La presente invención se refiere a una serie de compuestos derivados del cromano, así como sus diferentes usos, más concretamente en Ia identificación de compuestos terapéuticos, como compuestos reguladores de las proteínas desacoplantes o su uso terapéutico para el tratamiento de diferentes enfermedades y dolencias que cursen con un aumento en Ia actividad de dichas proteínas como son el cáncer, Ia caquexia, Ia diabetes no dependiente de insulina, las infecciones o Ia fiebre.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las "especies reactivas de oxígeno" (ROS) son moléculas muy reactivas debido a que tienen un electrón no pareado (radical libre) como el ion superóxido o el radical hidroxilo. Se incluyen en esta denominación las moléculas precursoras de los radicales libres, como por ejemplo el H ₂ O ₂ . Las ROS son un subproducto más del metabolismo oxidativo, siendo Ia acción de Ia NADPH oxidasa, Ia xantina oxidasa, el citocromo P450 y Ia cadena transportadora de electrones de Ia mitocondria las fuentes de ROS más significativas. Las ROS participan en procesos fisiológicos, actuando en muchos casos como señales intracelulares [D'Autréaux B, Toledano MB (2007) ROS as signalling molecules: mechanisms that genérate specificity in ROS homeostasis. Nat. Rev. Mol. CeII Biol. 8:813-24]. En situaciones fisiológicas normales hay un equilibrio entre Ia producción de ROS y su inactivación mediante los mecanismos celulares de defensa frente al estrés oxidativo, en los que intervienen moléculas antioxidantes de bajo peso molecular (tales como glutation y vitamina E) y enzimas como Ia catalasa, superóxido dismutasa y Ia glutation peroxidasa, que inactivan las ROS. Además, un aumento de Ia actividad de Ia cadena respiratoria también mitiga Ia producción mitocondrial de ROS. Cuando se rompe este equilibrio se produce el estrés oxidativo. Este genera una serie de cambios fisiológicos y bioquímicos que son Ia base de muchos procesos patológicos y que pueden originar incluso Ia muerte celular. El daño celular ocurre a varios niveles, siendo los más importantes Ia alteración del ADN mitocondrial, Ia peroxidación lipídica y Ia modificación covalente de proteínas.

El uso de agentes que provocan un aumento en Ia producción de ROS es una estrategia que se ha explotado de modo satisfactorio en Ia terapia contra el cáncer. Este objetivo se puede conseguir mediante dos aproximaciones: (i) induciendo directamente Ia generación de ROS en Ia célula tumoral o (ii) inhibiendo los sistemas de defensa. Entre los agentes químicos utilizados para esta estrategia están Ia procarbazina, vinblastina, doxorubicina, motexafina, camptotecina, neocarzinostatina, y el cisplatino [Renschler MF (2004) The emerging role of reactive oxygen species in cáncer therapy. Eur. J. Cáncer 40:1934-1940; y Ozben T (2007) Oxidative stress and apoptosis: impact on cáncer therapy. J. Pharm. Sci. 96:2181- 2196].

La respiración celular es un proceso mitocondrial de oxidación de azúcares y grasas. La transferencia de electrones desde las moléculas que se están oxidando hasta el oxígeno tiene lugar en Ia membrana mitocondrial interna y se acopla a un bombeo de protones de dentro hacia afuera de Ia mitocondria, con Io que se forma un gradiente de protones. La energía almacenada en este gradiente es usada para Ia síntesis del ATP mediante Ia fosforilación oxidativa de su precursor. El ATP es Ia molécula universal que permite almacenar Ia energía y distribuirla luego a Ia fabricación de componentes celulares, el transporte de moléculas, Ia transmisión de señales, etc. Los dos procesos (respiración y síntesis de ATP) se encuentran acoplados, de modo que Ia velocidad de oxidación de sustratos (respiración) se ajusta a Ia demanda celular de ATP, evitando así que se malgasten las reservas energéticas.

Las proteínas desacoplantes (uncoupling proteins, UCP) son transportadores que pertenecen a Ia superfamilia formada por los transportadores mitocondriales de metabolitos, proteínas relacionadas evolutivamente y que presentan semejanzas estructurales y funcionales. La función de las UCP es disminuir Ia eficiencia de Ia fosforilación oxidativa, mediante una disipación controlada del gradiente de protones [Krauss S, Zhang CY & Lowell BB (2005) The mitochondrial uncoupling protein homologues. Nature Rev. Mol. CeII Biol. 6:248-261]. En mamíferos se han descrito cinco UCP, con una distribución anatómica específica para cada una de ellas.

La proteína desacoplante UCP1 , exclusiva del tejido adiposo marrón de mamíferos, es Ia mejor conocida jugando un importante papel por ejemplo en el mantenimiento de Ia temperatura corporal en recién nacidos. Cuando Ia UCP1 es activada por ácidos grasos provoca que los protones vuelvan al interior de Ia mitocondria sin que haya síntesis de ATP. Se acelera, por tanto, Ia respiración, pero Ia energía del gradiente de protones se disipa en forma de calor [Nicholls DG, & Locke RM (1984) Thermogenic mechanisms in brown fat. Physiol. Rev. 64: 1-64]. La actividad transportadora es inhibida por los nucleótidos de purina que se unen en el interior de Ia proteína, a Ia que acceden desde Ia cara expuesta al espacio intermembranar. El sitio de unión de esos nucleótidos aún no se conoce con detalle, pero los datos disponibles sugieren que el anillo de purina interacciona con los loops (lazos) que cierran por el lado matricial el barril formado por las regiones transmembrana de Ia proteína [Ledesma A et al. (2002) Modeling the transmembrane arrangement of the uncoupling protein UCP1 and topological considerations of the nucleotide-binding site. J Bioenerg Biomembr. 34:473-86]. La UCP2 se encuentra en numerosos tejidos y órganos y su función no está totalmente esclarecida. Sin embargo, hay numerosas evidencias de su papel en el control de Ia producción de ROS, constituyendo un mecanismo de defensa frente al estrés oxidativo basado en que Ia inducción del desacoplamiento entre respiración y síntesis de ATP origina una aceleración de Ia respiración y esto provoca una reducción de Ia producción de ROS. [Krauss S, Zhang CY & Lowell BB (2005) The mitochondrial uncoupling protein homologues. Nature Rev. Mol. CeII Biol. 6:248-261]. El primer fenotipo que se describió en el ratón knock-out para Ia UCP2 fue unos mayores niveles de ROS en los macrófagos, Io cual confirió a estos ratones una mayor resistencia a Ia infección por toxoplasma [Arsenijevic D, et al. (2000) Disruption of the uncoupling protein-2 gene in mice reveáis a role in immunity and reactive oxygen species production. Nat. Genet. 26:435-439]. En consonancia con este posible papel protector frente al daño por estrés oxidativo, se ha encontrado que UCP2 está implicada en procesos patológicos en los que las ROS juegan un papel importante para el desarrollo de Ia enfermedad (aterosclerosis, cáncer e inflamación crónica) [Nübel T & Ricquier D (2006) Respiration under control of uncoupling proteins: clinical perspective. Hormone Res. 65:300-310].

