou plusieurs hétéroatomes ou groupes sélectionnés dans le groupe constitué par -O-, -S-, -C(O)-, -NR’-, -C(O)NR’-, -NR’-C(O)-, -C(S)NR’-, -NR’-C(S)-, - NR’-C(S)-NR’, chaque R’ est indépendamment H ou un alkyl en Ci-C ₆ ,

[0100] Dans un mode de réalisation particulier Zi et/ou Z ₂ est une chaîne alkyle comportant entre 1 et 12 atomes de carbone.

[0101] Dans un autre mode de réalisation particulier, Zi et/ou Z ₂ est un polyéthylène glycol (PEG).

[0102] Conformément à l’invention, z est compris entre 0 et 0,2. En d’autres termes les unités de type C peuvent être exclusivement des unités comportant comme liant Zi et comme groupement portant un agent chélatant Rci.

[0103] Le polysaccharide selon l’invention a une masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 100 kDa et 1000 kDa, de manière avantageuse, la masse moléculaire moyenne en poids du polysaccharide selon l’invention est comprise entre 200 kDa et 750 kDa, de manière plus avantageuse entre 250 kDa et 500 kDa et de manière encore plus avantageuse, entre 300 kDa et 400 kDa.

[0104] Selon un mode de réalisation, le copolysaccharide B est choisi parmi les polysaccharides suivants :

- copolysaccharide de formule II où y = 0,15, Rci est DOTAGA et Zi est une liaison;

- copolysaccharide de formule II où 0,05 < z < 0,06, Rci est DOTAGA et Zi est une liaison, et Rc ₂ est DFO et Z ₂ est sélectionné dans le groupe constitué par : une liaison et une chaine alkyle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaine alkyle pouvant être interrompue par un ou plusieurs groupes aryle en C ₆ - Cio, et/ou par un ou plusieurs hétéroatomes ou groupes sélectionnés dans le groupe constitué par -O-, -S-, -C(O)-, -NR’-, -C(O)NR’-, -NR’-C(O)-, -C(S)NR’-, -NR’-C(S)-, - NR’-C(S)-NR’, chaque R’ est indépendamment H ou un alkyl en Ci-C ₆ ,

[0105] Le copolysaccharide B peut être obtenu selon un procédé comprenant les trois étapes successives suivantes :

Etape 1 : solubilisation d’un chitosane dans une solution acide à un pH compris entre 4 et 5 ;

Etape 2 : acétylation partielle des fonctions amines du chitosane solubilisé en étape 1 (formation d'unités acétylées) ;

Etape 3 : fonctionnalisation d’au moins une partie des fonctions amines toujours présentes à l’issu de l’étape 2 (formation des unités comprenant le groupement Rc).

[0106] L’étape 3 peut être subdivisée en plusieurs sous étapes, notamment lorsque le liant Z est une chaine hydrocarbonée telle que définit précédemment.

[0107] Dans les modes de réalisations où le liant Z est une chaine hydrocarbonée telle que définit précédemment, l’étape 3 peut comprendre une sous étape 3-1 consistant à greffer ladite chaine hydrocarbonée sur au moins une partie des fonctions amines toujours présentes à l’issue de l’étape 2, puis une sous étape 3-2 consistant au greffage du groupement Rc sur ladite chaine hydrocarbonée. De manière alternative, l’étape 3 ne comporte pas de sous étape. Dans cette alternative, ladite chaine hydrocarbonée est couplée avec le groupement Rc préalablement à l’étape 3, ladite étape 3 est alors réalisée avec une molécule comprenant le groupement Rc et ladite chaine hydrocarbonée.

[0108] De manière alternative, le copolysaccharide B peut être obtenu à partir d’un chitosane présentant le taux d’acétylation souhaité, ainsi, dans ce mode de réalisation les unités acétylées sont déjà présentes et n’ont pas besoin d’être formées. Dans ce mode de réalisation, le procédé d’obtention du copolysaccharide B comporte au moins les deux étapes successives suivantes :

Etape 1 b : solubilisation d’un chitosane partiellement acétylé dans une solution acide à un pH compris entre 4 et 5 ;

Etape 2b : fonctionnalisation d’au moins une partie des fonctions amines dudit chitosane partiellement acétylé solubilisé à l’étape 1 b (formation des unités comprenant le groupement Rc).

[0109] De la même manière que précédemment pour ladite étape 3, ladite étape 2b peut être subdivisée en plusieurs sous étapes, notamment lorsque le liant Z est une chaine hydrocarbonée telle que définit précédemment. [0110] Dans les modes de réalisations où le liant Z est une chaine hydrocarbonée telle que définit précédemment, l’étape 2b peut comprendre une sous étape 2b-1 consistant à lier ladite chaine hydrocarbonée sur au moins une partie des fonctions amines, puis une sous étape 2b-2 consistant au greffage du groupement Rc sur ladite chaine hydrocarbonée. De manière alternative, l’étape 2b ne comporte pas de sous étape. Dans cette alternative, ladite chaine hydrocarbonée est couplée avec le groupement Rc préalablement à l’étape 2b, ladite étape 2b est alors réalisée avec une molécule comprenant le groupement Rc et ladite chaine hydrocarbonée.

Exemples

Matériels et méthodes

[0111] Plusieurs chitosane A et copolysaccharides B ont été utilisés pour préparer les compositions selon l’invention. Le tableau 1 récapitule les composés utilisés. Les synthèses des composés B1 et B2 sont présentées respectivement en exemple 1 et 2.

[0112] [Tableau 1]

[0113] Le degré d’acétylation (DA) des composés B1 et B2 est obtenu de la manière suivante : Les spectres RMN 1 H des produits à analyser sont obtenus à l'aide d'un spectromètre Avance III HD 400 MHz NanoBay de Bruker. La phase est corrigée manuellement à l'aide du pic d'eau situé à 4,7 ppm. L'intégration des pics se fait manuellement en intégrant le massif des pics entre 4,1 et 2,9 ppm et en intégrant le pic à 2,00 ppm entre 2,02 et 1 ,90 ppm. Le DA en pourcentage est directement obtenu en normalisant l’intégration du massif de pics à 200. [0114] Le degré de substitution en DOTAGA (DS) est obtenu de la manière suivante : Différents échantillons du produit à analyser sont obtenus par redispersion du produit lyophilisé dans un tampon acétate (0,1 M acide acétique et 0,1 M ammonium acétate) pour obtenir une concentration massique finale en polymère de 0,1%. Différents volumes d’une solution de nitrate de cuivre sont ajoutés afin d’obtenir des concentrations en cuivre dans chaque échantillon allant de 0 à 1 mM puis chaque échantillon est agité. L’absorbance des solutions résultantes est ensuite mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Visible Varian Cary® 50. La détermination du DS est réalisée en traçant l’absorbance à 295 nm (maximum d’absorption du DOTA-GA) en fonction de la concentration en cuivre, la rupture correspondant à la quantité de DOTAGA pour 1 g de produit.

