MEMORIADESCRIPTIVA INDICE DE LA CLASIFICACIÓN INTERNACIONAL DE PATENTES : G01 N 27/26.

CAMPO O RAMA DE LA TÉCNICA CON LA QUE SE RELACIONA LA INVENCIÓN : La presente invención se relaciona con equipos eléctricos utilizados en electroforesis, en especifico con la generación de potenciales eléctricos fijados en el contorno para establecer campos homogéneos que alternan su dirección de aplicación.

NIVEL CONOCIDO DE LA TÉCNICA. CARACTERÍSTICAS DE LAS SOLUCIONES TÉCNICAS ANÁLOGAS.

La electroforesís La electroforesis es una técnica que separa moléculas por migración diferencia) de las mismas en un campo eléctrico. Las moléculas pueden ser depositadas en un gel y tamizadas en el mismo cuando se aplica el campo eléctrico que las obliga a migrar. Las moléculas cargadas negativamente migran hacia el ánodo y las cargadas positivamente lo hacen hacia el cátodo. De esta forma las moléculas se van separado y formando bandas en el gel, de acuerdo a su talla. Para la generación del campo eléctrico se suelen disponer paralelamente dos electrodos que se conectan a una fuente de corriente directa.

Las moléculas de ADN se cargan negativamente cuando se preparan en solución tampón a pH neutro o alcalino. Al aplicar el campo eléctrico, las moléculas de ADN se elongan y su relación carga-masa se vuelve independiente de su talla molecular.

Lo anterior, unido al hecho que las moléculas de ADN migran a través de los poros del gel de manera similar al movimiento de una serpiente, o sea mediante un mecanismo de reptación, determina que las moléculas mayores de 20000 pares de

bases no puedan ser separadas en la electroforesis a campo eléctrico constante, aun cuando están sometidas a tamizaje molecular.

La electroforesis de campos pulsantes La electroforesis de campos pulsantes (ECP) fue creada por Schwartz y Cantor en 1984 (Cell, 37, pp 67-75, 1984; Patente US 4, 473, 452 de Septiembre 25 de 1984) e incrementó el rango de separación de las moléculas de ADN que podían ser separadas en electroforesis. Los autores obtuvieron que las grandes moléculas intactas de ADN, mayores de 20000 pares de bases, se resolvían en los geles de agarosa en patrones de bandas mediante la aplicación de pulsos eléctricos de duraciones seleccionadas que alternaban periódicamente su dirección de aplicación en relación con el gel de separación. Los cambios de dirección de aplicación del campo eléctrico provocan reorientación de la migración de las moléculas de ADN, mientras que la duración de dicha reorientación depende del tamaño o talla de cada molécula. Los patrones de bandas obtenidos se han denominado'patrones electroforéticos','cariotipos moleculares','cariotipos electroforéticos', etc.

Así, cualquier sistema de electroforesis de campos pulsantes consta de : 1. La cámara de electroforesis con sus accesorios.

2. La electrónica apropiada para alternar los campos eléctricos con la intensidad y duraciones de pulsos deseadas.

3. El método de polarizar los electrodos.

Los campos eléctricos que fueron generados en los equipos iniciales de ECP, tales como los descritos por Schwartz y Cantor (Cell, 37, pp 67-75, 1984 ; Patente U. S.

No. 4, 473, 452 de Septiembre 25 de 1984) y otros como los descritos por Carle y Olson (Carle G. F., Olson M. V. Nucleic. Acid Res., 12, pp 5647-5664, 1984) no brindaban valores homogéneos de intensidad def campo eléctrico a lo largo del gel, por lo que, la trayectoria y la velocidad de migración de las moléculas de ADN en dichos geles dependía de la posición que ellas ocuparan en el mismo.

Generación de campos eléctricos homogéneos en la ECP En teoría, un campo eléctrico homogéneo es generado por dos electrodos infinitos que se colocan paralelos y separados cierta distancia. Pero el diseño de tal cámara de electroforesis es impracticable. Para aproximarse a la obtención de un campo eléctrico de intensidad homogénea a lo largo del gel de separación, empleando electrodos finitos, Chu (Chu G., Vollrath D., Davis R. W. Science, 234, pp 1582- 1585,1986) propuso la siguiente variante : 1. Se selecciona un polígono regular (cuadrado, rectángulo o hexágono) como contorno cerrado sobre cuyos fados será colocado un arreglo de electrodos para generar en el interior del polígono un campo eléctrico de valores homogéneos de intensidad.

2. Se hace coincidir el eje X (y = 0) de un plano cartesiano imaginario con uno de los lados del polígono regular.

3. En esos electrodos colocados en y=0 se aplica el potencial de D volts.

4. En los electrodos de lado opuesto del polígono regular, que se encuentran a una distancia y=A del eje'X', se aplica un valor Vo de potencial.

5. En los restantes electrodos, situados sobre los otros lados del polígono regular y a una distancia yj del eje'X'se aplica un potencial V (yj), donde V (yj) = Vo*y/A.

6. Así, el potencial generado en el interior del polígono regular es igual al que seria generado por dos electrodos infinitos y paralelos separados entre sí una distancia A.

7. Si se permuta electrónicamente la polaridad entre los electrodos colocados en dos pares opuestos de lados, se formara un ángulo entre las líneas de fuerza de los campos eléctricos resultantes. Ese ángulo es denominado en ECP'ángulo de reorientación'.

8. El ángulo de reorientación obtenido al permutar electrónicamente la polaridad entre los electrodos de dos pares de lados diferentes en el cuadrado será de 90° y en el hexágono de 60° o 120°.

