La présente invention concerne de nouveaux composés dotés de propriétés inhibitrices de t'activité des toxines clostridiales (tétaniques et botuliques), leurs procédés de préparation et les compositions pharmaceutiques correspondante-s.

Maigre de larges programmes de vaccination dans le monde de nombreuses bactéries demeurent une menace pour I'homme.

Introduites dans un organisme, elles y induisent la production de toxines variées et initient ainsi le développement de maladies graves voire létales.

Le tétanos et le botulisme sont deux exemples particuliers de maladies neuromusculaires graves, induites par des neurotoxines clostridiales, respectivement la toxine tétanique et les sept sérotypes de toxines botuliques, A, B, C, D, E, F et G.

En termes de prophylaxie, seuls un vaccin ainsi qu'un sérum antitétanique sont aujourd'hui disponibles. En revanche, il n'existe à ce jour aucune thérapie pour traiter les maladies déclarées.

Le mode d'action de ces toxines, au niveau moléculaire, n'a été mis en évidence que fort récemment, en 1992 par Schiavo et al. <BR> <BR> <BR> <P> (Nature, 359,832). Elles sont constituées de deux chaines polypeptidiques, I'une lourde et t'autre légère, associées par un pont disulfure. La chaîne lourde est responsable de la liaison spécifique au neurone et de la pénétration cellulaire. La chaîne légère bloque I'exocytose des neurotransmetteurs par protéolyse sélective et distincte de trois protéines impliquées dans ce phénomène : la synaptobrévine, la syntaxine et SNAP-25. La dégradation de l'une ou t'autre de ces protéines inhibe, dans le cas de la toxine tétanique, la libération des neurotransmetteurs inhibiteurs et, dans le cas des neurotoxines botuliques, la libération des neurotransmetteurs excitateurs.

Cette voie de protéolyse et l'appartenance de ces toxines à la famille des métalloendopeptidases à zinc ont dans un premier temps conduit les chercheurs à envisager une thérapie basée sur la mise en oeuvre d'inhibiteurs puissants et sélectifs de cette activité enzymatique.

Toutefois, toutes les molécules connues comme étant des inhibiteurs puissants et sélectifs de protéases à zinc telles que le phosphoramidon pour la thermolysine, le captopril pour l'enzyme de conversion de I'angiotensine et le thiorphan pour t'endopeptidase neutre 24.11 et bien d'autres se sont révélées inefficaces même à des

concentrations millimolaires sur ces toxines (Soleilhac et al. (1996) Analytical Biochemistry, 241,120-127 ; Cornille et al. (1994) Europ. J.

Biochem., 222,173-181 ; Shone et al. (1993) Europ. J. Biochem., 217.

965-971).

II demeure donc à ce jour un besoin de médicaments pour traiter les maladies induites par les toxines clostridiales.

La présente invention a précisément pour objet de proposer de nouveaux composés capables d'inhiber, sélectivement ou conjointement, les activités enzymatiques de la toxine tétanique et des divers sérotypes de toxines botuliques. Ces composés sont des agents thérapeutiques potentiels du tétanos et du botulisme.

Plus précisément, la présente invention concerne des nouveaux composés de formule générale (I) : dans laquelle : -X représente : un groupement méthylène ou un groupement carbonyle, -R, représente : un groupement aikyle, alkoxyalkyle, alkylthioalkyle, halo- hétérocycloalkyle,(cycloalkyl)alkyle,alkyle,cycloalkyle, (hétérocycloalkyle) alkyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle, ou (hétéroaryl) alkyle, substitué sur la chaine alkyle ou sur le cycle par au moins un groupement R7 choisi parmi : un groupe suifonamide-S02NH2,-S02NHR8 ou -S02N (R8) 2, un groupe amide,-CONH2,-CONHR8 ou-CON (R8) 2, un groupe amine NH2,-NHR8 ou-N (R8) 2 et un groupe guanidinyle

avec R8 étant un groupement alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl) alkyle, aryle ou arylalkyle, -R2, R3 représentent indépendamment l'un de t'autre un atome d'hydrogène, un groupement alkyle, alkoxyalkyle, carboxyalkyle, halo- alkyle, hydroxyalkyle, aminoalkyle, alkylthioalkyle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, (cycloalkyl) alkyle, (hétérocycloalkyle) alkyle, aryle,<BR> arylalkyle, arylarylalkyle, hétéroaryle, (hétéroaryl) alkyle,<BR> carbamoylalkyle, guanidinylalkyle, -R4 représente un atome d'hydrogène, un groupement acétyle, un groupement benzoyle, un groupement-SR9 avec Rg étant un groupement alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl) alkyle, aryle, arylalkyle, ou un groupement -S-CH [CHR,-NH2]-X-N (R5) CHR2CON (R6) CHR3COZ, avec Ri. X, R5 R2, R6, R3 et Z tels que définis ci-dessus ou ci-après, -R5 et R6 représentent indépendamment l'un de t'autre un atome d'hydrogène, un groupement alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl) alkyle, aryle, arylakyle, (hétéroaryl)alkyle, -R2 et Rs pris ensemble peuvent éventuellement constituer avec l'atome d'azote portant R5 un groupement hétérocycloalkyle éventuellement condensé avec un aryle, ou un hétéroaryle, -R3 et R6 pris ensemble peuvent éventuellement constituer avec l'atome d'azote portant R6 un groupement hétérocyctoatkyte éventuellement condensé avec un aryle ou un hétéroaryle,

-Z représente un groupement OH, OR, o, NHz, NHR, o, N (Ra0) 2, avec R, o étant un groupement alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl) alkyle, aryle ou arylalkyle et leurs dérivés.

Les définitions des différents groupements proposés dans la formule générale I des composés revendiqués sont précisées dans la liste ci-dessous. Ces définitions s'appliquent aux termes tels qu'ils sont utilisés à travers ce texte (à moins qu'elles soient limitées à des exemples précis) soit individuellement soit en tant que faisant partie d'un groupe plus large.

C'est ainsi qu'au sens de l'invention, on entend désigner par : -alkyle et alkoxy, une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée comportant de 1 à 7 atomes de carbone ; -halo-alkyle, un groupement alkyle dans lequel au moins un hydrogène est remplacé par un atome de chlore, de brome, d'iode ou de fluor. A titre représentatif d'un tel groupement on peut citer notamment les groupements pentafluoroéthyle, 2,2,2-trichloroéthyle, chlorométhyle, bromométhyle et plus préférentiellement le bromométhyle ; -cycloalkyle, un groupement cycloalkyle ayant 3,4,5,6 ou 7 atomes de carbone non substitué ou substitué par 1,2, ou 3 groupements alkyle, aryle, alkoxy, alkylthio, hydroxy, amino, alkylamino, dialkylamino, nitro, trifluorométhyle, ou atomes de chlore, brome, iode ou fluor ; -hétérocycloalkyle, un groupement cycloalkyle comportant au moins un hétéroatome pris parmi I'azote, t'oxygène ou le soufre et portant le cas échéant au moins un substituant tel que défini précédemment pour le cycloalkyle ; -aryle, un groupement phényle ou naphtyle non substitué ou substitué par 1,2 ou 3 groupements alkyle, alkoxy, alkylthio, hydroxy, amino, alkylamino, dialkylamino, nitro, trifluorométhyle, ou atome de chlore, brome, iode ou fluor ; -hétéroaryle, un groupement 2-ou 3-furanyle, 2-ou 3- thiényle, 2-, 3-ou 4-pyridinyle, 4-imidazolyle et 3-indolyle.

A titre illustratif des groupements hétérocycliques susceptibles d'être constitués par R3, Rs et l'atome d'azote portant Rs ou par R3, R6 et l'atome d'azote portant R6, on peut notamment citer les

hétérocycles azotés comme les carboxy 2-pipéridinyle et carboxy 2- pyrrolidinyle.

Au sens de la présente invention, on entend couvrir sous le terme"dérivés"notamment les sels d'addition des composés de formule générale (I) obtenus avec des acides organiques ou minéraux pharmacologiquement acceptables. II peut par exemple s'agir de sels tels que les chlorhydrate, bromhydrate, sulfate, nitrate, borate, phosphate, méthane sulfonate, acétate, fumarate, succinate, ascorbate, oxalate, lactate, pyruvate, citrate, tartrate, maléate, malonate, benzoate, diaminobenzène sulfonate, chromoglycate, benzène sulfonate, cyclohexane sulfonate, toluène sulfonate, dipropyl acétate, glucose-1 phosphate, palmoate et palmitate.

Parmi ces dérivés, on peut également citer les dimères de composés de formule générale 1, constitues par deux molécules de composés de formule générale 1, identiques ou différentes, couplées entre elles au niveau de leurs atomes de soufre respectifs. Dans ce cas particulier, R4 est représenté par le groupement-S-CH [CHRi-NH2]-X- N (R5) CHR2CON (R6) CHR3COZ, identifié précédemment.

De même, la présente invention s'étend aux différentes formes éniantomériques des composés revendiqués.

En effet, les composés de formule (I), possédant plusieurs carbones asymétriques, ils existent sous forme de mélanges soit racémiques ou de diastéréoisomères ou encore sous forme de stéréoisomères purs.

Les composés optiquement purs peuvent être isolés par des synthèses énantiosélectives ou des résolutions par des amines chiales.

Dans le cas de procédés de préparation conduisant à des mélanges de stéréoisomères, une séparation par HPLC semi-préparative sur colonne (Vydac C18, lOx250 mm, CH3CN-H20) est effectuée, permettant une étude biochimique et pharmacologique séparée de chaque stéréoisomères Parmi ces stéréoisomères, sont préférés ceux possédant une configuration absolue (S) ou (R) sur le carbone portant le groupement Ri.

(S) ou (R) sur le carbone portant la fonction-SR4, et (S) sur les carbones portant les groupements R2 et R3

De préférence, les composés selon l'invention comprennent titre de R, un groupement alkyle, cycloalkyle, aryle, ou hétéroaryle. substitué par au moins un groupement-SO2NH2,-SO2NHRB,-SO2N (R8) 2, avec R8 tel que défini précédemment.

Selon un autre mode particulier de l'invention, il s'agit de composés de formule générale (I) dans laquelle X représente une fonction carbonyle.

A titre de composés préférés selon la présente invention, on peut plus particulièrement citer les composés de formule générale (I) dans laquelle X représente une fonction carbonyle et Ri représente un groupement alkyle, cycloalkyle, aryle, ou hétéroaryle, substitue par au moins un groupement-S02NH2,-S02NHR8,-S02N (R8) 2,-CONH2,- CONHR8-CON (R8) 2, NH2, -NHR6 ou-N (R8) 2, avec R8 tel que défini précédemment. Selon un mode préféré de l'invention, R, y représente un groupement choisi parmi les groupements (CH2) nSO2NH2, (CH2) nCONH2 ou (S02NH2) Ph, avec de préférence n compris entre 1 et 5. Plus préférentiellement, il s'agit d'un composé avec un groupement (CH2) nSO2NH2 avec n compris entre 1 et 5.

Plus préférentiellement, il s'agit de composés de formule générale I dans laquelle R4, R5, et R6 représentent un atome d'hydrogène, X une fonction CO et avec R, représentant un groupement (CH2) 2S02NH2 ou un groupement (S02NH2) Ph.

A titre illustratif des composés revendiqués selon l'invention on peut plus particulièrement citer les dérivés suivants : - N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl)-L-Valyl-L- Isoleucine, -N- (N- (2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl)-L-Valyl)-L- lsoleucyl-benzylamide,<BR> N- (N- (2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl)-L-Tyrosyl-L- Histidine, - N-(N-2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyt pentanoyl)-L-Tyrosyl)-L- H istidyl-benzylamide,

3-amino,5-sulfamoylpentyl)-L-Tyrosyl)-L--N-(N-(2-mercapto, Histidine, 3-amino,3-(3-sulfamovl)phénylpropanoyl)-L--N-(N-(2-mercapto , Tyrosyl)-L-Histidyl-benzylamide, -N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-carbamoyl pentanoyl)-L-ß(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-carbamoyl pentanoyl)-L-ß (2- naphtyl)-Ala-L-ß (2-naphtyl)-Alanine, - N-(N-2-mercapto, 3-amino, 5-carbamoyi pentanoyl)-L-Trp)-L- Leucine.

La présente invention a également pour objet des procédés de préparation. des composés revendiqués.

Les composés de formule générale (I) dans laquelle X représente un groupement carbonyle, CO, peuvent être préparés par couplage d'un acide de formule générale (II) : dans laquelle : -P, représente un groupement tertbutyloxycarbonyle ou benzyloxycarbonyle, -P2 représente un groupement 4-méthoxybenzyle ou 2,4 diméthoxybenzyle, -avec R1 étant défini comme précédemment. avec une amine de formule générale (III) dans laquelle : R2 et R3, R5, R6 et Z sont définis comme précédemment,

dans un solvant organique, en présence d'un agent de couplage et d'une amine tertiaire, à une température de l'ordre de 20°C.

