SIMULTANEMENT, PREPARATION ET UTILISATIONS DE CELLES-CI

La présente invention concerne la modification génétique de bactéries du genre Clostridium, typiquement de bactéries solvantogènes du genre Clostridium. Elle concerne en outre des méthodes, outils et kits permettant l’élimination ou la modification de séquence(s) codant, ou contrôlant la transcription de séquence(s) codant, les répresseurs transcriptionnels XylR et/ou AraR, les bactéries génétiquement modifiées obtenues et leurs utilisations, en particulier pour fermenter simultanément au moins un hexose et un pentose ou les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose.

ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE

Le genre Clostridium contient des bactéries à Gram positif, anaérobies strictes et sporulantes, appartenant au phylum des Bacillota. Les Clostridia sont un groupe d’importance pour la communauté scientifique pour plusieurs raisons. La première est qu’un certain nombre de maladies graves (e.g. tétanos, botulisme) sont dues à des infections de membres pathogènes de cette famille (John & Wood, 1986). La deuxième est la possibilité d’utiliser des souches dites acidogènes ou solvantogènes en biotechnologie. Ces Clostridia, non pathogènes, ont naturellement la capacité de transformer une variété importante de sucres pour produire des espèces chimiques d’intérêt, et plus particulièrement de l’acétone, du butanol, et de l’éthanol (John & Wood, 1986) au cours d’une fermentation dite ABE. La bactérie Clostridium acetobutylicum est aujourd’hui considérée comme un représentant modèle des Clostridium solvantogènes.

Les Clostridium solvantogènes sont capables d’assimiler une large variété de sources carbonées, ce qui est un atout pour les procédés de fermentation ABE (Keis, Shaheen et Jones 2001). Cette versatilité leur permet en théorie de proliférer efficacement sur de larges gammes de substrats, notamment sur des co-produits issus de l’agro-industrie (Qureshi ét al. 2008; Ezeji, Qureshi et Blaschek 2007; Ezeji et Blaschek 2008; Qureshi et al. 2006). Grâce à l’essor des procédés industriels de fermentation, et plus récemment de la chimie verte, l’incorporation de la biomasse végétale dans les procédés industriels tend à se répandre. Or, une catégorisation des substrats végétaux s’est vite généralisée à l’ensemble de l’industrie, mettant en opposition deux « générations » de substrats industriels, sur la base de considérations environnementales et humaines.

Les substrats dits de première génération (« IG »), regroupent toutes les sources carbonées issues des organes de réserve des végétaux. Les substrats IG peuvent en particulier être issus de maïs, de blé, mais aussi de canne à sucre ou de betterave. Majoritairement constitués de saccharose et d’amidon, leur fermentation à l’échelle industrielle est aujourd’hui très efficace. En revanche, l’utilisation de ces substrats est sujette à controverse, puisqu’ils nécessitent l’utilisation de terres arables et de denrées exploitées par l’industrie agroalimentaire.

En opposition à ce paradigme, les substrats de seconde génération (« 2G ») rassemblent tous les substrats issus d’organes de structure de plantes, ou de co-produits de F agro-industrie. Ce faisant, cette approche contribue à réduire les tensions entre les secteurs de l’énergie et de l’alimentation. Leur utilisation est cependant beaucoup moins aisée que les substrats IG. En cause, la source de carbone majoritaire de ces substrats : la lignocellulose, matrice polymérique complexe et récalcitrante. Sa dégradation en sucres fermentescibles nécessite des prétraitements plus ou moins coûteux, et pouvant générer des inhibiteurs de croissance microbienne.

Du fait de la nature complexe des différentes fractions dont ils sont issus, les hydrolysats d’hémicellulose contiennent diverses sources carbonées. Parmi celles-ci on trouve majoritairement le xylose et le glucose, accompagnés d’un mélange de sucres minoritaires comme le galactose, le mannose et F arabinose. Tous ces sucres sont fermentescibles par les espèces solvantogènes de Clostridium. Par exemple, Clostridium cellulovorans DSM 743B est décrite par Wen et al. (2020) comme une souche susceptible d’être manipulée afin d’optimiser la production de //-butanol à partir de lignocellulose, et WO 2013/159710 décrit une bactérie C. beijerinckii modifiée présentant une capacité de consommation augmentée de xylose et/ou d’ arabinose. En pratique cependant, un processus biologique connu sous le terme de Répression Catabolique (RC), empêche l’utilisation optimale et simultanée de toutes ces sources de carbone. En particulier, la répression catabolique empêche la métabolisation efficace du xylose contenu dans les hydrolysats de lignocellulose. La bactérie C. acetobutylicum en particulier est sensible à ce phénomène de répression (Qureshi et al. 2006; Grimmler et al. 2010). Hu et al. (2011) enseignent que l’inactivation du gène xylR (CA_C2613) au sein de la souche ATCC 824 de C. acetobutylicum entraîne une utilisation plus rapide du xylose qui n’impacte toutefois pas la quantité totale de xylose fermentée. WO 2013/159710 déconseille à l’homme du métier l’inactivation de xylR (CAC3673) chez C. acetobutylicum.