La configuración de electrodos en un arreglo hexagonal ha sido la utilizada en los sistemas actuales de ECP. Ese sistema se denomino como campos eléctricos homogéneos fijados en el contorno o CHEF (Contour Clamped Homogeneous

Electric Field) y fue introducido por Chu en 1986 (Chu G. Science 234, pp 1582- 1585, Diciembre 16,1986).

Una de las deficiencias del sistema CHEF actual es que el contorno cerrado de electrodos esta limitado a los polígonos regulares descritos anteriormente.

Métodos para imponer los voltajes en los electrodos del sistema CHEF y obtener campos eléctricos de intensidad homogénea en el gel.

Se han propuesto fundamentalmente tres métodos que fueron ganando en complejidad y componentes electrónicas : 1. Un simple divisor de voltaje (Chu G., Vollrath D., Davís R. W. Science, 234, pp 1582-1585,1986).

2. El divisor de voltaje asociado a juegos de transistores en configuración push-pull (Maule J., Green D. K. Anal Biochem 191, pp 390-395,1990).

3. El uso de operacionales para control mejor los voltajes impuestos en cada electrodo de sistema CHEF (Clark S. M., Lai E., Birren B. W., Hood L. Science 241, pp 1203-1205,1988).

El simple divisor de voltaje en los sistemas de ECP.

Uno de los métodos para imponer los valores de potencial en los electrodos del CHEF es emplear un anillo de resistores que se conectan en serie. Este anillo forma un divisor de voltaje entre los valores'cero'y CVOX-Nombraremos nodos al lugar de unión entre dos resistores consecutivos del divisor de voltaje y en cada nodo se une un electrodo del hexágono.

Los electrodos colocados en y=0 y y=A, o sea en dos lados opuestos del hexágono, se conectan respectivamente a los potenciales'0'y GVO'-A cada lado, quedan otros dos grupos de electrodos, donde cada grupo está compuesto por los electrodos de dos lados consecutivos del hexágono. Cada uno de esos electrodos se conecta a un nodo de divisor de voltaje que define el potencial que debe aplicarse en dicho electrodo. El valor de potencial que se impone se calcula como se mencionó en el acápite anterior. Por eso, los dos electrodos que se encuentren en dos lados

diferentes del hexágono, pero a la misma distancia yi de los electrodos más electronegativos (y=0) deben poseer el mismo valor de voltaje dado por V (yj) = VoyjlA Para lograr el cambio de dirección de aplicación de campo eléctrico, lo cual es imprescindible en la ECP, se aplica la diferencia de potencial a otros dos grupos de electrodos diferentes. Esto se realiza con la ayuda de relés y diodos que conectan los electrodos que se deben polarizar con cero volt y Vo a los bornes de la fuente a través del sistema de conmutación de los campos eléctricos.

Sin embargo, el uso de series de resistores para fijar los voltajes tiene un inconveniente. Cuando se pone en contacto el anillo de resistores con la solución tampón, esta última se comporta como un nuevo resistor conectado en paralelo con los resistores del anillo. Las corrientes que se inyectan desde los resistores hacia los electrodos y viceversa, cambian el valor del potencial en cada electrodo lo que afecta la homogeneidad del campo eléctrico. El cambio de voltaje depende de la cantidad de corriente que se inyecta o se extrae de la solución tampón y esta a su vez depende de cambios en la concentración, temperatura, volumen y pH de la solución tampón, entre otros. Dichos cambios afectan aleatoriamente la conductividad de) tampón y por tanto la magnitud de la corriente eléctrica que se intercambia con el circuito resistivo puro (Maule J., Green D. K. Anal Biochem 191, pp 390-395,1990). Estos cambios aleatorios del patrón de voltaje son incontrolables y por tanto, afectan de manera diferente los resultados y la reproducibilidad de los patrones electroforéticos que se obtienen en cada experimento.

Esos cambios pueden ser reducidos si la corriente que pasa por la serie de resistencias es mucho mayor a la que circula por la solución (Maule, J. and Green, D. K. Anal Biochem 191, pp 390-395 1990). Sin embargo, esa solución tiene la desventaja de que provoca un gasto innecesario de energía eléctrica y obliga a utilizar componentes (especialmente los resistores) de mayor potencia que son más caros.

El divisor de voltaje asociado a juegos de transistores en configuración push-pull.

Para resolver los problemas planteados para el divisor resistivo de voltaje se propuso el uso de fuentes de corrientes construidas con elementos semiconductores (Maule J., Green D. K. Anal Biochem 191, pp 390-395,1990). Esas fuentes de corriente separan cada electrodo del nodo correspondiente en la serie de resistores del divisor. Entre cada nodo y su electrodo correspondiente se coloca una pareja de transistores en la llamada configuración'push-pull', los que inyectan y extraen corriente eléctrica de cada electrodo, con lo cual repiten en los electrodos el voltaje que brinda el nodo del divisor sin que sea afectado por los cambios de conductividad de la solución tampón. El sistema mencionado logra polarizar adecuadamente los electrodos en las dos direcciones de aplicación del campo eléctrico en la ECP. Sin embargo, posee algunas limitaciones : 1. Los pares de electrodos que deben estar polarizadas con igual valor de voltaje, V (yj) =VO*yj/A, obtienen su potencial de nodos diferentes, por lo que, no siempre se logra la igualdad de voltajes en todas los pares de electrodos que se requieren.

2. Los electrodos que se encuentran más cerca de los electrodos más electropositivos reciben la corriente eléctrica del transistor tipo NPN del push-pull al que están conectados. Mientras que los electrodos que se encuentran más cerca del los electrodos más electronegativos drenan corriente eléctrica hacia eI transistor tipo PNP de push-pull al que están conectados. El hecho de que están activos a la vez transistores de polaridades diferentes introduce errores en el patrón de voltajes.