El papel protector de UCP2 frente al daño por estrés oxidativo es relevante para el tratamiento del cáncer, ya que en muchos casos Ia aparición de células tumorales resistentes a Ia quimioterapia está asociada con su capacidad de defensa frente al estrés oxidativo [Benhar M, Engelberg D & Levitzki A (2002) ROS, stress-activated kinases and stress signalling in cáncer. EMBO Rep. 3:420-425 y Derdak Z et al. (2008) The mitochondrial uncoupling protein-2 promotes chemoresistance in cáncer cells. Cáncer Res. 68:2813-2819]. Existen datos que demuestran una mayor síntesis de UCP2, acompañada de una mayor protección frente al estrés oxidativo, en sublíneas de células tumorales resistentes a quimioterapia [Harper ME, et al. (2002) Characterization of a novel metabolic strategy used by drug- resistant tumor cells. FASEB J. 16:1550-1557]. Asimismo, se ha encontrado aumento de Ia expresión de UCP2 en cáncer de colon [Horimoto M, et al. (2004) Expression of uncoupling protein-2 in human colon cáncer. Clin. Cáncer Res. 10:6203-6207] y que esta mayor síntesis está asociada a una respuesta al estrés oxidativo [Derdák Z, et al. (2006) Enhanced colon tumor induction in uncoupling protein-2 deficient mice is associated with NF-kB activation and oxidative stress. Carcinogenesis 27:956-961]. Además, se ha demostrado que un aumento de Ia expresión de Ia UCP2 en Ia línea celular de hematoma HepG2 disminuye el daño por estrés oxidativo y hace las células más resistentes a Ia apoptosis [Jones CP, et al. (2005) Increased expression of uncoupling protein 2 in HepG2 cells attenuates oxidative damage and apoptosis. Liver Int. 25:880-887].

Por otra parte, el cáncer es una causa de Ia caquexia, un proceso multifactorial que provoca un incremento del gasto energético, anorexia, pérdida de las reservas de grasa y degradación proteica, y conlleva una severa pérdida de peso que es, en muchos casos, Ia causa de Ia muerte del enfermo de cáncer. La zinc-a2-glicoproteína (ZAG), segregada por los tumores caquécticos, promueve Ia oxidación de las reservas de lípidos y provoca un aumento en los niveles de UCP2 en el músculo esquelético, tejido adiposo e hígado así como en los de UCP3 en músculo [Bing C et al. (2002) Expression of uncoupling proteins-1 -2 and -3 mRNA is induced by adenocarcinoma-derived lipid-mobilizing factor. Br. J. Cáncer 86: 612- 618; y Sanders PM & Tisdale MJ (2004) Effect of zinc-a2-glycoprotein (ZAG) on expression of uncoupling proteins in skeletal muscle and adipose tissue. Cáncer Lett. 212: 71-81]. Las UCP podrían estar jugando un doble papel en este proceso: actuar como vías disipadoras de energía y como mecanismo de protección frente al estrés oxidativo que se origina por Ia alta oxidación lipídica. Las UCP pueden por tanto ser dianas farmacológicas para el tratamiento del cáncer y para mitigar los efectos de Ia caquexia tumoral. El desarrollo de inhibidores de su actividad desacoplante serviría para potenciar el efecto antitumoral de todos aquellos agentes que actúan aumentando el estrés oxidativo y también contrarrestaría el efecto del aumento en los niveles de UCP2 en los tumores caquécticos.

Además de los nucleótidos de purina, que son los inhibidores naturales de las UCP, se ha descrito un compuesto natural, Ia genipina, que actúa como inhibidor de Ia UCP2 en células beta pancreáticas [Zhang CY, et al. (2006) Genipin inhibits UCP2-mediated protón leak and acutely reverses obesity- and high glucose-induced beta cell dysfunction in isolated pancreatic islets. CeII Metabolism 3:417-427 y Zhang CY, et al. (2008) Genipin derivatives and uses thereof. Publicación US2008/0009450 A9]. Este compuesto se obtiene a partir de extractos de los frutos de Ia planta Gardenia jasmonides EINs, que han sido utilizados en Ia medicina tradicional china para tratar una variedad de patologías, incluida Ia diabetes tipo 2. La relación entre UCP2 (como modulador de Ia secreción de insulina) y Ia diabetes tipo 2 está bien establecida [Zhang CY, et al. (2001 ) Uncoupling protein-2 negatively regulates insulin secretion and is a major link between obesity, beta cell dysfunction, and type 2 diabetes. CeII 105:745-755]. Aunque Ia citotoxicidad de Ia genipina es baja, puede causar estrés oxidativo e inducir apoptosis [Kim BC, et al. (2005) Genipin- induced apoptosis in hepatoma cells is mediated by reactive oxygen species/c-Jun NH2-terminal kinase-dependent activation of mitochondrial pathway. Biochem Pharmacol. 70:1398-407].

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En Ia presente invención se describen una serie de compuestos derivados del cromano. Dichos compuestos han sido caracterizados como inhibidores de Ia actividad transportadora de Ia UCP1 tras un primer cribado realizado en levaduras y validados posteriormente como inhibidores de Ia UCP2 utilizando células tumorales. Estos compuestos pueden ser utilizados para el tratamiento de enfermedades y dolencias en las que hay un aumento en los niveles y/o actividad de las UCPs como, por ejemplo, pero sin limitarse a, el cáncer, Ia caquexia tumoral, Ia diabetes no dependiente de insulina, las infecciones o Ia fiebre.

Por tanto, un primer aspecto de Ia presente invención se refiere a compuestos derivados del cromano, que presentan Ia fórmula general (I), sus enantiómeros, y cualquiera de sus sales aceptables farmacéuticamente (a partir de ahora compuestos de Ia invención):

(I)

Donde: R ¹ y R ² , son iguales o diferentes entre sí, y están representados por un átomo de hidrógeno (H) o un grupo alquilo (Ci-Ce); R ³ está representado por un átomo de H, un halógeno, un grupo arilo o un grupo -COOR ⁵ ; donde R ⁵ es alquilo (C ₁ -C ₄ ) o un alquilarilo; y R ⁴ está representado por un átomo de hidrógeno (H), un grupo alquilarilo o un grupo alquilo (d-Cβ), lineal o ramificado.

Una realización preferida de los compuestos de Ia invención comprende derivados 2,2-alquilcromanos, donde R ¹ es un grupo alquilo (CrC ₄ ), más preferiblemente un grupo metilo, y R ² es H.

Otra realización preferida de los compuestos de Ia invención comprende derivados 4,4-alquilcromanos, donde R ¹ es H y R ² es un grupo alquilo (Ci- C ₄ ), más preferiblemente R ² es un grupo metilo.

El término "alquilo" se refiere en Ia presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 8 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, tert-butilo, sec-butilo, n- pentilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 4 átomos de carbono.

El término "arilo" se refiere en Ia presente invención a una cadena carbocíclica aromática, que tiene de 6 a 12 átomos de carbono, pudiendo ser de anillo único ó múltiple, en este último caso con anillos separados y/o condensados. Un ejemplo, no limitante, de arilo es un grupo fenilo.

Por "arilalquilo" se entiende en Ia presente invención a un grupo arilo unido al resto de Ia molécula por un grupo alquilo. Un ejemplo, no limitante, de arilalquilo es un grupo bencilo.

Por "halógeno" se entiende en Ia presente invención a un átomo de bromo, cloro, yodo o flúor.