RESUME DE L’INVENTION

Les inventeurs décrivent, dans le contexte de la présente invention, des bactéries du genre Clostridium, typiquement les bactéries solvantogènes, aptes à consommer, de manière simultanée, des sources de carbone différentes, en particulier des sucres différents. Ils décrivent en particulier, pour la première fois, une bactérie C. acetobutylicum apte à consommer, de manière simultanée, du glucose et un pentose, préférentiellement du glucose et de F arabinose.

Les inventeurs décrivent en particulier une bactérie génétiquement modifiée, appartenant au genre Clostridium, en particulier une bactérie solvantogène, n’exprimant pas les répresseurs transcriptionnels XylR et/ou AraR ou exprimant des versions non fonctionnelles de ceux-ci. Cette bactérie génétiquement modifiée est une bactérie n’exprimant pas les produits des gènes xylR et/ou araR, en particulier les produits des gènes CA_C2613, CA_C3673 et/ou CA_C1340, ou exprimant des versions non fonctionnelles desdits produits.

Une bactérie particulière décrite par les inventeurs dans le présent texte n’exprime pas le répresseur transcriptionnel XylR ou exprime une version non fonctionnelle de celui-ci. Cette bactérie génétiquement modifiée est une bactérie n’exprimant pas les produits des gènes xylR, en particulier les produits des gènes CA_C2613 et/ou CA_C3673, ou exprimant des versions non fonctionnelles desdits produits.

Une autre bactérie particulière décrite par les inventeurs dans le présent texte n’exprime pas le répresseur transcriptionnel AraR ou exprime une version non fonctionnelle de celui-ci. Cette bactérie génétiquement modifiée est une bactérie n’exprimant pas le produit du gène araR, en particulier le produit du gène CA_C1340, ou exprimant une version non fonctionnelle dudit produit.

Une autre bactérie génétiquement modifiée préférée selon l’invention est une bactérie n’exprimant pas les répresseurs transcriptionnels XylR et AraR ou exprimant des versions non fonctionnelles de ceux-ci. Cette bactérie génétiquement modifiée est une bactérie n’exprimant pas les produits des gènes xylR et araR, en particulier les produits des gènes CA_C2613, CA_C3673 et CA_C1340, ou exprimant des versions non fonctionnelles desdits produits.

Des bactéries génétiquement modifiées particulièrement préférées selon l’invention correspondent à la souche identifiée dans la présente description en tant que IFP 968 telle qu’enregistrée le 13 juin 2022 sous le numéro de dépôt LMG P-32703 auprès de la collection BCCM-LMG (également identifié dans le présent texte en tant que ACA_C1340 ACA_C2613 ACA_C3673 ou araR AxylRl xylR2), et à la souche identifiée dans la présente description en tant que IFP 967 telle qu’enregistrée le 13 juin 2022 sous le numéro de dépôt LMG P-32702 auprès de la collection BCCM-LMG (également identifié dans le présent texte en tant que ACA_C1340 ou t iraR), utilisable pour préparer une souche équivalente à la souche IFP 968. L’invention vise également toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de celles-ci.

Les inventeurs décrivent en outre un procédé de production d’une bactérie recombinante telle que décrite dans le présent texte, en particulier un procédé comprenant la délétion ou l’inactivation des gènes xylR et/ou araR de manière à empêcher ou diminuer l’expression de protéines XylR et/ou AraR fonctionnelles, ainsi que les bactéries modifiées génétiquement susceptibles d’être obtenues par ce procédé, dont les bactéries IFP 967 et IFP 968 sont des exemples.

Ils décrivent aussi l’utilisation d’une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas le produit du gène xylR ou araR, ou exprime une version non fonctionnelle du gène xylR ou araR, telle que la souche IFP 967, pour préparer une bactérie modifiée génétiquement selon l’invention n’exprimant pas les produits des gènes xylR et araR, ou exprimant des versions non fonctionnelles de ceux-ci.

Les inventeurs décrivent par ailleurs l’utilisation d’un bactérie selon l’invention pour produire un solvant, un sucre ou une molécule biosourcée par exemple à partir i) d’une biomasse lignocellulosique, ii) du produit d’une culture dédiée particulière telle qu’une culture énergétique, une culture de plantes pérennes fourragères, une culture d’herbacées ou une culture arbustive, ou iii) de substrat(s) IG issu(s) d’une ou plusieurs plantes sucrières, céréalières, ou oléagineuses, ou iv) d’un mélange de telles sources carbonées. Ils décrivent aussi rutilisation des bactéries selon l’invention pour fermenter simultanément (ou en d’autres termes, pour « cofermenter ») au moins un hexose et un pentose, ou encore les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose. De telles bactéries peuvent être avantageusement utilisées pour produire un solvant ou un mélange de solvants, en particulier à l’échelle industrielle.