Généralement, le couplage de J'acide de formule (II) sur I'amine générale (III) est effectué en opérant dans un solvant organique comme le dichlorométhane ou le diméthylformamide, en utilisant comme réactif de couplage, un composé du type BOP [benzotriazol-1-yl-oxy- tris (diméthylamino)-phosphonium hexafluorophosphate], HATU [0- (7- azabenzotriazol-1-yl) 1,1,3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate], ou TFFH [tétraméthylfluoro formamidinium hexafluorophosphate] à une température de mélange réactionnel voisine de 20°C et en présence d'une amine tertiaire comme la diisopropyléthylamine.

Ces produits de formule générale (II) peuvent préalablement être obtenus par sulfénylation électrophile du p-amino ester protégé de formule (IV), Dans cette formule, Pi et R, sont définis comme précédemment, P3 représente un groupement méthoxy, éthoxy, allyloxy ou une copule chirale telle que celle décrite par Evans ou par Oppolzer permettant ainsi une synthèse énantiosélective par action d'un disulfure asymétique.

Généralement, le disulfure asymétrique de 4-méthoxybenzyle et de 2,4-dinitrophényle est ajouté sur t'énotate du p-amino-ester protégé (IV), obtenu par traitement du p-amino ester (IV) par le diisopropylamidure de lithium dans le THF à-78°C. La saponification des produits obtenus précédemment est effectuée par la soude dans un mélange d'eau et de méthanol à une température comprise entre 0°C et 20°C, pour conduire aux produits de formule générale ( !)).

Ces produits de formule (IV) peuvent prétiminairement être obtenus soit : -par homologation selon a réaction de Arndt-Eistert à partir de I'amino-acide protégé de formule (V) :

ce produit de formule (V) étant converti en diazocétone par addition de diazométhane sur t'anhydride mixte obtenu par traitement de (V) avec le chloroformiate d'isobutyle. Le réarrangement de Wolff avec du benzoate d'argent en présence d'un alcool (méthanol, ethanol, alcool allylique ou autre) conduit alors au composé de formule (IV), ou -par addition de Michael de I'amidure de lithium de la benzyl-1-phényléthylamine (+) ou (-) sur t'ester a, ß insaturé de formule (VI). L'utilisation de cette amine secondaire chirale permet une synthèse parfaitement énantiosélective (ee> 99%), la configuration obtenue dépendant de la configuration absolue de l'amine de départ. La débenzylation du p-amino acide est obtenue par hydrogénolyse sous 20 bars d'hydrogène en présence d'hydroxyde de palladium sur charbon et en présence de Boc20 afin de protéger l'amine primaire obtenue par un groupement t-butoxycarbonyl (P1).

L'ester (VI) peut être lui même obtenu par réaction de Wittig d'un composé de formule (VII) sur une aldéhyde de formule (VIII)

Les composés de formule générale (1) dans laquelle X représente un groupement méthylene, cH2., peuvent être préparés par traitement d'une amine de formule générale (III) telle que définie précédemment avec une aldéhyde de formule (IX) dans laquelle Ri, P, et P2 sont définis comme précédemment, au sein d'un solvant organique et en présence d'un catalyseur.

De préférence, le traitement de,'amine (III) sur l'aldéhyde (IX) est effectué dans un solvant organique en présence d'acide paratoluènesulfonique en tant que catalyseur pour la formation de t'imine suivie de la réduction par le cyanoborohydrure de sodium conduisant au composé de formule (I), dans lequel X = CH2.

Les produits de formule (IX) sont généralement obtenus par réduction en alcool des composés de formule (11) suivie d'une oxydation de Swern en aldéhyde.

La transformation de (II) en alcool est obtenue par réduction au borohydrure de sodium de I'anhydride mixte de (il). L'oxydation de Swern est réalisée par action du DMSO en présence de chlorure d'oxalyle dans un solvant organique.

Les amines de formule (III) sont généralement obtenues par formation successive de liaisons peptidiques soit en phase liquide soit en phase solide selon la méthode de Merrifield sur des résines diversement substituées afin d'obtenir les différentes protections de I'acide C-terminal.

A l'exception des structures où R2 et R5 (respectivement R3 et Rs) pris ensemble constituent un cycle, les substitutions R5 et R6 des groupes amino sont obtenues soit par formation de la base de schiff entre t'aldéhyde correspondant à R5 et t'acide aminé supportant R2, ou entre l'aldéhyde correspondant à R6 et t'acide aminé supportant R3 respectivement puis réduction par le cyanoborohydrure de sodium.

Les composés revendiqués s'avèrent capables d'inhiber significativement l'activité enzymatique des toxines clostridiales comme la toxine tétanique et les sept sérotypes de toxine botulique.

A ce titre, les composés revendiqués peuvent être utilisés en thérapie dans tous les processus pathologiques induits par des toxines clostridiales.

Plus précisément, les applications cliniques pour lesquelles on peut envisager l'utilisation de ces composés comprennent les maladies initiées par des toxines de type tétanique ou botulique.

A ces fins, les composés revendiqués et leurs dérivés peuvent être utilisés pour ta préparation de compositions pharmaceutiques correspondantes.

Plus particulièrement, la présente invention concerne, selon un autre de ses aspects, une composition pharmaceutique comprenant en tant que principe actif au moins un composé de formule générale (I) ou un de ses dérivés.

Bien entendu, ce composé peut y être associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

De même on peut envisager d'introduire conjointement deux ou plusieurs composés de formule générale t dans une même composition pharmaceutique.

Ces compositions pharmaceutiques peuvent être administrées par voie orale, parentérale, sublinguale, transdermique ou topique.

En ce qui concerne t'administration par voie orale ou sublinguale, on utilise en particulier des comprimés, simples ou dragéifiés, des gélules, des granules éventuellement à libération retardée, des gouttes ou encore des liposomes. En ce qui concerne l'administration par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire, on a recours à des solutions stériles ou stérilisables en particulier pour perfusion veineuse, tandis que l'on peut réaliser les patches conventionnels pour t'administration par voie transdermique. Pour l'utilisation topique on peut utiliser des crèmes ou des lotions à étendre sur la peau.

Les compositions pharmaceutiques se, on la présente invention peuvent être préparées selon des méthodes usuelles bien connues dans le domaine de la technique pharmaceutique.

Le principe actif peut être incorporé dans les excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, I'amidon, le stéarate de magnésium, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, différents agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs, etc.

La quantité de principe actif à administrer par jour dépend bien entendu de la particularité de l'indication thérapeutique, de la gravité des affections à traiter, ainsi que du poids du malade et de la voie d'administration.

Pour une administration systémique, la dose globale chez l'homme varie généralement entre 1 et 100 mg par jour, par exemple de 2 à 50 mg, et plus convenablement de 3 à 40 mg par jour.

Des formes unitaires de dosage pour l'administration systémique comprendront généralement de 3 à 50 mg (à savoir 3,5,10, 20,30,40, et 50 mg de produit). Ces doses unitaires seront administrées normalement une ou plusieurs fois par jour, de préférence une à trois fois par jour.

Pour l'administration topique, les compositions pharmaceutiques contiennent généralement de 0,0001 à 1 % de principe actif et de préférence de 0,01 à 5 %.

Outre cette utilisation des composés de formule générale (I), à titre d'agent thérapeutique potentiel des maladies induites par des toxines clostridiales, comme le tétanos ou le botulisme, on peut également envisager leur utilisation conjointe avec des toxines, botuliques par exemple, à des fins thérapeutiques.

En effet, il a été développé en clinique humaine des méthodes de traitement thérapeutiques symptomatiques des dystonies par hyperactivité motoneuronale. Ce type de prophylaxie est en particulier proposé pour traiter des troubles du type strabisme, blépharospasme, crampe de l'écrivain, spasme hémifacial. La thérapie consiste à injecter des doses de toxines clostridiales au niveau de l'organisme traité. ! ! est clair que compte tenu du caractère toxique de ces toxines, les doses mises en oeuvre, doivent être minimisées de manière à prévenir tout effet secondaire néfaste. La co-administration d'un composé selon l'invention

avec une toxine offre donc la possibilité d'employer des doses plus importantes et donc plus efficaces de ces toxines.

En conséquence, les composés selon l'invention fournissent avantageusement un antidote pour toute activité non désirée de neurotoxines botuliques, administrées en clinique humaine.

On peut également envisager le développement de protocole de co-administration permettant la détection et/ou titration de j'activité de ces toxines dans des cibles musculaires définies pour atteindre le résultat clinique désiré.

En conséquence, la présente invention a également pour objet l'utilisation conjointe d'au moins un composé de formute générate (t) avec au moins une toxine clostridiale comme la toxine tétanique ou la neurotoxine botulique et propose une composition pharmaceutique comprenant au moins un composé de formule générale I en mélange avec au moins une toxine clostridiale. Selon un mode particulier de l'invention, il s'agit d'une toxine tétanique ou d'une neurotoxine botulique Les composés décrits selon l'invention peuvent également être utilisés dans le cadre d'applications non thérapeutiques en particulier dans des systèmes de diagnostic et de détection de neurotoxines clostridiales dans des cibles musculaires.

En effet, t'inhibition sélective de tel ou tel sérotype de toxines clostridiales par les composés décrits dans cette invention peut permettre dans un test enzymatique in vitro d'identifier avec certitude le sérotype de toxine contaminant une solution aqueuse et pouvant contenir d'autres enzymes.

La présente invention a également pour objet un système de diagnostic pour détecter des neurotoxines dostridiates (tétanique et botuliques) caractérisé en ce qu'il comprend au moins un composé de formule générale I.

Les exemples présentés ci-après à titre non limitatif mettront en évidence d'autres avantages de la présente invention.

Les protons de spectre de résonance magnétique nucléaire sont numérotés selon les règles de nomenclature en vigueur et les déptacements chimiques sont mesurés en ppm en utilisant le 1,1,1,3,3,3- hexaméthytdisitazane (HMDS) comme étalon interne.

A-PROCEDE DE PREPARATION GENERAL DE PEPTIDYL RESINE La synthèse des peptidyl résines H-A1-A2-dichlorotritylrésine (respectivement H-A1-A2-HMP-résine ou H-A1-A2-Rink-amide-résine) est réalisée sur la dichtorotrity ! résine substituée à 1,35 mmol/g (respectivement HMP-résine ou Rinkamide-résine substituée à 1,0 mmol/g) en utilisant la stratégie Fmoc sur un synthétiseur Applied Biosystems AB ! 431B". L'acide aminé protégé Fmoc-An-OH (1mmol) est couple a 125 mg (200 mol) de dichlorotrityl-résine dans la NMP en présence de diisopropyléthylamine (DIEA) (respectivement, à 150 mg de HMP-résine (150 µmol)) en présence de DCC (dicyclohexylcarbodiimide) et de DMAP (diméthylaminopyridine). Le groupement a-amino est déprotégé par un traitement avec 20% de piperidine dans la NMP (N- méthylpyrrolidone). Les différents acides Fmoc-An-OH (1 mmol), sont successivement couplés dans la NMP en utilisant comme agent d'activation le couple dicyclohexylcarbodiimide (DCC)/1- hydroxybenzotriazole (HOBt). Le groupement Fmoc est clivé avec une solution de 20% en piperidine dans la NMP. Après chaque couplage et déprotection, la résine est alternativement lavée avec de la NMP et du dichlorométhane.

B-PROCEDE DE PREPARATION DES DIFFERENTS SYNTHONS : Bl) SYNTHESE DU SYNTHON 1 : <BR> <BR> <BR> Acide 2-(paraméthoxybenzyl-thio)-, 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino)-,<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 5- (N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoique.

Ce synthon est commun aux exemples 1,2,3,4 et 5.