Otra realización preferida de Ia presente invención comprende cualquiera de los compuestos de fórmula: 8-isopropil-2,2-dimetilcromano; 6-bromo-8- etil-2,2-dimetilcromano; 6-bromo-2,2-dimetil-8-propil-cromano; 6-bromo-8- isopropil-2,2-dimetilcromano; 6-bromo-8-terc-butil-2,2-dimetilcromano; 6- bromo-8-isopropil-4,4-dimetilcromano; 6-fenil-8-isopropil-2,2- dimetilcromano; 8-isopropil-2,2-dimetilcroman-6-carboxilato de etilo; ó 4,4- dimetilcroman-8-isopropil-6-carboxilato de etilo. Los compuestos de Ia invención, de fórmula general (I), en los que R ¹ es alquilo (d-Cs), R ² es H, y R ³ es H ó halógeno se obtienen por reacción de un alcohol alílico con un fenol en presencia de una cantidad catalítica de ácido p-toluensulfónico (Esquema 1 ).

Esquema 1

La síntesis de los compuestos de Ia invención, de fórmula general (I), en los que R ¹ es H, R ² es alquilo (CrCs) y R ³ es H o halógeno se puede llevar a cabo en una secuencia de tres pasos (Esquema 2). El primer paso es Ia reacción entre un bromuro alílico (a) y un fenol (b) en presencia de una base, que produce un aril alil éter (c). La transformación de (c) en (d) se realiza por tratamientos consecutivos con acetato de mercurio, borohidruro sódico y finalmente NaOH. En el tercer paso, (d) cicla en presencia de tricloruro de aluminio, dando lugar a los derivados de cromano de fórmula general (I) en los que R ² es alquilo (CrCs) y R ³ es H o halógeno.

HF H ₂ O

Esquema 2 Los compuestos de fórmula general (I) en los que R ³ es arilo se preparan por reacción de los bromo crómanos (e) (siendo R ³ = Br) con arilestannanos (f) y un catalizador de paladio, en presencia de cristales de BHT (2,6-di-terc-butil-4-metilfenol) en tolueno (Esquema 3).

Esquema 3

Los compuestos de fórmula general (I) en los que R ³ = -COOR ⁵ se preparan por reacción de los bromo crómanos (e) (siendo R ³ = Br) con íerc-butillitio en tetrahidrofurano a 78 ⁰ C [1 )], seguido por adición del un electrófilo adecuado, por ejemplo un cloroformiato [2)] (Esquema 4).

Esquema 4

Los compuestos de Ia invención pueden tener las siguientes aplicaciones o usos:

- reguladores de Ia actividad de las proteínas desacoplantes;

- reguladores del consumo de oxígeno celular modulando Ia actividad respiratoria mitocondrial;

- reguladores de Ia producción de ROS, a través de Ia modulación de la actividad de las proteínas desacoplantes;

- tratamiento de patologías asociadas a un aumento de Ia actividad de las proteínas desacoplantes;

- inhibidores de Ia actividad de las proteínas desacoplantes en el tratamiento de enfermedades como el cáncer;

- inhibidores de Ia actividad de las proteínas desacoplantes en el tratamiento de enfermedades como Ia diabetes no dependiente de insulina;

- inhibidores de Ia actividad de las proteínas desacoplantes en el tratamiento de enfermedades en las que se necesite aumentar Ia producción de radicales libres en los macrófagos para combatir las infecciones; o

- inhibidores de Ia actividad de las proteínas desacoplantes en el tratamiento de enfermedades como Ia caquexia y dolencias como Ia fiebre.

Por tanto, otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de cualquiera de los compuestos de Ia invención para Ia elaboración de una composición farmacéutica. Preferiblemente, Ia composición farmacéutica es capaz de inhibir Ia actividad desacopladora de las proteínas desacoplantes.

Un aspecto más de Ia presente invención se refiere al uso de cualquiera de los compuestos de Ia invención para Ia elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades y/o dolencias en las que hay un aumento en los niveles y/o actividad de las proteínas UCP, como por ejemplo, no limitante, cualquiera del grupo que comprende el cáncer, Ia caquexia tumoral, Ia diabetes no dependiente de insulina, las infecciones o Ia fiebre.

Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de Ia invención en cantidad terapéuticamente efectiva, o mezclas de los mismos, una sal, profármaco, solvato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo junto con un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable, para Ia administración a un paciente.

Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en Ia materia y utilizados habitualmente en Ia elaboración de composiciones terapéuticas.

En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a Ia cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar Ia acción terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, Ia edad y estado del paciente, Ia severidad de Ia alteración o trastorno, y de Ia ruta y frecuencia de administración.

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1.- Comparación del efecto inhibidor del nucleótido GDP (guanidin- difosfato) y del derivado de cromano E379 en mitocondrias aisladas de

Sacharomyces cerevisiae transformada para que exprese Ia proteína desacoplante UCP1. Fig. 1A.- Disminución de Ia fluorescencia del NADH con el tiempo debido a su oxidación por las mitocondrias. Fig. 1 B.- Consumo de NADH. En ambas figuras se representan los resultados obtenidos en situación basal (control) en presencia del activador palmitato (círculos), tras Ia adición del inhibidor GDP a una concentración de 100 μM (triángulos negros hacia abajo) y tras Ia adición de compuesto E379 a una concentración de 20 μM (triángulos blancos hacia arriba).

Figura 2.- Efectos de distintos compuestos derivados de cromano a distintas concentraciones (0, 2, 20 y 125 μM) sobre Ia respiración de mitocondrias aisladas de S. cerevisiae transformadas con un vector con el que no se expresa ninguna proteína recombinante (círculo negro) y transformadas para que expresen UCP1 (cuadrados).

Figura 3.- Actividad inhibidora de compuestos derivados de cromano. Se representa Ia EC ₅₀ para Ia inhibición de Ia actividad de Ia UCP1 determinada a partir de Ia velocidad de oxidación de NADH en mitocondrias aisladas de S. cerevisiae transformadas para que expresen UCP1 a Ia que se sustrajo el efecto de los mismos compuestos observado en mitocondrias de S. cerevisiae no transformadas. En todos los casos, las concentraciones de inhibidor usadas para el cálculo de Ia EC50 fueron 0, 2, 20, 125 y 250 μM. Las barras cortadas representan valores de EC50 mayores de 200 μM.

Figura 4.- Efecto del compuesto E379 sobre Ia supervivencia de las células de Ia línea celular de adenocarcinoma de colon humano Caco-2, tratadas con trióxido de arsénico. Fig. 4A.- Inmunodetección de Ia proteína desacoplante UCP2 en extractos mitocondriales obtenidos a partir de cultivos de Ia línea celular Caco-2. Como control se muestra Ia señal obtenida con mitocondrias extraídas de bazo. Fig. 4B.- Efecto del compuesto E379 sobre Ia viabilidad de las células de Ia línea Caco-2 tratadas durante 24 horas con distintas concentraciones de trióxido de arsénico en ausencia (círculos) o en presencia (cuadrados) del compuesto E379 a una concentración de 50 μM.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se describe adicionalmente en conexión con los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1 : Síntesis de 2,2-dimetilcromanos

El procedimiento general es Ia adición gota a gota de 3-metil-2-buten-1-ol a una disolución de un fenol y ácido p-toluensulfónico en 1 ,2-dicloroetano (3,5 mL/mmol) y posterior calentamiento a 80 ⁰ C hasta Ia completa desaparición del sustrato de partida. Posteriormente se hidroliza Ia mezcla con disolución saturada de NaHC03 (1 ,5 mL/mmol) y H ₂ O (2 mL/mmol) y se separan las fases. Se extrae Ia fase acuosa con Et ₂ O, se secan las fases orgánicas reunidas con MgSO ₄ anhidro, y se filtran y concentran a presión reducida para dar lugar a un crudo de reacción del que, tras purificación cromatográfica en gel de sílice, se obtiene el 2,2- dimetilcromano.