[0115] La pureté des composés B1 et B2 est vérifiée de la façon suivante : Les chromatogrammes HPLC-SEC-UV des produits à analyser ont été enregistrés sur des échantillons à une concentration massique en polymère de 1% avec un système HPLC Shimadzu Prominence. La colonne SEC utilisée est une colonne PolySep-GFC-P 4000 et un tampon acétate est utilisée comme éluant (0,1 M acide acétique et 0,1 M ammonium acétate). La température de fonctionnement est de 30°C et la longueur d'onde d'absorption est de 295 nm. Le débit d'éluant est de 0,8 mL / min. La pureté du produit est vérifiée par intégration du pic du DOTA-GA libre sur l’intégration du pic du chitosane greffé avec du DOTA-GA.

Exemple 1 - Synthèse du MEX-CD2 (B1)

[0116] Le chitosane précurseur du polysaccharide MEX-CD2 (B1 ) est de qualité médicale et d’origine animale. Les masses molaires moyennes en poids et en nombre (respectivement M _w = 2,583.10 ⁵ g/mol, M _n = 1 ,323.10 ⁵ g/mol) ont été déterminées par chromatographie d'exclusion de taille couplée à des mesures d'indice de réfraction et de diffusion de la lumière laser multiangle. Le degré d'acétylation (proportion d’unité N- acétyl-D-glucosamine) d'un tel chitosane brut a été déterminé par spectroscopie RMN 1H par la méthode d’Hirai (Asako Hirai et al., Determination of degree of deacetylation of chitosan by 1 H NMR spectroscopy, Polymer Bulletin, 1991 , 26, 87-94) et est estimé à 6 ± 0,5%.

[0117] 60 g de chitosane sont introduits dans un réacteur de 10 L avec 4 L d’eau ultra pure et 50 mL d’acide acétique, puis le mélange est placé sous agitation mécanique à 500 RPM. Après dissolution complète du chitosane (3h), 4L de 1 ,2-propanediol sont ajoutés au milieu et le mélange est maintenu sous agitation jusqu’à homogénéisation (2h). 120g de DOTA-GA anhydride sont ensuite introduits et le mélange est maintenu sous agitation pendant la nuit jusqu’à dissolution complète. Le produit de synthèse est ensuite purifié par filtration tangentielle à l’aide du dispositif Sartoflow® Advanced avec une cassette Sartocon® Slice PESU (membranes polyéthersulfone ; seuil de coupure : 100 kDa ; surface de filtration : 0,1 m ² ) selon un modèle de diafiltration-concentration contre 200L d’une solution d’acide acétique à 0,1 M puis 200L d’une solution d’acide acétique à 5 mM. La purification est suivie par une chromatographie d’exclusion de taille couplée à un détecteur UV jusqu’à obtenir moins de 5% de DOTA-GA libre. Le produit est ensuite lyophilisé et le degré d’acétylation (DA) et le degré de substitution (DS) sont déterminés respectivement par RMN ¹ H et par la méthode de chélation au cuivre décrite ci-dessus. La pureté a été vérifiée par HPLC comme mentionné ci-dessus.

Exemple 2 - Synthèse du MEX-CDDFO1 (B2)

[0118] Le chitosane précurseur du polysaccharide MEX-CDDFO1 (B2) est identique à celui décrit dans l’exemple 1 (M _w = 2,583.10 ⁵ g/mol, M _n = 1 ,323.10 ⁵ g/mol, DA=6±0,5%).

[0119] 60 g de chitosane, 4 L d’eau ultra-pure et 45 mL d’acide acétique glacial sont introduits dans un réacteur de 10 L et placés sous agitation pendant une durée de 16 heures à un pH de 4,5 ± 0,5. 1 ,2 L de propane-1 ,2-diol sont ajoutés à la solution et l’agitation est maintenue pendant 1 h. Une solution composée de 14 mL d’anhydride acétique dissous dans 600 mL de propane-1 ,2-diol est ensuite ajoutée lentement en 30 min, le milieu réactionnel est maintenu sous agitation pendant 4 h. 120 g de DOTA-GA anhydride sont ensuite pesés et ajoutés dans le réacteur puis 2 L de propane-1 , 2-diol sont ajoutés et l’agitation est maintenue pendant 16 h. A l’issu de la réaction, la solution est purifiée par filtration tangentielle en utilisant une membrane de 100 kDa. Le produit de synthèse est ensuite purifié par filtration tangentielle de la même façon que décrite dans l’exemple 1 , contre 200 L d’une solution d’acide acétique à 0,1 M puis 200 L d’eau ultra pure. La purification est suivie par chromatographie d’exclusion de taille couplée à un détecteur UV jusqu’à obtenir moins de 5 % de DOTA-GA libre. Le produit est ensuite lyophilisé à une concentration de 7 g/L et le degré d’acétylation (DA) et le degré de substitution (DS) sont déterminés respectivement par RMN ¹ H et par la méthode de chélation au cuivre décrite précédemment.

[0120] Un volume de 720 mL de chitosane-DOTAGA purifié à une concentration de 7 g/L est introduit dans un ballon de 2 L. Cette solution (pH entre 6 et 6,5) est complétée avec de l’eau ultra-pure pour atteindre un volume total de 900 mL. En parallèle, 143,1 mg de p-NCS-Bz-DFO sont pesés et dissous dans 100 mL de DMSO. Cette solution est ensuite ajoutée goutte à goutte à la solution de chitosane-DOTAGA. La solution est maintenue sous agitation et chauffée à 40°C pendant une nuit. 500 mL de cette solution sont dilués jusqu’à 5 L avec de l’eau ultra pure puis reconcentrée à 1 L par filtration tangentielle à l’aide du dispositif Sartoflow® Smart avec deux cassettes Sartocon® Slice PESU (membranes polyéthersulfone ; seuil de coupure : 100 kDa ; surface de filtration : 0,02 m ² ). La filtration est poursuivie à concentration constante contre 4L d’eau ultra pure puis la solution est reconcentrée à 500 mL.

[0121] L’analyse HPLC-SEC-UV du produit permet de confirmer le greffage du DFO et l’élimination du p-NCS-Bz-DFO résiduel. La comparaison des analyses HPLC-SEC-UV du chitosane-DOTAGA et du chitosane-DOTAGA-DFO montre une augmentation de l’absorption du pic polymère (autour de 7 min) lorsque le p-NCS-Bz-DFO est greffé.

[0122] Dans le cas du MEX-CDDFO1 (B2), la méthode de chélation au cuivre a été appliquée sur le produit avant fonctionnalisation avec le DFO et a permis de déterminer un DS en DOTAGA de 8,6%. Une méthode analogue à celle de la chélation au cuivre a permis de déterminer le DS en DFO. Des concentrations croissantes de fer (III) sont ajoutées à une solution de MEX-CDDFO1 (B2) à 0,1 g/L dans un tampon acétate à pH 4,5 (0,1 M ammonium acétate et 0,1 M acide acétique). L’absorption mesurée à 425 nm (Àmax du complexe [Fe(n ⁶ -DFO)]) est ensuite tracée en fonction de la concentration en fer et la concentration de fer correspondant à la rupture de pente permet d’obtenir le DS. Cette méthode permet d’estimer le DS du MEX-CDDFO1 (B2) à 0,7%.