I-) Acide (2SR), 4.4'-dithiobis, 2-(N-benzv, oxvcarbonyl)-amino, butanoique ou (SR) (Z-HOMOCYS-OH) 2 A un mélange de dioxanne (100 ml) l eau (100 ml), on ajoute <BR> <BR> à 0 °C, 5,52 g de soude en pastilles (137,9 mmot) puis 18,5 g (68,94 mmol) de (SR) (D, L) Homocystine commerciale. On coule alors goutte à goutte une solution de chloroformiate de benzyle (100 ml). Pendant l'addition, on ajuste le pH à 9 avec une solution de NaOH (1N) puis on laisse revenir à température ambiante et on agite pendant 2 heures. On évapore le dioxanne puis on ajoute de t'acétate d'éthyte et on acidifie la phase aqueuse avec HCI 2N jusqu'à pH=1. On t'extrait à trois reprises avec de t'acétate d'éthyle puis on sèche la phase organique avec une solution de NaCI saturée et un passage sur Na2S04. Après évaporation à sec, on reprend la phase organique avec du toluène puis avec du <BR> <BR> <BR> dichlorométhane.<BR> <BR> <BR> <BR> <P> On obtient, avec un rendement de 99,2%, 36,7 g (68,39mmol) de (Z-Homocys-OH) 2 dont les caractéristiques sont les suivantes : Rf (MeOH : CH2CI2 : H20 : AcOH 3 : 7 : = 0,55 <BR> <BR> 1 H RMN (d6-DMSO) 5 1.85 à 2.00 (m, 1H, CH-CH2-CH2), 2.00 à 2.15 (m, 1 H, CH-CH »-CH2), 2.70 (t, 2H, CH-CH2-CH2), 4.08 (m, 1 H, CH-CH2-CH2), 4.97 (s, 2H, CH2-C6H5), 7.30 (m, 5H, CH aromatiques), 7.58 (d, 1 H, NH- Z). <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>II-) (2SR). 4.4'-dithiobis. 2- (N-benzvloxvcarbonvl)-amino butanoate de méthyle ou (SR) (Z-Homocvs-OMe} o A une solution de 36,7 g de (Z-Homocys-OH) 2, dans un mélange de dichlorométhane (50 ml)/éther (50 mi) refroidi à 0°C, on ajoute un excès de diazométhane. Après 1 heure, l'excès de diazométhane est neutralisé par ajout d'AcOH jusqu'à disparition de la coloration jaune. On évapore à sec. On obtient, avec un rendement de <BR> <BR> 89,5%, 34,52 g de (Z-Homocys-OMe) 2 dont les caractéristiques sont les suivantes :

Rf (AcOEt/cyclohexane 3 : 7) = 0,27 1H RMN (d6-DMSO) 5 1.82 à 2.10 (m, 2H, CH-CH2-CH2), 2.68 (m, 2H, CH-CH2-CH2), 3.60 (s, 3H, COOMe), 4.13 (m, 1 H, CH-CH2-CH2), 4.99 (s, 2H, CH2-C6H5). 7.2 à 7.4 (m,, 5H, CH aromatiques), 7.73 (d, 1 H, NH-Z) <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> III-) (2SR), 2- (N-benzvloxvcarbonvl)-amino, 4- (N-tertiobutvlaminosulfonvl) butanoate de méthYle A une solution de 34,51 g (61,19 mmol) de (Z-Homocys- OMe) 2 refroidie à 0 °C dans 20 ml de MeOH et 250 ml de CCl4, du chlore gazeux est mis à buller sous vive agitation pendant 35 minutes. On purge le mélange réactionnel avec de t'azote. L'évaporation à sec permet d'obtenir, avec un rendement de 87%, 37,25 g de 2- (N- benzyloxycarbonyl)-amino 4- (chlorosulfonyl) butanoate de méthyle.

A une solution de 37,25 g (106,5 mmol) du composé précédent dans 140 ml de CH2CI2, refroidi à 0 °C est ajoutée rapidement une solution de 50 ml de tBuNH2 dans 50 ml de CH2CI2. Après 30 minutes d'agitation, on filtre le chlorhydrate de tBuNH2. On rince avec un peu de CH2CI2 puis on évapore à sec. On obtient, avec un rendement de 95%, 39,12 g de (2SR), 2-(N-benzyloxycarbonyl-amino), 4-(N- tertiobutylaminosulfonyl) butanoate de méthyle dont les caractéristiques sont les suivantes : Rf (AcOEt : CH2CI2 10 : 90) = 0,35 1H RMN (d6-DMSO) # 1.18 (s, 9H, tBu), 1.89 à 2.15 (m, 2H, CH-CH2- CH2), 2.84 à 3.09 (m, 2H, CH-CH2-CH2), 3. 59 (s, 3H, COOMe), 4.22 (m, 1 H, CH-CH2-CH2), 4.99 (s, 2H, CH2-C6H5), 6.84 (s, 1 H, S02-NH), 7.29 (m, 5H, CH aromatiques), 7.80 (d, 1 H, NH-Z) IV-) Acide 4-(N-2-(N-benzyloxycrbonyl-amino), tertiobutvlaminosulfonvi) butanoïoue A une solution de 39,12 g (101,22 mmol) de (2SR), 2- (N- benzyloxycarbonyl-amino), 4- (N- tertiobutylaminosulfonyl) butanoate de <BR> <BR> <BR> méthyle dans 100 ml, refroidie à 0 °C. est ajoutée une solution de 11,33 g

(283,42 mmoi) de NaOH dans 100 ml de MeOH. Après 3 heures d'agitation, on évapore le MeOH.. On ajoute de l'eau. La phase aqueuse est extraite avec Et20. On acidifie la phase aqueuse avec KHS04 (2N) puis on extrait 3 fois avec de t'acétate d'éthyle. L'ensemble des phases organiques est lavé par de t'eau, séché sur sulfate de sodium et évaporé. <BR> <BR> <BR> <P>On obtient avec un rendement de 99%, 37, 40 g d'acide (2SR), 2- (N- benzyloxycarbonyl-amino), 4-(N-tertiobutylaminosulfonyl) butanoïque dont les caractéristiques sont les suivantes : Pf=133°C Rf (MeOH : AcOH : CH2C12) = 0,31 <BR> <BR> 1H RMN (d6-DMSO) 5 1.08 (s, 9H, tBu), 1.75 à 2.00 (m, 2H, CH-CH2- CH2), 2.70 à 2.84 (m, 1H, CH-CH2-CH2), 2.84 à 2.98 (m, 1H, CH-CH2- CH. 3.98 (m, 1 H, CH-CH2-CH2), 4.86 (s, 2H, CH2-C6H5), 6.72 (s, 1H, S02-NH), 7.19 (m, 5H, CH aromatiques), 7.56 (d, 1H, NH-Z), 12.70 (s, 1H, COOH).

V-) 5-(N-tertiobutylaminosulfonyl)3-(N-benzyloxycarbonyl-amino), pentanoate de méthYle On dissout 20 g (53,7 mmol) d'acide (2SR), 2- (N- benzyloxycarbonyl-amino), 4-(N-tertiobutylaminosulfonyl) butanoïque(N-tertiobutylaminosulfonyl) butanoïque dans 15 ml de DMF, on y ajoute 100 ml de THF fraîchement distillé puis 7,1 ml (1,2 eq) de N-méthylmorpholine. A-15°C, on ajoute goutte à goutte 8,5 ml d'iBuOCOCI sous azote et on laisse agiter 20 minutes. Après filtration du chlorhydrate de N-méthylmorpholine, on ajoute un excès de diazométhane. Après une heure d'agitation, on évapore et on reprend à t'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont lavées avec H20, NaHC03 (10%), NaCI saturé puis on sèche sur Na2SO4 et on évapore pour obtenir <BR> <BR> <BR> avec un rendement quantitatif, 21,12 g de (3SR), 3- (N-benzyloxycarbonyl- amino), 4-oxo, 5-diazenyl, N-tertiobutylsulfonamide pentanoate.

A une solution de 21,12 g (53,28 mmol) de (3SR), 3- (N- benzyloxycarbonyl-amino), 4-oxo, 5-diazenyl, N-tertiobutylaminosulfonyl pentanoate dans 180mt de méthanol, on coule goutte à goutte une <BR> <BR> <BR> solution de 1,64 g de benzoate d'argent dans 70 ml de triéthylamine.

Après une agitation d'1 h 30, on ajoute une spatule de célite, une spatule

de charbon actif et 50 ml de NaCI. On agite pendant 1 heure et on filtre sur colite.

Le filtrat est évaporé à sec. Le résidu est repris avec de l'AcOEt. Les phases organiques sont lavées avec NaHCO3 (10%), H20, KHS04 (1N) et NaCI saturé. On sèche sur Na2S04 et on évapore à sec. Le produit est purifié sur une colonne de siiice avec comme éluant le mélange suivant (20% AcOEt, 30% CH2CI2,50% cyclohexane). Après concentration, on obtient avec un rendement de 95%, 20,06 g de (3SR), 3-<BR> (N-benzyloxycarbonyl-amino), 5- (N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoate de méthyle dont les caractéristiques sont les suivantes : Pf = 88°C Rf (AcOEt : CH2CI2 : cyclohexane 1 : 1 : 1) = 0,48 1 H RMN (CDCl3) 5 1.29 (s, 9H, tBu), 1.99 (m, 2H, CH-CH2-CH2), 2.54 (d, 2H, CH2-COOMe), 3.05 (t, 2H, CH-CH2-CH2), 3.61 (s, 3H, COOMe), 4.02 (m, 1H, CH-CH2-CH2), 4.14 (s, 1 H, S02-NH), 5.03 (s, 2H, CH2-C6H5), 5.37 (d, 1 H, NH-Z), 7.2 à 7.4 (m, 5H, CH aromatiques) (3SR),3-(N-benzyloxycarbonyl-amino),5-(N-VI-)Acide tertiobutvlaminosuifonvi) pentanoïque<BR> <BR> 10 g (25mmol) de (3SR), 3- (N-benzyloxycarbonyl-amino), 5- (N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoate de méthyle est saponifié selon la méthode décrite précédemment dans l'exemple Blv en utilisant 2 équivalents de NaOH.

On obtient avec un rendement quantitatif, 9,65 g (25 mmol) d'acide (3SR), 3- (N-benzyloxycarbonyl-amino), 5- (N- tertiobutyiaminosulfonyl) pentanoïque dont les caractéristiques sont les suivantes : Rf (MeOH : AcOH : CH2CI2) = 0,46 1H RMN (d6-DMSO) 8 1.18 (s, 9H, tBu), 1.67 à 1.90 (m, 2H, CH-CH2- CH2), 2.37 (d, 2H, CH2-COOH), 2.89 (t, 2H, CH-CH2-CH2), 3.83 (m, 1H, CH-CH2-CH2), 4.95 (s, 2H, CH2-C6H5), 6.77 (s, 1 H, S02-NH), 7.29 (m, 5H, CH aromatiques)

(3S),3-(N-benzyloxycarbonyl-amino),5-(N-VII-A)Acide <BR> <BR> <BR> tertiobutvlaminosulfonvl) pentanoique<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 9,65 g (25 mmol) d'acide (3SR), 3-(N-benzyloxycarbonyl- amino), 5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque sont résolus en utilisant un équivalent de D (+)-a.-méthyl-benzylamine dans un système chloroforme/isopropanol. On obtient avec un rendement de 73,9%, 3,571 g (9,24 mmol) d'acide (3S), 3- (N-benzyloxycarbonyl-amino), 5- (N- L'excèsénantiomérique(94%)ettertiobutylaminosulfonyl)pent anoïque. déterminé après couplage avec la D (+)-a-méthyl-benzylamine et comparé avec la synthèse réalisée sur la L-homocystine. Les caractéristiques de ce produit sont les suivantes : Rf (MeOH : AcOH : CH2CI2 5 : 5 : 90) = 0,46 <BR> <BR> 1H RMN (d6-DMSO) 6 1.18 (s, 9H, tBu), 1.67 à 1.90 (m, 2H, CH-CHv- CH2), 2.37 (d, 2H, CH2-COOH), 2.89 (t, 2H, CH-CH2-CH2), 3.83 (m, 1H, CH-CH2-CH2), 4.95 (s, 2H, CH2-C6H5), 6.77 (s, 1H, S02-NH), 7.29 (m, 5H, CH aromatiques) VII-B) L'acide (3R). 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino) 5-(N- tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque II est obtenu par un protocole analogue en utilisant la D (-)-a- methyl benzylamine.

3-(N-benzyloxycarbonyl-amino),5-(N-tertiobutylaminosulfon yl)VII-A)(3S). pentanoate de méthyle A une solution de 2,405 g (6,22 mmol) d'acide (3S), 3- (N- benzyloxycarbonyl-amino), pentanoïque, 675 mg (7,09 mmol) de 4-hydroxypyridine dans 15 ml de pyridine, est <BR> <BR> <BR> ajouté à 0°C 1,580 g (7,66 mmol) de dicyclohexylcarbodiimide (DCC). La suspension est agitée pendant 3 heures à température ambiante puis concentrée sous pression réduite. On ajoute, à 0°C 10 ml de méthanol.

On agite pendant une nuit à 50°C. La suspension est concentrée puis repris avec de I'AcOEt, le précipité de dicyclohexylurée est filtré. Le filtrat

est ensuite avé avec KHS04 (1N), NaHC03 (10%), une solution saturée de NaCI, séché sur Na2SO4 puis évaporé sous pression réduite.

