本发明属于生物能源领域， 具体地涉及一种衣藻及其制备生物柴油的 应用， 更具体地， 本发明涉及一株新的衣藻藻株， 其油脂含量较好， 可用 于制备生物柴油、 饲料或食用油的应用。 背景技术

随着日益严重的环境恶化， 控制汽车尾气排放和温室效应， 保护人类 赖以生存的自然环境成为人类急需解决的问题 。 同时全球能源需求不断扩 大， 寻求可以替代石油在能源结构中占主导地位的 可再生清洁能源是目前 普遍关注的热点。

微藻是一类在水中.生长的种类繁多且分布极� �广泛的低等植物， 它是 由阳光驱动的细胞工厂， 通过微藻细胞高效的光合作用， 吸收 CO ₂ ， 将光 能转化为脂肪或淀粉等化合物的化学能，并放 出 0 ₂ 。微藻是光合效率最高 的原始植物， 也是自然界中生长最为迅速的一种低等植物， 而且某些微藻 可以生长在高盐、 高碱环境的水体中， 可充分利用滩涂、 盐碱地、 沙漠进 行大规模培养， 也可利用海水、 盐碱水、 工业废水等非农用水进行培养， 还可以利用工业废气中的 co ₂ 。利用微藻生产生物柴油能够解决目前使 用 植物原料发展生物柴油面临的耕地不足、气候 变化对产量影响大和引起农 作物价格上涨等突出问题。 因此， 微藻生物柴油作为可再生清洁能源成为 了潜在的能源研究热点。

衣藻 （Chlamydomonas) 亦称"单衣藻 "。 绿藻门、 团藻目、 衣藻科中 的衣藻属。藻体为单细胞，球形或卵形，前端 有两条等长的鞭毛， 能游动。 鞭毛基部有伸缩泡两个； 另在细胞的近前端， 有红色眼点一个。 载色体大 型杯状， 具淀粉核一枚。 无性繁殖产生游动孢子； 有性生殖为同配、 异配 和卵式生殖。 在不利的生活条件下， 细胞停止游动， 并进行多次分裂， 外 围厚胶质鞘， 形成临时群体称"不定群体"。 环境好转时， 群体中的细胞产 生鞭毛， 破鞘逸出。 其中的莱茵衣藻是一种单细胞真核鞭毛藻类， 是研究 多种生命活动 （如光合作用、 生理节律和趋光性等） 的模式生物， 与酵母 细胞有许多共词的特征， 素有"光合酵母"之称。 关于衣藻基因方面的研究 有大量报道， 如专利 CN200610026203.3 衣藻红色荧光标记蛋白基因 CrmRFP 其合成方法及其真核表达载体 的 构建方法 ， CN200810066705.8表达人组织激肽释放酶的转基因� �茵衣藻的构建方 法， CN 200610018306.5 —种莱茵衣藻外源基因表达系统及其构建生产 PHB转基因藻的方法， 却未见衣藻生产生物柴油的报道， 本发明提供了一 种含油量较高的衣藻， 其可以进一步进行基因改造。 发明内容

本发明的目的是提供一种产油衣藻及其在生物 能源领域的应用。

在一个方面中，本发明提供一株衣藻藻株 OQA-0l(CMam _y domo麵 sp. DQA-01), 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心， 其保 藏号为 CGMCC No.3577。 此衣藻藻粉含油量占干重量的 10%----50%， 其 油脂可以做成生物柴油， 饲料或食用油； 所述的产油衣藻是属于衣藻属的 一个新种， 命名为 DQA-01 , 与作为基因工程中微藻模式生物的莱茵衣藻 (Chlamydomo丽 reinhardtii )在进化树上非常相近， 可为能源微藻基因工 程改造提供材料。 在一个实施方案中， 所述衣藻藻株 DQA-01在 15-35 °C 的温度范围内培养， 温度优选为 23 °C。 在一个实施方案中， 所述衣藻藻株 DQA-01在培养过程光照强度控制在 50---200μηιο1/ηι ² .3。 在一个实施方案 中， 所述衣藻藻株在光照强度 150-30(^mol/m ² .s诱导下积累油脂。 在一个 实施方案中， 所述衣藻藻株首先在 6(Vmol/m ² . _S 培养， 在第 3天时将光强 加大到 12( mol/m ² .s， 在第 7天时将光强加大到 200μιηο1/ηι ² .5。 在一个实 施方案中，所述衣藻藻株 DQA-01在培养期间将培养基的 pH值调节在 7-9 之间， 优选 pH为 7.2。