3. Las resistencias que establecen el patrón de potenciales en una de las dos direcciones de aplicación del campo son las mismas que lo hacen en la otra dirección. Por eso, no es posible hacer un ajuste independiente del patrón de potenciales en cada campo. Cualquier variación que se quiera introducir en una de las dos direcciones afecta necesariamente a la otra dirección.

4. El circuito posee tantos pares de transistores en configuración push-pull como electrodos tiene la cubeta CHEF. Los pares de transistores en configuración push-pull se conectan en paralelo. Cuando ocurre rotura de alguno de los transistores es difícil determinar el par dañado.

5. En los pares de transistores configurados en push-pull siempre uno de los transistores está activo mientras el otro se encuentra inactivo. Esto significa que en todo momento la mitad de los transistores está inactiva. Sin embargo, esos transistores no pueden eliminarse del circuito, pues cuando el campo eléctrico se aplica en la otra dirección, algunos pares cambian el transistor activo. Por tanto, el anillo divisor de voltaje unido a pares de transistores en configuración push- pull es ineficiente, ya que el número total de transistores inactivos en cada campo es excesivo al igual que la cantidad total de transistores.

6. Todos los pares de transistores están conectados a la fuente de poder sin ningún elemento que limite la corriente. El fallo de uno solo de los transistores provoca cortocircuito entre los bornes positivo y negativo de la fuente de poder. Por lo que se puede concluir que el circuito no es seguro.

El uso de operacionales para control mejor los voltajes impuestos en cada electrodo del sistema CHEF.

Otros sistemas más complejos utilizan amplificadores operacionales para realizar un control individual del potencial que se impone en cada electrodo del arreglo hexagonal de la cámara (Patente US 5,084,157). Esos sistemas logran variar el ángulo entre las dos direcciones de aplicación del campo eléctrico pero a costa de aumentar la complejidad electrónica de los sistemas, tanto en su construcción como su operación. Adicionalmente, los elementos que realizan el control de los potenciales no pueden ser convenientemente aislados de los elementos de poder.

Es necesario la conversión digital lo que implica nuevas complejidades y aumenta el costo de equipo.

Por otra parte, Riverón y cols. (Patente Cubana, No. de solicitud : 306/2000) demostraron que para la obtención de patrones de bandas rectos y reproducibles en ECP es necesario garantizar campos eléctricos de intensidad homogénea en la cámara de electroforesis. Ellos determinaron que la homogeneidad del campo eléctrico aplicado solo puede ser obtenida si, además de poseer un sistema de polarizar adecuadamente los electrodos en el contorno cerrado, se garantiza homogeneidad en la resistencia eléctrica del tampón y dei gel. Si describimos la resistencia eléctrica como

R=(1/#)#(d/A) donde : (6) es la conductividad de electrolito, (d) es la separación entre los electrodos de polaridades opuestas y (A) es el área de sección transversal al paso de la corriente.

Se deduce que para que la resistencia eléctrica sea homogénea en toda la cámara es necesario que no exista turbulencia en la superficie de tampón ni deformaciones o meniscos en el gel que alteren o modifiquen el área de la sección transversal al paso de la corriente.

Por lo tanto, si los sistemas de ECP, aún los que poseen circuitos electrónicos muy complejos para polarizar los electrodos, no tienen en cuenta la homogeneidad de la resistencia eléctrica en el tampón, no pueden garantizar patrones de bandas rectos y experimentos reproducibles. Esta situación se hace mas crítica con cámaras más pequeñas.

ESENCIA DE LA INVENCIÓN Para explicar adecuadamente el circuito propuesto en esta invención es necesario definir un sistema de referencia.

El sistema de referencia Consideraremos un contorno cerrado de electrodos (de las cámaras de ECP del sistema CHEF) al conjunto de varios electrodos que se colocan sobre los'm'lados de un polígono regular, donde'm'es par. En nuestro sistema de referencia (Figura 1) se define el lado Li arbitrariamente y se coloca sobre el eje'X'de un plano cartesiano. El lado opuesto (denominado como L (m/2) +i queda a una distancia'A'del eje'X'. De esta forma, los lados restantes del polígono regular quedan distribuidos simétricamente a ambos lados de los lados L1 y L (m/2) +i. Los lados del polígono

regular que se encuentran a la izquierda de los lados Li y L(m/2)+1 se les denominará como lados'C'y los que se encuentran a la derecha como lados'D'.

Sobre cada lado se colocan'k'electrodos donde'k'es un número natural entre 1 y 10. Así quedarán'k'electrodos colocados sobre el lado Li o sea sobre el eje'X con ordenadas yo = 0. También quedarán'k'electrodos situados sobre el lado'L 'L(m /2)+1 a una distancia'A'del eje'X'con ordenadas yn+i=A.

Todos los electrodos situados sobre los lados'C'y'D'se denominarán como Eic, E2C,..., Enc y E1D, E2D,.., EnD, donde 'n' es igual a 'k#(m-2)/2'. La denominación de los electrodos se hace en el siguiente orden para los lados'C'y'D', partiendo del lado L hasta llegar al lado L(m/2)+1. Electrodos, Elc, E2c,.., Enc, y electrodos E1D, E2D,.., EnD. Los dos electrodos EiC y EiD se colocan a la misma distancia y del eje'X, donde i es un número natural entre 1 y n. Cada uno de esos ([E1C- E1D], [E2C- E2D],.., [Enc-EnD]) se denominará par de electrodos Pi.

