本发明涉及一种经选育的用以生产单细胞油脂 及生物柴油的小球藻突变株及其 应用。 背景技术

生物柴油突出的环保性和可再生性引起了世界 发达国家尤其是资源贫乏国家的 高度重视。 生物柴油主要以生物脂为原料， 经酯化反应转化为脂肪酸甲酯而得。 生物 柴油产生的二氧化碳仅为传统柴油的 16%到 40%， 所产生的尾气微粒排放量也降低 了 30%左右， 同时不需要对现有柴油发动机作任何改装即可 混合或单独使用，也不需 要改变能源的分配方式以及能源资源的市场， 可直接作为民用燃料和内燃机燃料。

生物柴油的生物脂原料主要来源于植物油脂、 废油和动物脂肪。其中以产脂微藻 作为原料制备生物柴油， 具有其他产脂生物无法比拟的优势： （1 )微藻很容易繁殖并 且培养的时间短，一般高等植物需要生长好几 个月甚至几年才能完成一代，微藻繁殖 一代的时间仅为 2-5天； （2 )微藻不像高等植物那样受气候、 季节变化的影响， 可保 持纯培养， 一年四季都可连续大规模生产， 可保证原料供应充足； （3 )微藻的生长繁 殖是在水域中，不依靠土壤，可以在占地有限 的设备上进行而得到高产，不与粮争地; ( 4 )藻类所需酯化反应的条件相对较低， 使生产成本降低， 炼制工艺相对较为简单。

虽然产脂微藻是目前最好的生物柴油工业生产 来源，但它的含油量不高， 导致大 规模培养微藻生产油脂成本昂贵， 最终使得利用微藻制备生物柴油难以获得经济 效 益， 产业化进程减缓。提高微藻细胞的油脂含量是 目前降低成本的关键， 有望从根本 上解决生物柴油产业成本过高的瓶颈问题。 因此， 一直需要努力不懈的研究， 以开发 出产脂量及生物量更高的优良藻株，为单细胞 油脂及生物柴油的工业生产提供具有竞 争力的原材料。

为了提高微藻细胞的产脂量， 过去的研究主要集中在以下几个方面： （1 )培养基 优化； （2 ) 培养过程控制； （3 ) 代谢工程方法改造藻株； （4 ) 诱变选育高脂突变株。 前两种方法虽然可在一定程度上有效促进藻细 胞的产脂量， 但提高的百分比数有限 (通常提高 20%以下）， 仍无法满足产业化规模开发的要求。 代谢工程方法改造微藻 是解决藻细胞脂含量低的根本方法，需要全面 考虑藻株的整体代谢网络的结构和调控 特点， 有待进一步进行研究。 诱变育种方法研发成本低， 选育过程简单、 耗时少， 是 提高微藻细胞产脂量的有效途径。 发明内容

本发明目的在于提供一种小球藻突变株及其应 用。

为实现上述目的， 本发明采用的技术方案为：

一种小球藻突变株：小球藻突变株已于 2011年 5月 27日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC ) , 编号为 CGMCC No. 4917, 分类名称小 球藻 Chlorella kessleri。

小球藻突变株的应用： 所述小球藻突变株为单细胞油脂高脂突变株， 可应用于生 物柴油生产工艺中。

所述小球藻突变株的筛选过程：

1 )将在 Kuhl培养基中培养至对数生长期的小球藻 Ch reUa kessleri)采用 EMS 化学诱变处理； 将小球藻接种到 Kuhl培养基中， 在温度为 18-35 °C， 转速为 100-200 rpm, 光照强度为 20-150 μ ηιοΐ m- ² s- ¹ 连续光照的摇床中振荡培养至对数生长期 ， 在 培养至对数生长期的每毫升藻体内加入 10-100 μ 1 EMS溶液，在黑暗条件下以 18-35 °C处理 15-180 min, 而后加入 EMS溶液等体积的硫代硫酸钠溶液终止诱变反应 ； 所述 Kuhl培养基为： 10 g/L葡萄糖、 l g/L硝酸钾、 89 mg/L十二水磷酸氢二钠、 621 mg/L二水磷酸二氢钠、 246 mg/L七水硫酸镁、 9.3 mg/L EDTA、 6.9 mg/L七水 硫酸亚铁、 14.7 mg/L二水氯化钙、 0.29 mg/L七水硫酸锌、 0.17 mg/L—水硫酸锰、 0.06 mg/L硼酸、 0.002 mg/L五水硫酸铜、 0.012 mg/L 四水钼酸铵， pH 6.5。