在另一个方面中， 本发明提供筛选所述含油衣藻的方法， 所述方法包 括下述步骤：

1)藻样采集， 选择含有多种藻类的污染河流、 湖泊或沼泽地， 使用藻 样采集器进行藻样采集；

2)藻种分离纯化， 利用稀释铺平板法或毛细管法将混合在一起的 多种 藻种进行分离， 得到单个藻种的纯藻株； 3)藻种培养及油脂诱导， 将纯藻株在 BG11培养基， 25°C下进行培养， 当藻的浓度达到 1-8 g/1的时候， 加强光进行油脂诱导；

4)油脂含量测定， 取油脂诱导后的藻进行尼罗红染色， 在荧光显微镜 下进行观察， 选择荧光比较多的藻种， 从而快速得到含油较高的藻 种。 在一个实施方案中， 所述方法还包括对纯藻株进行藻种鉴定， 通过形态和分子相结合的方法确定藻种在进化 树中的位置的步骤。 在另一个方面中， 本发明提供一种生产生物柴油的方法， 所述方法特 征在于使用本发明提供的所述衣藻藻株 DQA-01进行。

在另一个方面中， 本发明提供一种生产词料的方法， 所述方法特征在 于使用本发明提供的所述衣藻藻株 DQA-01进行。

在另一个方面中， 本发明提供一种生产食用油的方法， 所述方法特征 在于使用本发明提供的所述衣藻藻株 DQA-01进行。

在另一个方面中， 本发明提供一种对衣藻藻株进行基因改造的方 法， 所述方法特征在于使用本发明提供的所述衣藻 藻株 DQA-01进行。

在又一个方面中， 本发明提供所述衣藻藻株 DQA-01用于制备生物柴 油、 饲料或食用油的应用。

在又一个方面中， 本发明提供所述衣藻藻株 DQA-01用于制备基因改 造藻株的应用。

在又一个方面中， 本发明提供一种饲料， 其由本发明提供的所述衣藻 藻株 DQA-01制备而来。

在又一个方面中， 本发明提供一种食用油， 其由本发明提供的所述衣 藻藻株 DQA-01制备而来。

在又一个方面中， 本发明提供一种生物柴油， 其特征在于， 其是通过 培养本发明提供的衣藻藻株 DQA-01 , 并从中分离油脂制备而来。

本发明中的衣藻藻体为单细胞，球形或卵形， 前端有两条等长的鞭毛， 能游动。 鞭毛基部有伸缩泡两个； 另在细胞的近前端， 有红色眼点一个。 载色体大型杯状， 具淀粉核一枚。 无性繁殖产生游动孢子； 有性生殖为同 配、 异配和卵式生殖。 在不利的生活条件下， 细胞停止游动， 并进行多次 分裂， 外围厚胶质鞘， 形成临时群体称"不定群体"。 环境好转时， 群体中 的细胞产生鞭毛， 破鞘逸出。 其用于藻种鉴定的 ITS 序列是 ( GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGA

CGCCGTACG AGCCTGGGTCGCCTGCCCAATTAATTATTAATTAATT

GAACGCAGCGAAATGCGATACGTAGTGCGAATTGCAGAAATACGTG AATCATCGAATCTTTGAACGCAAATTGCGCTCGAGGCTTCGGCCAAG

TGTGCATGCAAGCGGAGCTGGCTGTCTCGGCCCCTCGTAAAACAGG

TGCCGGGTCTGCTGAAGTACAGAGGTTGATGCATGGACCCGCTCATG

GGCCTCAA TGGGTAGGCAACTCGTTGCTAATGCTTTAGTTGATGGC

GAACTTAAGC ATATCAATAAGCGGAGGA ) (SEQ ID NO: 1 )， 与最相近的 Chlamydomonas callosa的相似度为 89%， 是衣藻属的一个新种。

发明人已将所述衣藻 DQA-01 W^Chlamydomo丽 sp. DQA-Ol)于 2010年 1 月 6 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心 (北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号，简称 CGMCC),其保藏号为 CGMCC No.3577。 发明效果

本发明分离的衣藻藻株在高光的情况下可以积 累占干重 20%以上的油 脂， 其油具有很好的流动性， 是品质比较好的油脂。 此株衣藻本身就含有 比较高油脂的特征， 将对微藻生物柴油利用基因工程改造突破现有 能源微 藻产量低、 成本高等难题具有十分重要的意义。 附图说明

图 1为根据 DQA-01藻株的 ITS及 5.8S部分序列构建的进化树 图 2为 DQA-01藻株的显微照片

图 3为 DQA-01藻株的油脂尼罗红染色荧光显微照片 .

图 4为 DQA-01藻 ITS序列与 genebank中 Chlamydomonas callosa比对结 果照片 本发明的创新性：

目前用于基因工程改造的衣藻是不产油或产油 非常少的藻种， 而其它 含油量高的藻株在基因改造方面难度比衣藻大 。

本发明中提供的微藻不仅产油， 而且是衣藻属的一个物种， 为产生物 柴油的微藻基因改造提供了操作性简便的材料 。 下面将通过具体实施方式来对本发明的优选实 施方案进行说明。但是 本发明的保护范围并不受所述实施例的限制。 具体实施方式

实施例 1 筛选含油衣藻藻株

取无菌水稀释后的从达旗地区取回的小河水水 样， 在 400倍显微镜观 察后， 大约细胞浓度为 800— 1200个 /ml， 用毛细管取大约 lul的藻液， 接 种于 48孔装有 BG11培养基的培养板中，在 25 °C、光照强度为 50μπι _Ο 1/ιη ² . _δ 情况下进行培养， 当达到一定细胞浓度时， 显微镜观察， 选择只有单藻株 的孔， 进行铺平板， 得到单藻株。

将纯藻株在 BG11培养基中， 25°C、 光照强度为 5(^mol/m ² .s下进行 培养， 当藻的浓度达到 3g/l的时候， 加开灯管， 使光强达到 250 mol/m ² . _S ， 进行油脂诱导；

将单藻株进行尼罗红染色， 藻内油脂被染上了色， 在荧光显微镜下进 行观察（见图 3 )， 选择荧光多的藻株， 即为油脂含量高的藻株。 将分离出 来的含油量较高的藻株命名为 DQA-01。

实施例 2确定藻种在进化树上的分类

藻株鉴定采取形状鉴定和分子鉴定相结合。 形状鉴定 (见图 2): 对上述分离出来的藻株 DQA-01在 1000倍显微镜进 行观察， 发现藻体为单细胞， 球形或卵形， 前端有两条等长的鞭毛， 能游 动。 鞭毛基部有伸缩泡两个； 另在细胞的近前端， 有红色眼点一个。 载色 体大型杯状， 具淀粉核一枚。 无性繁殖产生游动孢子； 有性生殖为同配、 异配和卵式生殖。在不利的生活条件下， 细胞停止游动，并进行多次分裂， 外围厚胶质鞘， 形成临时群体称"不定群体"。 检索 《中国淡水藻类--系统、 分类及生态》， 发现此藻在形态上分类相同的为绿藻门、绿藻 纲、 团藻目、 衣藻科、 衣藻属。