El circuito de esta invención para lograr campos eléctricos homogéneos en el interior de un contorno cerrado de electrodos Para explicar el circuito, primero se referirá como lograr un campo homogéneo empleando el sistema de referencia anteriormente descrito. Se parte de la base que todos los electrodos son energizados durante la electroforesis con un voltaje dado entre 0 y Vo volts que se obtiene de una fuente de poder de la siguiente forma.

1. A los'k'electrodos colocados sobre el lado Li se le aplican 0 volts.

2. A los'k'electrodos colocados sobre el lado opuesto L(m/2)+1 se le aplican Vo volts.

Sin embargo, al aplicar una diferencia de potencial entre los electrodos colocados en los lados Li y L(m/2)+1 se establece en el interior de la cámara de ECP un campo eléctrico cuya intensidad no es homogénea en todas las regiones de la cámara.

Esto signifia que en los pares de electrodos Pi aparece un voltaje dado que no es proporcional a la distancia y. Por lo que, en los electrodos restantes deben

imponerse valores de voltaje tales que homogeneicen el campo eléctrico en toda la cámara de electroforesis. Entonces a los electrodos de los pares Pi se le aplica un voltaje Vj = Voyj/A.

Así, los electrodos del contorno cerrado quedan polarizados de forma que generan un campo eléctrico homogéneo en una dirección de aplicación determinada. Un razonamiento similar es aplicable para lograr un campo eléctrico homogéneo de igual magnitud, pero cuyas líneas de fuerza posean otra dirección. Solo es necesario definir como Li otro lado del polígono regular.

En esta invención se propone que los dos campos eléctricos de la ECP pueden ser energizados con dos circuitos de imposición idénticos. Estos circuitos de imposición se conectan entre los bornes positivos y negativos del circuito existente para alternar los campos eléctricos o alternador de forma que solo uno de los circuitos de imposición reciba energía eléctrica a la vez.

Cada uno de esos circuitos impone en los electrodos los voltajes que generan un campo eléctrico de intensidad homogénea en una de las direcciones de aplicación en las cubetas de sistema CHEF. Las conexiones circuitales en una de las dos direcciones donde se aplicará el campo eléctrico se realizan de la siguiente forma : I. Uno de los bornes negativos de alternador se conecta a través de diodos a todos los'k'electrodos del lado L1 (lado colocado sobre el eje'X'), mientras que el borne positivo correspondiente a ese borne negativo del alternador se conecta a través de diodos a los'k'electrodos situados sobre el lado L (m/2) +i, es decir a los electrodos de lado que se encuentra a la distancia A del eje'X'.

II. La conexión a través de diodos entre el borne negativo del alternador y los'k' electrodos del lado Li se realiza de la siguiente forma : a) cada electrodo de lado Li del polígono regular se conecta al ánodo de un diodo, b) los cátodos de esos diodos, uno por cada electrodo, se conectan entre si y al ánodo de un segundo diodo, c) ei cátodo de ese segundo diodo se une al borne negativo del alternador.

III. La conexión a través de diodos entre el borne positivo del alternador y los'k' electrodos del lado L (m, 2) +1 se realiza de la siguiente forma : a) cada electrodo del lado L(m/2)+1 del poligono regular se conecta al cátodo de un diodo, b) los ánodos de esos diodos, uno por cada electrodo, se conectan entre si y al cátodo de un segundo diodo, c) el ánodo de ese segundo diodo se une al borne positivo de alternador.

IV. A los bornes negativo y positivo de alternador se conectan además los extremos de un divisor de voltaje formado por n+1 resistores Ri y una cantidad variable de diodos. Así, se divide el voltaje total (Vo-0) en valores que son proporcionales a la distancia y que separa cada par de electrodos P1 (Ejc-EjD) del eje'X'.

V. Cada nodo Ni que se forma entre los resistores Ri y Ri+1 del divisor de voltaje se conecta a la entrada de un repetidor de voltaje. La salida de cada repetidor de voltaje se conecta a una de las parejas de electrodos Pi, Los repetidores de voltaje tienen dos funciones, una es repetir en su salida (la pareja de electrodos Pj) el voltaje de su entrada que procede del nodo Ni. La otra función es mantener constante ese voltaje frente a los cambios de conductividad del tampón durante la ECP.

Los repetidores de voltaje son de dos tipos : 1-Cuando el repetidor de voltaje se conecta entre un nodo Ni dey divisor y un par de electrodos Pi donde'i'es un número natural entre [(n/2) +1] y n, dicho repetidor de voltaje está formado por los siguientes elementos circuitales : un transistor de polaridad NPN cuya base se conecta al nodo Ni dey divisor de voltaje, su colector al borne positivo del alternador y su emisor a los ánodos de dos diodos, cuyos respectivos cátodos se conectan con los electrodos de la pareja de electrodos Pi, ya mencionada.

2-Cuando el repetidor de voltaje se conecta entre un nodo Ni dey divisor y un par de electrodos P donde'i'es número natural entre 1 y n/2, dicho repetidor de voltaje está formado por los siguientes elementos circuitales :

un transistor de polaridad PNP cuya base se conecta al nodo Ni dey divisor de voltaje, su colector al borne negativo del alternador y su emisor a los cátodos de dos diodos, cuyos respectivos ánodos se conectan con los electrodos de la pareja de electrodos Pi ya mencionada.

El valor de cada resistor Ri se escoge de forma tal que el voltaje de cada par de electrodos Pi sea proporcional a la distancia que los separa de los electrodos situados sobre el lado Li de polígono regular.