2 ) 将步骤 1 ) 诱变处理后藻体转接培养在高脂定向筛选平板 上， 筛选出体积增 大的单细胞藻体进行扩种继代培养；即将诱变 处理后藻体洗涤后观测其细胞浓度， 根 据细胞数将藻体稀释 10 ³ -10 ⁶ 倍， 分别涂布到高脂定向筛选平板上， 置于 18-35 °C的程 控恒温培养箱中无光静置培养， 筛选单细胞体积增大的藻体于 Kuhl培养基中， 在温 度为 18-35 °C， 转速为 100-200 rpm， 光照强度为 20-150 μ mol m ² s" ¹ 连续光照的摇 床中振荡扩种继代培养至对数生长期。

3 )将上述扩种继代培养至对数生长期的藻体进� �诱导培养 6-20天， 待用； 将扩 种继代培养至对数生长期的藻体中加入 50%葡萄糖母液（取 250 g葡萄糖溶于水中至 总体积 500 ml)至终浓度为 30-60 g/L， 诱导培养 6-20天， 使藻细胞内脂的大量合成， 而后用去离子水 3000 g低温离心洗涤， 去除上清， 藻泥沉淀进行真空冷冻干燥处理 24 h, 得到干藻粉。

4 ) 取步骤 3 ) 藻体利用气相色谱 （GC ) 测定突变株与野生株的脂含量， 突变株 的脂含量与野生株的脂含量的比值大于 110%， 即突变株为单细胞油脂高脂突变株； 将诱导培养后藻体中加入甲苯、 1%硫酸一甲醇 （体积比硫酸： 甲醇 =1 :99 ) 和十九烷 酸（C19:0 ) 内标液混合均匀后， 置于 50-60 振荡水浴过夜； 取出， 冷却后， 加入 5% NaCl水溶液和正己烷， 混合均匀后， 离心收集上层液体， 向收集的上层液中加入 2% KHC0 ₃ 水溶液混合均匀， 漩涡仪上混匀离心收集上层液体， 用氮气吹干溶剂后， 用正己烷定容， 利用气相色谱 （GC ) 测定突变株中脂含量。 所述气相色谱条件为： 采用分流模式， 以氮气为载气； 进样口温度为 250 V FID检测器温度为 260°C ; 柱 温箱的温度为以 2.5 °C/min的升温速率从 140 °C升至 240 。C。

经上述技术方案选育获得的高脂突变株小球藻 （Oz/ore//a kessleri) A\ , 已于 2011 年 5月 27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普� ��微生物中心 （CGMCC ) , 编 号为 CGMCC No. 4917，分类名称小球藻 Chlordla kessleri。

所述的小球藻 Ch reUa kessleri) Al CGMCC No. 4917具有典型的绿藻门、 绿 藻纲、 绿球藻目、 小球藻科、 小球藻属的特征性结构。 在无菌 BG-11、 BBM、 Basak CZ-M1、 Kuhk KM1等培养液中、适宜条件下培养时， 其营养细胞大小约 5-10 μ m， 球形， 绿色， 生长快速。

所述的小球藻 Ch rella kessleri) Al CGMCC No. 4917生理生化特征如下： 1 . 在 BG-11、 BBM、 Basak CZ-M1、 Kuhk KM1 等自养培养基和异养培养基 中均能生长， 也可以混养培养。 混养时生长最好。 混养时最适的碳源是葡萄糖， 最好 的氮源是硝酸盐。 较低的溶解氧有利于自养生长， 而饱和的溶解氧有利于异养生长。 适量的镁能改善其生长。

2. 营养生长时以孢子繁殖的方式进行细胞增殖， 比生长速率为 0.025-0.065 h- ¹ , 代时为 27.72-10.66 h; 生长最适 pH范围： 4-10; 生长最适宜温度： 18-35 °C ; 生长 最适光照强度为 20-150 μ mol m ² s" ¹ ; 摇床振荡培养时的最适转速 100-200 rpm。

3.在氮限制、磷或硫缺乏、盐胁迫等不利环境� ��件下，补给足够的碳源， Chlorella Al CGMCC No. 4917细胞迅速变大， 脂合成速度加快， 脂产量显著提高， 产 脂率可达 2.93 mg g ¹ h" ¹ , 高达 ChhreUa kessleri野生株产脂率的 2.14倍。碳水化合物 含量也相应增加， 但总蛋白含量下降。