L’invention concerne aussi un procédé de fermentation impliquant l’utilisation d’une bactérie génétiquement modifiée telle que décrite dans le présent texte.

Les inventeurs décrivent enfin des kits, en particulier un kit pour transformer et de préférence modifier génétiquement une bactérie appartenant au genre Clostridium, et un kit pour produire un solvant, un sucre ou une molécule biosourcée à l’aide d’une bactérie appartenant au genre Clostridium, ledit kit comprenant i) une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium selon l’invention et ii) un milieu, en particulier un milieu de culture riche, préférentiellement un milieu de culture de type RCM, plus préférentiellement un milieu de culture de type GAPES, encore plus préférentiellement un milieu de culture de type CGM, contenant au moins du glucose et un pentose, préférentiellement du glucose et de 1’ arabinose et/ou du xylose.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION

Bien qu’utilisées en industrie depuis plus d’un siècle, les connaissances sur les bactéries appartenant au genre Clostridium, en particulier sur les bactéries solvantogènes, restent très limitées. Une contrainte majeure rencontrée par les industriels concerne leur incapacité à utiliser simultanément plusieurs sources distinctes de carbone et donc à métaboliser efficacement différents types de substrats, en particulier différents types de sucres.

Malgré les difficultés, bien connues de l’homme du métier, rencontrées pour modifier génétiquement les bactéries appartenant au genre Clostridium, les inventeurs sont parvenus, pour la première fois dans le contexte de la présente invention, à obtenir une bactérie C. acetobutylicum capable d’utiliser simultanément, i.e., de coassimiler, cométaboliser ou cofermenter (ces termes étant utilisés de manière indistincte dans le présent texte) plusieurs sources distinctes de carbone, en particulier issues de biomasse, notamment de biomasse végétale, par exemple de biomasse lignocellulosique.

Une « biomasse brute », dite aussi « biomasse native », préférée dans le cadre de l’invention est une biomasse végétale, en particulier une biomasse lignocellulosique. Cette dernière comprend essentiellement trois constituants naturels (polymères) présents en quantités variables selon son origine: la cellulose (environ 35 à 50% en masse sèche de la biomasse), qui est un polysaccharide essentiellement constitué d’hexoses, l’hémicellulose (environ 20 à 30% en masse sèche de la biomasse) qui est un polysaccharide essentiellement constitué de pentoses, et la lignine (environ 15 à 25% en masse sèche de la biomasse) qui est un polymère de structure complexe et de haut poids moléculaire, composé d’alcools aromatiques reliés par des liaisons éther. Ces différentes molécules sont responsables des propriétés intrinsèques de la paroi végétale et s’organisent en un enchevêtrement complexe. Parmi ces trois polymères de base qui intègrent la biomasse lignocellulosique, la cellulose et l’hémicellulose sont ceux qui permettent la production de jus sucrés 2G et d’ alcool 2G.

Des exemples non limitatifs de biomasses lignocellulosiques comprennent par exemple les résidus d’exploitation agricole (notamment les déchets de paille, les rafles de maïs, la bagasse de canne à sucre, etc.), mais aussi les résidus d’exploitation forestière, les résidus de scieries (typiquement les copeaux de bois) ou tout autre type de résidus ligneux d’origine sylvicole, industrielle, urbaine ou ménagère. La biomasse cellulosique peut également être le produit d’une culture dédiée particulière telle qu’une culture énergétique, dédiée par exemple à la culture de plantes annuelles (utilisation « plante entière » par exemple du blé ou du maïs). Elle peut autrement être par exemple une culture de plantes pérennes fourragères (par exemple de fétuque, dactyle ou ray-grass), une culture d’herbacées (par exemple le miscanthus ou « herbe à éléphant » ou encore le switchgrass ou « panic érigé »), ou une culture arbustive (taillis à courtes ou très courtes rotation par exemple de saule, de peuplier, de châtaignier ou d’eucalyptus).

Une autre biomasse susceptible d’être utilisée dans le cadre de l’invention peut être un substrat 1 G ou un mélange de plusieurs substrats IG issus de plantes sucrières (telles que par exemple la canne à sucre ou la betterave à sucre), céréalières (telles que par exemple le maïs ou le blé) et/ou oléagineuses (telles que par exemple le soja, le colza, la palme). Dans le contexte de l’invention, la biomasse peut être utilisée seule ou un mélange, par exemple de plusieurs types de biomasse différents. La quantité d’eau contenue dans la biomasse brute est comprise entre 1% et 70 % de la masse totale de biomasse brute.