On obtient avec un rendement quantitatif, 2,49 g (6,22 mmol) de (3S), 3- (N-benzyloxycarbonyl-amino), 5- (N- tertiobutylaminosulfonyl) pentanoate de méthyle dont les caractéristiques sont les suivantes : Rf (AcOEt : CH2Cl2 : cyclohexane 1 : 1 : 1) = 0,48 <BR> <BR> 1 H RMN (CDC13) 5 1.29 (s, 9H, tBu), 1.99 (m, 2H, CH-CH2-CH2), 2.54 (d, 2H, CH2-COOMe), 3.05 (t, 2H, CH-CH2-CH2), 3.61 (s, 3H, COOMe), 4.02 (m, 1H, CH-CH2-CH2), 4.18 (s, 1 H, S02-NH), 5.03 (s, 2H, CH9-C6H5), 5.37 (d, 1 H, NH-Z), 7.2 à 7.4 (m, 5H, CH aromatiques) VIII-B) L'ester (3R) 3-(N-benzvioxvcarbonvl amino} 5-(N-tertiobutvl amino sulfonvl) pentanoate de méthvie II est obtenu par un protocole analogue en utilisant l'acide (3R) décrit dans le paragraphe VII-B (synthon 1).

IX-A) (2S. 3S). 2-(paraméthoxybenzyl-thio), 3-(N-benzyloxycarbonyl- amino). 5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoate de méthyle.

Sous azote, 1,5 g (3,75 mmol) d'ester (3S), 3- (N- benzyloxycarbonyl-amino), 5- (N-tertiobutylamino-thio) pentanoate de méthyle est dissout dans 10 mi de THF. A-78°C, 6 ml de LDA (2M/ heptane/THF/ethylbenzene ; 4,80 mmol) sont ajoutés goutte à goutte. <BR> <BR> <P>Après 30 minutes, on ajoute à-78°C 1,98 g (5,625 mmol) de disulfure de paraméthoxybenzyle et 2,4 dinitrophenyle, et la solution est agitée pendant 2 heures à-78°C. On ajoute KHS04 (1N), on extrait avec de j'acétate d'éthyle ; les phases organiques sont lavées par KHS04 (1N), NaCI saturée, séchées sur Na2SO4 puis évaporées sous pression réduite.

Après purification sur colonne de silice (AcOEt : CH2CI2 : cyclohexane 2 : 3 : 5), on obtient avec un rendement de 54%, 1,125g de (2S, 3S) 2-(paraméthoxybenzyl-thio), 3-(N- benzytoxycarbonyl-amino), 5- (N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoate de méthyle dont les caractéristiques sont les suivantes. L'excès énantiomérique est supérieur à 95 % comme en témoigne I'analyse HPLC.

Rf (AcOEt : CH2CI2 : cyclohexane 1 : 1 : 1) = 0,57 Rf (AcOEt : CH2CI2 : cyclohexane 15 : 25 : 60) = 0,15 1 H RMN (CDC13) # 1.25 (s, 9H, tBu), 1.86 à 2.30 (m, 2H, CH-CH2-CH2), 2.96 (t, 2H, CH-CH2-CH2), 3.29 (2d, 1H, CH-S), 3.64 (s, 3H, COOMe), 3.72 (s, 5H, S-CH2-C6H4-OMe), 4.02 (m, 1H, CH-CH2-CH2), 4.87 (s, 1 H, S02-NH), 5.05 (s, 2H, CH2C6H5), 5.50 (d, 1H, NH-Z), 6.75 (d, 2H, CH aromatiques ortho à OMe), 7.14 (d, 2H, CH aromatiques méta à OMe), 7.27 (m, 5H, CH aromatiques).

SM (ES), (M+H) + m/z 539.3, (M+Na) + m/z 561.3 IX-B) 5-(N-3-(N-benzyloxycarbonyl-amino), tertiobutvlaminosulfonvl) pentanoate de méthyle.

Le composé analogue de configuration (2R, 3R) est obtenu par le même protocole en utilisant le composé décrit en VIII-B (Synthon 1).

X-A) Acide (2SR, 3S), 2- (Param6thoxvbenzvl-thioL 3- (N- <BR> <BR> <BR> benzvtoxvcarbonvl-amino), 5- (N-tertiobutvlaminosulfonvll pentanoïque.<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P> A 0,546 g de (2S, 3S) 2-(paraméthoxybenzyl-thio), 3-(N- benzyloxycarbonyl-amino), 5- (N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoate de méthyle dans 5 ml de méthanol, on ajoute 1 ml de NaOH (6N). En suivant les conditions opératoires décrites dans 1'exemple Biv, on obtient avec un rendement de 91%, 484 mg d'acide (2SR, 3S), 2-(paraméthoxybenzyl- thio), 5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque dont les caractéristiques sont les suivantes : Rf (AcOEt : AcOH. CH2Cl2 30 : 2 : 70) = 0,24 et 0,32 <BR> <BR> 1 H RMN (CDC13) 5 1.21 (s, 9H, tBu), 1.79 à 1.93 (m, 1H, CH-CH2-CH2), 1.96 à 2.10 (m, 1H, CH-CH2-CH2), 2.97 (t, 2H, CH-CH2-CH2), 3.24 et 3.30 (d, 1 H, CH-S), 3.70 (s, 3H, OMe), 3.76 (s, 2H, CH2-CH4-OMe), 4.04 (m, 1H, CH-CH2-CH2), 5.01 (s, 2H, CH2-C6H5), 5.60 (d, 1 H, NH-Z), 6.72 et 6.77 (d, 2H, CH aromatiques ortho à OMe), 7.12 et 7.17 (d, 2H, CH aromatiques méta à OMe), 7.25 (br s, 5H, CH aromatiques).

X-B) (2SR, 3-(N-benzyloxycarbonyl-2-(paraméthoxybenzyl-thio), amino), 5- (N-tertiobutvlaminosulfonvl) pentanoïque.

Le deuxième couple de diastéréoisomères de configuration (2SR, 3R) est obtenu par le même protocole en-utilisant le composé décrit en IX-B (synthon 1).

Bli) VOIE DE SYNTHESE DU SYNTHON 2 : Acide 5-trityl-carbamoyl3-Boc-amino, pentanoïque.

Ce synthon est commun aux exemples 7 et 8.

I-A) (3S), 5-(N-Trityl-carbamoyl)- pentanoate de méthyle A partir de 10 g (20,5 mmol) de (L) Boc Gln (Trt) COOH, on obtient en suivant les conditions opératoires de l'exemple Bv (Synthon 1), avec un rendement de 85 %, 4,35 g de (3S), 3-Boc-amino-5-Trityl- carbamoyl-pentanoate de méthyle dont les caractéristiques sont les suivantes : Rf (AcOEt : CH2CI2 1 : 3) = 0,58 1H RMN (d6-DMSO) 5 1.32 (s, 9H, tBu), 1.25 à 1.37 (m, 1H, CH-CH2- CH2), 1.40 à 1.53 (m, 1H, CH-CH2-CH2), 2.20 (t, 2H, CH-CH2-CH2), 2.30 (d, 2H, CH2COOMe), 3.50 (s, 3H, COOMe), 3.63 à 3.77 (m, 1 H, CH-CH2- CH2), 6.67 (d, 1H, NH-Boc), 7.08 à 7.22 (m, 15H, Trt), 8.50 (s, 1H, NH-Trt) IB) (3R) 3- (Boc-amino) 5-(tritvl carbamovl) Dentanoate de méthyle.

Ce composé est obtenu par le même protocole à partir de la Boc (D) Gin (Trt) COOH.

3S),2-paraméthoxybenzyl-thio,3-Boc-amino,5-Trityl-II-A)( 2RS, carbamovl-pentanoate de méthyle.

A partir de 1,032 g de (3S), 3-Boc-amino-5-Trityl-carbamoyl- pentanoate de méthyle, on obtient en suivant les conditions opératoires de t'exempte Bix (Synthon 1), avec un rendement de 43%, 574 mg de (2RS, 3S), 2-paraméthoxybenzyl-thio, 3-Boc-amino, 5-Trityl-carbamoyl- pentanoate de méthyle dont les caractéristiques sont les suivantes : Rf (AcOEt : CH2Cl2 : cyclohexane 20 : 30 : 50) = 0,27 1H RMN (d6-DMSO) 8 1.32 (s, 9H, tBu), 1.28 à 1.37 (m, 1H, CH-CH ?- CH2), 1.86 à 1.95 (m, 1H, CH-CH2-CH2), 2.10 à 2.24 (m, 2H, CH-CH2- CH2), 3.22 (d, 1H, CH-S), 3.55 (s, 3H, COOMe), 3.67 (2s, 5H, S-CH2- C6H4-OMe), 3.70 à 3.78 (m, 1H, CH-CH2-CH2), 6.72 (d, 1H, NH-Boc), 6.79 (d, 2H, CH aromatiques ortho à OMe), 7.12 (d, 2H, CH aromatiques méta à OMe), 7.10 à 7.23 (m, 15H, Trt), 8.50 (s, 1H, NH-Trt) MS (El) 153,243,559,669.

II-B) (2 RS, 3R), 2-paraméthoxy 5-(Trityl-3-(Boc-amino), carbamovl)-pentanoate de méthyle II est obtenu par le même protocole à partir du composé (IB) (Synthon 2).

III-A) Acide (2RS, 3S). 2-paraméthoxvbenzvl-thio, 3-Boc-amino. 5-trityl- carbamoyl pentanoïque A partir de 334 mg (0,5 mmol) de (2RS, 3S), 2- (synthon 1) Bx paraméthoxybenzytsutfanyt, 3-Boc-amino, 5-trityl-carbamoyl-pentanoate de méthyle, on obtient en suivant les conditions opératoires de l'exemple (Synthon 1) Bx, avec un rendement de 97%, 317 mg d'acide (2RS, 3S), 2- paraméthoxybenzylthio, 3-Boc-amino, 5-trityl-carbamoyl pentanoique dont les caractéristiques sont les suivantes : Rf (MeOH : CH2CI2 10 : 90) = 0,4

1 H RMN (d6-DMSO) 6 1.30 (1. 39) (s, 9H, tBu), 1.55 à 1.66 (m, 1 H, pCH2 (Gln)), 1.80 à 1.93 (m, 1H, ßCH2(Gln)), 2.13 à 2.26 (m, 2H, <BR> <BR> <BR> (3.18)(d,1H,CH-S),3.68(s,5H,CH2-C6H5-OCH3),γCH2(Gln)),3.12 3.70 à 3.80 (m, 1 H, aCH (Gln)), 6.62 (6.70) (d, 1 H, BocNH), 6.80 (d, 2H, CH arom ortho à OMe), 7.12 (d, 2H, CH arom méta à OMe), 7.10 à 7.25 (m, 15 H, Trt), 8.48 (8.52) (s, 1H, NHTrt) III-B) Acide 2-paraméthoxybenzyl-thio,3-Boc-amino,5-trityl-3R), carbamovl pentanoïque Le composé analogue de configuration (2RS, 3R) est obtenu par le même protocole à partir du composé décrit en (IIB) (Synthon 2).

Bail) VOIE DE SYNTHESE DU SYNTHON 3 : Acide 3-3-(N-t-butoxycarbonyl-amino)-, (3-(N-tertiobutylaminosulfonyl)phényl)propanoïque.

Ce synthon est utilisé dans l'exemple 6. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> t-) Acide 3- (N-tertiobutvlaminosulfonvl) benzoiaue<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> A une solution de 12,5 g (56,6 mmol) de l'acide 3- chlorosulfonyl benzoïque dans 200 ml de CH2CI2, refroidi à 0 °C est ajoutée rapidement une solution de 21 ml (198 mmol) de tBuNH2 dans 50 ml de CH2CI2. Après 30 minutes d'agitation, on filtre le chlorhydrate de tBuNH2. On rince avec un peu de CH2CI2 puis on évapore à sec. On obtient, avec un rendement de 95%, 13,83 g d'acide 3- (N- tertiobutylaminosulfonyl) benzoïque dont les caractéristiques sont les suivantes : Rf (AcOH/Toluene, 3/7) = 0,45 1H RMN (d6-DMSO) 8 1.05 (s, 9H, tBu), 7,65 (s, 1 H, S02NH) 7,65 (t, 1H aromatique), 8,00 (d, 1H, aromatique), 8,08 (d, 1 H, aromatique), 8,33 (s, 1 H, aromatique).

II-) 3-(N-tertiobutvlaminosulfonvl) Phenvi methanol A une solution de 12,94 g (50,3 mmol) d'acide 3- (N- tertiobutylaminosulfonyl) benzoïque dans 100 ml de 1, 2-diméthoxyéthane (DME) sont ajoutés successivement à-15°C 6,6 ml (60,3 mmol) de N- méthyl morpholine et 7,8 ml (60,3 mmol) de chloroformiate d'isobutyle.