El otro circuito es idéntico a éste, pero se conecta a los electrodos E de forma diferente. Para ello, se redefine como lado Li a cualquier otro lado del polígono regular según el ángulo que se desee establecer entre las líneas de fuerza de ambos campos eléctricos que se generarán y se rota el sistema de referencia el ángulo necesario para que el nuevo lado Li quede sobre el eje'X'. A partir de Li se redefinen los lados'C'y'D', los electrodos El y los pares de electrodos Pi Del razonamiento anterior se deduce que las parejas de electrodos Pi de cada uno de los circuitos son diferentes. Por eso, se requieren diodos y no se pueden conectar directamente a los emisores de los transistores de los repetidores de voltaje. Los diodos permiten unir ambos electrodos de la pareja garantizando que tengan el mismo potencial cuando ese repetidor de voltaje esta activo, pues se aplicó el campo en esa dirección. Cuando el campo eléctrico se establece en la otra dirección los diodos que unen la antigua pareja Pi quedan conectados en serie pero con polaridades opuestas. Así se garantiza que las ramas de circuito entre las antiguas parejas de electrodos, que en ese momento unen electrodos de diferente potencial, tengan al menos un diodo polarizado inversamente. La resistencia de éstos al paso de la corriente eléctrica es muy alta y los electrodos de esa rama quedan aislados eléctricamente.

La influencia de los cambios de conductividad de la solución tampón sobre el potencial de cada nodo Ni dey divisor se reduce inyectando o extrayendo corriente del electrodo hasta que su voltaje sea igual al de su nodo. Como fuentes de corriente se utilizan transistores en la configuración de"seguidor de emisor". Los pares de electrodos situados más cerca del borne negativo siempre tienen que

extraer corriente de la solución puesto que el potencial tiende a ser mas elevado que el de su nodo de referencia correspondiente. Por esta razón se utilizan los transistores de tipo PNP que drenan esta corriente hacia el borne negativo de la fuente. Los pares de electrodos situados más cerca de borne positivo siempre tienen que añadir corriente a la solución puesto que su potencial tiende a ser mas bajo que el de su nodo correspondiente. Para ello se utiliza un transistor de tipo NPN que extrae corriente del borne positivo. De esa forma no se afecta apreciablemente el potencial de los nodos de referencia.

Durante la electroforesis ocurren variaciones en la temperatura, concentración, pH, altura, etc. de la solución. Estas perturbaciones tienden a alterar el patrón de voltaje en los electrodos. La corriente necesaria para contrarrestar estos efectos es también manejada por los transistores.

El potencial de cada pareja de electrodos es similar al de su nodo de referencia pero se diferencia en cierto valor. La diferencia es provocada por la caída de voltaje entre los terminales base y emisor del transistor y en el diodo asociado a cada electrodo de la pareja. Esta caída es propia de las uniones PN de los elementos semiconductores de silicio y es aproximadamente igual a 0,7 volt.

El cambio de polaridad de los transistores y los diodos que ocurre en el centro del divisor introduce un error en el patrón de voltajes. Este error se puede compensar insertando diodos en serie con el resistor central del divisor de voltaje. De esta forma el potencial de los nodos de referencia se modifia en igual magnitud pero sentido contrario al efecto de las caídas en los transistores y diodos de cada pareja.

Finalmente es necesario añadir un diodo en serie con los diodos que polarizan los electrodos situados sobre los lados Li y 4mu2) +1 y que se conectan a los bornes negativo y positivo del alternador. Esto es necesario para homogeneizar el número de caídas de voltaje (provocadas por uniones PN directamente polarizadas) en el camino entre los bornes del alternador y cada uno de los electrodos. Este camino para los electrodos situados sobre los ados'C'y'D'presenta dos uniones PN.

Por tanto, el circuito propuesto en esta invención consta de dos partes iguales que se conectan a la fuente de poder a través de otro circuito electrónico apropiado para alternar los campos eléctricos con la intensidad y duración de pulsos deseadas.

Ejemplos de realización : Los siguientes ejemplos son ilustrativos del circuito que se describe pero en ninguna medida son limitativos del alcance de esta patente.

Ejemplo 1. Circuito para potarizar tos etectrodos de una cámara hexagonal de 18 electrodos.

Arreglo de electrodos.

En la Figura 2 se muestra un grupo de electrodos 101 al 118 dispuestos sobre un hexágono regular a razón de tres electrodos por cada lado. En una de las direcciones de aplicación del campo eléctrico (denominada A) los electrodos 101, 102 y 103 (denominados grupo A+) se polarizan con el máximo potencial, cercano al potencial de, borne positivo de la fuente de poder. Los electrodos 110,111 y 112 (denominado grupo A-) se polarizan con el mínimo potencial, cercano a 0 volts. El resto de los electrodos se organizan en parejas (Tabla I). Ambos electrodos de cada pareja serán polarizados al mismo voltaje, el que será proporcional a la distancia desde cada pareja hasta los electrodos de grupo A-.

En la otra dirección de aplicación del campo eléctrico (denominada B) los electrodos 113,114 y 115 (denominados grupo B+) se polarizan con el máximo potencial, cercano al potencial de borne positivo de la fuente de poder. Los electrodos 104, 105 y 106 (denominado grupo B-) se polarizan con el mínimo potencial, cercano a 0 volt. El resto de los electrodos se organizan en parejas (Tabla I). Ambos electrodos de cada pareja serán polarizados al mismo voltaje, el que será proporcional a la distancia desde cada pareja hasta los electrodos del grupo B-.

En este arreglo particular de electrodos la distancia'dist'entre dos electrodos consecutivos es la misma. Sin embargo la distancia entre la pareja de electrodos 118-104 y los electrodos del grupo A+ es la mitad o sea'dist/2'. Lo mismo ocurre con las parejas 113-109,116-112 y 103-107 respecto a los electrodos de los grupos A-, B+ y B-respectivamente.

