Изобретение относится к новым клатратным комплексам циклодекстрина с противовирусным средством, которые могут найти применение в фармацевтической промышленности и способам их получения. Изобретение также относится к композициям и лекарственным средствам на основе новых клатратных комплексов циклодекстрина.

В настоящее время комплексы активных веществ с циклодекстринами нашли свое применение не только в фармацевтике, но и в косметологии. Например, существуют и пользуются спросом комплексы фитоаминокислот, включенных в состав циклодекстриновой капсулы. Известны аналогичные комплексы циклодекстрина с моносахаридами, уроновыми кислотами.

Получение клатратных комплексов в решении проблем транспорта лекарственных средств оказывает существенное влияние практически на каждый способ введения - от перорального до инъекционного. Описана перспектива развития систем целевой доставки и систем транспортирования через слизистые оболочки (патент РФ 2005115883 опубл. 2006г.). Общий потенциал систем транспортирования лекарственных средств на основе комплексов включения также оценивался в патенте РФ 2121830, опубл.в 1998г.

Новые формы и пути транспортирования лекарственных средств могут расширить терапевтический потенциал назначаемого лечения, позволяя доставлять новые виды лекарств в недостижимые ранее области в организме человека. Технологии транспортирования лекарственных веществ на основе комплексов могут в значительной степени изменить существующие лекарства, улучшая их биодоступность, позволяя снизить терапевтическую дозу. В патенте РФ 2121830, указанном выше, описана водорастворимая лекарственная композиция и способ ее получения для таких известных препаратов, как Сибазон, Азалептин, Мезапам, Индометацин. Фармакологические испытания полученных комплексов на лабораторных животных показали снижение терапевтической дозы ЛС(лекарственного средства) в несколько раз.

Молекулы циклодекстринов имеют тороидальную форму, причем ее внутренняя полость гидрофобна. Водорастворимые межмолекулярные комплексы липофильных органических соединений образуются в растворе за счет интеркаляции их молекул в эту полость. Известны комплексы β- циклодекстрина с нестероидными противовоспалительными средствами (парацетамол, ибупрофен, кетопрофен, флуфенамовая и мефенамовая кислоты и др.), стероидами, простагландинами и простациклинами, барбитуратами, сульфонамидами, сердечными гликозидами и другими препаратами (см. например, патенты US 4524068, US 4727064,патент РФ 2337710,опублик. в 2008г., Szejtli, "Industrial Applications of Cyclodextrins" Ch. 1 1 of Inclusion Compounds, v. 3, Atwood et al, ed. Acad. Pr., 1984. pp. 331- 389).

Известны публикации описывающие соединениях включения (клатратных комплексах) а- или β-циклодекстринов с противовирусными соединениями, способы их получения и применения (см., например, заявку РФ 2005114097, патенты РФ 2288921, РФ 2377243, РФ 2247576, DE19814815A1, DE19814814A1,US4956351, US5221669, заявки US 2005/0209189, US 2005/0281872,US 2009/0286757, JP10-045319, JP58- 09269 l,JP-2005- 179329 JP-9-015632). В патенте P2128664, опублик.10.04.1999 описано соединение включения 9-(2- оксиэтоксиметилгуанина (ацикловира) с β-циклодекстрином, обладающее антигерпесной активностью. В этом же патенте описывается жидкофазный и твердофазный способы получения соединения включения. Жидкофазный способ заключается в поэтапном растворении компонентов при определенном соотношении в воде или водно-спиртовых растворах при нагревании, с последующей концентрацией образовавшегося продукта и выделением готового продукта.

Твердофазный метод заключается в механическом измельчении смеси кристаллического ацикловира и β-циклодекстрина в вибромельнице. При этом продукт остается кристаллическим и представляет собой мелкодисперсный подвижный порошок. В патентах РФ 2242974, 2357968, 2377243 описаны кристаллические формы и наноформы клатратов циклодекстрина и противовоспалительных средств. Согласно патенту РФ 2377243 описывается твердофазный способ, который включает получение твердых дисперсий компонентов с последующим необязательным размалыванием или растиранием данной дисперсии.