Síntesis de 8-¡sopropil-2,2-d¡met¡lcromano (E155).

A partir de 2-isopropilfenol (0,41 mL, 3,0 mmol), 3-metil-2-buten-1-ol (0,10 mL, 1 ,0 mmol) y ácido p-toluensulfónico (9,5 mg, 0,05 mmol) siguiendo el procedimiento general (2 h) se obtuvo un crudo de reacción que tras purificación (usando EtOAc-hexano 1-5 %) condujo a 91 mg (0,45 mmol,

45 %) de E 155 como un aceite amarillo.

Datos de E155: R _f = 0.58 (EtOAc/Hex, 10 %). ¹ H RMN (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 1 ,21 (d, 6 H, J = 7,1 Hz), 1 ,34 (s, 6 H), 1 ,79 (t, 2 H, J = 6.8 Hz, H ₃ ), 2.79 (t,

2 H, J = 6.7 Hz, H ₄ ), 3.27 (sept, 1 H, CH), 6.79 (t, 1 H, J = 7,4 Hz, H ₆ ), 6,91 (d, 1 H ₁ J = 7,8 Hz, H ₅ ), 7.04 (d, 1 H, J = 7,4 Hz, H ₇ ). ¹³ C RMN (CDCI ₃ , 75 MHz) δ 22.4 (2 C), 22,7, 26,9 (2 C), 27,0, 32,7, 73,7, 119,1 , 120,3, 123,6, 126,8, 136,5, 151 ,1. EM (API-ES): 205 [M+H] ⁺ . IR (película): 2972, 2928, 2866,1591 , 1453, 1444, 1368, 1240, 1219, 1199, 1157, 1123, 942, 746 cm ^{" 1} .

Síntesis de 6-bromo-8-etil-2,2-d¡met¡lcromano (E225).

A partir de 4-bromo-2-etilfenol (402 mg, 2,0 mmol), 3-metil-2-buten-1-ol

(0,41 ml_, 4,0 mmol) y ácido p-toluensulfónico (57 mg, 0,3 mmol) siguiendo el procedimiento general (20 h) se obtuvo un crudo de reacción que tras purificación (usando hexano) condujo a 439 mg (1 ,64 mmol, 82 %) de E225 como un aceite amarillo.

Datos de E225: R _f = 0,42 (EtOAc/Hex, 5 %). ¹ H RMN (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 1 ,13 (t, 3 H, J = 7,5 Hz), 1.29 (s, 6 H), 1.74 (t, 2 H J = 6,8 Hz, H ₃ ), 2,52 (c, 2 H, J = 7,5 Hz), 2.72 (t, 2 H, J = 6,8 Hz, H ₄ ), 7,01 (s, 1 H), 7,03 (s, 1 H). ¹³ C RMN (CDCI ₃ , 75 MHz) δ 13,8, 22,5, 23,1 , 26,9 (2 C), 32,4, 74,1 111 ,1 , 122,5, 129,3, 129,3, 134,6, 150,8. EM (API-ES): 291 [M+Na] ⁺ , 270 [M+2] ⁺ , 268 [M] ⁺ . IR (película): 2974, 2932, 2873, 1456, 1369, 1239, 1201 , 1157, 1123, 928, 866, 835 cm ^"1 .

Síntesis de 6-bromo-2,2-dimet¡l-8-prop¡l-cromano (E221 ). A partir de 4-bromo-2-propilfenol (430 mg, 2,0 mmol), 3-metil-2-buten-1-ol (0,41 ml_, 3,5 mmol,) y ácido p-toluensulfónico (38 mg, 0,2 mmol) siguiendo el procedimiento general (20 h) se obtuvo un crudo de reacción que tras purificación (usando EtOAc-hexano, 0-10 %) condujo a 487 mg (1 ,72 mmol, 86 %) de E221 como un aceite amarillo. Datos de E221 : R _f = 0,45 (EtOAc/Hex, 5%). ¹ H RMN (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 0,90 (t, 3 H, J = 7,3 Hz), 1 ,28 (s, 6 H), 1 ,54 (sext, 2 H, J = 7,6 Hz), 1 ,74 (t, 2 H, J = 6,8 Hz, H ₃ ), 2.47 (t, 2 H, J = 7,3 Hz), 2,71 (t, 2 H, J = 6,8 Hz, H ₄ ), 7,00-7.02 (m, 2 H, H ₇ , H ₅ ). ¹³ C RMN (CDCI ₃ , 75 MHz) δ 13,9, 22,6, 22,7, 26,9 (2 C), 31 ,9, 32,5, 74,1 , 110,9, 122,5, 129,3, 130,2, 133,1 , 150,9. EM (IE): 284 [M+2] ⁺ , 282 [M] ⁺ , 227, 69 (100 %). IR (película): 2959, 2926, 2867, 1456, 1382, 1369, 1240, 1201 , 1157, 1123, 942 cm ^"1 .

Síntesis de 6-bromo-8-¡soprop¡l-2,2-dimet¡lcromano (E183). A partir de 4-bromo-2-isopropilfenol (697 mg, 3,2 mmol), 3-metil-2-buten-1-

01 (0,83 ml_, 7,9 mmol) y ácido p-toluensulfónico (62 mg, 0,3 mmol) siguiendo el procedimiento general (40 h) se obtuvo un crudo de reacción que tras purificación (usando EtOAc-hexano, 1 %) condujo a 623 mg (2,2 mmol, 68 %) de E183 como un aceite amarillo. Datos de E183: R _f = 0,44 (EtOAc/Hex, 5 %). ¹ H RMN (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 1 ,15 (d, 6 H, J = 6,8 Hz), 1 ,29 (s, 6 H), 1.75 (t, 2 H, J = 6,8 Hz, H ₃ ), 2,76 (t,

2 H, J = 6,8 Hz, H ₄ ), 3,19 (sept, 1 H, J = 6.8 Hz), 7,00 (s, 1 H, H ₇ ), 7.07 (s, 1 H, H ₅ ). ¹³ C RMN (CDCI ₃ , 75 MHz) δ 22,3 (2 C), 22,6, 26,8 (2 C), 26,9, 32,4, 74,1 , 111 ,5, 122,6, 126,7, 129,1 , 138,9, 150,2. EM (API-ES): 285 [M+2] ⁺ , 284 [M+1] ⁺ , 283 [M] ⁺ . IR (película): 2973, 2926, 2871 , 1459, 1441 , 1240, 1200, 1159, 1123, 941 , 863, 762 cm ^"1 . Anal, caled para Ci ₄ H ₁₉ BrO: C = 59,37; H = 6,76, Br = 28,21. Encontrado: C = 59,60; H = 6,84, Br = 27,88.