Tabla I. Parejas de electrodos y tipo de transistor que posee el repetidor de voltaje al que se conectan.

Dirección A Dirección B Tipo de transistor 118 104 116 112 117 105 117 111 NPN 116 106 118 110 <BR> <BR> <BR> 115 107 101 109<BR> <BR> <BR> <BR> 114 108 102 108 PNP 113 109 103 107 Las filas muestran el número de los electrodos que deben polarizarse al mismo voltaje para generar un campo eléctrico homogéneo en las dos direcciones de aplicación A y B en una cubeta con una disposición de electrodos similar al de la figura 1.

Para generar los potenciales de referencia en esta cámara CHEF de tres electrodos por lado se necesitan siete resistores 201 y 202 conectados en serie (Figura 3). Los resistores 201 son de igual valor, los resístores 202 tiene la mitad de este valor. La cadena de resistores 201 y 202 se conectan a los potenciales positivo (+) y negativo (-) de una fuente de poder a través de conmutadores. Este divisor de voltajes genera los potenciales de referencia que aparecen en los nodos 203 y 204.

Los repetidores de voltaje 205 y 206 toman el voltaje de los nodos de referencia 203 y 204 para polarizar adecuadamente a los electrodos en las direcciones A y B.

En la Figura 4 se muestran con más detalles los repetidores de voltaje 205 y 206. La base del transistor 301 de polaridad NPN se conecta al nodo 203. El colector del transistor 301 se conecta al borne positivo (+) a través de conmutadores. El emisor del transistor 301 se conecta a los ánodos de dos diodos 302, los que a su vez se conectan por el cátodo a los electrodos cuyo potencial corresponde a ese nodo 203 en particular.

La base del transistor 303 de polaridad PNP se conecta al nodo 204. El colector de transistor 303 se conecta al borne negativo a través de conmutadores. El emisor del transistor 303 se conecta a los cátodos de dos diodos 304 los que a su vez se conectan por el ánodo a os electrodos cuyo potencial corresponde a ese nodo 204 en particular.

En la tabla 1 se señala los electrodos que se polarizan con transistores de tipo NPN (repetidor de voltaje 204) y PNP (repetidor de voltaje 205).

Los electrodos de los grupos A+ y B+ (Figura 5) se conectan al cátodo de diodos 401 que se unen por el ánodo. El ánodo de los diodos 401 se une al cátodo de otro diodo 402 que a su vez se une por el ánodo al borne positivo de la fuente a través de conmutadores.

Los electrodos de los grupos A-y B-se conectan al ánodo de diodos 403 que se unen por el cátodo. El cátodo de los diodos 403 se une al ánodo de otro diodo 404 que a su vez se une por el cátodo al borne positivo de la fuente a través de conmutadores. Los diodos 402 y 404 garantizan que las ramas que alimentan a los electrodos de los grupos A+, A-, B+ y B-tengan las mismas caídas de voltaje provocadas por las uniones PN que el resto de los electrodos del arreglo.

Los diodos 207 (Figura 3) son los que compensan los errores provocados por el cambio de polaridad de los transistores y los diodos en el patrón de voltaje.

En la Tabla 11 se presentan los voltajes teóricos y medidos en los electrodos de una cubeta CHEF. Los electrodos están dispuestos sobre los ados de un hexágono como el de la Figura 2. La separación entre los lados opuestos es 11,6 cm. La cubeta se llenó con 225 mi de solución tampón TBE 0,5x (TBE 1x : Tris 89 mM, Acido bórico 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8,4) a 20 °C. Los voltajes se generaron con un circuito similar al presentado. Los resistores utilizados fueron de 470,0 ohm, para lograr la mitad del valor en los resistores 202 se colocaron dos en paralelo. Los transistores utilizados fueron MJE 340 y MJE 350 y los diodos 1N4007. La energía se obtuvo de una fuente de poder Macrodrive I cuya salida se ajustó a un voltaje

constante de 120,0 volt entre los bornes positivo (+) y negativo (-) en las direcciones A y B.

Tabla II. Valores teóricos y generados por el circuito presentado en los electrodos de una cubeta CHEF de 18 electrodos dispuestos sobre los lados de un hexágono.

Voltajes teóricos Voltajes reales (Volt) 'VO'"Dirección A Dirección B 118,6 101, 102 y 103 : 118,7 115,114 y 113 : 118,7 108, 8 118 : 108,8 104 : 108,9 116 : 108,8 112 : 108, 8 89, 3 117 : 89,2 105 : 89,2 117 : 89,2 111 : 89,2 69, 8 116 : 69,7 106 : 69,7 118 : 69,7 110 : 69,6 50, 2 115 : 50,2 107 : 50,3 101 : 50,4 109 : 50,3 30, 7 114 : 30,8 108 : 30,8 102 : 30,8 108 : 30,8 11, 2 113 : 11,2 109 : 11,2 103 : 11,2 107 : 11,2 1, 4 112, 111 y 110 : 1,4 104,105 y 106 : 1,4 El número del electrodo, según la Figura 2, aparece en negrita.

El voltaje teórico se calculó considerando una caída típica de 0,7 volt en cada unión PN (en los diodos y entre la base y el emisor de los transistores) de los elementos semiconductores de silicio. Para el calculo se consideró a los transistores como elementos ideales que no poseen corriente de base.

Ejemplo 2. Circuito para polarizar los electrodos puntuales de una cámara hexagonal de 36 electrodos distribuidos no uniformemente.