4. 细胞中主要色素为叶绿素 a、 b， 新黄质， 紫黄质， 环氧玉米黄质， 玉米黄质， 叶黄素以及 β -胡萝卜素。 在高脂诱导、 合成过程中， 细胞的色素组成不变， 各色素 的比例随诱导及培养条件的不同而有所变化， 但色素总量呈下降趋势。

5. 在高脂诱导、 合成过程中， 细胞的呼吸速率上升， 光合速率下降。

6. 细胞中脂的主要成分： C16、 C18系饱和和不饱和脂肪酸， 为肉豆蔻酸、 棕榈 酸、 棕榈油酸、 硬脂酸、 油酸、 亚油酸、 亚麻酸中的一种或几种。

本发明以小球藻的野生株系为材料，采用化学 诱变，脂合成抑制剂筛选的诱变育 种方法， 结果得到了一个产脂率高达出发株 2.14倍、 生理生化特性稳定、 具有稳定 遗传性能的小球藻优良突变株。

本发明所具有的优点： 本发明与现有的高脂微藻突变株选育方法区别 在于， 从诱 变处理后的藻株中， 直接选育耐受脂合成抑制剂的微藻突变株， 因而避免了低脂突变 株和脂含量变化不显著的突变株的干扰， 实现了高脂突变株的定向筛选，避免了盲目 性， 因此大大提高了选育效率， 减少了无用工作量， 节约了研发成本和研发时间。 具体实施方式

以下结合实施例为本发明作进一步描述。

第一步、在无菌操作台上，挑取固体培养基上 生长状态良好的原始野生株小球藻 ( Chlorella kessleri) 藻落， 接种到含 10 ml无菌 Kuhl培养基的 50 ml三角瓶中， 在 温度为 25 V , 转速为 150 rpm， 光照强度为 100 μ mol m ² s" ¹ 连续光照的摇床中振 荡培养。 Kuhl培养基配方： 10 g/L葡萄糖、 l g/L硝酸钾、 89 mg/L十二水磷酸氢二 钠、 621 mg/L二水磷酸二氢钠、 246 mg/L七水硫酸镁、 9.3 mg/L EDTA、 6.9 mg/L七 水硫酸亚铁、 14.7 mg/L二水氯化钙、 0.29 mg/L七水硫酸锌、 0.17 mg/L一水硫酸锰、 0.06 mg/L硼酸、 0.002 mg/L五水硫酸铜、 0.012 mg/L 四水钼酸铵， 加水至总体积 1000ml, pH 6.5。

第二步、 取第一步中生长至指数期的藻液， 进行 EMS化学诱变处理。 在黑暗无 菌条件下， 取 3 ml藻液到有盖的无菌玻璃试管中， 加入 300 W 1 EMS溶液 （1M)， 充分混匀。 25 °C处理 30 min， 以处理 0 min作为空白对照。 加入 EMS溶液等体积无 菌现配的硫代硫酸钠溶液 （10%， w/v) 终止诱变反应。

第三步、 将第二步中诱变处理完毕的藻细胞分别用新鲜 无菌 Kuhl 培养基离心 ( 3000 rpm, 10 min)清洗两次， 收集沉淀将其悬浮在 3 ml新鲜无菌 Kuhl培养基中， 4°C避光存放。

第四步、观测第三步中悬浮液的细胞浓度， 而后将第三步中悬浮液稀释至空白对 照组细胞密度， 空白对照组细胞密度约为 1 X 10 ³ cells/ml， 取 100 μ ΐ稀释的藻液涂 布高脂定向筛选平板， 将涂布了藻液的 500个平板置于 25 °C的程控恒温培养箱中无 光静置培养。

所述配制的高脂定向筛选平板为， 配制含有 15 g/L琼脂的高起始 C/N比（30 g/L 葡萄糖、 1 g/L硝酸钾） 的 Kuhl培养基， 于 120°C 下高压蒸汽灭菌 20分钟后冷却至 50°C， 加入过滤灭菌后的脂合成抑制剂浅蓝菌素 （Cerulenin) 至终浓度为 200 μ M， 轻轻摇动混匀， 倒制成高脂定向筛选平板。

第五步、将能够在第四步中生长的菌株与对照 （原始小球藻）相比单克隆藻明显 增大的单克隆藻落挑出， 悬浮到装有 3 ml新鲜无菌 Kuhl液体培养基的玻璃试管中， 在温度为 25 °C， 转速为 150 rpm， 光照强度为 100 w mol m- ² s- ¹ 连续光照的摇床中振 荡培养， 进行扩种继代培养；