Задачей настоящего изобретения является изыскание новых клатратных комплексов β-циклодекстрина с противовирусным соединением 1 -{[6-бром- 1 -метил-5-метокси-2-фенилтиометил- 1 -Н-индол-3- ил]карбонил}-4-бензилпиперазином соответствующим формуле (1), возможно в виде наночастиц, с улучшенной растворимостью в воде и биодоступностью. Указанные новые соединения позволяют снизить терапевтические дозы препаратов на их основе, и, следовательно, уменьшить возможное токсическое воздействие препарата. Задачей настоящего изобретения также является разработка новых способов их получения и применение в фармацевтических композициях и лекарственных средствах.

Согласно настоящему изобретению предлагаются новые клатратные комплексы β-циклодекстрина с 1 -{[6-бром- 1-метил-5-метокси- 2 -фени лтиометил- 1 -Н-индол-3 -ил ]карбонил}-4-бензил пиперазином формулы (1) при мольном соотношении 1 -{[6-бром- 1-метил-5-метокси-2- фенилтиометил-1-Н-индол-3-ил]карбо нил}-4-бензилпиперазин: β-цикл о декстрин от 1 :1 до 1 : 10.

Формула 1

Необходимо отметить, что мольные соотношения 1 -{[6-бром- 1- метил-5-метокси-2-фенилтиометил-1-� �-индол-3-ил]карбонил}-4- бензилпиперазина соответствующего формуле (1) и β-цикло декстрина находятся в пределах от 1 :1 до 1 : 10, предпочтительно, при соотношения от 1 :3 до 1 :7, Указанные соотношения позволяют нацело перевести противовирусный препарат в клатратный комплекс, что существенно влияет на его водорастворимость и био доступность. Так, например, растворимость противовирусного соединения А, соответствующего формуле 1, в воде практически нулевая (5,7-10 ^"7 г/л), тогда как растворимость в комплексе 1 :5 составляет 0,02 г/мл, а в комплексе 1 :7 составляет практически 0,03 г/л.

Изобретение также относится к противовирусной фармацевтической композиции, которая содержит вышеуказанный клатратный комплекс β- циклодекстрина с 1 -{[6-бром- 1 -метил-5-метокси-2-фенилтиометил- 1 -Н- индол-3-ил]карбонил}-4-бензилпипер азином общей формулы (1) при мольных соотношениях 1 -{[6-бром -1-метил-5-метокси-2-фенилтиометил- 1- Н-индол-З-ил] карбонил}-4-бензилпиперазин : β-цикл о декстрин в пределах от 1 : 1 до 1 :10, предпочтительно, при соотношения от 1 :3 до 1 :7, в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый наполнитель.

Изобретение также относится к противовирусному лекарственному средству в виде капсул, таблеток или инъекций в фармацевтически приемлемой упаковке, содержащему вышеуказанный клатратный комплекс β-циклодекстрина с 1-{[6-бром-1-метил-5-метокси-2- фенилтиометил- 1 -Н-индол-3 -ил]карбонил}-4-бензилпиперазином формулы (I) при мольных соотношениях производное 1-{[6-бром-1-метил-5-метокси- 2-фенилтиометил-1 -Н-индол-3 -ил] карбонил}-4-бензилпиперазин: β- циклодекстрин в пределах от 1 : 1 до 1 :10, предпочтительно, при соотношения от 1 :3 до 1 :7, или фармацевтическую композицию на их основе в эффективном количестве.

При этом обнаружено, что клатратные комплексы являются пригодными для большинства лекарственных форм и путей введения.

Понятие «эффективное количество», используемое в данной заявке, подразумевает использование того количества соединения формулы 1, которое вместе с его показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной фармацевтической композиции или лекарственной форме.