[0123] L’analyse RMN ¹ H du produit intermédiaire (N-DOTAGA chitosane) selon la méthode décrite précédemment a permis de déterminer un DA de 26%. L’analyse RMN 1H du MEX-CDDFO1 (B2) révèle la présence d’un pic à 7,3 ppm caractéristique des protons d’un benzène substitué. Le spectre RMN du produit présente également des pics identiques entre 1 ,1 et 1 ,7 ppm à ceux de la déferoxamine mésylate seul qui confirme le greffage effectif du DFO sur le N-DOTAGA chitosane après purification.

Exemple 3 - Synthèse du MEX-CDFO (B3)

[0124] Le chitosane précurseur du polysaccharide MEX-CDFO est identique à celui décrit dans l’exemple 1 (Mw = 2,583.105 g/mol, Mn = 1 ,323.105 g/mol, DA = 6±0,5%). Pour 2,5 g de chitosane, 170 mL d’eau ultra-pure et 2,25 mL d’acide acétique glacial sont introduits dans un réacteur de 1 L et placés sous agitation jusqu’à dissolution totale du chitosane. 50 mL de propane-1 ,2-diol sont ajoutés à la solution. Une solution composée de 785 pL d’anhydride acétique dissous dans 25 mL de propane-1 , 2-diol est ensuite ajoutée lentement, le milieu réactionnel est maintenu sous agitation pendant 4 h. 40 mL d’eau ultra-pure et 43 ml d’une solution de NaOH à 1 M sont ajoutés pour obtenir une solution entre pH 5,5 et 6,5. Un volume de 75 mL de propane-1 , 2-diol et 35 mL de DMSO sont ajoutés. Simultanément 576 mg de p-NCS- Bz-DFO sont pesés et dissous dans 57,6 mL de DMSO. Cette solution est ajoutée à une vitesse de 150 pL/min. Pendant l’ajout du DFO, 3,1 mL de HCl à 1 M sont aussi ajoutés à une vitesse de 8 pL/min. La solution est maintenue sous agitation et chauffée à 40°C pendant une nuit. 250 mL de cette solution sont dilués par 5 dans l’acide acétique 0,1 M puis elle est reconcentrée à 500 mL par filtration tangentielle à l’aide du dispositif Sartoflow® Smart avec deux cassettes Sartocon® Slice PESU (membranes polyéthersulfone ; seuil de coupure : 100 kDa ; surface de filtration : 0,02 m ² ). La filtration est poursuivie à concentration constante contre 5 L d’acide acétique et 2,5 L d’eau ultra pure puis la solution est reconcentrée à 250 mL.

[0125] Dans le cas du MEX-CDFO (B3), la méthode de chélation au fer expliquée préalablement est aussi utilisée dans le but d’estimer le DS. Cette méthode permet d’estimer le DS du MEXCDFO (B3) à 3%.

[0126] L’analyse RMN 1 H permet de confirmer le greffage du DFO et le DS grâce aux pics caractéristiques du DFO. Selon le spectre RMN le DS est égal à 2,9%. Également il est possible de déterminer le DA avec ce même spectre. Le DA retrouver est de 41%.

Exemple 4 - Compositions selon l’invention (Solutions aqueuses)

[0127] Différentes compositions selon l’invention ont été préparées. Un chitosane A non fonctionnalisé de faible DA pouvant être de 250 kDa ou de 650 kDa est mélangé avec un copolysaccharide B selon un rapport o/ % où a est la concentration massique du chitosane A et 0 la concentration massique du copolysaccharide B dans la formulation considérée (Tableau 2). Différentes quantités de chitosane A (a) et de copolysaccharide B (P) sous forme lyophilisée sont introduites dans un réacteur de 50 mL et sont redispersées sous faible agitation dans un volume d’eau adéquat. De l’acide acétique est ajouté en proportion stoechiométrique par rapport aux fonctions amines primaires non fonctionnalisées présentes dans le milieu. Le mélange est laissé sous agitation jusqu’à solubilisation complète du produit.

[0128] À titre d’exemple, la préparation de la composition 10 selon l’invention (HG-5-10) se déroule de la manière suivante : 3,0 g de B1 (MEX-CD2) et 1 ,5 g de chitosane A1 sont dispersés dans 28,93 mL d’eau ultra pure et 1 ,07 mL d’acide acétique ultra pure sont ajoutés sous agitation mécanique à 100RPM dans un réacteur de 50 mL. Le mélange est laissé sous agitation pendant 24h jusqu’à dissolution complète et homogénéisation du milieu.

[0129] Les différentes compositions et leurs préparations sont présentées dans le tableau 2.

[0130] [Tableau 2]

[0131] La solution obtenue est récupérée et introduite dans un doseur de fluide adapté, puis centrifugée à 4000 RPM pendant 10 minutes pour obtenir une solution sans bulles d’air comprenant la composition. Les viscosités newtoniennes de chaque solution ont été déterminées à l’aide d’un rhéomètre AR200 de chez TA Instruments. Chaque solution obtenue a également été testée pour savoir s’il est possible de produire un gel et/ou un fil. Les résultats sont présentés ci-dessous (Tableau 3).

[0132] [Tableau 3]

[0133] Ces résultats montrent que, contrairement à la composition selon l’invention, lorsque la composition comprend uniquement le copolysaccharide B, il n’est pas possible de gélifier la solution ou de produire des fils. Cependant, l’ajout d’un copolysaccharide B à un chitosane A permet d’obtenir une solution gélifiable et, dans certains cas, de baisser la viscosité de la solution résultante (cf. compositions comparative 2 et 3 et composition 9, et composition comparative 4 et composition 13), ce qui contribue à une meilleure maniabilité de la solution et permet un meilleur filage.

Exemple 5 - Compositions selon l’invention (Gels)

[0134] Plusieurs hydrogels ont été obtenus par gélification de solutions obtenues à l’exemple 3. La gélification de la solution se produit après immersion dans un bain de soude à 3 mol/L. Les hydrogels obtenus selon l’invention sont caractérisés d’hydrogels physiques où la gélification à lieu à pH basique après neutralisation des amines (NH ₂ ) initialement protonée (NH ₃ ⁺ ) présentent dans la solution. L’état d’enchevêtrement des chaînes résultant de la forte viscosité initiale est figé par la formation des nœuds d’interactions physiques interchaînes et assure ainsi l’obtention d’un hydrogel physique stable et de propriétés mécaniques suffisantes pour être manipulé ou étiré. Les hydrogels résultants sont réversibles par un traitement en solution acide et se dissocient des hydrogels chimiques où la gélification est assurée par la formation de liaisons chimiques covalentes irréversibles. Ils peuvent être séchés et réhydratés de manière réversible.