分子鉴定：

A， 从分离的衣藻扩增其 ITS及 5.8S部分核苷酸序列

用 CTAB法提取培养 4天的 DQA-01藻基因组 DNA。 取一定量的细 胞， 研磨处理后加入适量 CTAB缓冲液， 匀浆， 加入等体积的酚： 氯仿抽 提， 等体积异丙醇沉淀， 75 %乙醇洗涤后溶于一定体积灭菌双蒸水中， 紫 外分光光度计检测其浓度和纯度。

ITS序列扩增采用真核生物 ITS扩增通用引物（引物合成由上海生工 生物工程公司合成）。

引物 1 5， GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3，

引物 2 5， GCATATC AATAAGCGGAGGA 3，

取 1 μΐ总 DNA为模板。 扩增条件如下： 94 °C变性 5 min， 然后 94 V 40 s, 56 °C 40 s, 72 °C 2 min 30个循环， 最后 72 °C 10 min。 1.0 %的琼脂 糖凝胶电泳检测其扩增产物， PCR扩增获得约 750bp片断。序列如 SEQ ID NO: 1所显示。

B， 所克隆的核苷酸序列同源性搜索

将获得的 DQA 的 ITS 及 5.8S 部分序列登录 GenBank数据库进行 BLAST比对， 结果显示与 ACCESSION号为 U66945 的 CMamydomonas cfl//o 的内转录间隔区 1 (ITS1 ), 5.8S核糖体 RNA及内转录间隔区 2(ITS2) 序列具有较高的相似性达 89% (见图 4)， 该 Chlamydomonas callosa序列， l-.217b 为 ITS 1序列， 218-378为 5.8S核糖体 RNA基因序列， 377-625 为 ITS2序列。 C， 根据上述序列作出进化树， 见图 1。

利用 NCBI数据库中的 BLAST工具对藻株 DQA 的 ITS部分序列进 行序列相似性分析。 选取部分同源序列和该藻株的 ITS 部分序列利用 clustaLx软件包进行序列同源进化比对， 形成一个多重序列匹配排列矩阵。 然后， 运用 Mega4.0软件，采用邻位相连 (Neighbor-joining)算法， 自展数据 集 bootstraps值为 1000构建系统发育进化树。

根据形态和 ITS blast的结果， 限定 DQA-01为衣藻属 -Chlamydomonas Sp的一个新种。

发明人已将所述藻株于 2010年 1月 6 日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心 (北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 简称 CGMCC), 其保藏号为 CGMCC No.3577。

实施例 3衣藻油脂积累

将处在对数生长期的藻种接种在配制好的培养 基中， 通过光强的调节 进行生长培养和油脂诱导培养。 进行衣藻油脂积累的培养基和一般方法如下：

A， 培养基配制：

根据下表 BG11配方进行培养基配制

NaN0 ₃ 0.8--1.5 g/1

K ₂ HP0 ₄ . 3H ₂ 0 0.02—0.08 g/1

MgS0 ₄ ·7Η ₂ Ο 0.075 g/1

CaCl ₂ . 2Η ₂ Ο 0.036 g/1

citric acid 0.006 g/1

Ferric ammonium citrate 0.006 g/1

EDTA (dinatrium-salt) 0.001 g/1

Na ₂ C0 ₃ 0.02 g/1

A5 + Co solution * 1ml 去离子水 919ml

* A5 + Co solution的组成成分

加到 1000 ml去离子水中

H ₃ B0 ₃ 2.86g

MnCl ₂ . H ₂ 0 1.81g

ZnSO ₄ . 7H ₂ 0 0.222g

CuS0 ₄ . 5 H ₂ 0 0.079g

Na ₂ Mo0 ₄ . 2H ₂ 0 0.390g

Co(NO ₃ ) ₂ .6H ₂ 0 0.049g

B， 接种

将所述衣藻藻株 DQA-01绿色游动细胞接种在配置好的培养基中， 使 细胞密度达到 OD ₇₅ 。为 0.2---0.8之间。

C， 培养

培养过程光照强度控制在 50-200μηκ)1/ιη ² . _δ ，利用通气使藻株在培养基 中保持均匀， 温度调控在 15-35°C范围内， 在培养期内， 通过向培养液中 通人二氧化碳， 将培养基的 pH值调节在 7-9之间。