При необходимости фармацевтическая композиция может содержать вспомогательные средства, такие как наполнители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы, например, такие добавки могут быть выбраны из микроцеллюлозы, лактозы, стеарата кальция, крахмала. Выбор и соотношение указанных компонентов зависит от природы и способа назначения и дозировки.

Содержание активного ингредиента составляет обычно от 1 до 20 вес.%, в сочетании с одной или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными добавками, такими как разбавители, связующие, разрыхляющие агенты, адсорбенты, ароматизирующие вещества, вкусовые агенты.

Указанные фармацевтическая композиция и лекарственное средство могут быть получены известными в фармацевтике способам.

Для получения фармацевтической композиции активный ингредиент (соединение формулы 1) смешивают с фармацевтически приемлемым носителем и, при необходимости с соответствующими добавками.

При этом лекарственное средство может быть в виде жидкой или твердой формы.

Примерами твердых лекарственных форм являются например, таблетки, пилюли, желатиновые капсулы и др. Примерами жидких лекарственных форм для инъекций и парентерального введения являются растворы, эмульсии, суспензии и др. Получение указанных лекарственных форм осуществляется традиционными для фармацевтики методами- смешением компонентов, таблетированием, капсулированием и т.д.

Клатратные комплексы могут быть получены двумя путями:

1) жидкофазным методом синтеза и

2) твердофазным методом синтеза.

Согласно способам настоящего изобретения получают нековалентные клатратные комплексы, стабилизированные водородными связями. Нековал ентный комплекс - комплекс, который образуется между молекулами веществ, например, в подходящем растворителе, за счет межмолекулярного ван-дер-ваальсового взаимодействия нековалентной природы, а именно - водородного связывания, координационно-ионных.

Жидкофазный способ заключается в том, что готовят растворы исходного β-циклодекстрина и 1 -{[6-бром-1-метил-5-метокси-2- фенилтиометил- 1 -Н-индол-3 -ил]карбонил}-4-бензилпиперазина формулы (1), которые затем смешивают при перемешивании и нагревании до температуры не выше 70°С, при мольном соотношении производное 1-{[6- бром- 1 -метил-5-метокси-2-фенилтиометил- 1 -Н-индол-3-ил]карбонил}-4- бензилпиперазин: β-циклодекстрин от 1 : 1 до 1 :10, с последующей выдержкой при перемешивании при указанной температуре до получения однородного(истинного) раствора и вьщелением полученного клатратного комплекса. При получении клатратного комплекса предпочтительными, являются мольные соотношения 1-{[6-бром-1-метил-5-метокси-2- фенилтиометил-1-Н-индол-3-ил]карбо нил}-4-бензилпиперазин:

β-циклодекстрин преимущественно в пределах от 1 :3 до 1 :7 , особенно при соотношениях 1,3 , 1 :5 и 1 :7. При необходимости, соединения включения (т.е.клатратные комплексы) могут быть выделены в виде наночастиц с размером менее 500 нм, предпочтительно около 175 нм.

Получение клатратного комплекса в виде наночастиц с указанным размером подтверждает анализ, проведённый на приборе Zetasizer Nano ZS (рисунок 1). Условия измерения следующие: дисперсия в воде. Плотность 1,330, вязкость 0,8886сР, температура 25°С, скорость истирания 210, диаметр получаемых частиц 174,5nm.

Твердофазный метод заключается в том, что β -циклодекстрин и 1 -{[6-бром- 1 -метил-5-метокси-2-фенилтиометил- 1 -Н-индол-3-ил]карбонил} -4-бензилпиперазин соответствующий формуле (1), подвергают размалыванию (перемалывают) со скоростью от ЮОоб/мин до 500об/мин в интервале времени от 10 до 60 мин при мольном соотношении 1-{[6- бром- 1 -метил-5-метокси-2-фенилтиометил- 1 -Н-индол-3-ил]карбонил}-4- бензилпиперазин: β-цикло декстрин от 1 :1 до 1 :10, преимущественно в пределах от 1 :3 до 1 :7 , особенно при соотношениях 1,3 , 1 :5 и 1 :7, при температуре от 20 до 30°С. При необходимости, соединения включения (т.е.клатратные комплексы) могут быть выделены в виде наночастиц с размером менее 500 нм, предпочтительно около 175 нм путем дополнительного измельчения дисперсии. Из теории механосинтеза известно, что пластическая деформация твердого тела обычно приводит не только к изменению формы твердого тела, но и к накоплению в нем дефектов, изменяющих физико-химические свойства, в том числе реакционную способность. Накопление дефектов может быть использовано в химии для ускорения реакций с участием твердых веществ, снижения температуры процессов и других путей интенсификации химических реакций в твердой фазе.