Les inventeurs sont ainsi avantageusement parvenus à modifier génétiquement, en ce sens, une bactérie solvantogène, la souche de référence C. acetobutylicum. Ils l’ont en particulier rendue apte à fermenter deux éléments carbonés de natures différentes, par exemple au moins un hexose et un pentose, ou encore les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés distincts choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose, de préférence choisis parmi glucose, arabinose et xylose, encore plus préférentiellement du glucose et de 1’ arabinose.

Chez C. acetobutylicum, les gènes liés au catabolisme du xylose sont organisés sous la forme d’un régulon (Gu et al. 2010). Le principal opéron impliqué dans l’assimilation du xylose est le locus CA_C2610- CA_C2612, qui contient les gènes codant la xylose isomérase XylA (CA_C2610) et la xylulokinase XylB (CA_C2612) (Gu et al. 2010). Les gènes codant les perméases prédites comme impliquées dans l’import de xylose, AraEl (CA_C1339) et XylT (CA_C1345), sont localisés sur un second locus (CA_C1339- CA_C1349) contenant également des gènes liés à l’assimilation de l’arabinose. Un troisième opéron (CA_C3451-CA_C3452) contient les gènes codant les protéines XynT et XynB, correspondant respectivement à une perméase hypothétique et à une 1,4-P-D-xylosidase.

A l’exception de xylT, tous ces gènes possèdent dans leur promoteur ou leur séquence codante des séquences opératrices XylR-binding-site (XBS) (Gu et al. 2010). La présence du XBS a pour effet de placer ces gènes sous le contrôle d’un répresseur xylose, nommé XylR, capable d’empêcher la transcription en T absence de xylose dans le milieu.

Le gène CA_C2613 est situé en amont du gène xylB au sein de l’opéron principal d’assimilation du xylose. Cette organisation est très similaire à ce qui est observé chez les espèces possédant un répresseur du xylose (Gu et al. 2010).

Le gène CA_C3673 possède un XBS au niveau de son promoteur, suggérant une autorégulation de sa transcription. Le produit de ce gène est également le répresseur présentant le plus d’identité avec des homologues de XylR appartenant à des Clostridium solvantogènes proches, tels que C. beijerinckii NCIMB 8052.

Les gènes impliqués dans l’assimilation de 1’ arabinose sont pour la plupart situés au sein du locus CA_C1339-CA_C1349. Ce locus comprend les gènes codants les transporteurs présumés de l’arabinose AraEl et XylT, les L-arabinose isomérases AraAl (CA_C1342) et AraA2 (CA_C1346), la ribulokinase AraK (CA_C1344) et la L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase AraD (CA_C1341).

Un second opéron contient les gènes CA_C1529 et CA_C1530 qui codent l’arabinofuranosidase Arb43 et le transporteur d’ arabinoside AraT.

Tous ces gènes, ainsi que le gène codant la phosphocétolase Xfp sont placés sous contrôle du répresseur transcriptionnel AraR (CA_C1340), actif en l’absence d’ arabinose (Zhang et al. 2012).

Une particularité récemment mise en évidence chez C. acetobutylicum est la différence phénotypique qui existe entre la croissance sur xylose et celle sur arabinose, bien que les voies métaboliques permettant l’assimilation de ces sucres possèdent de nombreux intermédiaires communs (Servinsky et al. 2010). En effet, alors que le temps de génération sur arabinose est de 78 min, celui-ci atteint 287 min sur xylose (Servinsky et al. 2012). Si les activités xylose-perméase et xylulokinase ont été mises en cause, cette différence s’explique également par l’action de facteurs de régulation transcriptionnels.

L’analyse transcriptomique de cultures de C. acetobutylicum ATCC 824 en présence de glucose, de xylose ou d’ arabinose révèle que la voie des pentoses phosphate est induite de façon analogue par le xylose et l’arabinose (Servinsky et al. 2010). En revanche, l’expression de la phosphocétolase Xfp présente un profil d’expression différent. En effet, xfp est faiblement induit par le xylose (d’un facteur 3 comparé au glucose) mais fortement induit par l’arabinose (d’un facteur 185 comparé au glucose) (Servinsky et al. 2012). Le contraste marquant d’induction de l’expression du gène xfp en absence d’ arabinose peut être expliqué par la présence d’un AraR-binding-site en amont de ce gène. Ainsi, Tune des conséquences les plus remarquables lors de l’analyse transcriptomique d’un mutant dont le gène araR a été inactivé est l’amélioration de la transcription du gène xfp d’un facteur supérieur à 1000 (Zhang et al. 2012). Cette régulation transcriptionnelle de la phosphocétolase contribue à entraver partiellement l’assimilation du xylose en absence d’ arabinose.