[0135] Obtention d’hydroqels sous forme de disque

[0136] Après centrifugation, les compositions 9 à 12 selon l’invention sont introduites dans un moule en PVC dont les dimensions sont soit 0=1 cm et h=2mm ou 0=3cm et h=2,5mm. Après que la solution se soit étalée uniformément, le moule contenant la solution est introduit dans un bain de soude (NaOH) à 3 mol/L pendant 1 h30. Le disque d’hydrogel alors formé est retiré du moule et introduit dans un bain d’eau pendant 30 minutes. Le disque est ensuite rincé une deuxième fois dans un autre bain d’eau ultra pure pendant 30 minutes. L’hydrogel est ensuite rincé dans un tampon phosphate à pH=7,4 pendant 24 heures. Il est ensuite introduit avec du tampon phosphate dans un flacon en verre et stérilisé pendant 20 minutes à 121 °C dans un autoclave. Les hydrogels obtenus sous forme de disque sont présentés en figure 1 .

[0137] Obtention d’hydroqel sous forme de cylindre

[0138] Après centrifugation, la composition comparative 2 et la composition 10 selon l’invention sont connectées à un système d’air comprimé (Nordson Ultimus™) permettant l’extrusion de la solution. Un tube d’extrusion de 5 mm de diamètre est adapté à la seringue du dispenseur et la solution est extrudée directement dans un bain de soude à 3 mol/L. La pression d’extrusion est adaptée à la viscosité initiale de la solution de précurseur et est comprise entre 1 et 3 bars. L’hydrogel ainsi formé est laissé immergé dans le bain de soude pendant 1 h30. Le cylindre est retiré et introduit dans un bain d’eau ultra pure pendant 30 minutes. Le tube est ensuite rincé une deuxième fois dans un autre bain d’eau ultra pure pendant 30 minutes. L’hydrogel est ensuite rincé dans un tampon phosphate à pH 7,4 pendant 24 heures. Il est enfin introduit avec du tampon phosphate dans un flacon en verre et stérilisé pendant 20 minutes à 121 °C dans un autoclave. Les hydrogels obtenus sous forme de cylindre sont présentés en figure 2 et 3.

[0139] L’hydrogel obtenu à partir de chitosane A seul est d’aspect blanc opaque et relativement rigide à la manipulation. Plus l’hydrogel est chargé en copolysaccharide B, plus ce dernier apparaît transparent avec un effet Tyndall moins prononcé traduisant une meilleure homogénéité de la structure à l’échelle microscopique.

Exemple 6 - Compositions selon l’invention (Fils)

[0140] Des fils comprenant la composition selon l’invention sont obtenus de la façon suivante : certaines des solutions obtenues à l’exemple 3 sont introduites dans un dispenseur (ou doseur) de fluide adapté, puis centrifugées. Le dispenseur de fluide contenant la solution est ensuite connecté à un système d’air comprimé. Un cône d’extrusion pouvant être de 254 pm, de 406 pm, ou de 584 pm est équipé au dispenseur puis la solution est extrudée sous une pression constante pouvant aller de 150 kPa à 400 kPa dans un bain de soude concentrée à 3 mol/L. L’hydrogel obtenu est neutralisé dans deux bains d’eau puis séché à une température pouvant aller de 100°C à 200°C à l’aide d’une souffleuse d’air thermo régulée. Le fil sec est récupéré et enroulé dans des bobines. [0141] À titre d’exemple, la préparation de fil à partir de la composition 10 selon l’invention se déroule de la manière suivante : 3,0 g de copolysaccharide B1 et 1 ,5 g de chitosane A1 sont dispersés dans 28,93 mL d’eau ultra pure et 1 ,07 mL d’acide acétique ultra pur sous faible agitation mécanique à 100 RPM dans un réacteur de 50 mL. Le mélange est laissé sous agitation pendant 24 h jusqu’à dissolution complète et homogénéisation du milieu. La solution obtenue est récupérée et introduite dans un dispenseur de fluide adapté, puis centrifugée à 4000 RPM pendant 10 minutes. Le dispenseur de fluide contenant la solution est ensuite connecté à un système d’air comprimé et un cône d’extrusion de 406 pm est équipé au système. Une pression constante de 200 kPa est délivrée jusqu’à extrusion complète de la solution de départ. La solution est extrudée directement dans un bain de soude à 3 mol/L et gélifiée directement pour former un hydrogel. L’hydrogel obtenu sous forme de cylindre fin est entraîné dans un circuit de bobine et est neutralisé successivement dans deux bains d’eau ultra pure contenant chacun 5L d’eau. L’hydrogel est ensuite séché sous air chaud à 150°C à l’aide d’une souffleuse d’air thermorégulée. Le fil obtenu après séchage est enroulé sur une bobine située à la fin du circuit de filage. Le fil obtenu est présenté en figure 4 et 5. Ces figures montrent qu’il est possible de faire des nœuds et de tresser plusieurs fils ensemble.

[0142] Le diamètre moyen des fils a été déterminé au microscope optique par mesure de différentes portions du fil. En moyenne, 5 portions du fils ont été étudiées afin d’établir un diamètre moyen le plus représentatif possible de la globalité de la structure. La masse linéique des différents fils a également été déterminée par pesée à la balance de précision de différentes longueurs de fils. Les propriétés mécaniques des fils obtenus ont été déterminées par essais de traction à l’aide d’un système Shimadzu Autograph AG-X plus. En moyenne, cinq essais de traction sont réalisés sur chaque fil afin de vérifier la répétabilité de chaque mesure. Les résultats sont présentés dans le tableau 4.

[0143] [Tableau 4]

[0144] Ces résultats montrent que les fils selon l’invention présentent des propriétés mécaniques satisfaisantes et comparables à celles des fils de chitosane A seul. En particulier, les fils selon l’invention présentent des propriétés mécaniques adaptées pour une mise en forme des fils par tressage de plusieurs fils ou par tissage ou tricotage.

Exemple 7 - Etude du gonflement des fils et des gels selon l’invention

[0145] Les gels et fils selon l’invention décrits dans les sections précédentes présentent tous des capacités de gonflement unique en présence de fluides aqueux. Dans un premier temps, la capacité et la cinétique de séchage et de gonflement des gels ont été déterminées en fonction de la formulation initiale. Après neutralisation du pH des hydrogels par rinçage successif, le gel est laissé à l’air libre pendant 1 semaine jusqu’à séchage complet en xérogel. La masse de l’hydrogel a été mesurée à la balance de précision avant séchage et à intervalle de temps régulier durant le séchage. La cinétique de séchage des hydrogels est répertoriée dans le Tableau 6. Le chitosane A étant plus hydrophobe que les copolysaccharides B, la vitesse de séchage est plus lente lorsque la quantité de copolysaccharide B contenue dans le gel est élevée. Ainsi, le gel référence de chitosane A seul (composition comparative 2) atteint une masse stable au bout de 30 heures, la composition 9 selon l’invention (HG-5-5) au bout de 52 heures, la composition 12 selon l’invention (HG-8-8) au bout de 72h, et les compositions 10 et 11 selon l’invention (HG-5-10 et HG-5-15) au bout de 144 heures.