Особенностью процесса активирования твердого вещества в результате механической обработки является то, что активирование происходит, когда размер частиц по мере измельчения достигнет некоторой критической величины. В ходе механической активации не столько увеличивается поверхность, сколько накапливаются дефекты во всем объеме кристалла. Это резко изменяет многие физико-химические свойства твердых веществ, в том числе и реакционную способность.

Повышение реакционной способности в результате механической активации можно рассматривать как один из методов получения твердых веществ в метастабильной, активной форме. Поскольку химические реакции с участием твердых веществ в зависимости от особенностей их механизма по-разному чувствительны к различным дефектам, которые содержатся в кристалле, задача механической активации состоит не только в том, чтобы произвести накопление дефектов вообще, но и получить именно тот вид дефектов, который необходим для данной реакции. Эта цель может быть достигнута как подбором условий механического воздействия на кристалл (энергия воздействия, длительность, соотношение между давлением и сдвигом, температура обработки, состав окружающей атмосферы), так и учетом особенностей строения кристалла, характера химической связи, его прочностных характеристик и т.д.

Для получения наночастиц обычно вначале получают твердую дисперсию с последующим необязательным размалыванием или растиранием твердой дисперсии до получения соответствующего размера частиц. Тонкое измельчение частиц может быть осуществлено механическим способом путем приложения к частицам силы, под действием которой происходит их размельчение. Такая сила может быть обеспечена при столкновении частиц, которым придана высокая скорость, между собой. Тонкое измельчение с целью получения тонкоизмельченных частиц может быть осуществлено, например, с помощью перемалывания, с применением воздушно-струйной микронной коллоидной мельницы, с применением шаровой мельницы или с применением штифтовой мельницы. Размер получаемых наночастиц может быть определен любыми способами, общеизвестными в отрасли. Могут быть использованы, например, следующие способы: просеивание сквозь сита, седиментация, микроскопия. Предпочтительными для использования в предлагаемом изобретении являются способы измерения размеров частиц, наиболее широко используемые в фармацевтической промышленности, такие как лазерная дифракция или ситовый анализ.

Более подробно изобретение раскрывается в нижеуказанных примерах, которые, однако, не ограничивают притязания заявителя, а только иллюстрируют возможность его осуществления.

Получаемые соединения обладают улучшенным терапевтическим действием по сравнению с ранее известным близким по структуре и применяемым в лечебной практике противовирусным соединением - Арби долом, что является неожиданным и неочевидным для данного клатратного комплекса. Токсикологические исследования, проведенные в ФГУ «РКНПК Росмедтехнологий» и Медицинском радиологическом научном центре РАМН, свидетельствуют о низкой токсичности заявляемого комплекса: LD ₅₀ для мышей составляет 9800 и крыс LD ₅₀ более 6000 мг на 1кг массы тела. При этом было получено, что терапевтический индекс, который показывает широту терапевтического действия лекарственных веществ и представляет собой отношение средней смертельной дозы к дозе, вызывающей терапевтический эффект у 50% экспериментальных животных, соединения А и заявляемого комплекса не отличаются и составляют приблизительно величину 80.