Des travaux récents montrent en outre qu’en plus de subir une répression partielle en l’absence d’ arabinose, l’assimilation du xylose est réduite en présence d’ arabinose. En effet, des cultures réalisées en présence de xylose et d’ arabinose montrent une consommation minime de xylose, alors que le taux d’assimilation de 1’ arabinose ne diffère pas du taux observable sur arabinose seul (Aristilde et al. 2014). Une analyse des flux métaboliques confirme l’assimilation préférentielle de 1’ arabinose par rapport au xylose de culture sur ces deux sucres (Aristilde et al. 2014). Servinsky et al. ont également montré que la préférence de l’arabinose sur le xylose ne peut pas s’expliquer entièrement par les taux de croissance inhérents à ces deux hydrates de carbone. Ils ont ainsi mis en évidence le fait que l’arabinose serait capable d’inhiber spécifiquement l’expression de gènes d’assimilation d’autres sucres, dont ceux du xylose.

Les inventeurs montrent pour la première fois que l’inactivation conjointe des gènes codant les répresseurs AraR et XylR permet d’obtenir une souche présentant des capacités de coassimilation étonnantes, puisque capable d’assimiler et/ou de métaboliser de manière simultanée deux sources carbonées distinctes telles que l’arabinose et le glucose, sans lever la répression catabolique sur l’assimilation du xylose.

Un objet décrit par les inventeurs vise ainsi une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium, en particulier une espèce de Clostridium d’intérêt industriel, en particulier C. acetobutylicum, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas les produits des gènes xylR et/ou araR, ou exprime des versions non fonctionnelles de ceux-ci.

Dans le contexte de la présente invention, le terme « gène xylR » vise en particulier la séquence SEQ ID NO : 1 (CA_C2613) ou la séquence SEQ ID NO : 2 (CA_C3673). Le terme « gène xylR » vise aussi les variants desdites séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2, en particulier les variants présentant une homologie de séquence avec l’une desdites séquences SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2.

Dans le contexte de la présente invention, le terme « gène araR » vise en particulier la séquence SEQ ID NO : 3 (CA_C1340) ou un variant de ladite séquence, en particulier un variant présentant une homologie de séquence avec ladite séquence SEQ ID NO : 3.

Un exemple typique de variant selon l’invention présente une homologie de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, avec la SEQ ID NO : 2 ou avec la séquence SEQ ID NO : 3 comprise entre 95% et 100%, et de préférence entre 96% et 100%. La séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3 et son variant sont par exemple homologues à au moins 95%, par exemple à au moins 96%, à au moins 97%, à au moins 98%, ou à au moins 99%. Selon un mode de réalisation préféré, la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3 et son variant présentent des séquences homologues à au moins 96%, au moins 97%, ou au moins 98%.

Le terme « gène xylR » vise également une séquence codant un fragment ou variant fonctionnel de la protéine XylR, en particulier une protéine apte à/ capable de réprimer, diminuer ou empêcher (ou impliquée dans la répression de), par exemple en l’absence de xylose, l’expression d’une enzyme de la voie d’assimilation du xylose, par exemple apte à/ capable de réprimer, diminuer ou empêcher, la transcription d’au moins un gène choisi parmi le gène codant la xylose isomérase « XylA » (codée par le gène CA_C2610, SEQ ID NO : 4), le gène codant la xylulokinase « XylB » (codée par le gène CA_C2612, SEQ ID NO : 5), un gène codant une perméase impliquée dans l’import de xylose telle que par exemple la protéine « AraEl » (codée par le gène CA_C1339, SEQ ID NO : 6), la protéine « XylT » (codée par le gène CA_C1345, SEQ ID NO : 7), ou la protéine « XynT » (codée par le gène CA_C3451, SEQ ID NO : 8), et le gène codant la 1,4-P-D-xylosidase « XynB » (codée par le gène CA_C3452, SEQ ID NO : 9).

Le terme « gène xylR » vise aussi une séquence nucléotidique variante codant une protéine capable de lier en particulier le promoteur (SEQ ID NO : 10) du gène « xylA » (CA_C2610, SEQ ID NO : 4), le promoteur (SEQ ID NO : 11) du gène « xylB » (CA_C2612, SEQ ID NO : 5) ou une séquence opératrice « XBS » (XylR-binding site) choisie par exemple parmi SEQ ID NO : 12 et SEQ ID NO : 13. La protéine codée par la séquence nucléotidique variante est de préférence capable de reconnaître une séquence XBS (XylR- Binding site) telle que par exemple la SEQ ID NO : 12 ou la SEQ ID NO : 13, et/ou de réprimer, diminuer ou empêcher, l’expression desdits gènes.