[0146] [Tableau 5]

[0147] Les xérogels ont ensuite été immergés dans de l’eau ultra pure pendant 48 heures jusqu’à hydratation complète des gels. La masse de chaque gel a été précisément mesurée avant hydratation et à intervalle de temps régulier durant le test de gonflement. La cinétique de gonflement des gels est retranscrite dans le Tableau 6. De la même façon que pour l’étape de séchage, l’hydrophobicité du gel de référence à base de chitosane A seul entraine une réhydratation limitée du gel. Ainsi un faible gonflement maximal du gel obtenu à partir de la composition comparative 2 (Ref HG-8-0), de l’ordre de 2 fois son volume initial, est observé au bout de 6 heures. D’un autre côté, on observe une forte augmentation de la capacité de gonflement des gels selon l’invention, en fonction de la quantité de copolysaccharide B présent dans la formulation, allant jusqu’à plus de 22 fois son volume initial pour la composition 1 1 selon l’invention (HG-5-15) au bout de 30 heures.

[0148] Les gels avant et après hydratation sont présentés en figure 6 et 7 (composition 11 selon l’invention).

[0149] [Tableau 6]

[0150] La capacité de gonflement des fils selon l’invention a également été évaluée lors de leur réhydratation par immersion dans un bain d’eau ultra pure. De la même façon que pour les hydrogels massifs, des fils selon l’invention ont été découpés puis immergés dans de l’eau ultra pure pendant 15 minutes. La masse initiale de chaque fil, ainsi que la masse du fil à intervalle de temps régulier a été mesurée à l’aide d’une balance de précision. La cinétique de gonflement pour les fils est retranscrite dans le Tableau 7. On note une légère différence de gonflement pour une formulation donnée en fonction du diamètre du fil initial. À formulation identique, les valeurs de gonflement obtenues à partir des fils sont relativement similaires à celles obtenues avec les hydrogels. De la même façon que pour les hydrogels, le fil de référence à base de chitosane A (composition comparative 2, Ref HG-8-0) présente un faible gonflement maximal de l’ordre de 2 fois son volume initial au bout de 15 minutes. Le fil obtenu avec la composition 11 selon l’invention (HG-5-15) contenant le plus de copolysaccharide B présente une capacité de gonflement équivalente à l’hydrogel de même formulation allant jusqu’à 21 fois son volume initial au bout de 15 minutes d’immersion. Contrairement aux hydrogels, la réhydratation observée avec les fils est très rapide et découle d’un ratio surface / volume beaucoup plus élevé pour les fils que pour les hydrogels massifs. Une observation microscopique du phénomène de gonflement des fils a également été réalisée en immergeant pendant 5 minutes une partie d’un fil obtenu avec la composition 11 selon l’invention (HG-5-15) dans de l’eau ultra pure. De la même façon, l’influence d’une goutte d’eau déposée sur une portion de fil a été observée. Les fils sont présentés en figure 8 et 9.

[0151] Ces résultats nous montrent que les compositions selon l’invention ont une capacité de gonflement beaucoup plus élevées que les fils avec seulement le chitosane A.

[0152] [Tableau 7]

[0153] Une expérience a été conduite sur un disque d’hydrogel selon l’invention pour évaluer l’influence de plusieurs cycles de séchage-gonflage sur les capacités d’hydratation et de déshydratation de l’hydrogel. Une solution de la composition 11 selon l’invention (HG-5-15) a été formulée puis gélifiée dans un moule de dimension 0=3cm et h=2,5mm pour obtenir un hydrogel sous forme de disque dont la masse a été mesuré précisément à la balance de précision. L’hydrogel est ensuite rincé comme décrit précédemment puis laisser sécher pendant 1 semaine et pesé. Le xérogel est alors de nouveau hydraté et pesé après hydratation complète puis de nouveau séché pendant une semaine. Après une semaine le gel est pesé puis de nouveau immergé dans l’eau pendant 5 jours. Les valeurs obtenues sur plusieurs cycles sont retranscrites dans le tableau 8.

[0154] [Tableau 8]

[0155] Une faib e perte de masse liée à la diminution des capacités de gonflement et de séchage du gel semble graduellement se produire au fil des cycles d’hydratation et de déshydratation, mais reste très limitée. De même, une perte limitée de 14% des capacités de gonflement est observée après deux cycles complets d’hydratation et de déshydratation s’étalant sur deux semaines au total.

Exemple 8 - Etude de la capacité d’extraction métallique des fils selon l’invention

[0156] La capacité d’extraction en plomb, en cuivre, en cadmium et en fer de certains fils selon l’invention a été évaluée précisément par analyse ICP-MS après immersion des fils dans des solutions diluées de métaux. Dans un premier temps, une expérience a été conduite sur une solution métallique contenant trois cations métalliques (Cu ²⁺ , Pb ²⁺ , Cd ²⁺ ). 10 mL de solutions métalliques composés des trois métaux Cu, Pb et Cd à 0 ppb, 10 ppb et 100 ppb respectivement ont été préparées dans de l’eau pure à partir de solution de référence de chaque métal à 500 ppb. En parallèle un fil de 1 mg est pesé précisément à la balance de précision et ce morceau est ensuite découpé en quatre morceaux de longueurs et de masses identiques (m = 0,25 mg). Les quatre morceaux de fil sont ensuite immergés dans chaque solution métallique. Après une durée de 4 heures, 1 jour, 2 jours et 1 semaine respectivement, un morceau de fil est prélevé puis séché à l’étuve pendant 24 h à 40°C. Les échantillons secs à 4 heures, 1 jour et 2 jours sont ensuite analysés à l’aide d’un spectrophotomètre ICP-MS Nexion 2000 de chez Perkin-Elmer sans minéralisation préalable et après simple solubilisation du fil sec dans 1 mL d’une solution d’acide nitrique (HNO ₃ ) à 10% wt. Les échantillons à 1 semaine sont, quant à eux, récupérés puis introduits dans un récipient en Teflon avec 2mL d’HNO ₃ à 69% wt. et 1 mL d’eau ultra pure pour digestion dans un micro-onde Multiwave 5000 de chez Anton Paar pendant 30 minutes à 200°C. Le produit minéralisé est ensuite analysé par ICP-MS. Les résultats obtenus sur le fil obtenu avec la composition 12 selon l’invention (HG-8-8) sont présentés dans le Tableau 9.

[0157] [Tableau 9] [0158] Le fil utilisé pour cette expérience est obtenu avec la composition 12 selon l’invention (HG-8-8) et se compose donc à 50% en masse de chitosane A et à 50% en masse de copolysaccharide B. Le fil a été immergé dans une solution métallique correspondant à 10,000 fois son propre volume et est capable d’extraire efficacement le cuivre, le plomb et le cadmium en concentrant les métaux plus de 1000 fois dans son volume par rapport à la solution avoisinante. Le fil est également capable d’extraire efficacement les trois métaux pour des solutions métalliques dilués de l’ordre de la dizaine de ppb.