Après 5 minutes, le précipité de chlorhydrate de N-méthyl morpholine est filtré et lavé avec du DME. Au filtrat recueilli dans un grand ballon, est ajoutée à-15°C une solution de 5g (130 mmol) de NaBH4 dans 10 ml d'eau. Après 30 minutes de réaction, 100 ml d'eau sont ajoutés et le DME évaporé sous. pression réduite. La phase aqueuse est alors extraite par 2x100 ml d'acétate d'éthyle. La phase organique est alors lavée par NaCI saturé avant d'être séchée sur Na2S04. On obtient, avec un rendement de <BR> <BR> <BR> 90 %, 10,9 g de 3- (N-tertiobutylaminosulfonyl) phenyl méthanol dont les caractéristiques sont les suivantes : <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 1 H RMN (d6-DMSO) 5 1.04 (s, 9H, tBu), 4,52 (d, 2H, CH ;, OH), 5,36 (t, 1 H, CH20H), 7,45 (s, 1H, S02NH), 7,46 (d, 2H, aromatique), 7,64 (dd, 1H, aromatique), 7,77 (s, 1 H, aromatique).

Rf (AcOH/Toluène, 3/7) = 0,24 benzaidehydeIII-)3-(N-tertiobutylaminosulfonyl) A une solution de 4,7 ml (53,7 mmol) de chlorure d'oxalyl (fraichement distillé) dans 100 ml de dichlorométhane, est ajouté goutte à goutte, à-78°C, sous azote, une solution de 9,5 ml (134 mmol) DMSO <BR> <BR> <BR> dans 20 ml de dichlorométhane. Une solution de 10,9 g (44,8 mmol) de 3- (N-tertiobutylaminosulfonyl) phényl méthanol dans 4ml de DMSO puis 30 ml de CH2CI2 est coûté goutte à goutte. L'agitation est maintenue pendant 30 minutes, puis on ajoute 31,2 mi (224 mmol) de triéthylamine.

Le mélange réactionnel est agité pendant 5 minutes supplémentaires à -65°C puis on laisse revenir le bain à température ambiante.

Après 1 h d'agitation, on ajoute de t'eau et la phase aqueuse est extraite au dichlorométhane. Les phases organiques sont combinées, lavées avec KHS04 (1N), NaHC03 (10%), NaCI saturée, séchées sur Na2S04.

Après concentration sous pression réduite, on obtient avec <BR> <BR> <BR> un rendement de 96%, 10,45 g de 3- (N-tertiobutylaminosulfonyl) benzaldehyde dont les caractéristiques sont les suivantes : Rf (AcOEt/cyclohexane, 1/2) = 0,32 1H RMN (DMSO) 8 1.05 (s, 9H, tBu), 7,70 (s, 1H, S02NH), 7,78 (t, 1H, aromatique), 8,10 (d, 2H, aromatiques), 8,29 (s, 1H, aromatique), 10,05 (s, CHO). phenyl)propenoated'éthyleIV-)3-(3-(N-tertiobutylaminosulfon yl) 20,4 ml (102 mmol) de triéthyl phosphonoacetate sont coûtés goutte à goutte à une suspension d'hydrure de sodium (3g, 104 mmol) dans le DME (200 ml). Après 30 minutes d'agitation à 45°C, 16,8 g (69,6 mmol) de 3- (N-tertiobutylaminosulfonyl) benzaldehyde sont ajoutés rapidement et le mélange agité pendant 45 minutes à 50 °C. On ajoute alors 250 ml de mélange eau-glace et on extrait par 250 ml d'acétate d'éthyie. La phase organique est lavée par NaCl saturé avant d'être séchée sur Na2SO4. Après concentration sous pression réduite, on <BR> <BR> <BR> obtient avec un rendement de 95 %, 20,56 g de 3- (3- (N- tertiobutylaminosulfonyl) phenyl) propenoate d'éthyle dont les caractéristiques sont les suivantes : Rf (AcOEt/cyclohexane, 4/6) = 0,40 1 H RMN (DMSO) # 1.05 (s, 9H, tBu), 1,20 (t, 3H, CH3-CH2), 4,15 (q, 2H, CH3-CH2), 6,65 (d, 1 H, CH¢), 7,50 (s, 1 H, S02NH), 7,58 (t, 1 H, aromatique) 7,68 (d, 1H, CH-COOEt), 7,82 (d, 1H, aromatique) 7,91 (d, 1H, aromatique), 8,10 (s, 1H, aromatique).

V-A) (3R) 3-((S)-N-benzyl-1-phényl) Phénvléthvlamino) propanoate d'éthvle A une solution de 4g (18,9 mmol) de (S) (-) N-benzyl-1- phényléthylamine (préparé selon la procédure décrite par Juaristi, Murer et Seebach (1993) Synthesis, p 1243-1246) dans 70 mi de THF anhydre sont ajoutés à 0°C 11,8 ml (18,9 ml) de nBuLi (1,6 M dans I'hexane). Le mélange réactionnel est agité 15 minutes puis refroidi à -78°C. 2,36 g

(7,56 mmol) dans 30 ml de THF sont ajoutés goutte à goutte au mélange réactionnel qui est agité 30 minutes supplémentaires avant d'ajouter 30 ml d'une solution aqueuse de KHS04 (1M). Après évaporation du THF, la phase aqueuse est extraite avec de !'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par KHS04 (1 N), NaHC03 saturé, NaCI saturé, séchée sur Na2SO4 puis évaporée sous pression réduite.

Après purification sur colonne de silice (AcOEt/CH2CI2/cyclohexane 1,5/1,5/7), on obtient avec un rendement de <BR> <BR> <BR> 87%, 3,28 g de (3R) 3-(3-(N-tertiobutylaminosulfonyl) phényl) 3-((S)-N- benzyl-1-phényléthylamino) propanoate d'éthyle dont les caractéristiques sont les suivantes. L'excès énantiomérique est supérieur à 95 % comme en témoigne l'analyse HPLC et la RMN.

Rf (AcOEt/cyclohexane, 3/7) = 0,41 <BR> <BR> 1 H RMN (CDC13) 5 1,02 (t, 3H, CH2CH3), 1.13 (s, 9H, tBu), 1,20 (t, 3H, CH- CH3), 2,57 (M, 2H, CH2-COOEt), 3,64 (d, 2H, CH2#), 3,84 à 3,95 (m, 3H, CH3-CH2 et CH3-CH), 4,47 (q, 1 H, CH-CH2-COOEt) 4,51 (s, 1 H, S02NH), 7,11 à 7,35 (m, 2#, 10H), 7,39 (dd, 1H, aromatique), 7,51 (d, 1H, aromatique) 7,71 (d, 1 H, aromatique), 7,90 (s, 1 H, aromatique).

V-B) 3-((S)-N-benzyl-1-phényl) phénvléthvlamino) propanoate d'éthvte Le composé analogue de configuration (3S) est obtenu par le même protocole en utilisant la (R) (-) N-benzyl-1-phényléthylamino) propanoate d'éthyle. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>Vl-A) (3R) 3-(N-t-butoxvcarbonvl-amino)-, 3-(3-(N-tertisbutylaminosulfonyl) phénvl} propanoate d'éthyle 3,28 g (6,28 mmol) de (3R) 3- (3- (N-tertiobutylaminosulfonyl) <BR> <BR> <BR> phenyl) 3-((S)-N-benzyl phényléthylamino) propanoate d'éthyle et 4,8 g (22 mmol) de Boc20 sont solubilisés dans 60 ml d'acétate d'éthyle contenant 4,4 g Pd (OH) 2/C (20%). La solution est vigoureusement agitée en présence de 20 bars d'hydrogène à 25 °C pendant 18 heures. Après élimination du catalyseur par filtration sur célite, le filtrat est évaporé sous pression réduite et purifié sur colonne de silice (AcOEt/cyclohexane, 1/3)

pour obtenir avec un rendement de 85% 2,28g de (3R) 3- (N-t- butoxycarbonyl-amino)-,3-(3-(N-tertiobutylaminosulfonyl)phé nyl) propanoate d'éthyle dont les caractéristiques sont les suivantes.

Rf (AcOEt/cyclohexane, 3/7) = 0,21 1 H RMN (CDCl3) # 1, 13 (t, 3H, CH2CH3), 1.15 (s, 9H, tBu-NH-SO2-), 1.35 (s, 9H, Boc), 2,76 (d, 2H, CH2-COOEt), 3,99 (q, 2H, CH3-CH2), 4,60 (s, 1H, S02NH), 5,08 (m, 1H, CH-CH2-COOEt), 5,58 (d, 1H, NH-Boc), 7,38 (dd, 1H, aromatique), 7,40 (d, 1H, aromatique) 7,72 (d, 1H, aromatique), 7,77 (s, 1 H, aromatique).

3-(N-t-butoxycarbonyl-amino)-,3-(3-(N-VI-B)(3S), tertiobutvlaminosulfonvt) phénvl) propanoate d'éthvle Le composé analogue de configuration (3S) est obtenu par le même protocole à partir du composé décrit en (V-B) (Synthon 3).

VII-A)VII-A)(2S,3S) 3-(N-t-butoxycarbonyl-amino)- d'éthyle3-(3-(N-tertiobutylaminosulfonyl)phényl)propanoate Sous azote, 0,5 g (1,17 mmol) d'ester (3R) 3-(N-t- butoxycarbonyl-amino)-, 3-(3-(N-tertiobutylaminosulfonyl)phényl) propanoate d'éthyle est dissous dans 10 ml de THF. A-78°C, 1,9 ml de LDA (2M/ heptane/THF/ethylbenzene ; 3,8 mmol) sont ajoutés goutte à <BR> <BR> <BR> goutte. Après 30 minutes, on ajoute à-78°C 0,5 g (1,4 mmol) de disulfure de paraméthoxybenzyle et 2,4 dinitrophenyle (préparé selon Bischoff et al., (1997) J. Org. Chem., 62 (14), p 4848-4850), et la solution est agitée pendant 2 heures à-78°C. On ajoute KHS04 (1 N), on extrait avec AcOEt ; les phases organiques sont lavées par KHS04 (1 N), NaCI saturée, séchées sur Na2SO4 puis évaporées sous pression réduite.

Après purification sur colonne de silice (AcEt/cyclohexane 1/3), on obtient avec un rendement de 49%, 331 mg de (2S, 3S) 2- 3-(3-(N-(paraméthoxybenzyl-thio)-,3-(N-t-butoxycarbonyl-ami no)-, tertiobutylaminosulfonyl) phényl) propanoate d'éthyle dont les caractéristiques sont les suivantes. L'excès énantiomérique est supérieur à 95 % comme en témoigne l'analyse HPLC et la RMN.

Rf (AcOEt/cyclohexane, 3/7) = 0,31 1H RMN (CDCl3) # 1, 08 (t, 3H, CH2CH3), 1.12 (s, 9H, tBu-NH-S02-), 1.36 (s, 9H, Boc), 3,40 (d, 1 H, CH-COOEt), 3,75 (s, 3H et 2H, OMe et #-CH2-S) 3,96 (q, 2H, CH3-CH2), 4,51 (s, 1H, SO2NH), 5,00 (m, 1H, BocNH-CH), 6,11 (d, 1H, NH-Boc), 6,82 (d, 2H, #-OMe), 7,22 (d, 2H, #-OMe), 7,25 (d, 1H, aromatique), 7,30 (t, 1H, aromatique), 7,50 (s, 1H, aromatique), 7,68 (d, 1 H, aromatique).

3R),2-(paraméthoxybenzyl-thio)-,3-(N-t-butoxycarbonyl-VI I-B)(2R, amino)-, d'éthylepropanoate Le composé analogue de configuration (2R, 3R) est obtenu par le même protocole à partir du composé décrit en (VI-B) (Synthon 3).