Нижеследующие примеры иллюстрируют предлагаемое изобретение 1. Жидкофазный метод: Рассчитанную навеску β-цикл о декстрина растворяли в 0.5л дистиллированной воды при температуре 65-70°С . Навеску соединения А растворяли в 0,5л этанола при той же температуре, что и циклодекстрин. При перемешивании и нагревании раствор соединения А соответствующего формуле (1) приливался к раствору циклодекстрина. После смешения продолжали поддерживать температуру на уровне 65-70°С до получения истинного раствора, после чего в течение 2-х часов понижали температуру до 55°С. Спирт и часть воды из раствора упаривали, остаток отправляли на лиофильную сушку.

2. Твердофазный метод: Испытания проводились на шаровой планетарной мельнице Pulverisette 7 с материалом помольных стаканов из оксида циркония. Оптимальными оказались режимы ЮОоб/мин Юмин, 200об/мин Юмин, ЮОоб/мин Юмин, шары Змм для получения комплекса соединение А щиклодекстрин мольные соотношения также варьировались от 1 :1 до 1 :10. Благодаря именно этим режимам были получены комплексы с оптимальным набором спектральных данных и растворимостью.

Образование комплексов подтверждалось данными УФ и ИК спектроскопии.

В качестве конкретного примера приведены данные УФ спектра для соединения А: представлены сравнительные УФ спектры чистого соединения А, комплексов в соотношении 1 :3, 1 :5 и 1 :7, а также чистого β- циклодекстрина. Результаты показаны на рисунках 2, 3, 4, 5 и 6 соответственно . Растворитель: метанол: вода=1 :1 Растворение проводят нагревании

Соединение А 0,0250г в 50мл

ЦД: Соединение А =3:1 0,0500г в 25мл растворителя ЦД: Соединение А =5:1 0,0750г в 25мл растворителя ЦД: Соединение А =7:1 0,1000г в 25мл растворителя ЦЦ (циклодекстрин) 0,1750г в 50мл растворителя

Для снятия спектров данные растворы разбавлены в 21 раз (0,2мл + 4мл растворителя).

Навески образцов содержали одинаковое количество соединения А (0,025г), поэтому падение интенсивности поглощения можно отнести за счет экранирования молекулы соединения А циклодекстринами, т.е. образования комплекса.

При этом в образце полученным при соотношении ЦЦ: Соединение А =7:1 содержится больше комплекса, чем в образце ЦД: Соединение А = 5: 1, что подтверждается более низкой интенсивностью поглощения (образование комплекса), а также характером спектра в диапазоне 200- 220нм (отсутствие поглощения характерного для свободного цикл о декстрина). Таким образом, установлено, что мольное соотношение ЦД: Соединение А =7: 1 является оптимальным для образования комплекса.

Кроме того был проведён сравнительный анализ ИК-спектров чистого Соединения А, комплексных препаратов (соотношения 1 :3, 1 :5 и 1 :7), а также чистого циклодекстрина: рисунки 7-11 соответственно. Красным показан ИК-спектр чистого противовирусного препарата (соединение А).

На этих спектрах отчётливо видно, что происходит перекрывание сигналов характерных групп соединения А, особенно уширенной полосы поглощения в области 2200 см ^"1 , связанной с валентными колебаниями группы C-S-C6H5, а также полос поглощения 1585-1600 см ^"1 и 1400- 1500 см ^"1 , соответствующих валентным колебаниям связей С-С бензольного кольца. Данный факт говорит о том, что молекула противовирусного препарата находится в полости молекулы циклодекстрина, за счёт чего и происходит перекрывание сигналов и однозначно подтверждается образование клатратных комплексов.

Также необходимо отметить, что по совокупности физико- химических характеристик оптимальным является мольное соотношение соединение А: цикл о декстрин 1:7.

ТАБЛЕТКИ

Клатратный комплекс 100мг

соединения А и циклодекстрина

при мольном соотношении 1 :7

Возможные добавки: микроцеллюлоза, лактоза, стеарат кальция, крахмал.

Получают смешением компонентов в смесителе Bectochem и прессованием на таблетирующей машине Rimec.