[0159] Une étude d’extraction métallique a également été conduite en milieu biologique sur du sang de porc reconstitué et fortement hémolysé afin d’évaluer la capacité d’extraction du fer des fils. 10 mL d’une solution de sang de porc hémolysé sont préparés par redispersion à 10 g/L de la poudre de sang séché dans de l’eau ultra pure. En parallèle, un fil de 1 mg est pesé précisément à la balance de précision et ce morceau est ensuite découpé en quatre morceaux de longueurs et de masses identiques (m=0,25mg). Les quatre morceaux de fil sont ensuite immergés dans la solution de sang de porc reconstituée. Après une durée de 1 heure, 2 heures, 4 heures et 24 heures respectivement, un morceau de fil est prélevé puis rincé dans 60mL d’eau ultra pure pendant 1 minute avant d’être séché à l’étuve pendant 24h à 40°C. Les fils secs sont ensuite récupérés puis introduits dans un récipient en Teflon avec 2mL d’HNOs à 69% wt. et 1 mL d’eau ultra pure pour digestion dans un micro-onde Multiwave 5000 de chez Anton Paar pendant 30 minutes à 200°C. Le produit minéralisé est ensuite analysé par ICP-MS. Les résultats obtenus sur trois fils sont présentés dans le Tableau 10.

[0160] [Tableau 10]

[0161] Au bout d’une heure d’immersion, les trois fils sont capables d’extraire du fer du milieu. Cependant, l’ajout de copolysaccharide B dans la composition permet d’augmenter les capacités de chélation du fil vis-à-vis du fer au bout d’une heure et significativement au bout de 2 heures. Cette augmentation est particulièrement significative lorsque la composition selon l’invention comprend 2 chélatants de type Rc différent.

[0162] La capacité d’extraction en fer selon l’invention face à différents chélateurs du fer (III) (citrate, NTA, Défériprone) a été évaluée précisément par analyse ICP-MS après immersion des pastilles de xerogel dans des solutions de fer (2 ppm en fer) contenant des chélateurs du fer dans des proportions pour avoir un cation de fer par complexe (11 citrate/1 fer ; 1 ,1 NTA/1 fer ; 4 Défériprone/ 1 fer). Les solutions sont tamponnées à pH 7,4 avec du PBS 0,1 M pour les solutions ayant du citrate ou de la défériprone, pour les solutions ayant du NTA le tampon utilisé est le tris HCl 0,05M. Une pastille de xerogel de masse connue a été plongée dans un volume de 20 ml de solution métallique pendant une durée de 24 H dans le cas de l’expérience avec la Défériprone et 90 H pour les expériences avec le NTA et le citrate. Les pastilles contrôle ont été plongées dans la solution tampon (PBS ou Tris-HCI) pour un temps correspondant à l’expérience considérée. Des prélèvements dans les solutions ont été faits à t : 0 et t : final. Ces échantillons sont alors analysés à l’aide d’un spectrophotomètre ICP-MS Nexion 2000 de chez Perkin-Elmer. Les pastilles de gel sont récupérées et minéralisées dans un micro-onde Multiwave 5000 de chez Anton Paar suivant la méthode présentée précédemment. Ainsi les solutions résultantes sont analysées par ICP-MS. Les résultats obtenus pour les inventions 10, 16, 17, 15, 18 de compositions respectives HG-5-10 ; HG-5-9,5-0,5 ; HG-5-9,2-0,8 ; HG-5-9-1 ; HG-5-8-2 sont présentés dans le Tableau 11 .

[Tableau 11 ] comportant des chélates du fer présentant des constante de complexation relativement faibles comme le sont le citrate ou le NTA. Dans le cas où les pastilles sont face à un fort agent complexant du fer comme c’est le cas de la défériprone, seuls les gels comportant du DFO sont capables d’extraire du fer ce qui correspond aux inventions 16, 17, 15, 18. L’invention 18 (HG-5-8-2) ayant le plus de polymère MEX-CDFO (B3) dans sa composition possède la meilleure capacité d’extraction du fer face à la défériprone.

[0164] Une autre étude d’extraction métallique a été conduite en milieu biologique sur du plasma bovin afin d’évaluer la capacité d’extraction du fer des pastilles dans des conditions plus proches de la réalité. Pour les inventions 10, 16, 17, 15 et 18, une pastille a été pesée et introduite dans 20 mL de plasma bovin pendant 24 heures. Le plasma a t : 0 est analysé par ICP-MS. Les pastilles sont minéralisées et analysées par ICP-MS suivant la méthode expliquée précédemment. Les résultats obtenus pour les inventions 10, 16, 17, 15, 18 de compositions respectives HG-5-10 ; HG-5-9,5-0,5 ; HG-5-9,2-0,8 ;

HG-5-9-1 ; HG-5-8-2 sont présentés dans le Tableau 12.

[Tableau 12] Après 24 heures, les 3 gels sont capables d’extraire une partie du fer du plasma. Exemple 9 - Etudes de la capacité de relargage des fils et des hydrogels selon l’invention

[0165] La capacité de chargement du fil en substance d’intérêt et de leur relargage contrôlé dans une autre solution ou un autre milieu ont été mises en évidence. Dans un premier temps, la possibilité de chargement et de relargage du fil avec une substance a été évaluée à l’aide d’une molécule fluorescente. 10 mL d’une solution de fluorescéine à 25 mg/L est préparé par solubilisation de la fluorescéine dans de l’eau ultra pure. Un fil de 4 mg est alors découpé et pesé à la balance de précision avant d’être immergé dans la solution de fluorescéine pendant 10 minutes. Les fils sont ensuite retirés de la solution et séchés dans une étuve à 40°C pendant 2 heures puis à température ambiante pendant 3 jours. Le fil est ensuite immergé dans 20 mL d’eau ultra pure et un prélèvement de 2 mL de cette solution est réalisé au bout de 0, 1 , 2, 5, 10, 15, 30, 45 minutes et au bout de 15 heures et est analysé à l’aide d’un spectromètre à fluorescence Cary Eclipse de chez Agilent (Tableau 11 ).

[0166] [Tableau 13]

[0167] Les capacités de chargement et de relargage de substance d’intérêt de trois formulations de fils ont été étudiées à l’aide de la fluorescéine par analyse de la fluorescence de la solution après relargage. Les trois fils relarguent de la fluorescéine 1 minute après l’immersion du fil sec chargé dans l’eau ultra pure. La formulation comparative 2 (HG-8-0) composée uniquement de chitosane A relargue très peu de fluorescéine. L’ajout de copolysaccharide B dans la composition du fil permet d’augmenter la capacité de relargage des fils, ceci est particulièrement vrai plus la composition est chargée en copolysaccharide B

[0168] Une expérience identique a été réalisée en chargeant cette fois-ci les fils à l’aide de miconazole qui est une molécule antimycosique imidazolé couramment utilisé dans des dispositifs médicaux variés (spray topique, crèmes, lotions, etc.) pour guérir les infections fongiques. 100 mL d’une solution de miconazole à 0,1 g/L est préparé par solubilisation du miconazole dans de l’eau ultra pure. Un fil obtenu à partir de la composition 10 selon l’invention (HG-5-10) de 0,9mg (10cm) est alors découpé et pesé à la balance de précision avant d’être immergé dans la solution de miconazole pendant 10 minutes. Les fils sont ensuite retirés de la solution et suspendus à une tige en verre pour sécher pendant 3 heures à température ambiante. Le fil est ensuite immergé directement dans 3 mL d’eau ultra pure contenue dans une cuvette pour spectrophotomètre en plastique et une analyse du milieu est réalisée à intervalle de temps régulier par analyse de fluorescence à l’aide d’un spectromètre à fluorescence Cary Eclipse de chez Agilent (Tableau 12).