VIII-A) acide 3-(N-t-butoxy-2-(paraméthoxybenzyl-thio)-, propanoïque.carbonylamino)-,3-(3-(N-tertiobutylaminosulfony l)phényl) A 0,33 g (0,57 mmole) de (2S, 3S) 2-(paraméthoxybenzyl- thio)-, 3- (N-t-butoxycarbonyl-amino)-, 3- (3- (N- tertiobutytaminosu) fonyi) phényt) propanoate d'éthyle dans 2,5 ml d'éthanol, on ajoute 2,5 ml de NaOH (2N). En suivant les conditions opératoires décrites dans l'exemple (Synthon 1) BIV, on obtient avec un rendement de 98%, 310 mg d'acide (2SR, 3S), 2-(parméthoxybenzyl- thio)-, 3- (N-t-butoxycarbonyl-amino)-, 3- (3- (N-tertiobutylamino sulfonyl) phényl) propanoïque dont les caractéristiques sont les suivantes : Rf (CH2CI2/MeOH/AcOOH, 96/3/1) = 0,16 <BR> <BR> 1H RMN (CDC13) (deux diastéréoisomères A et B) 6 1,11 (A) et 1.12 (B) (s, 9H, tBu-NH-S02-), 1,30 (A) et 1,35 (B) (s, 9H, Boc), 3,40 (A) et 3,45 (B) (d, 1H, CH-COOEt), 3,72 et 3,75 (A+B) (s, 3H et 2H, OMe et ¢-CH2- S), 3,65 (s, 1H, SO2NH), 5,05 (A) et 5,32 (B) (m, 1H, BocNH-CH), 5, 37 (A) et 6,20 (B) (d, 1 H, NH-Boc), 6,75 (A) et 6,80 (B) (d, 2H, #-OMe), 7,12 (A) et 7,20 (B) (d, 2H, (A+B)(d,1H,aromatique),7,40(A+B)(t,7,30 1 H, aromatique), 7, 81 (B) et 7,70 (A) (s, 1 H, aromatique), 7,68 (A) et 7,75 (B) (d, 1 H, aromatique).

VIII-B) (2SR, 3R), 2-(paraméthoxybenzyl-thio)-, 3-(N-t-butoxy-<BR> carbonvlamino)-. 3-(3-(N-tertiobutvtaminosutfonv))phénytorooanoïQue.

Le composé de configuration (2SR, 3R) est obtenu par le même protocole à partir du composé décrit en VII-B (Synthon 3).

EXEMPLE N° 1 5-sulfamoylpentanoyl)-L-Valyl)-L-N-(N-(2-mercapto,3-amino, lsoleucine<BR> <BR> I-) H-Val-Ile-HMP-résine La synthèse du dipeptidyl-résine H-Val-Ile-HMP-résine est réalisée en utilisant la procédure A sur 150 mg (0,15 mmol) de HMP- résine avec A2 = Fmoc-lle-OH et Ai = Fmoc-Val-OH.

Il-A) (2RS, 3S). N- (N- (2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamovl pentanovl)-L- Valvl)-L-lsoleucine A 135 mg (250 µmol) d'acide (2RS, 3S), 2- 5-(N-(paraméthoxybenzyl-thio),3-(N-benzyloxycarbonyl-amino) , tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque (Synthon 1A), 122 mg (320 µmol) de HATU (0- (7-azabenzotriazol-1-yl) 1,1,3,3-tetramethyluronium µmoldeH-Val-lle-HMPrésinedans5mldehexafluorophosphate),150 dichlorométhane est ajoutée, sous agitation à température ambiante, 200 Kll de diisopropyléthylamine. La fin de la réaction est suivie par le test de Kaiser. Après 6 heures de réaction à cette température, la résine est lavée alternativement avec NMP (N-méthyl-pyrrolidone) et dichlorométhane.

On effectue une déprotection TFA avec le mélange TFA : eau : triisopropylsilane 40 : 2 : 1 pendant 3 heures à température ambiante.

Le mélange réactionnel est évaporé sous pression réduite, repris avec de t'eau puis lyophilisé.

On effectue des lors une déprotection HF à 0°C avec le mélange HF : métacrésol 10 : 0,2 pendant 1 heure. Après distillation du HF, le résidu est repris avec un peu de TFA puis précipité avec un mélange

froid éther diéthylique : n-hexane 50 : 50. Le produit est ensuite lyophilisé.

On obtient 100 mg de brut.

Le produit est purifié sur une colonne semi-préparative (Vydac C18 ref 218TP510,20x250 mm). Les deux diastéréoiomères sont ainsi séparés.

HPLC (gradient 20% de B à 60% de B en 15 min ; colonne Macherey- Nagel C18) : 2 pics 8.9 et 9.4 SM (ES) : (M+H) + m/z = 441,1 1 H-RMN (D20) 5 0.90 (t, 3H, #CH3(lle)), 0.92 à 1.10 (m, 9H, yCH3 (lue)// yCH3 (Val)/γCH3(Val)), 1.20 à 1.30 (m, 1 H, yCH2 ('te)). 1.42 à 1.53 (m, 1 H, yCH2 (Ile)), 1.88 à 1.96 (m, 1H, ßCH(lle), 2.06 à 2.14 (m, 1H, ßCH(Val)) 2.22 à 2.32 (m, 2H, CH-CH2-CH2), 3.39 (m, 2H, CH-CH2-CH2), 3.82 (d, 1H, CH-SH), 3.88 (d, 1H, CH-CH2-CH2), 4.16 (m, 1H, αCH(Val), 4.27 (d, 1H,αCH(lle)).

Il-B) (2RS. 3R) N- (N- (2-mercapto, 3-amino,. 5-sulfamovl Pentanovl)-L- Valyl)-L-Isoleucine Les deux autres diastéréoisomères sont obtenus par le même protocole à partir du synthon 1 de configuration (2RS, 3R).

EXEMPLE N° 2 <BR> <BR> <BR> N- (N- (2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl)-L-Valyl)-L-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> lsoleucyl Benzylamide<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> I-) H-Val-Ile-NHBz Le composé H-Val-Ile-NHBz est obtenu en phase liquide par condensation et déprotection successives du Boc-lle-OH et du Boc-Val- OH sur la benzylamine. Ce composé présente les caractéristiques suivantes : <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 1H RMN (d6-DMSO) 5 0.80 (t, 3H, 5CH3 (lle)), 0.82 (d, 3H, yCH3 (Val)), 0.84 (d, 3H, yCH3 (lle)), 0.86 (d, 3H, yCH3 (Val)), 0.99 à 1.11 (m, 1H,

γCH2(lle)), 1.40 à 1.52 (m, 1H, yCH2 (lle)), 1.60 à 1.65 (m, 1H, aCH (Ile)), 1.93 à 2.08 (m, 1 H, OCH (Val)), 3.65 (dd, 1 H, aCH (lle)), 4.11 à 4.20 (m, 2H, CH2-C6H5), 4.31 (dd, 1H, aCH (Val)), 7.20 (m, 5H, aromatiques), 8.03 (s, 3H, NH3+), 8.38 (d, 1H, NH (Ile)), 8.60 (t, 1H, NH-CH2-C6H5) Il-A) (2RS. 3S). N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl) - L- Valvl)-L-Isoleucvl-Benzvlamide A 269 mg (500 µmol) d'acide (2RS, 3S), 2- 5-(N-(paraméthoxybenzyl-thio),3-(N-benzyloxycarbonyl-amino) , tertiobutylaminosulfonyl) pentanoique (dont la synthèse est détaillée dans la procédure 2), 380 mg (1 mmol) de HATU (0-(7-azabenzotriazol-1- hexafluorophosphate),192mg(600µmol)yl)1,1,3,3-tetramethylur onium de H-Vat-Ile-NHBz dans 5 ml de dichlorométhane est ajouté, sous agitation à température ambiante, 305 µl de diisopropyléthylamine.

Après 6 heures de réaction à cette température, on évapore le dichlorométhane sous pression réduite. On reprend le résidu avec de I'AcOEt ; les phases organiques combinées sont lavées avec NaHC03 (10%), KHS04 (1N), une solution saturée de NaCI. Après avoir séché sur Na2SO4 puis évaporée sous pression réduite, on effectue une déprotection TFA avec le mélange TFA : eau : triisopropy ! sitane 40 : 2 : 1 pendant 3 heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est évaporé sous pression réduite, repris avec de t'eau puis lyophilisé.

On effectue des lors une déprotection HF à 0°C avec le mélange HF : métacrésol 10 : 0,2 pendant 1 heure. Après distillation du HF, le résidu est repris avec un peu de TFA puis précipité avec un mélange froid éther diéthylique : n-hexane 50 : 50. Le produit est ensuite lyophilisé.

On obtient 460 mg de brut.

Le produit est purifié sur une colonne semi-préparative (Vydac C18 ref 218TP510,20x250 mm). Les deux diastéréoiomères ne sont pas séparés.

HPLC (gradient 40% de B à 80% de B en 15 min ; colonne Macherey- Nagel C18) : un seul pic à 8.6 min ''H-RMN (de-DMSO) 5 0.75 à 0.85 (m, 12H, yCH3 (lle)/ #CH3(lle)/ /CH3 (Val)/yCH3 (Val)), 0 96 à 1.07 (m, 1 H, γCH2(lle)), 1.35 à 1.45 (m, 1 H, γCH2(lle)), 1.62 à 1.72 (m, 1H,ßCH(lle), 1.90 à 2.10 (m, 3H, ßCH (Val)/

CH-CH2-CH2), 2.94 à 3.07 (m, 2H, CH-CH2-CH2), 3.47 et 3.57 (m, 1H, CH-CH2-CH2), 3.83 et 3.87 (d, 1H, CH-SH), 4.13 (m, 1 H, aCH (Ile)), 4.17 et 4.24 (m, 2H, CH2-C6H5), 4.28 (m, 1H, aCH (Val), 6.69 et 6.71 (s, 2H, S02NH2), 7.15 à 7.25 (m, 5H, CH2-C6H5), 8.02 et 8.09 (d, 1H, NH (lle)), 8.34 et 8.38 (d, 1 H, NH (Val)), 8.48 et 8.52 (t, 1H,NH-CH2-C6H5) 1 H-RMN (D20) 8 0.84 à 0.97 (m, 12H, γCH3(lle)/ #CH3(lle)/ γCH3(Val)/ à1.23(m,1H,γCH2(lle)),1.47à1.56(m,1H,γCH2(lle)),γCH3(Va l),1.16 1.82 à 1.88 (m, 1H, ßCH(lle), 2.02 à 2.08 (m, 1H, ßCH (Val)), 2.22 à 2.28 (m, 2H, CH-CH2-CH2), 3.33 à 3.41 (m, 2H, CH-CH2-CH2), 3.78 (m, 1H, CH-SH), 3.79 (m, 1H, CH-CH2-CH2), 4.10 (d, 1H, aCH (Val), 4.12 (d, 1H, aCH (lle)), 4.40 (s, 2H, CH9-C6H5), 7.29 à 7.41 (m, 5H, CH2-C6H5) SM (ES) : (M+H) + m/z = 530,2 riz Les deux autres diastéréoisomères sont obtenus par le même protocole à partir du synthon 1 de configuration (2RS, 3R).

EXEMPLE N° 3 N- (N- (2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl)-L-Tyrosyl)-L- Histidine 1-)H-Tyr(tBu)-His(Trt)-dichlorotritylrésine La synthèse du dipeptidyl-résine H-Tyr (tBu)-His (Trt)- dichlorotritylrésine est réalisée en utilisant la procédure 1 sur 125 mg (168 µmol) de dichlorotritylrésine avec A2 = Fmoc-His (Trt)-OH et Ai = Fmoc- Tyr (tBu)-OH.

Il-A) (2RS. 3S), N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl)- L- Tyrosyl)-L-Histidyl-OH A 135 mg (250 mol) d'acide (2RS, 3S), 2- (paraméthoxybenzyl-thio), 3- (N-benzyloxycarbonyl-amino), 5- (N- tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque (dont la synthèse est détaillée dans la procédure 2), 140 mg (320 4mol) de BOP, 168 µmol de H-Tyr (tBu)-

His (Trt)-dichlorotritylrésine dans 5 mt de dichlorométhane, est ajouté, sous agitation à température ambiante, 200 aI de diisopropyléthylamine. La fin de la réaction est suivie par le test de Kaiser. Après 6 heures de réaction à cette température, la résine est lavée alternativement avec NMP et dichlorométhane.

Le peptide est clivé de la résine par traitement avec le mélange trifluoroéthanol : dichlorométhane 2 : 8 (20 ml).

On effectue une déprotection TFA avec le mélange TFA : eau : triisopropylsilane 40 ml : 2 ml : 1 ml pendant 3 heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est évaporé sous pression réduite, repris avec de t'eau puis lyophilisé.

On effectue dès lors une déprotection HF à 0°C avec le mélange HF : métacrésol 10 ml : 0,2 ml pendant 1 heure. Après distillation du HF, le résidu est repris avec un peu de TFA puis précipité avec un mélange froid éther diéthylique : n-hexane 50 : 50. Après centrifugation, le culot est repris avec de t'eau puis lyophilisé. On obtient 100 mg de brut.

Le produit est purifié sur une colonne semi-préparative (Vydac C18 ref 218TP510,20x250 mm). Les deux diastéréoiomères sont ainsi séparés.