Síntesis de 6-bromo-8-ferc-butil-2,2-d¡met¡lcromano (E231 ).

A partir de 4-bromo-2-terc-butilfenol (458 mg, 2,0 mmol), con 3-metil-2- buten-1-ol (0,31 ml_, 3,0 mmol) y ácido p-toluensulfónico (38 mg, 0,2 mmol) siguiendo el procedimiento general (22 h) se obtuvo un crudo de reacción que tras purificación (usando hexano) condujo a 557 mg (1 ,87 mmol, 94 %) de E231 como un aceite amarillo.

Datos de E231 : R _f = 0.46 (EtOAc/Hex, 5 %). ¹ H RMN (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 1 ,32 (s, 15 H), 1 ,75 (t, 2 H, J = 6,8 Hz, H ₃ ), 2.74 (t, 2 H, J = 6,9 Hz, H ₄ ), 7.03 (d, 1 H, J= 2,4 Hz), 7,15 (d, 1 H, J = 2,2 Hz). ¹³ C RMN (CDCI ₃ , 75 MHz) δ 22,9, 26,8 (2 C), 29,5 (3 C), 32,3, 34,9, 74,3, 111.3, 123.0, 127.4, 129.8, 140.2, 151.6. EM (IE): 298 [M+2] ⁺ , 296 [M] ⁺ , 281 [M-15] ⁺ , 241 [M- 55] ⁺ , 225 [M-71] ⁺ (100%). IR (película): 2971 , 2950, 2867, 1436, 1384, 1369, 1241 , 1215, 1166, 1124, 938, 868, 715 crτϊ ¹ .

EJEMPLO 2: Síntesis de 6-fenil-8-isopropil-2,2-dimetilcromano (E379). A una disolución de 6-bromo-8-isopropil-2,2-dimetilcromano (47 mg, 0,17 mmol) en tolueno anhidro (6 mL/mmol), se añadió Pd(PPlIs) ₄ (4 mg, 0,034 mmol) y BHT (2 cristales). La mezcla se agitó y se Ie añadió gota a gota feniltributilestannano (0,10 ml_, 0,26 mmol). Se calentó a reflujo de tolueno (110 ⁰ C) hasta observar Ia desaparición del producto de partida. Tras 16 h se eliminó el disolvente a presión reducida, se disolvió en EtOAc y se filtró en gel de sílice para dar lugar a un crudo que tras purificación con CH ₂ CI ₂ - hexano al 2 %, condujo a 30 mg (0,11 mmol, 65 %) de E379 como un aceite incoloro. Datos de E379: R _f = 0.28 (EtOAc/Hex, 5 %). ¹ H RMN (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 1.07 (d, 6 H, J = 6.9 Hz), 1.34 (s, 6 H), 1.81 (t, 2 H, J = 6,6 Hz, H ₃ ), 2.83 (t, 2 H, J = 6,9 Hz, H ₄ ), 3.29 (sept, 1 H, J = 7. ,3 Hz), 7.12 (s, 1 H), 7.24 (m, 2 H), 7.37 (m, 2 H), 7.53 (d, 2 H). ¹³ C RMN (CDCI ₃ , 75 MHz) δ 22.5 (2 C), 22.9, 27.0 (2 C), 27.1 , 32.8, 74.0, 120.5, 122.8, 125.5, 126.2, 126.8 (2 C), 128.5 (2 C), 132.1 , 136.8, 141.7, 150.9. EM (IE): 280 [M] ⁺ (100%), 265 [M- 15] ⁺ , 163 [M-55] ⁺ . IR (película): 3056, 3026, 2927, 2926, 2867, 1600, 1573, 1464, 1368, 1252, 1216, 1188, 1158, 1123, 943, 877, 762, 697 crτϊ ¹ .

EJEMPLO 3: Síntesis de 4,4-dimetilcromanos

Síntesis de 4-bromo-2-isoprop¡lfen¡l 3-metilbut-2-en-1-il éter (intermedio c). A una disolución de 4-bromo-2-isopropilfenol (851 mg, 3,9 mmol) en acetona anhidra (1.5 mL/mmol) se añadió K ₂ CO ₃ (819 mg, 5,9 mmol), yoduro de tetrabutilamonio (0,30 mmol) y 4-bromo-2-metil-2-buteno (0.6 mL, 4,7 mmol). La suspensión se agitó a temperatura ambiente hasta observar Ia desaparición del producto de partida. Después de 20 h se añadió una disolución saturada de ditionito de sodio y H ₂ O, se separaron las fases, se extrajo Ia fase acuosa tres veces con EtOAc, las fases orgánicas se secaron con MgSO ₄ anhidro, se filtraron y concentraron a presión reducida para dar lugar a un crudo de reacción que, tras purificación cromatográfica en gel de sílice (usando EtOAc-hexano, 2-4 %) condujo a 890 mg (3,4 mmol, 93 %) del producto puro, como un aceite incoloro.

Datos de 4-bromo-2-isoprop¡lfen¡l 3-metilbut-2-en-1-il éter: Rf = 0,52 (EtOAc/Hex, 5 %). ¹ H RMN (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 1 ,16 (d, 6 H, J = 6,8 Hz), 1 ,70 (s, 3 H), 1.76 (s, 3 H), 3,27 (sept, 1 H, J = 6,9 Hz), 4,47 (d, 2 H, J = 6,6 Hz), 5,44 (m, 1 H), 6,69 (d, 1 H, J = 8,7 Hz), 7,19-7,26 (m, 2 H). ¹³ C RMN (CDCI ₃ , 75 MHz) δ 18,2, 22,5 (2 C), 25,7, 26,8, 65,3, 112,9, 113,4, 119,8, 128,9, 129,1 , 137,5, 139.8, 155,1. EM (IE): 284 [M+2] ⁺ , 282 [M] ⁺ , 214 [M-68] ⁺ , 199 [M-83] ⁺ , 149 (100%). IR (película): 2964, 2926, 2865, 1485, 1447, 1342, 1239, 1189, 1003, 803 crrϊ ¹ .