[0169] [Tableau 14]

[0170] La même expérience a été réalisée en chargeant les fils avec de la pénicilline qui est un antibiotique. 100 mL d’une solution de pénicilline à O,1g/L est préparé par solubilisation de la pénicilline dans de l’eau ultra pure. Un fil obtenu à partir de la composition 10 selon l’invention (HG-5-10) de 0,9 mg (10 cm) est alors découpé et pesé à la balance de précision avant d’être immergé dans la solution de pénicilline pendant 5 minutes. Les fils sont ensuite retirés de la solution et suspendus à une tige en verre pour sécher pendant 3 heures à température ambiante. Le fil est ensuite immergé dans 10 mL d’eau ultra pure et des prélèvements sont réalisés après 1 h, 2 h et 22 h. Les échantillons sont ensuite analysés par absorbance UV-visible à l’aide d’un

Spectrophotomètre UV-Vis Varian Cary 50 de chez Agilent (Tableau 13).

[0171] [Tableau 15]

[0172] Ces résultats montrent que les compositions selon l’invention peuvent être chargées en ingrédient pharmaceutique actif, et peuvent également les relarguer.

Exemple 10 - Étude préliminaire de la composition d’une solution injectable gélifiante

[0173] Plusieurs solutions ont été préparées de la même façon que décrit dans l’exemple 4 mais cette fois-ci la quantité d’acide acétique est ajoutée de sorte à obtenir un mélange homogène où l’acide est en défaut par rapport aux fonctions amines non fonctionnalisées. Brièvement, différentes quantités de chitosane A1 et de composé B1 sont ajoutées dans un réacteur avec de l’eau milli-Q et de l’acide acétique. Le mélange est laissé sous agitation pendant au moins une heure à 100 RPM. La solution est ensuite récupérée et introduite dans un dispenseur de fluide puis centrifugée à 4000 RPM pendant 10 minutes pour enlever les bulles d’air restantes. Le pH et l’osmolarité de chaque formulation ont été mesurés avec un pH mètre Mettler Toledo SevenCompact S210 pH et un osmomètre Camlab Lôser Micro MCD200 Plus respectivement. Les différentes compositions et leurs préparations sont présentées dans le tableau 16.

[Tableau 16]

[0174] Les valeurs de pH obtenues sur les solutions aqueuses de MEX-CD2 sans ajout d'acide sont relativement basses. Ceci s'explique par la présence préalable d'acide acétique dans le lyophilisât de MEX-CD2 pour assurer sa solubilité durant l’étape de purification. L'acide acétique contenu dans le lyophilisât de MEX-CD2 est également osmotiquement actif et contribue à une augmentation de l'osmolarité. [0175] La viscosité de chaque solution a été mesurée à l'aide d'un rhéomètre HAAKE RheoStress 600 équipé d'une géométrie cône plan C35/2 ⁰ Ti L. Les valeurs des viscosités newtoniennes sont présentées tableau 15. On note que la viscosité dépend directement de la concentration totale en polymère, plus la concentration est faible, plus la viscosité est faible. De la même manière, à concentration totale en polymère égale, une fraction massique de MEX-CD2 plus importante contribue à réduire la viscosité.

[0176] L'injectabilité de chaque composition a été précisément mesurée à l'aide d'une machine de force Shimadzu AG-X plus. Chaque solution a été introduite dans une seringue pré-remplissable en verre BD Hylok™ de 1 mL équipée d'une aiguille Sterican 27G (0,4x12 mm). L'injectabilité a été déterminée comme la force en Newtons nécessaire pour éjecter la solution à une vitesse constante du piston de 1 mm/s. L'injectabilité du système dépend principalement de la viscosité de la solution et dépend donc de la concentration totale en polymère et dans une moindre mesure de la fraction massique de MEX-CD2 dans la composition considérée. Ainsi, les solutions sont facilement injectables à 3% (w/w), modérément injectables à 5% (w/w), difficiles à injecter à 7% (w/w) et non injectables à 10% (w/w) (T. E. Robinson et al., Filling the Gap: A Correlation between Objective and Subjective Measures of Injectability, Adv. Healthc. Mater., vol. 9, no 5, p. 1901521 , 2020).

[Tableau 17]

Exemple 11 - Détermination de la fraction massique de MEX-CD2 adéquate pour une solution injectable gélifiante

[0177] Cet exemple permet de mettre en évidence l'impact de la fraction massique de MEX- CD2 sur la formulation finale. Par conséquent, des solutions à 5 % (w/v) ont été produites avec différentes fractions massiques de MEX-CD2 allant de 0 % à 100 % de MEX-CD2. Chacune de ces formulations a été stérilisée pendant 20 minutes à 121 °C dans un autoclave afin d’évaluer l’impact de ce procédé sur les propriétés rhéologiques du système. Pour chacune de ces formulations, le pH, l'osmolarité, la viscosité et l'injectabilité ont été déterminés et sont présentés tableau 18.

[Tableau 18]

[0178] Ces formulations ont été réalisées en ajoutant de l'acide acétique dans des proportions stoechiométriques avec les amines libres des deux polymères ; la quantité résiduelle d'acide acétique présente dans le lyophilisât de MEX-CD2 n'a pas été considérée. Ceci explique pourquoi le pH décroît quasi linéairement avec la quantité de MEX-CD2 ajoutée à la composition et donc avec la fraction massique de MEX-CD2 de la formulation considérée. La viscosité newtonienne mesurée sur ces solutions avant et après stérilisation décroît linéairement en fonction de la fraction massique de MEX-CD2. L’injectabilité suit la même tendance et démontre donc que plus la quantité de MEX- CD2 est importante dans la formulation considérée, plus cette dernière est simple à injecter. Les échantillons formulés à 5% (w/v) sont tous modérément injectables à 27G avec des forces d'éjection allant de 19 N pour une formulation à 100% de MEX-CD2 à 38 N pour une formulation à 100% de chitosane standard. L'impact de la stérilisation sur la viscosité de la formulation dépend fortement de la fraction massique de MEX- CD2. Ainsi, les formulations comprenant une fraction massique de MEX-CD2 supérieure ou égale à 67% voient leurs viscosités peu ou pas affectées lors de la stérilisation du mélange.

Exemple 12 - Injectabilité et gélification d’une solution injectable gélifiante MEX-CD2-I

[0179] Cet exemple vise à déterminer précisément les propriétés physico-chimiques et rhéologiques de deux formulations de MEX-CD2-I (solution injectable gélifiante) sélectionnées parmi les résultats des précédents exemples. Ainsi les formulations à 5% (w/w) avec une fraction massique de MEX-CD2 égale à 67% et 100% respectivement ont été étudiées plus précisément. La formulation à 67 % de MEX-CD2 a été synthétisée à deux pH légèrement différents pour évaluer l'impact du pH sur les propriétés rhéologiques de la formulation. Chacune de ces deux formulations a également été préparée à 10% (w/w) afin d'envisager un mélange de ces solutions précurseurs plus concentrées avec des molécules d'intérêt selon un ratio 1 :1. Chacune de ces formulations a été stérilisée pendant 20 minutes à 121 °C dans un autoclave pour étudier l'impact de la stérilisation sur leurs propriétés. Pour chacune de ces formulations, le pH, l'osmolarité et la viscosité ont été mesurés et sont présentés au tableau 19. Pour les formulations à 5 % (w/w), l'injectabilité a également été déterminée à l'aide d'aiguilles différentes.