D， 油脂积累诱导

从培养的第 5天起，加大光照强度，使光照强度在 150-300 m _O l/ _m ² .s， 在这一阶段内， 衣藻开始油脂积累。 .

E, 采收藻

培养进行到第 12天， 藻液颜色变黄或乳白时， 将藻液收集， 通过离心 或自然沉降的方法获得藻泥， 将藻泥在 100°C下进行干燥。 藻粉油脂含量积累及测定

按上述步骤进行培养， 其初始接种细胞密度 OD _75Q 为 0.5， 使用 BG11 培养基， 其中 NaNO ₃ 浓度为 0.9g/l、 K ₂ HPO ₄ 3H ₂ 0浓度为 0.04g/l， 光照强 度为 6(^mol/m ² .s， pH为 7.2，温度维持在 23°C左右， 在第 3天时将光强 加大到 12(^mol/m ² .s， 在第 7天时将光强加大到 20(^mol/m ² .s， 培养到第

12天， 藻液颜色变黄或乳白时， 将藻液收集， 通过离心或自然沉降的方法 获得藻泥， 将藻泥在 100°C下进行干燥。

测定干燥后的藻粉油脂含量， 其测定方法： 取 50mg或 lOOmg冻干藻 粉放置在具 Telfnon螺口瓶盖的体积为 15-20ml的小玻璃瓶中， 再放置一 小磁力棒， 加入 2- 4ml 10%DMS0- Methanol溶液， 40 °C砂浴（盛砂的烧杯放 置恒温加热磁力搅拌器上) 5分钟； 然后在 4Ό下磁力搅拌抽提 30分钟， 3500转 /分钟离心， 转移上清液到另一小瓶中。 剩下藻渣再加入 1 : 1的乙 醚、 正己烷 4- 8 ml 4°C下磁力搅拌抽提 1小时， 3500转 /分钟离心， 转移 上清液到上述一小瓶中。 可重复上述过程直到藻渣变白。 在上述合并抽提 液中加入纯水使四者（水、 DMSO-Methanol.乙醚、正己垸）比例为 1 : 1 : 1 : 1， 震荡分相， 移取有机相转移到另一小玻璃瓶中， 在通风橱中用氮气吹至成 浓缩液， 然后转移到事先称重过的 1. 5ml塑料离心管中， 再用氮气吹干至 恒重， 称量恒重后的管重， 用此管重减去事先称重过的离心管重得到油脂 重量，然后用油脂重量除以藻粉重，计算出其 油脂总含量为藻粉干重 31%。

取 25mg— 100mg藻粉照上面方法进行提取后， 用正己垸溶解， 使用 Agilent 6820气相色谱仪进行气相色谱分析（色谱条件� �载气： 氮气流量 lml/min、氢气流量 30ml/min、空气流量 300ml/min，进样口温度： 280 °C , 检测器温度： 280°C， 检测器类型： FID， 分析方法： 内标法， 进样口类型： 分流 /不分流进样口）， 其油脂组分含量如下表 1。

表 1 气相色谱测定的样品总脂组分表 （组分含量为重量百分比)

本发明中的衣藻具有一定的油含量， 可用于提炼生物柴油； 此藻种为 衣藻属下的一个种， 其与做了大量基因方面研究的莱茵衣藻是同一 属， 在 进化上具有许多相似处， 故可以借鉴莱茵衣藻基因方面的研究经验对此 产 油衣藻进行基因改造， 有助于能源微藻基因改造方面的研究。