Síntesis de 4-(4-bromo-2-isoprop¡lfenox¡)-2-met¡lbutan-2-ol (intermedio d) A una disolución de acetato de mercurio (1 ,06 g, 3,3 mmol) en THF:H ₂ O (1 ,0:1 ,5 mL/mmol) se añadió gota a gota una disolución de 4-bromo-2- isopropilfenil 3-metilbut-2-en-1-il éter (799 mg, 3.3 mmol) en THF (0,5 mL/mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente hasta observar Ia desaparición del producto de partida. Después de 2 h 30 minutos se añadió NaOH 3 M (1 ,9 mL, 5,6 mmol), y una disolución de NaBH ₄ (125 mg) en NaOH 3 M (1 ,4 mL, 4,3 mmol). La mezcla resultante se agitó durante 30 minutos, hasta observar Ia completa formación del producto, tras los cuales se diluyó con hexano y se hidrolizó con disolución saturada de NH ₄ CI (3 mL/mmol) y H ₂ O (1 ,5 mL/mmol), se separaron las fases, Ia fase acuosa se extrajo dos veces con hexano y una vez con Et ₂ O. La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de NH ₄ CI, se secó con MgSO ₄ anhidro, se filtró y concentró a presión reducida para dar lugar a un crudo de reacción que tras purificación cromatográfica en gel de sílice (usando EtOAc-hexano, 5-50 %) condujo a 506 mg (1 ,7 mmol, 51 %) del producto puro, como un aceite incoloro. Datos de 4-(4-bromo-2-¡sopropilfenox¡)-2-met¡lbutan-2-ol: R _f = 0,32 (EtOAc/Hex, 25 %). ¹ H RMN (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 1 ,14 (d, 6 H, J = 6,8 Hz), 1 ,28 (s, 6 H), 1 ,96-1 ,99 (m, 2 H), 3,19 (sept, 1 H, J = 6,8 Hz) 4,05-4,11 (m, 2 H), 5,25 (s, OH), 6,69 (d, 1 H, J = 8,5 Hz), 7,19 (dd, 1 H, J = 8,5, 2,4 Hz), 7.24 (d, 1 H, J = 2,4 Hz). ¹³ C RMN (CDCI ₃ , 75 MHz) δ 21 ,0, 22,5 (2 C), 26,7, 29,4, 41 ,8, 65,3, 70,2, 112,8, 113,3, 129,1 , 129,2, 139,2, 154,8. EM (API-ES): 325 [M+Na+H] ⁺ . IR (película): 3392, 2966, 2926, 2871 , 1489, 1474, 1240, 1191 , 1156, 1026, 879, 804 cm ^"1 .

Síntesis de 6-bromo-8-isoprop¡l-4,4-d¡met¡lcromano (E179).

A una suspensión de AICI ₃ (269 mg, 2,0 mmol) en CH ₃ NO2 (1 ,5 mL/mmol) enfriada a -5 ⁰ C se añadió gota a gota una disolución de 4-(4-bromo-2- isopropilfenoxi)-2-metilbutan-2-ol (407 mg, 1 ,3 mmol) en CH ₃ NO2 (0,5 mL/mmol). Se dejó subir Ia temperatura a 0 ⁰ C y se agitó a esa temperatura hasta observar Ia completa desaparición del producto de partida. Tras 2 h de reacción se hidrolizó con disolución saturada de NaHCO ₃ (2 mL/mmol) y H ₂ O, se separaron las fases y se extrajo Ia fase acuosa con hexano. La fase orgánica se secó con MgSO ₄ anhidro, se filtró y concentró a presión reducida para dar lugar a un crudo de reacción que tras purificación cromatográfica en gel de sílice (usando EtOAc-hexano, 1 %) condujo a 183 g (0,65 mmol, 48 %) de E179, como un aceite incoloro. Datos de E179: R _f = 0,56 (EtOAc/Hex, 5 %). ¹ H RMN (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 1 ,5 (d, 6 H, J = 6,9 Hz), 1 ,29 (s, 6 H), 1 ,79 (t, 2 H, J = 5,5 Hz, H ₃ ), 3,20 (sept, 1 H, J = 6,9 Hz), 4,16 (t, 2 H, J = 5,5 Hz, H ₂ ), 7,07 (d, 1 H, J = 2,3 Hz, H ₇ ), 7,24 (d, 1 H, J = 2,4 Hz, H ₅ ). ¹³ C RMN (CDCI ₃ , 75 MHz) δ 22,5 (2 C), 26,8, 31 ,1 , 31 ,3 (2 C), 37,4, 62,9, 112,4, 126,6 , 127,0, 133,4, 138,9, 149,9. EM (IE): 284 [M+2] ⁺ , 282 [M] ⁺ , 267 [M-15] ⁺ , 239 [M-43] ⁺ , 149 (100%). IR (película): 2962, 2932, 2871 , 1453, 1462, 1425, 1334, 1247,

1218, 1193, 1063, 865, 691 cm ^" EJEMPLO 4: Procedimiento de síntesis de esteres derivados de crómanos.

El procedimiento general consistió en añadirle gota a gota, a una disolución de 6-bromocromano en THF anhidro (5 mL/mmol de 6- bromocromano) enfriada a 78 ⁰ C, una disolución de íBuLi 1 ,5 M en pentano (2.0 equiv). La mezcla se agitó a 78 ⁰ C durante 20 minutos, tras los cuales se añadió mediante cánula, sobre una disolución de cloroformiato de etilo (1 ,5 equiv) en THF anhidro (3 mL/mmol de 6- bromocromano) enfriada también a 78 ⁰ C. La mezcla se agitó a Ia misma temperatura durante 30 minutos, hasta Ia completa formación del producto. A continuación, se hidrolizó a baja temperatura con disolución saturada de NH ₄ CI (4 mL/mmol). Se separaron las fases y Ia fase acuosa se extrajo con Et ₂ O. La fase orgánica se secó con MgSO ₄ anhidro, se filtró, y concentró a presión reducida para dar un crudo de reacción que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice.

Síntesis de 8-¡sopropil-2,2-d¡met¡lcroman-6-carbox¡lato de etilo (E1127). A partir de 6-bromo-8-isopropil-2,2-dimetilcromano (92 mg, 0,32 mmol), disolución de íBuLi 1 ,5 M en pentano (0,43 mL, 0,64 mmol,) y cloroformiato de etilo (46 μL, 0,48 mmol) siguiendo el procedimiento general se llegó a un crudo de reacción que tras purificación (usando EtOAc-hexano, 1-10 %) condujo a 47 mg (0,17 mmol, 53%) de E1127 como un aceite amarillo y a 17 mg (0,08 mmol, 26 %) del producto de protonolisis E155. Datos de E1127: R _f = 0,36 (EtOAc/Hex, 10 %). ¹ H RMN (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 1 ,19 (d, 6 H, J = 6,9 Hz), 1 ,32 (s, 6 H), 1 ,35 (t, 3 H, J = 6,9 Hz), 1 ,79 (t, 2 H ₁ J = 6,7 Hz, H ₃ ), 2,79 (t, 2 H, J = 6,6 Hz, H ₄ ), 3,22 (sept, 1 H, J = 6,9 Hz), 4.31 (c, 2 H, J = 7,2 Hz), 7,62 (s, 1 H, H ₅ ), 7,69 (s, 1 H, H ₇ ). ¹³ C RMN (CDCI ₃ , 75 MHz) δ 14,4, 22,3 (2 C), 22,6, 26,9 (3 C), 32,4, 60,4, 74,9, 120,0, 121 ,1 , 125,5, 128,9, 136,5, 155,4, 167,1 (C=O). EM (API-ES): 299 [M+Na], 277 [M+H] ⁺ . IR (película): 2974, 2932, 2867 1712, 1606, 1464, 1447, 1368, 1284, 1238, 1194, 1157, 1122, 771 cm ^"1 . Síntesis de 4,4-dimet¡lcroman-6-carbox¡lato de etilo (E1113). A partir de 6-bromo-4,4-dimetilcromano (169 mg, 0,7 mmol), disolución de íBuLi 1 ,5 M en pentano (0,9 ml_, 1 ,4 mmol) y cloroformiato de etilo (0,1 ml_, 1 ,05 mmol) siguiendo el procedimiento general, se llegó a un crudo de reacción que tras purificación (usando EtOAc-hexano, 1-10 %) condujo a 87 mg (0,3 mmol, 43 %) de E 1113 como un aceite amarillo y 15 mg (0,09 mmol, 13 %) del producto de protonolisis.