第六步、 将第五步中生长至指数期的藻液中加入已灭菌 的 50%葡萄糖母液 （取 250 g葡萄糖溶于水中至总体积 500 ml) 至终浓度为 50 g/L, 诱导藻细胞内脂的大量 合成。

第七步、 在第六步中诱导培养 6天时， 取 50 ml藻液， 用去离子水 3000 rpm低 温离心洗涤 2次， 去除上清， 藻泥沉淀进行真空冷冻干燥处理 24 h， 得到干藻粉。

第八步、 称取第七步中所述干藻粉 20 mg， 加入 l ml甲苯、 2 ml 1%硫酸一甲醇 (体积比为硫酸： 甲醇 =1 :99)、 0.8 ml十九烷酸 （C19:0 ) 内标液， 漩涡仪上混匀后， 置于 50 。C 振荡水浴过夜。取出， 冷却后， 加入 5 ml 5% NaCl水溶液、 3 ml正己烷， 漩涡仪上混匀， 离心收集上层液体， 重复多次直至提取完全， 向收集的上层液中加入 6 ml 2% KHC0 ₃ 水溶液， 漩涡仪上混匀， 离心收集上层液体， 用氮吹仪吹干溶剂后， 用正己烷定容至 l ml， 去除杂质后转移入色谱进样瓶中， 4 °C保存。将样品中的有效 脂肪酸提取并甲酯化以便利用气相色谱 （GC ) 测定。

利用气相色谱 （GC ) 法测定第八步所述提取液。 色谱条件为： DB-23 毛细管气 相色谱柱（30 m X 0.25 mm X 0.25 rn) ; 氮气为载气； 采用分流模式， 进样体积 为 1 μ 1;进样口温度为 250°C ; FID检测器温度为 260°C ;柱温箱的温度为以 2.5 °C/min 的升温速率从 140 °C 升至 240 °C。通过比较脂肪酸甲酯与可信标准的停留时 间来识 别脂肪酸甲酯， 并且通过比较脂肪酸甲酯与内标的峰面积对脂 肪酸甲酯进行量化（参 见表 D o

本实施例以小球藻 CMorella kessler 为原始株， 经化学诱变剂 EMS处理， 高 脂定向筛选平板初筛， 获得 80个高脂突变株新品系， 经气相色谱法复筛， 分析结果 显示， 这 80个新品系确实全部为高脂突变株， 其中突变株的脂含量与野生株的脂含 量的比值为 110-150%的占 9%， 为 150-200%的占 43%， 200%以上的占 48%。

其中的一个新品系小球藻 ChhreUa kessleri) Al， 其目的产物脂的产脂率高达 野生株的 2.14倍， 而生长状况与出发株一致， 是一个理想的优良突变株， 可应用于 单细胞油脂及生物柴油的工业生产有一定的优 势。 该高脂突变株新品系于 2011年 5 月 27日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通� ��生物中心（CGMCC )保藏， 编号 为 CGMCC No. 4917,该藻株命名为：小球藻（ Chlorella kessleri) \ CGMCC No. 4917。 小球藻 Chhrella kessler Al CGMCC No. 4917藻株的脂肪酸组成、 各脂肪酸占总 脂肪酸的比例、 以及产脂率如下表 1 :

表 1 突变株 A1诱导脂合成六天时脂肪酸组成及含量与野生� ��的比较。

另夕卜， 将高脂突变株小球藻 Chlorella kessler Al CGMCC No. 4917藻株在扩 种继代培养不同代数时其产脂率和比生长速率 与原始野生株的比较如下表 2。

比生长速率的测定方法： 在藻细胞的指数生长期初期和后期， 各取 5 ml藻液称 细胞干重， 以公式 μ = ( Ln t-Ln o ) I (t-t ₀ ) 计算生长速率， μ为比生长速率， N _t 为 t时间的细胞干重值， N _Q 为起始细胞干重值。

表 2 突变株 A1继代培养时产脂率和比生长速率与野生株的� ��较。

突变株 产脂率比野生株提高 比生长速率 生长状况与野生株相比 倍数 ( h- ¹ )

第一代 2.18 0.050 相似 第二代 2.14 0.048 相似 第三代 2.20 0.049 相似 第四代 2.15 0.051 相似 继代培养 6个月 2.18 0.050 相似 继代培养 1年后 2.14 0.049 相似