Dans un mode de réalisation particulier, Le terme « gène xylR » vise également une séquence codant un fragment ou variant fonctionnel de la protéine XylR, en particulier une protéine apte à/ capable de réprimer, diminuer ou empêcher (ou impliquée dans la répression de), par exemple en présence de xylose, l’expression d’une enzyme de la voie d’assimilation du xylose telle que décrite ci-dessus.

Le terme « gène araR » vise aussi une séquence codant un fragment ou variant fonctionnel de la protéine AraR, en particulier une protéine apte à/ capable de réprimer, diminuer ou empêcher (ou impliquée dans la répression de), par exemple en l’absence d’arabinose, l’expression d’une enzyme de la voie d’assimilation du xylose ou de la voie d’assimilation de F arabinose, en particulier capable d’empêcher partiellement l’assimilation du xylose ou de F arabinose.

Le terme « gène araR » vise aussi une séquence apte à/ capable de réprimer, diminuer ou empêcher, par exemple en l’absence d’arabinose, la transcription d’au moins un gène choisi parmi un gène codant un transporteur, ou transporteur présumé, de F arabinose « XylA », tel que « AraEl » (codée par le gène CA_C1339, SEQ ID NO : 6) ou « XylT » (codée par le gène CA_C1345, SEQ ID NO : 7) ; un gène codant une L-arabinose isomérase telle que « AraAl » (codée par le gène CA_C1342, SEQ ID NO : 14) ou « AraA2 » (codée par le gène CA_C1346, SEQ ID NO : 15) ; le gène codant la ribulokinase « AraK » (codée par le gène CA_C1344, SEQ ID NO : 16) ; le gène codant la L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase « AraD » (codée par le gène CA_C1341, SEQ ID NO : 17) ; le gène codant F arabinofuranosidase « Arb43 » (codée par le gène CA_C1529, SEQ ID NO : 18) ; le gène codant le transporteur d’arabinoside « AraT » (codée par le gène CA_C1530, SEQ ID NO : 19) ; et le gène xfp (CA_C1343, SEQ ID NO : 20) codant une phosphocétolase .

Le terme « gène araR » vise aussi une séquence nucléotidique variante codant une protéine capable de lier en particulier le promoteur d’un gène « ara » tel que « araEl », « araAl », « araA2 », « araK » ou « araD », par exemple une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, et SEQ ID NO : 24, ou une séquence opératrice « ABS » (AraR-binding site) choisie par exemple parmi SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26, et SEQ ID NO : 27. La protéine codée par la séquence nucléotidique variante est de préférence capable de reconnaître une séquence ABS (AraR-binding site) telle que par exemple la SEQ ID NO : 25 ou la SEQ ID NO : 26, et/ou de réprimer, diminuer ou empêcher, l’expression d’un ou plusieurs desdits gènes codant une enzyme impliquée dans la voie d’assimilation de F arabinose.

Dans un mode de réalisation particulier, Le terme « gène araR » vise également une séquence codant un fragment ou variant fonctionnel de la protéine AraR, en particulier une protéine apte à/ capable de réprimer, diminuer ou empêcher (ou impliquée dans la répression de), par exemple en présence d’ arabinose,, l’expression d’une enzyme telle que décrite ci-dessus de la voie d’assimilation du xylose ou de la voie d’assimilation de F arabinose.

Lorsque le présent texte fait référence à une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas les produits des gènes xylR et/ou araR, ou exprime des versions non fonctionnelles de ceux-ci, l’expression « version non fonctionnelle du produit du gène » xylR, ou araR, désigne une protéine, typiquement une protéine identifiée dans le présent texte en tant que « XylR » ou « AraR », non fonctionnelle, i.e., incapable d’exercer la fonction de la protéine codée par la version sauvage du gène visé. Dans le cas du produit du gène xylR, la version non fonctionnelle dudit produit désigne une protéine incapable de réprimer, diminuer ou empêcher, l’expression d’une enzyme de la voie d’assimilation du xylose et/ou de F arabinose, par exemple incapable de réprimer, diminuer ou empêcher, la transcription d’au moins un gène choisi parmi le gène codant la xylose isomérase « XylA », le gène codant la xylulokinase « XylB », un gène codant une perméase impliquée dans l’import de xylose telle que par exemple la protéine « AraEl », la protéine « XylT », ou la protéine « XynT », et le gène codant la 1,4-P-D-xylosidase « XynB ».