HPLC (gradient 0% de B à 40% de B en 15 min ; colonne Macherey-Nagel C18) : 2 pics 10.6 min et 11.5 min SM (ESI) : (M+H) + m/z = 529,1 et 2+ 265,2 Il-B) (2RS. 3R) N- (N- (2-mercapto. 3-amino. 5-sulfamovl pentanovl)-L- Tvrosvl)-L-Histidine Les deux autres diastéréoisomères sont préparés par le même protocole à partir du synthon 1 de configuration (2RS, 3R).

EXEMPLE N° 4 <BR> <BR> <BR> N- (N- (2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl)-L-Tyrosyl)-L- Histidyl-NHBz.

I-) H-Tvr (tBu)-His (Trt)-NHBz H-Tyr (tBu)-His (Trt)-NHBz dont les caractéristiques sont les suivantes est obtenu en phase liquide par condensations et déprotections successives du Fmoc-His (Trt)-OH et du Fmoc-Tyr (tBu)-OH sur la benzylamine, en utilisant les protocoles connus de t'homme de l'art. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>1 H RMN (d6-DMSO) 6 1.20 (s, 9H, Trt), 2.40 (dd, 1H, ßCH2(His) / ßCH2 (Tyr)), 2.80 (dd, 2H, ßCH2 (His)/pCH2 (Tyr)), 3.30 (m, 1 H, aCH (His)), 4.17 (m, 2H, CH2-C6H5), 4.48 (m, 1H, aCH (His)), 6.60 (s, 1H, His), 6.77 (d, 2H, H3 Hs (Tyr)), 6.95 (d, 2H, H2 H6 (Tyr)), 7.00 à 7.33 (m, 20H, C6H5/Trityl), 8.12 (d, 1H, NH (His)), 8.30 (t, 1H, NH-CH2-C6H5), 8.52 (d, 2H, NH2 (Tyr)).

N-(N-(2-mercapto,3-amino,5-sulfamoyl,pentanoyl)-L-II-A)(2 RS,3S), Tyrosyl)-L-Histidyl-NHBz.

239 mg (444 4mol) d'acide (2RS, 3S), 2-(paraméthoxybenzyl- thio), 3- (N-benzyloxycarbonyl-amino), 5- (N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque (dont la synthèse est détaillée dans la procédure 2) sont condensés sur 367 mg (533 µmol) de H-Tyr (tBu)-His (Trt)-NHBz dans 5 mi de dichlorométhane selon le mode opératoire décrit dans l'exemple n°2 étape 11. Après déprotection, on obtient 460 mg de brut qui est purifié sur une colonne semi-préparative (Vydac C18 ref 218TP510,20x250 mm).

Les deux diastéréoiomères sont séparés.

HPLC (gradient 20% de B à 60% de B en 15 min ; colonne Macherey- Nage) C18) : 2 pics à 9.5 min et 9.9 min.

1H RMN (D20) 8 2.12 (m, 2H, CH-CH2-CH2), 2.96 (dd, 2H, P (Tyr)), 3.08 (dd, 1H,ß (His)), 3.18 (dd, 1H,ß (His)), 3.33 (t, 2H, CH-CH2-CH2), 3.70 (d, 1H, CH-SH), 3.72 (m, 1H, CH-CH2-CH2), 4.22 (d, 1H, CH2-C6H5), 4.37 (d, 1 H, CH2-C6H5), 4.55 (t, 1H, α (Tyr)), 4.60 (t, 1H, a (His)), 6.82 (d, 2H, H3-H5 (Tyr)), 7.13 (d, 2H, H2-H6 (Tyr)), 7.14 (s, 1H, H4 (His)), 7.19 (d, 2H, C6H5), 7.37 (m, 3H, C6H5), 8.51 (s, 1 H, H2 (His)).

SM (ESI): (M+H) + m/z = 618,1 II-B) 3-amino,5-sulfamoyl,pentanoyl)-L-N-(N-(2-mercapto, Tyrosyl)-L-Histidyl-NHBz.

Les deux autres diastéréoisomères sont préparés par le même protocole à partir du synthon 1 de configuration (2RS, 3R).

EXEMPLE N°5 5-sulfamoylpentyl)-L-Tyrosyl)-L-HistidineN-(N-(2-mercapto,3- amino, I-A) (2RS. 3S). 2- (paraméthoxvbenzvl-thio), 3-fN-benzvloxvcarbonvl- amino), 5-(N-tertiobutYlaminosulfonvl) pentanol A une solution de 284 mg (0,51 mmol) de (2SR, 3S), 2- 5-(N-(paraméthoxybenzyl-thio),3-(N-benzyloxycarbonyl-amino) , tertiobutylaminosulfonyl) pentanoate de méthyle dans 2 mi de THF et 2 ml d'éthanol absolu, sont ajoutés 90 mg (2,1 mmol) de chlorure de lithium et 80 mg (2,1 mmol) de borohydrure de sodium (NaBH4). La réaction est agitée pendant 18 heures à température voisine de 20°C. Elle est arrêtée en additionnant KHS04 (1 N) et extraite avec de I'AcEt. Les phases organiques sont lavées avec de l'eau, KHS04 (1N), NaHC03 (10%), une solution deNaCl saturée, séchées sur Na2SO4 (1N) puis concentrées sous pression réduite.

On obtient avec un rendement quantitatif, 270 mg de (2SR, 3S), 2-(paraméthoxybenzyl-thio), 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino), 5- (N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanol dont les caractéristiques sont les suivantes : 1H RMN (d6-DMSO) 8 1,18 (s, 9H, tBu), 1,60 à 1,72 (m, 1H, CH-CH2- CH2), 1,82 à 1,97 (m, 1H, CH-CH2-CH2),2, 89 (t, 2H, CH-CH2-CH2), 3,20 à 3,30 (m, 2H, CH2OH), 3,49 (m, 1 H, CH-CH2-CH2), 4,70 (t, 1 H, CH20H), 4,96 (d, 2H, CH2C6H5), 6,73 (s, 1H, S02NH), 7,10 (d, 1H, ZNH), 7,28 (s, 5H, CH aromatiques)

I-B) 3-(N-benzyloxycarbonyl-2-(paraméthoxybenzyl-thio). amino), 5- (N-tertiobutvlaminosulfonvi) pentanol Le composé analogue de configuration (2RS, 3R) est obtenu par le même protocole à partir du synthon 1 sous forme d'ester méthylique et de configuration (2SR, 3R).

2-(paraméthoxybenzyl-thio),3-(N-benzyloxycarbonyl-II-A)( 2SR,3S), pentanalamino).5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) A une solution de 0,056 ml (0,63) mmol) de chlorure d'oxalyl (fraîchement distillé) dans 2,5 ml de dichlorométhane, est ajoutée goutte à goutte, å-78°C, sous azote, une solution de 0,115 ml (1,6 mmol) de DMSO dans 0,5 ml de dichlorométhane. Une solution de 270 mg de (2SR, 3S), 2-(paraméthoxybenzyl-thio), 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino), 5- (N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanol dans 1,5 ml de CH2CI2 est coûtée goutte à goutte. L'agitation est maintenue pendant 30 minutes, puis on ajoute 375 41 de triéthylamine. Le mélange réactionnel est agité pendant 5 minutes supplémentaire à -65°C puis on laisse revenir le bain à température ambiante.

Après 1 h d'agitation, on ajoute de t'eau et la phase aqueuse est extraite au dichlorométhane. Les phases organiques sont combinées, lavées avec KHS04 (1N), NaHC03 (10%), NaCI saturée, séchées sur Na2S04.

Après concentration sous pression réduite, on obtient avec un rendement de 94%, 0,747 g de (2SR, 3S), 2-(paraméthoxybenzyl-thio), 3- (N-benzyloxycarbonyl-amino), 5- (N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanal dont les caractéristiques sont les suivantes : <BR> <BR> 1 H RMN (d6-DMSO) 5 (s, 9H, tBu), 1,80 à 1,92 (m, 1H, CH-CH2-CH2), 2,05 à 2,18 (m, 1H, CH-CH2-CH2), 2,86 à 3,02 (m, 2H, CH-CH2-CH2), 4,03 (m, 1 H, CH-CH2-CH2), 5,00 (s, 1H, CH2C6H5), 6,87 (s, 1H, SO2NH), 7,27 à 7,37 (m, 5H, CH aromatiques), 7,87 (d, 1H, ZNH), 9,45 (s, 1H, CHO)

II-B) (2RS, 3R) 2- (paraméthoxvbenzvl-thio), 3- (N-benzvloxvcarbonvl- amino). pentanal Le composé analogue de configuration (2SR, 3S) est obtenu par le même protocole à partir du composé décrit en IB.

III-)H-Tyr(tBu)-His(Trt)-HMPrésine La synthèse du dipeptidyl-résine H-Tyr (tBu)-His (Trt)- HMPrésine est réalisée en utilisant la procédure 1 sur 150 mg (0,15mmol) de HMP-résine avec A2 = Fmoc-His (Trt)-OH et Ai = Fmoc-Tyr (tBu)-OH.

IV-) (2 SR, 3S) N- (N- (2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamovl Pentvl)-L-TvrosVl)- L-Histidine A une solution de 200 mg (0,4 mmol) de (2SR, 3S) 3- (N-Z), 2- <BR> <BR> <BR> (paraméthoxybenzyl-thio), 3- (N-benzyloxycarbonyl-amino), 5- (N- tertiobutylaminosulfonyl) pentanal, 150 4mol de résine H-Tyr (tBu)-His (Trt)- HMPrésine, 30 mg (0,16 mmol) d'acide paratoluènesulfonique (APTS) dans 6 ml de DMF, est ajoutée une solution de 25 mg de NaBH3CN dans 1 ml de DMF. Le mélange réactionnel est agité pendant 16 heures à température ambiante. La résine est lavée alternativement avec NMP et dichlorométhane. On effectue une déprotection TFA avec le mélange TFA : eau : triisopropylsilane 40 ml : 2 ml : 1 ml pendant 3 heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est évaporé sous pression réduite, repris avec de t'eau puis lyophilisé.

On effectue dès lors une déprotection HF à 0°C avec le mélange HF : métarésol 10 mi : 0,2 ml pendant 1 heure. Après distillation du HF, le résidu est repris avec un peu de TFA puis précipité avec un mélange froid éther diéthylique : n-hexane 50 : 50. Le produit est ensuite lyophilisé.

Les deux diastéréoisomères obtenus sont purifiés et séparés sur une colonne semi-préparative.

Les deux autres diastéréoisomères sont obtenus par le même protocole à partir du synthon 1 de configuration (2RS, 3R).

HPLC (gradient 0% à 40% de B en 15 min ; colonne Macherey-Nagel C18) : 4 pics à 03 et 11.14 min.

SM (ES) : (M+H) + m/z = 515.2 ; (M+2H) 2+ m/z = 258.1 EXEMPLE N° 6 3-(3-sulfamoyl)phénylpropanoyl)-L-N-(N-(2-mercapto,3-amino, Tyrosyl)-L-Histidyl-benzylamide. t-) H-Tyr (tBu)-His (Trt)-NHBz H-Tyr (tBu)-His (Trt)-NHBz dont les caractéristiques sont les suivantes est obtenu en phase liquide par condensations et déprotections successives du Fmoc-His (Trt)-OH et du Fmoc-Tyr (tBu)-OH sur la benzylamine. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>1 H RMN (d6-DMSO) 6 1.20 (s, 9H, Trt), 2.40 (dd, 1H, ßCH2(His) / ßCH2 (Tyr)), 2.80 (dd, 2H, ßCH2 (His)/PCH2 (Tyr)), 3.30 (m, 1 H, aCH (His)), 4.17 (m, 2H, CH2-C6H5), 4.48 (m, 1H, aCH (His)), 6.60 (s, 1 H, His), 6.77 (d, 2H, H3 H5 (Tyr)), 6.95 (d, 2H, H2 H6 (Tyr)), 7.00 à 7.33 (m, 20H, C6H5/Trityl), 8.12 (d, 1H, NH (His)), 8.30 (t, 1H, NH-CH2-C6H5), 8.52 (d, 2H, NH2 (Tyr)).

N-(N-(2-mercapto,3-amino,3-(3-sulfamoyl)phénylII-A)(2RS. 3S), propanovl)-L-Tyrosvl)-L-Histidyl-benzylamide.

300 mg (0,57 mmol) d'acide (2SR, 3S), 2- 3-(3-N-(paraméthoxybenzyl-thio)-,3-(N-t-butoxycarbonyl-amin o)-, tertiobutylaminosulfonyl) phényl) propanoique, (dont la synthèse est détaillée dans la procédure 2 BIII) sont condensés sur 470 mg (0,68 mmol) de H-Tyr (tBu)-His (Trt)-NHBz dans 5 mi de dichlorométhane selon le mode opératoire décrit dans l'exemple n°2 étape II. Après déprotection par l'acide trifluoroacétique, on obtient 460 mg de brut qui est purifié sur une colonne semi-préparative (Vydac C18 ref 218TP510,20x250 mm). Les deux diastéréoiomères sont séparés à ce niveau ta de la synthèse par HPLC sur une colonne Vydac C18 10X250 mm.