[Tableau 19]

[0180] L'injectabilité des formulations dépend principalement de la viscosité newtonienne de la solution, du rayon interne de l'aiguille et, dans une moindre mesure, de la longueur de l'aiguille utilisée. Pour une formulation à 5% (w/w) avec une fraction massique de MEX-CD2 de 67%, on observe qu'une diminution du pH génère une augmentation significative de l'injectabilité après stérilisation du mélange. Ceci est en accord avec l'observation faite sur la viscosité du système. La formulation à 5 % (w/w) avec 100 % de MEX-CD2 est plus facile à injecter que la formulation à 67 % de MEX-CD2/CTS, quelle que soit l'aiguille utilisée. Enfin, quelle que soit la formulation envisagée, le système ne semble pas injectable manuellement avec une aiguille de 30 G. Les deux formulations peuvent être injectées manuellement par un praticien avec une aiguille de 27G ou inférieur.

[0181] Les compositions IS-1 ,7-3,3 et IS-0-5 sont capable de gélifier spontanément par immersion dans un milieu physiologique comportant un pH supérieur à 6,2 et une osmolarité supérieure à 285 mOsm/L [Fig.10]. Pour évaluer les propriétés rhéologiques du gel formé, 2 mL de la composition IS-1 ,7-3,3 sont introduits dans un moule sous forme de disque de 25 mm de diamètre. Le moule est plongé dans 20 mL de PBS à 10 mM et laissé pendant 2 heures. Le module de stockage (G') et le module de perte (G") de l'hydrogel formé ont été enregistrés sur un rhéomètre ARES de TA Instruments en utilisant une géométrie plan/plan de 25 mm. Avant la mesure, l'écart zéro de l'appareil est réglé avec le moule vide. Un balayage avec une déformation constante de 1 % et une fréquence de 10 Hz a été effectué sur l'hydrogel formé après avoir placé le moule contenant l'hydrogel sur la géométrie. L'hydrogel commence à se former spontanément après immersion dans le PBS et on peut observer un front de gélification progressif. Le gel obtenu possède des valeurs de G' et G" supérieurs à 10 ² Pa pour une fréquence d'oscillation élevée ce qui correspond à un gel très souple. De plus, la valeur de G' est supérieure à celle de G" ce qui signifie que le matériau résultant est effectivement plus proche d'un gel que d'une solution. G' et G" diminuent avec la fréquence ce qui semble mettre en évidence un important phénomène de relaxation (flux/relaxation/mobilité des chaînes, effet viscoélastique) dû à un gel faiblement réticulé.

Exemple 13 - Étude de tolérance in-vivo de l’implantation dans la cavité péritonéale d’un xerogel HG-5-10

[0182] Un xerogel (h=1 ,5mm et 0=10mm) sous forme de pastille a été obtenu par séchage partiel d’un gel comprenant la composition HG-5-10 préparée comme décrit dans l’exemple 4. Ce xerogel a été implanté dans le péritoine de 10 souris mâles C57BI/6 afin d’évaluer la biocompatibilité et la tolérance de l’implant. Les paramètres évalués dans cette étude comprennent des observations et des mesures en cours de vie (y compris la morbidité/mortalité, signes cliniques, poids corporel, consommation alimentaire), hématologie avant et après traitement et la chimie du sang et le poids des organes après le traitement et l'autopsie. La moitié des souris ont été sacrifiées à J7 et l’autre moitié à J56.

[0183] Dans les conditions expérimentales retenues, le xerogel HG-5-10 administré comme dispositif médical implantable dans le péritoine, chez des souris mâles C57BI/6, n'a pas induit de signes systémiques de toxicité. Lors de cette étude, aucun décès, changement de poids corporel significatif ou changement hématologique n’a été induit par l’implant à J7 et J56 chez les souris. L’implantation intra-abdominale du xerogel HG-5-10 n’a pas provoqué de changements microscopiques dans le foie ni de modification du poids du foie.

Exemple 14 - Étude IRM in-vivo de la dégradabilité de la solution injectable gélifiante IS-1 ,7-3,3 par administration sous-cutanée

[0184] Environ 300 pL de la formulation IS-1 ,7-3,3 chargée à 305 ppm de Gd (précomplexé sur le MEX-CD2) ont été injecté par voie sous-cutanée dans le dos de souris BALB/c en bonne santé à l'aide d'une seringue de 22G. Les images IRM, de la figure 11 , du gel implanté chez la souris ont été acquises pendant 1 mois après l'implantation à 7,1 T sur un spectromètre Bruker Avance Neo 300 MHz équipé d’une sonde de micro-imagerie micro 2,5 à température ambiante (R.T. = 21 ⁰ C). Les intensités des signaux dans le foie, les reins et la rate ont également été surveillées.

[0185] Sur la figure 12, les images T ₂ w ont été acquises en utilisant une séquence standard RARE (Rapid Acquisition with Refocated Echoes) avec les paramètres suivants : TR = 4000 ms, TE = 24 ms, facteur RARE = 16, nombre de moyennes = 4, FOV = 30 mm, épaisseur de coupe = 1 mm, taille de matrice 128x 128. Les images Ti w ont été acquises en utilisant une séquence standard MSME (multi spins multi échos) avec les paramètres suivants : TR = 400 ms, TE = 3,3 ms, nombre de moyennes = 6, FOV = 30 mm, épaisseur de coupe = 1 mm, taille de la matrice 128x 128. Les valeurs de Ti ont été mesurées à l'aide d'une séquence Saturation Recovery Spin Echo (TE = 3,8 ms, 10 TR variables allant de 50 à 5000 ms, FOV = 30 mm, épaisseur de tranche = 1 mm, taille de matrice 128 x 128) et analysées à l'aide de l’équation Ti de récupération de saturation. La taille du gel formé a été mesurée par dessin manuel du ROI dans les images IRM.

[0186] Comme répertorié dans le tableau 20, le volume occupé par le gel formé a diminué jusqu'à environ 50 % du volume initial en 30 jours de surveillance, tandis que le Ti mesuré dans la même zone a augmenté d'environ 6 fois. À partir du jour 15 après l'implantation, l'hétérogénéité de l'implant a commencé à augmenter en raison de l'infiltration des cellules. Cette infiltration est mise en évidence par l'augmentation des écarts-types en Ti mesurés du jour 15 au jour 30. Les volumes de départ des implants chez les 3 souris étaient respectivement de 304, 348 et 216 mm ³ . Les intensités du signal Tiw dans le foie, les reins et la rate n'ont pas augmenté dans la plage de temps étudiée.

[Tableau 20]