КАПСУЛЫ

Клатратный нанокомплекс 100мг

Соединения А и циклодекстрина

при мольном соотношении 1 :5

Возможные добавки: микроцеллюлоза, лактоза, крахмал.

Получают смешением компонентов в смесителе Bectochem и заполнением желатиновых капсул 3VC.

Изучение противовирусной активности Соединения А комплексная форма препарата с β-циклодекстрином при соотношении 1:7. Исследования по противовирусной активности заявляемого комплекса in vivo проведены в Центре химии лекарственных средств (ЦХЛС-ВНИХФИ). Результаты исследований приведены в таблицах 2 и 3. Противовирусную активность полученных комплексов изучали в экспериментах на модели гриппозной пневмонии мышей. Эффективность соединений оценивали по показателю защиты от смертности и средней продолжительности жизни инфицированных вирусом и леченных животных.

В предварительном опыте была определена доза вируса, содержащая 10 LD50.

Для этого группы, состоящие из 5-6 мышей, заражали целым аллантоисным вирусом и последовательными 10-кратными его разведениями. Данные по наблюдению за животными в течение 15 дней представлены в Таблице 1.

Из представленных данных видно, что 50% гибель животных вызывает заражение вирусом 10 . Все животные в опыте были заражены этой дозой вируса.

Данные, приведенные в Таблице 2, свидетельствуют о том, что Цытривер, применявшийся в дозе 60 мг/кг/день сравним по противовирусной активности с Арбидолом в такой же дозе и даже несколько превосходил его, о чем свидетельствуют показатели защиты от смертности 61 % и 31 % соответственно .

В Таблице 3 представлены данные эффективности заявляемого комплекса на модели гриппозной инфекции у мышей.

Выводы

В результате проведенных исследований было установлено, что заявляемый комплекс в дозах 20,30, 60 и 90 мг/кг/ день при инфицировании вирусом А/Аичи/2/69 (H3N2) является эффективным в лечении мышей и имеет дозозависимый характер, увеличиваясь с увеличением дозы. Пероральное применение заявляемого комплекса в дозах 20, 30, 60 и 90 мг/кг/день в течение 5 дней снижает смертность мышей от гриппозной пневмонии, увеличивает среднюю продолжительность жизни и уменьшает потерю веса по сравнению с вирусным контролем.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что заявляемый комплекс является перспективным противогриппозным средством.

Токсикологические исследования проведены в ФГУ «РКНПК Росмедтехнологий» и Медицинском радиологическом научном центре РАМН. Полученные данные свидетельствуют о низкой токсичности заявляемого комплекса. LD ₅₀ для мышей составляет 9800 и крыс LD ₅₀ более 6000 мг на 1 кг массы тела. При этом было получено, что терапевтические индексы, которые показывают широту терапевтического действия лекарственных веществ и представляют собой отношение средней смертельной дозы к дозе, вызывающей терапевтический эффект у 50% экспериментальных животных, вещества А и заявляемого комплекса не отличаются и составляют приблизительно величину 80.

Таблица 1. Определение LD50 на модели гриппозной пневмонии мышей

* степень разведения

Таблица 2. Эффективность соединений на модели гриппозной инфекции у мышей (вирус А/Аичи/2/69)

*Схема лечения: за 24 и 1 часа до заражения, далее через 8,24,48,72 и 96 часов после заражения

** Среднюю продолжительность жизни определяли по формуле Zf(d-l)/n, где f-количество мышей умерших на день d (выжившие мыши включены в f и d в этом случае равно 16), η-количество мышей в группе.

Таблица 3. Эффективность заявляемого комплекса на модели гриппозной инфекции у мышей

>

m

х

δ

В о

^■ о

>

го

о

К)

*Схема лечения: за 24 и 1 часа до заражения, далее через 8, 24, 48, 72 и 96 часов после заражения ** Среднюю продолжительность жизни определяли по формуле Ef(d- l)/n, где f-количество мышей умерших на день d (выжившие мыши включены в f и d в этом случае равно 16), η-количество мышей в группе