Datos de E1113: R _f = 0,33 (EtOAc/Hex, 10 %). ¹ H RMN (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 1 ,34 (s, 6 H), 1 ,34 (t, 3 H, J = 7,1 Hz), 1 ,83 (t, 2 H, J = 5,5 Hz, H ₃ ), 4,22 (m, 2 H), 4,32 (m, 2 H), 6.77 (d, 1 H, J = 8,5 Hz, H ₈ ), 7.74 (dd, 1 H, J = 8,7, 2,1 Hz, H ₇ ), 7,97 (d, 1 H, J= 2,1 Hz, H ₅ ). ¹³ C RMN (CDCI ₃ , 75 MHz) δ 14,4, 30,6, 30,8 (2 C), 37,1 , 60,5, 63,4, 116,8, 122,5, 128,7, 129,1 , 131 ,3, 157,6, 166,6. EM (API-ES): 235.1 [M+H] ⁺ . IR (película): 2932, 2963, 1713, 1611 , 1493, 1249, 1192, 1107, 1062, 771 cm ^"1 .

Síntesis de 8-¡soprop¡l-4,4-d¡metilcroman-6-carbox¡lato de etilo (E1131 B). A partir de 6-bromo-8-isopropil-4,4-dimetilcromano (86 mg, 0,30 mmol), disolución ÍBuLi 1 ,5 M en pentano (0,40 ml_, 0,61 mmol) y cloroformiato de etilo (58 μl_, 0,61 mmol) siguiendo el procedimiento general, se llegó a un crudo de reacción que tras purificación (usando EtOAc-hexano, 1-10 %) condujo a 50 mg (0,18 mmol, 60 %) de E 1131 B como un aceite amarillo y a 25 mg (0,12 mmol, 40 %) del producto de protonolisis. Datos de E1131 B: R _f = 0,35 (EtOAc/Hex, 10%). ¹ H RMN (CDCI ₃ , 300 MHz) δ 1 ,19 (d, 6 H, J = 6,8 Hz), 1 ,34 (s, 2 H), 1 ,36 (t, 3 H, J = 7,1 Hz), 1 ,82 (t, 2 H ₁ J = 5,5 Hz, H ₃ ), 3,32 (sept, 1 H, J = 6,9 Hz), 4,23 (t, 2 H, J = 5,5 Hz, H ₂ ), 4,32 (c, 2 H, J = 6,9 Hz), 7,69 (d, 1 H, J = 1 ,9 Hz), 7,83 (d, 1 H, J = 2,1 Hz). ¹³ C RMN (CDCI ₃ , 75 MHz) δ 14,3, 22,4 (2 C), 26,6, 30,7, 30,9 (2 C), 37,0, 60,3, 63,1 , 121 ,6, 124,9, 126,3, 130,7, 136,2, 154,8, 166,8 (C=O). EM (API-ES): 299 [M+Na] ⁺ , 277 [M+H] ⁺ . IR (película): 2962, 2932, 2873, 1713, 1664, 1465, 1322, 1267, 1249, 1220, 1191 , 1137, 1064, 1035, 771 cm ^"1 . EJEMPLO 5: Determinación de Ia capacidad del compuesto E379 como inhibidor de UCP1.

Para determinar si un compuesto dado inhibe Ia actividad de una UCP1 se determina su efecto sobre Ia velocidad de respiración de mitocondrias aisladas que contengan UCP1 activa, y se compara dicho efecto sobre el que tiene lugar en mitocondrias control sin UCP, para discriminar posibles efectos inespecíficos [Rial E, González-Barroso MM, et al. (1999) Retinoids actívate protón transport by the uncoupling proteins UCP1 and UCP2. EMBO J. 18: 5827-5833; Patente ES9800225].

La obtención de mitocondrias que contengan UCP1 se inició por transformación de Ia cepa W303 de Saccharomyces cerevisiae con el vector pYeDP-1/8-10, que inserta Ia secuencia de UCP1 en el genoma de Ia levadura bajo el control del promotor gal-cyc [Arechaga I, Raimbault S, et al. (1993) Cysteine residues are not essential for uncoupling protein function. Biochem. J. 296: 693-700]. Con este sistema, Ia expresión de UCP1 se reprime en presencia de glucosa y se activa en presencia de galactosa. La UCP1 expresada en estas levaduras recombinantes retiene sus propiedades características: transporte de protones activado por ácidos grasos e inhibido por nucleótidos. Como mitocondrias control se usaron las aisladas de Ia misma cepa de levadura transformada con un vector pYeDP en el que el ADN que codifica por Ia UCP1 se inserta en sentido inverso, Io que impide Ia síntesis de dicha proteína. La comparación de los efectos de un compuesto dado sobre Ia velocidad de respiración de ambos tipos de mitocondrias permite discriminar efectos inespecíficos de dicho compuesto sobre UCP1 [Rial E, González-Barroso MM, et al. (1999) Retinoids actívate protón transport by the uncoupling proteins UCP1 and UCP2. EMBO J. 18: 5827-5833; Patente ES9800225].

La medida de Ia actividad de Ia UCP1 en las mitocondrias se realizó de acuerdo a Rial E y Jiménez-Jiménez J (2001 ) Procedimiento para Ia determinación de Ia actividad de las proteínas desacoplantes (UCP) mediante Ia monitorización del consumo de NAD(P)H (Patente de invención ES2177404). En los ensayos realizados, Ia concentración inicial de NADH fue de 0.3 mM y, puesto que para determinar Ia posible inhibición de Ia actividad de Ia UCP1 , hay que asegurarse de que se encuentra activada, se añadió palmitato 9 μM al medio de ensayo [Arechaga I, Raimbault S, et al. (1993) Cysteine residues are not essential for uncoupling protein function. Biochem. J. 296:693-700]. La medida de Ia actividad de Ia UCP1 se realizó determinando Ia fluorescencia del NADH, usando placas de 96 pocilios y un lector de placas, ajustado a una longitud de onda de excitación de 340 nm y de emisión de 460 nm. En los pocilios de las placas conteniendo las mitocondrias se añade el compuesto cuya actividad inhibidora de Ia UCP se quiere determinar.

La Figura 1 muestra el efecto de Ia adición de 100 μM de GDP, inhibidor de Ia actividad de UCP1 , así como de 20 μM de E379 (6-fenil-8-isopropil- 2,2-dimetilcromano, sintetizado según se describe en el Ejemplo 2 de Ia presente memoria). En el panel A se muestran el efecto del GDP y del E379 determinado por Ia disminución de Ia fluorescencia y en el panel B Ia velocidad de consumo de NADH una vez transformados los valores de fluorescencia en concentración de NADH por comparación con una curva patrón del mismo. En ambas figuras se representan los resultados obtenidos en situación basal en presencia del activador palmitato (círculos), tras Ia adición del inhibidor GDP a una concentración de 100 μM (triángulos negros hacia abajo) y tras Ia adición de compuesto E379 a una concentración de 20 μM (triángulos blancos hacia arriba).

Se demuestra, por tanto, Ia capacidad del compuesto E379 como inhibidor de Ia actividad UCP1 , que es equivalente a Ia mostrada por el GDP.

EJEMPLO 6: Actividad inhibidora de compuestos derivados de cromano sobre la actividad de Ia proteína UCP1.