En la Figura 6 se muestra un grupo de electrodos puntuales 501 al 536 dispuestos sobre un hexágono regular a razón de seis electrodos por cada lado. En una de las direcciones de aplicación del campo eléctrico (denominada A) los electrodos 501, al 506 (denominados grupo A+) se polarizan con el máximo potencial, cercano al potencial de borne positivo de la fuente de poder. Los electrodos 519 al 524 (denominado grupo A-) se polarizan con el mínimo potencial, cercano a 0 volts. El resto de los electrodos se organizan en parejas (Tabla 111). Ambos electrodos de

cada pareja serán polarizados al mismo voltaje, el que será proporcional a la distancia desde cada pareja hasta los electrodos del grupo A-.

En la otra dirección de aplicación del campo eléctrico (denominada B) los electrodos 525 al 530 (denominados grupo B+) se polarizan con el máximo potencial, cercano al potencial del borne positivo de la fuente de poder. Los electrodos 507 al 512 (denominado grupo B-) se polarizan con el mínimo potencial, cercano a 0 volt. El resto de los electrodos se organizan en parejas (Tabla III). Ambos electrodos de cada pareja serán polarizados al mismo voltaje, el que será proporcional a la distancia desde cada pareja hasta los electrodos del grupo B-.

En este caso las distancias entre dos electrodos contiguos no es la misma. Por ejemplo la distancia entre el electrodo 501 y el 502 es diferente a la distancia entre el electrodo 502 y el electrodo 503.

Para generar los potenciales de referencia en esta cámara CHEF de seis electrodos por lado se necesitan trece resistores 601,602 y 603 conectados en serie (Figura 7). Los valores de resistencia de los resistores 601,602 y 603 deben ser escogidos de forma tal que el potencial entre cada electrodo sea proporcional a la distancia entre cada electrodo y los electrodos de los grupos A-y B-para cada una de las direcciones A y B, respectivamente. En este caso los resistores 601 fueron son de 348 ohm los resistores 602 son de 470 ohm y los resistores 603 son de 235 ohm. La cadena de resistores 601,602 y 603 se conectan a los potenciales positivo (+) y negativo (-) de una fuente de poder a través de conmutadores. Este divisor de voltajes genera los potenciales de referencia que aparecen en los nodos 604 y 605.

Los repetidores de voltaje 606 y 607 toman el voltaje de los nodos de referencia 604 y 605 para polarizar adecuadamente a los electrodos en las direcciones A y B. Los repetidores de voltaje 606 y 607 son idénticos a los repetidores 205 y 206 (figura 3).

Se introducen diodos 608 en serie con los resistores para corregir los errores en el patrón de voltajes provocados por el cambio de polaridad de los transistores que se encuentran dentro de los repetidores de voltaje 606 y 607 activos Para polarizar los electrodos de los grupos A+, A-, B+ y B-se utilizan diodos (Figura 8) en un circuito similar al presentado en el ejemplo 1. En este caso se utilizan seis

diodos 701 y 703 para polarizar los electrodos de los grupos A+ y A-pues este arreglo particular de electrodos presenta seis diodos por cada lado. La función de los diodos 702 y 704 es igual a los de ejemplo 1, garantizar que el potencial de todos los electrodos este afectado por el mismo número de caídas de voltaje.

Tabla i. Valores teóricos y generados por el circuito presentado en los electrodos de una cubeta CHEF de 36 electrodos dispuestos sobre los lados de un hexágono.

Voltajes Voltajes reales (Volt) Teóricos (Volt) Dirección A Dirección B 118,80 501,502,503,504,505,506 : 118,75 525,526,527,528,529,530 : 118, 75 113,18 536 : 113,15 507 : 113,15 524 : 113,15 531 : 113,15 104, 85 535 : 104,70 508 : 104,70 523 : 104,75 532 : 104,75 93,62 534 : 93,40 509 : 93,40 522 : 93,40 533 : 93,40 85,28 533 : 85,05 510 : 85,05 521 : 85,00 534 : 85, 00 74,05 532 : 73,90 511 : 73,85 520 : 73,85 535 : 73,85 65,72 531 : 65,65 512 : 65,55 519 : 65, 55 536 : 65,65 54,48 530 : 54,40 513 : 54,30 518 : 54,30 501 : 54,40 46, 15 529 : 46,15 514 : 46,15 517 : 46,10 502 : 46,10 34,92 528 : 34,90 515 : 34,95 516 : 34,95 503 : 34,95 26,58 527 : 26,60 516 : 26,60 515 : 26,60 504 : 26,55 15,35 526 : 15,35 517 : 15,35 514 : 15,35 505 : 15,35 7, 02 525 : 6,95 518 : 6,95 513 : 6,95 506 : 6,95 1, 4 524, 523,522,521,520,519 : 1,4 512,511,510,509,508,507 : 1,4 Las filas muestran el número y el voltaje de los electrodos que deben polarizarse al mismo potencial para generar un campo eléctrico homogéneo en las dos direcciones de aplicación A y B. La primera columna muestra el potencial teórico que le corresponde a cada pareja de electrodos. El número de electrodo, según la Figura 6, aparece en negrita. El voltaje teórico se calculó con las mismas consideraciones que en el ejemplo 1.

En la Tabla 111 se presentan los voltajes teóricos y medidos en los electrodos de una cubeta CHEF. Los electrodos están dispuestos sobre los lados de un hexágono como el de la Figura 6. La separación entre los lados opuestos es 11,6 cm. La

cubeta se Ilenó con 225 ml de solución tampón TBE 0,5x (TBE 1x : Tris 89 mM, Acido bórico 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8,4) a 20 °C. Los voltajes se generaron con un circuito similar al presentado. La energía se obtuvo de una fuente de poder Macrodrive I cuya salida se ajustó a un voltaje constante de 120,2 volt entre los bornes positivo (+) y negativo (-) en las direcciones A y B.