HPLC (gradient 10% de B à 90% de B en 30 min ; colonne Macherey-Nagel C18) : 2 pics à 12,85 min et 14,35 min (débit 1,5 ml/min).

Les deux produits obtenus sont alors traités à t'acide fluorhydrique anhydre en présence de 2% m-crésol afin de déprotéger le groupe p- méthoxy benzyl protégeant le soufre puis repurifiés par HPLC. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>1 H RMN (D20) 5 2.96 (dd, 2H, ß (Tyr)), 3.08 (dd, 1H, ß(His)), 3.18 (dd, 1H, ß (His)), 3.70 (d, 1 H, CH-SH), 4.22 (d, 1H, CH2-C6H5), 4.37 (d, 1H, CH2-C6H5), 4.55 (t, 1H, α (Tyr)), 4.60 (t, 1H, a (His)), 6.82 (d, 2H, H3- H5 (Tyr)), 7.13 (d, 2H, H2-H6 (Tyr)), 7.14 (s, 1H, H4 (His)), 7.19 (d, 2H, C6H5), 7.37 (m, 3H, C6H5), 8.51 (s, 1 H, H2 (His)).

SM (ESI) : (M+H) + m/z 666,2 II-B) 3-(3-sulfamoyl)phénylpropanoyl)-L-3-amino.

Tyrosyl)-L-Histidyl-benzylamide.

Les deux autres diastéréoiomères sont obtenus par le même protocole à partir du synthon 3 de configuration (2RS, 3R).

EXEMPLE N°7 <BR> <BR> <BR> N- (N- (2-mercapto, 3-amino, 5-carbamoyl pentanoyl)-L-ß(2-naphtyl)- Ala)-L-b (2-naphtyl)-Alanine I-)H-ß(2-naphtyl)-L-Ala-ß(2-naphtyl)-L-Ala-dichlorotritylr ésine La synthèse du dipeptidyl-résine H-ß (2-Naphtyl)-L-Ala-ß (2- naphtyl)-L-Ala-dichlorotritylrésine est réalisée en utilisant la procédure 1 sur 125 mg (200 µmol) de dichlorotritylrésine avec Al et A2 = Fmoc-ß (2- naphtyl)-L-Ala-OH.

N-(N-(2-mercapto,3-amino,5-carbamoyl,pentanoyl)-L-ß(2-II -A)(2RS,2S) naphtyl)-Ala)-L-ß(2-naphtyl)-Alanine 200 mg (300 µmol) d'acide (2RS, 3S), 2-(paraméthoxybenzyl- thio), 3-(N-Boc), 5-trityl-carbamoyl pentanoïque (dont la synthèse est détaillée dans la procédure 3) sont condensés sur 200 4mol de H-0 (2- naphtyl)-L-Ala- ß(2-naphtyl)-L-Ala-dichlorotritylrésine dans 5 ml de dichlorométhane en suivant le mode opératoire décrit dans l'exemple n°3 étape tt. Après déprotection, on obtient 149 mg de brut qui est purifié sur

une colonne semi-préparative (Vydac C18 ref 218TP510,20x25 mm). Les deux diastéréoisomères obtenus sont ainsi séparés.

HPLC (gradient de 40% à 80% de B en 15 min ; colonne Interchrom#) : 2 pics à 12.3 min et 13.2 min. <BR> <BR> <P>1H RMN (d6-DMSO) 8 1.18 (m, 1H, ßCH2(Gln)), 1.33 (m, 1H, ßCH2(Gln)), 1.87 (m, 2H, yCH2 (Gln)), 2.80 à 3.15 (m, 4H, ßCH2 (ß (2-naphtyl)-L-Ala)), 3.23 (m, 1H, αCH(Gln)), 3.52 (m, 1H, CH-SH), 4.54 et 4.67 (m, 2H, aCH ((ß(2-naphtyl)-L-Ala))/ αCH((ß(2-naphtyl)-L-Ala)), 7.00 (s, 1 H, CONH2 (Gln)), 7.38 (s. 1H, CONH2 (Gln)), 7.38 à 7.85 (m, 16 H, arom (p (2- naphtyl)-L-Ala)/NH2 (Gln)), 8.62 et 8.66 (d, 2H, NH (ß (2-naphtyl)-L-Ala)) SM (ES) : (M+H) + = 586,22 N-(N-(2-mercapto,3-amino.5-carbamoyl,pentanoyl)-L-II-B)(2RS, 3R) ß(2-naphtyl)-Ala)-L-ß(2-naphtyl)-Alanine Les deux autres diastéréoisomères sont obtenus par le même protocole à partir du synthon 2 de configuration (2RS, 3R).

EXEMPLE N°8 <BR> <BR> <BR> N- (N- (2-mercapto, 3-amino, 5-carbamoyl pentanoyl)-L-Trp)-L-Leucine I-) H-Trp-Leu-OtBu H-Trp-Leu-OtBu dont les caractéristiques sont les suivantes est obtenu par condensation du Fmoc-Trp-OH sur la H-Leu-OtBu suivie par une déprotection.

Rf (MeOH : dichlorométhane 10 : 90) =0,30 H RMN (d6-DMSO) 5 0.75 (d, 3H, SCH3 (Leu)), 0.81 (d, 3H, 5CH3 (Leu)), 1.35 (s, 9H, tBu), 1.42 (m, 1H, yCH (Leu)), 1.63 (m, 2H, ßCH2 (Leu)), 2.68 (dd, 1H, ßCH2(Trp)), 3.01 (dd, 1H, ßCH2 (Trp)), 3.43 (m, 1H, aCH (Leu)), 4.15 (m, 1H, aCH (Trp)), 6.91 (t, 1 H, H5 (Trp)), 7.00 (t, 1H, H6 (Trp)), 7.01 (d, 1 H, H2 (Trp)), 7.27 (d, 1 H, H7 (Trp)), 7.51 (d, 1 H, H4 (Trp)), 8.00 (d, 1 H, NH (Leu)), 10.79 (s, 1H, NH (Trp))

3S),N-(N-(2-mercapto,3-amino,5-carbamoyljpentanoyl)-L-II-A)( 2RS, Trp)-L-Leucine 200 mg (300 pmol) d'acide (2RS, 3S), 2-(paraméthoxybenzyl- thio), 3-(N-Boc), 5-trityl-carbamoyl pentanoïque(N-Boc), 5-trityl-carbamoyl pentanoïque (dont la synthèse est détaillée dans la procédure 3) sont condensés sur 200 umol de H-Trp- Leu-OtBu dans 5 ml de dichlorométhane en utilisant le mode opératoire décrit dans étapeII.n°2, Après déprotection, on obtient 223 mg de brut qui sont purifiés sur une colonne semi-péparative (Vydac C18 ref 218TP510, 20x25 mm). Les deux diastéréoisomères obtenus sont ainsi séparés. <BR> <BR> <P> 1 H RMN (d6-DMSO) 8 0.83 (5,3H, #CH3 (Leu)), 0.88 (d, 3H, #CH3 (Leu)), 1.32 (m, 1 H, yCH (Leu)), 1.50 (m, 3H, aCH2 (Leu)/ßCH2(Gln)), 1.60 (m, 1 H, ßCH2 (Gln)), 2.01 (t, 2H, yCH2 (Gln)), 2.91 (dd, 1H, ßCH2 (Trp)), 3.07 à 3.17 (m, 2H, ßCH2 (Trp)/aCH (Gln)), 3.63 (m, 1H, CH-SH), 4.27 (m, 1H, aCH (Leu)), 4.64 (m, 1H, aCH (Trp)), 6.97 (t, 1H, H5(Trp)), 6.99 (s, 1H, CONH2), 7.03 (t, 1H, H6 (Trp)), 7.13 (t, 1 H, H2 (Trp)), 7.32 (d, 1 H, H7 (Trp)), 7.40 (s, 1 H, CONH2), 7.63 (d, 1H, H4 (Trp)), 7.95 (br s, 3H, NH3+), 8.40 (d, 1 H, NH (Leu)), 8.63 (d, 1 H, NH (Trp)), 10.76 (s, 1 H, NH1 (Trp)), 12.5 (br s, 1H, COOH).

II-B) 3-amino,5-carbamoylpentanoyl)-L-Trp)-N-(N-(2-mercapto, L-Leucine Les deux autres diastéréoisomères sont obtenus par le même protocole à partir du synthon 2 de configuration (2RS, 3R).

EXEMPLE 9 Caractérisation de l'activité biologique de composés de formule générale (l) Le pouvoir inhibiteur peut être déterminé sur t'activité endopeptidasique des chaînes légères purifiées de toxine tétanique et de toxine botulique de type B en suivant le protocole décrit dans la littérature

(Soleilhac et al, Analytical Biochemistry, 241,120,1996) car ces deux enzymes clivent toutes deux la synoptobnévine au même site de clivage.

Le composé à tester (101l1) est préincubé avec 1041 de chaîne légère purifiée de toxine tétanique (250 ng) ou de toxine botulique B pendant 30 minutes à 37°C dans un volume total de 80 il de tampon 20mM Hépes, 100 mM NaCI à pH 7,4. On ajoute alors 20 1 d'une solution à 100 µM du substrat fluorescent (Pya88) Syb 39-88 dans le même tampon ; l'incubation est prolongée pendant 30 minutes à 37°C et à I'abris de la lumière. On arrête la réaction par addition de 0,9 ml de 72% de MeOH dans t'eau contenant 0,1 % de TFA. Le métabolite fluorescent généré (Pya88) Syb 77-88 est séparé du substrat total par chromatographie sur colonne Sep-Pak Vac C18 contenant 500 mg de phase inverse C18 (Waters) @. La quantité de métabolite formée est mesurée par fluorimétrie avec comme longueur d'onde d'excitation 343 nm et comme longueur d'onde d'emission 377 nm.

A titre d'exemples, le tableau I ci-apres donne l'activité inhibitrice in vitro de certains composés sur les propriétés hydrolytiques de la toxine tétanique.

(R4, R5, R6 = Hydrogène) En ce qui concerne le tableau 11, y sont soumises les activités inhibitrices de certains composés revendiqués, sur les propriétés hydrolytiques de la toxine botulique de type B. Tableau I : Inhibition ICso 1 CH2 2S02NHz CO-CH CHs 2 CH CHs Et OH 10 M 2R, 3S CH2 2SOzNHz CO-CH CH3 2 CH CH3 Et NHBz 8 M 2R, 3S te (CHZ) 2S02NH2 CO CH2 ^ (OH) 5 NM (2R, 3S) 3 (CH2) 2SO2NH2 CO CH2<OH CH2tN (OH) 5 pM (2R, 3S)HN--- (CHz) 2S02NH2 CO CH2 (NHBz) 3, 5 NM (2R, 3S) -CH2 OHN HN--- (CH2) 2S02NH2 CH2 CH2 (OH) 50 NM (2 (S, R), (3S, R) HN--" 6 m- (S02NH2) Ph CO CH2 (NHBz) 3, 5 NM (2R, 3R) _ _ _ _ H_ '--'HN--" (CHz) 2CONHz CO (OH) pM (2R, 3S) 0 00 8 (CH2) 2CONH2 CO CH2-CH (CH3) 2 (OH) 100 pM (2R, 3S) L J 'C H2 1 ''--nu Tableau ici Inhibition ICso CHz 2SOzNH2 CO-CH CH3 2 CH CH3 Et OH 15 M 2R, 3S 2 (CH2) 2S02NH2 CO-CH (CH3) 2CH (CH3) (Et) (NHBz) 10M (2R. 3S) , (CH2) ZS02NHz CO CHZ (OH) 8 NM (2R, 3S) HAN-1 '--'HN--" (CHz) 2S02NH2 CO CH2 (NHBz) 5 NM (2R, 3S) HO--J HN---- (CH2) 2S02NH2 CH2 CHZ (OH) 25 NM (2 (S, R), (3S, R) | _ _.. _ '--'HN--" m- (S02NH2) Ph CO CH2 (NHBz) 2 NM (2R, 3R) -C ti2 O OH N HN (CH2) 2CONH2 CO -CHZ O n-CH2 (OH) 25 pM (2R, 3S) o0 8 (CH2) 2CONH2 CO CH2-CH (CH3) 2 (OH) 50 PM (2R, 3S) 0 t(CH2) 2CONH2X-CH2-H (CH3) 2 | (OH) | 50 pM (2R, 3S)H C H N-H