Utilizando Ia metodología descrita en el ejemplo anterior se ha caracterizado el efecto de los derivados de cromano descritos en Ia Tabla 1 , sintetizados según se ha descrito en los ejemplos 1 a 4 de Ia presente memoria. La Figura 2 muestra los resultados obtenidos con 14 compuestos derivados de cromano. La Figura 3 muestra Ia EC50 correspondiente a cada uno de dichos compuestos para Ia inhibición de Ia actividad de Ia UCP1. Los derivados de cromano analizados tienen las siguientes fórmulas:

E 379 E1127 E1131B E 179

E 155 E 1125 E 375

E 167 E 377 E 1113 Para la determinación de las constantes de inhibición, a los valores de velocidad de respiración obtenidos con mitocondrias que expresan UCP1 se les sustrajo los obtenidos con mitocondrias control que no Ia expresan. El cálculo de los parámetros cinéticos se llevó a cabo con el programa de regresión de SigmaPlot (Systat Software, Erkrath, Alemania) que realiza el ajuste de los datos utilizando el algoritmo Marquart-Levenberg. En todos los casos, las concentraciones de inhibidor usadas para el cálculo de Ia EC50 fueron 0, 2, 20, 125 y 250 μM. En aquellos compuestos en los que sus EC ₅₀ son tan altas que quedan fuera del rango de los datos, se indica que Ia misma es "mayor de 200" (>200), considerándose por tanto que dichos compuestos no tienen capacidad inhibidora de Ia actividad de UCP1 (Figura 3 y Tabla 1 ).

Los resultados mostraron Ia capacidad inhibidora de varios de los compuestos, en particular de E379, E1127, E1131 B, E225, E231 y E221 , con EC ₅₀ de 20, 27, 32, 34, 39 y 54 μM, respectivamente. Por el contrario, es importante destacar que ensayos realizados con compuestos de fórmula general (I), en los que R ³ es -COOR ⁵ , siendo R ⁵ hidrógeno, es decir, en los que R ³ es un grupo carboxi (-COOH), tales como E137, no presentan efecto inhibidor.

Tabla 1. Datos de actividad inhibidora de UCP1 de derivados de cromano de fórmula (I).

Donde Me = metilo, Et = etilo, Pr = propilo, i-Pr = iso-propilo, t-Bu = tere- butilo

EJEMPLO 7: Efecto del compuesto E379 sobre Ia viabilidad de células Caco-2 sometidas a estrés oxidativo.

Con el fin de estudiar el efecto de los compuestos de Ia invención en células tumorales, se seleccionó Ia línea celular Caco-2 de adenocarcinoma colorectal humano (ATCC HTB-37), en Ia que se confirmó previamente Ia presencia de UCP2 mediante inmunodetección en extractos mitocondriales. Para Ia preparación de los extractos ricos en mitocondrias, se cultivaron las células en medio completo (MEM Alpha, Gibco, Invitrogen) suplementado con 20% de suero fetal bovino, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 μg/ml) hasta que llegaron a un 70-80 % de confluencia en frascos de cultivo de 75 cm ² (Falcon) a 37°C y 5% de CO ₂ . Las células se lavaron con solución tampón PBS fría y se recogieron con un raspador en 1 mi de tampón 250 mM sacarosa, 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 7.4. Se lavaron a 4 ⁰ C una vez en este medio y se centrifugaron a 2000 g 5 minutos. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 1 mi del mismo medio conteniendo inhibidores de proteasas (protease inhibitor cocktail Sigma P8340) y se sometieron a tres ciclos de congelación en nitrógeno líquido durante 5 minutos y descongelación a 37 ⁰ C durante 10 minutos, para romper las células. Se centrifugaron las muestras a 750 g, 10 minutos para eliminar las células que no se habían roto y el sobrenadante se volvió a centrifugar a 10000 g, 20 minutos. El sedimento mitocondrial se resuspendió en 10-20 μl de medio conteniendo inhibidores de proteasas. Los extractos mitocondriales se sometieron a electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) y tras Ia electroforesis se transfirieron las proteínas a membrana de nitrocelulosa. La membrana se trató 2 horas con PBS/Tween 0.1 % y 5 % de leche en polvo y, a continuación, se incubó toda Ia noche con anticuerpo policlonal contra UCP2 (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, EEUU). Posteriormente, se lavó 3 veces con PBS/Tween 0.1 % y se incubó 2 horas con un anticuerpo anti-goat IgG conjugado con peroxidasa (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, EEUU). Para asegurar una carga similar de proteína y de riqueza mitocondrial se utilizó un anticuerpo policlonal anti-porina (Sigma-Aldrich). La señal de quimioluminiscencia se reveló con el kit ECL (GE Healthcare, Reino Unido) y se detectó con Ia cámara CCD de un Fujifilm LAS-3000 analyzer. La Figura 4 muestra Ia presencia de Ia UCP2 en extractos mitocondriales de las células Caco-2, mostrándose como control Ia señal obtenida con mitocondrias aisladas de bazo de ratón.

Como Ia UCP2 aumenta Ia resistencia de las células tumorales a Ia quimioterapia basada en agentes antitumorales que provocan estrés oxidativo, se estudió el efecto del compuesto E379 (que había demostrado su gran capacidad de inhibición de Ia actividad de Ia UCP1 ) sobre Ia viabilidad de las células Caco-2 sometidas a estrés oxidativo. Como agente antitumoral que provoca estrés oxidativo se utilizó el trióxido de arsénico [Laparra JM et al. (2008) As2θ3-induced oxidative stress and cycle progression in a human intestinal epithelial cell line (Caco-2). Toxicol In Vitro 22:444-449]. La viabilidad se determinó in vitro por el ensayo de MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetilltiazol-2-il]-2,5-difenill tetrazolio), que se basa en que las deshidrogenasas mitocondriales de las células viables rompen el anillo de tetrazolio del MTT dando lugar a cristales de formazán que, tras Ia solubilización de las células, dan un color morado. Para este ensayo, se sembraron 50000 células por pocilio en placas de 96 pocilios en MEM Alpha (Gibco, Invitrogen) suplementado con 20% de suero fetal bovino (v/v) inactivado por calor, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 μg/ml. Tras 24 horas, se trataron las células con concentraciones crecientes de trióxido de arsénico en presencia o ausencia del inhibidor E379 (50 μM). Después de 24 horas, se añadió a cada pocilio 0.5 mg/ml de MTT y se incubó durante 40 minutos hasta Ia aparición de cristales de formazán. Se añadió una solución de isopropanol ácido (0.1 N HCI) con 10% de tritón X-100, que permite disolver dichos cristales, y se midió por espectrofotometría Ia absorbancia de los extractos obtenidos a una longitud de onda de 595 nm.

La Figura 4 muestra que, aunque el tratamiento con trióxido de arsénico provoca muerte de las células tumorales, incluso a concentraciones del mismo de 10 μM, Ia supervivencia era superior al 70%. En las mismas condiciones, Ia adición del compuesto E379 a una concentración de 50 μM redujo Ia supervivencia a aproximadamente el 50%. La misma concentración del compuesto E379 cuando Ia concentración de trióxido de arsénico es de 0,5 μM logra reducir Ia supervivencia a menos del 70%, frente a una supervivencia de aproximadamente el 95% en ausencia de dicho compuesto.