Los ejemplos que se han presentado son ilustrativos de la presente invención y no constituyen limitaciones a su alcane. Cubetas de diferente tamaño y forma, número y distribución de electrodos pueden ser polarizadas con circuitos similares al mostrado variando solamente el número de elementos circuitales : transistores, diodos y resistores así como el valor de resistencia de estos últimos y estarían bajo el alcance de la presente invención.

Se adjuntan las siguientes figuras : Figura 1. Sistema de referencia utilizado para describir la distribución de los electrodos en las cámaras de ECP sistema CHEF que pueden ser polarizadas por el circuito de la presente invención. Los electrodos se disponen sobre un polígono regular de'm'caras, donde'm'es un número par entre 4 y 50. En cada lado de polígono se colocan'k'electrodos, donde'k'es un número natural entre 1 y 10. Uno de los ados del polígono (denominado Li) se hace coincidir con el eje'X'de un sistema de coordenadas. El lado opuesto del polígono (denominado L (m/2) +i se encuentra a una distancia y=A del eje'X'. A la izquierda de los lados Li y L (m, 2) +1 se encuentra los lados C y a la derecha los lados D.

Figura 2. Esquema de la distribución de los 18 electrodos de una cubeta CHEF hexagonal. Con los símbolos A+ y A-se indican los electrodos que se conectan a borne positivo y negativo de una fuente de poder (a través de un circuito alternador) para establecer un campo eléctrico en la dirección A. Con los símbolos B+ y B-se indican los electrodos que se conectan a borne positivo y negativo de una fuente de poder (a través de un circuito alternador) para establecer un campo eléctrico en la dirección B.

Figura 3. Divisor de voltaje formado por diodos y resistores que se conecta a los bornes de una fuente de poder (a través de un circuito alternador). Este circuito genera los voltajes que polarizan una parte de los electrodos de una cubeta CHEF hexagonal de 18 electrodos. A los nodos que se forman entre dos resistores se conectan repetidores de voltaje.

Figura 4. Repetidores de voltaje. La base de los transistores se conecta a los nodos del divisor de voltaje y al emisor se conectan dos diodos que a su vez se conectan a una pareja de electrodos que debe ser polarizada al mismo potencial. En la parte superior se encuentra un repetidor de voltaje con un transistor NPN cuyo colector se conecta al borne positivo de una fuente de poder (a través de un circuito alternador).

En la parte inferior se encuentra un repetidor de voltaje con un transistor PNP cuyo

colector se conecta al borne positivo de una fuente de poder (a través de un circuito alternador).

Figura 5. A la izquierda se muestra el circuito que polariza los electrodos de los grupos A+ o B+ en una cubeta CHEF modelo hexagonal de 18 electrodos. El ánodo de diodo que se encuentra en la parte superior se conecta al borne positivo de una fuente de poder a través de conmutadores. A la derecha se muestra el circuito que polariza los electrodos de los grupos A-o B-en una cubeta CHEF modelo hexagonal de 18 electrodos. El cátodo de diodo que se encuentra en la parte inferior se conecta al borne negativo de una fuente de poder a través de conmutadores.

Figura 6. Esquema de la distribución de los 36 electrodos de una cubeta CHEF hexagonal. Con los símbolos A+ y A-se indican los electrodos que se conectan a borne positivo y negativo de una fuente de poder (a través de un circuito alternador) para establecer un campo eléctrico en la dirección A. Con los símbolos B+ y B-se indican los electrodos que se conectan a borne positivo y negativo de una fuente de poder (a través de un circuito alternador) para establecer un campo eléctrico en la dirección B.

Figura 7. Divisor de voltaje formado por diodos y resistores que se conecta a los bornes de una fuente de poder (a través de un circuito alternador). Este circuito genera los voltajes que polarizan una parte de los electrodos de una cubeta CHEF hexagonal de 36 electrodos. A los nodos que se forman entre dos resistores se conectan repetidores de voltaje.

Figura 8. En la parte superior de la figura se muestra el circuito que polariza los electrodos de los grupos A+ o B+ en una cubeta CHEF modelo hexagonal de 36 electrodos. El ánodo de diodo que se encuentra en la parte superior del circuito se conecta al borne positivo de una fuente de poder a través de conmutadores. En la parte inferior de la figura se muestra el circuito que polariza los electrodos de los grupos A-o B-en una cubeta CHEF modelo hexagonal de 36 electrodos. El cátodo del diodo que se encuentra en la parte inferior del circuito se conecta al borne negativo de una fuente de poder a través de conmutadores.

VENTAJAS DE LA SOLUCIÓN PROPUESTA.

1) Se polarizan correctamente los electrodos de cubetas tipo CHEF de diferente forma, tamaño, número y distribución de electrodos.

2) El circuito es más sencillo que los sistemas de imposición de voltajes anteriores, sin embargo el patrón de voltajes generado en los electrodos es tan o más exacto que el generado por estos.

3) No existe la posibilidad de cortocircuito entre los bornes positivo y negativo de las fuentes de poder empleadas.

4) Se logran polarizar igualmente las parejas de electrodos situadas en la misma línea equipotencial teórica.

5) Los circuitos que generan el campo eléctrico en las dos direcciones son independientes.

6) El número de transistores que emplea es al menos tres veces menor que los sistemas anteriores.

7) El circuito es más económico y es más fácil su reparación y mantenimiento.