Dans le cas du produit du gène araR, la version non fonctionnelle dudit produit désigne une protéine incapable de réprimer, diminuer ou empêcher, l’expression d’une enzyme de la voie d’assimilation du xylose et/ou de la voie d’assimilation de l’arabinose, en particulier capable d’empêcher partiellement l’assimilation du xylose. Cette protéine est par exemple incapable de réprimer, diminuer ou empêcher, la transcription d’au moins un gène choisi parmi un gène codant un transporteur, ou transporteur présumé, de l’arabinose « XylA », tel que « AraEl » ou « XylT » ; un gène codant une L-arabinose isomérase telle que « AraAl » ou « AraA2 » ; le gène codant la ribulokinase « AraK » ; le gène codant la L-ribulose-5- phosphate 4-epimerase « AraD » ; le gène codant l’arabinofuranosidase « Arb43 » ; le gène codant le transporteur d’ arabinoside « AraT » ; et le gène xfp codant une phosphocétolase.

Par « bactérie du genre Clostridium », on entend en particulier les espèces de Clostridium dites d’intérêt industriel, typiquement les bactéries solvantogènes ou acétogènes du genre Clostridium. L’expression « bactérie du genre Clostridium » englobe les bactéries sauvages ainsi que les souches dérivées de celles- ci, modifiées génétiquement dans le but d’améliorer leur performance.

Par « espèce de Clostridium d’intérêt industriel » ou bactérie « Clostridium d’intérêt industriel » on entend les espèces capables de produire, par fermentation, des solvants tels que l’éthanol, le butanol, l’acétone ou l’isopropanol et/ou des acides tels que l’acide butyrique ou l’acide acétique, à partir de sucres ou d’oses, typiquement à partir de sucres comprenant 5 atomes de carbone tels que le xylose, 1’ arabinose ou le fructose, de sucres comprenant 6 atomes de carbones tels que le glucose ou le mannose, de polysaccharides ou polyosides tels que la cellulose ou une hémicellulose, et/ou de toute autre source de carbone assimilable et utilisable par les bactéries du genre Clostridium (CO, CO2, et méthanol par exemple). Des exemples de bactéries solvantogènes d’intérêt sont les bactéries du genre Clostridium productrices d’acétone, de butanol, d’éthanol et/ou d’isopropanol, telles que les souches identifiées dans la littérature en tant que « souche ABE » [souches réalisant des fermentations permettant la production d’acétone, de butanol et d’éthanol], « souche IBE » [souches réalisant des fermentations permettant la production d’isopropanol (par réduction de l’acétone), de butanol et d’éthanol] et « souche AIBE » [souches réalisant des fermentations permettant la production d’acétone, d’isopropanol, de butanol et d’éthanol]. Des bactéries solvantogènes du genre Clostridium peuvent être sélectionnées par exemple parmi, sans être limitées à, C. acetobutylicum, C. cellulolyticum, C. phytofermentans, C. beijerinckii, C. saccharobutylicum, C. saccharoperbutylacetonicum, C. sporogenes, C. butyricum, C. aurantibutyricum et C. tyrobutyricum, de manière préférée parmi C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C. butyricum, C. tyrobutyricum et C. cellulolyticum, et de manière encore plus préférée parmi C. acetobutylicum et C. beijerinckii. Une bactérie solvantogène préférée entre toutes est C. acetobutylicum.

Les bactéries acétogènes d’intérêt sont des bactéries productrices d’acides et/ou de solvants à partir de CO2 et H2. Des bactéries acétogènes du genre Clostridium peuvent être sélectionnées par exemple parmi C. aceticum, C. thermoaceticum, C. ljungdahlii, C. autoethanogenum, C. difficile, C. scatologenes et C. carboxidivorans .

Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie du genre Clostridium concernée est une « souche ABE », de préférence la bactérie C. acetobutylicum, par exemple la souche DSM 792 (également désignée souche ATCC 824 ou encore LMG 5710) de C. acetobutylicum.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la bactérie du genre Clostridium concernée est une « souche ABE », de préférence la bactérie C. beijerinckii, par exemple la souche la souche NCIMB 8052 de C. beijerinckii.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la bactérie du genre Clostridium concernée est une « souche IBE », de préférence un sous-clade de C. beijerinckii sélectionné parmi DSM 6423, LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593 et NCCB 27006. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, la bactérie selon l’invention appartenant au genre Clostridium est une bactérie Clostridium d’intérêt industriel, en particulier une bactérie solvantogène, capable, à l’état sauvage, de produire des solvants et/ou des acides par fermentation à partir d’une source de carbone, ladite source de carbone étant choisie par exemple parmi un sucre, du CO, du CO2, un alcool, et un acide organique. Dans un mode de réalisation particulier préféré, la source de carbone est un sucre, en particulier un sucre comprenant 5 atomes de carbone tels que le xylose ou 1’ arabinose, un sucre comprenant 6 atomes de carbones tels que le glucose, le fructose ou le mannose, ou un polysaccharide ou polyoside tels que la cellulose ou l’ hémicellulose.

Une bactérie particulièrement préférée selon l’invention est une bactérie Clostridium apte à fermenter simultanément au moins un hexose et un pentose. Une bactérie particulièrement préférée selon l’invention est une bactérie Clostridium apte à fermenter simultanément les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose, de préférence choisis parmi glucose, arabinose et xylose.

L’homme du métier peut ainsi aisément vérifier si ladite bactérie Clostridium est ou non une bactérie selon l’invention, en mettant en culture ladite bactérie sur un substrat comprenant plusieurs sources de carbone (par exemple selon la méthode enseignée par Grimmler et al., 2010) : si la bactérie fermente/ assimile aux moins deux sources de carbone différentes de manière simultanée (versus consécutive, i.e., les unes à la suite des autres), il s’agit d’une bactérie selon l’invention. Ainsi, une bactérie Clostridium sauvage mise en présence d’un substrat comprenant du glucose, de 1’ arabinose et du xylose, fermente d’abord le glucose, puis l’arabinose puis le xylose. Au contraire, une bactérie selon l’invention est capable de fermenter/ d’assimiler simultanément (i.e. en même temps) au moins deux des trois sucres présents au sein du substrat, à savoir dans l’exemple fourni le glucose et l’arabinose (le xylose étant assimilé dans un second temps). Une autre manière simple de vérifier facilement si la bactérie Clostridium est ou non une bactérie selon l’invention, consiste à mesurer la vitesse de croissance de la bactérie. L’observation chez cette bactérie d’une croissance plus rapide qu’une croissance observable chez une bactérie exprimant une protéine AraR fonctionnelle, ou un mélange des protéines XylR et AraR fonctionnelles, sur un milieu comprenant du xylose en tant qu’unique source de carbone, sera considérée comme un indice d’obtention de la bactérie à l’aide d’un procédé selon l’invention (comprenant la délétion ou l’inactivation des gènes xylR et araR de manière à empêcher ou diminuer l’expression de protéines XylR et AraR fonctionnelles). Concrètement, l’homme du métier considère qu’une bactérie Clostridium sauvage présente un taux de croissance maximal compris entre environ 0,10 et environ 0,25 ; préférentiellement d’environ 0,15 ; sur un milieu comprenant du xylose en tant qu’unique source de carbone (Servinsky et aL, 2010). Les inventeurs ont observé qu’une bactérie modifiée selon l’invention présente un taux de croissance maximal compris entre environ 0,45 et environ 0,60 ; préférentiellement supérieur à environ 0,50, sur un tel milieu. Une autre méthode permettant de vérifier si la bactérie Clostridium est ou non une bactérie selon l’invention, consiste à séquencer les loci CA_C1340, CA_C2613 et CA_C3673 et à vérifier s’ils ont, ou n’ont pas, été modifiés par rapport à leur version sauvage, en vue d’empêcher ou de diminuer l’expression de protéines XylR et AraR fonctionnelles.

Une bactérie particulièrement préférée appartient à l’espèce C. acetobutylicum et, comme expliqué ci- dessus, n’exprime pas les produits des gènes de séquences SEQ ID NO : 1 (CA_C2613) ou une séquence homologue à au moins 95%, par exemple à au moins 96%, au moins 97% ou à au moins 98% de celle-ci, de SEQ ID NO : 2 (CA_C3673) ou une séquence homologue à au moins 95%, par exemple à au moins 96%, au moins 97% ou à au moins 98% de celle-ci, et de SEQ ID NO : 3 (CA_C1340) ou une séquence homologue à au moins 95%, par exemple à au moins 96%, au moins 97% ou à au moins 98% de celle-ci, ou exprime des versions non fonctionnelles desdits produits d’expression.

Cette bactérie particulièrement préférée présente les aptitudes techniques décrites ci-dessus, i.e., elle est capable de fermenter/ assimiler aux moins deux sources de carbone différentes de manière simultanée, et elle croît plus vite qu’une bactérie exprimant une protéine AraR fonctionnelle, ou un mélange des protéines XylR et AraR fonctionnelles, sur un milieu comprenant du xylose en tant qu’unique source de carbone.

Une telle souche est caractérisée pour la première fois dans le cadre de la présente demande.

Cette souche a été enregistrée le 13 juin 2022 sous le numéro de dépôt LMG P-32703 auprès de la collection BCCM-LMG. Dans cette souche, les gènes xylR et araR ont été (conjointement) inactivés. La description concerne également toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de celle-ci, typiquement dépourvues des gènes xylR et araR, ou dans lesquels lesdits gènes ont également été inactivés.

Un autre objet de l’invention vise l’utilisation d’une bactérie selon l’invention pour fermenter simultanément deux sources distinctes de carbone, par exemple au moins un hexose et un pentose, ou encore les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose. Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie selon l’invention est par exemple capable de fermenter simultanément du glucose et de l’arabinose, du glucose et du xylose, du glucose et du mannose, du glucose et du galactose, de l’arabinose et du xylose, de l’arabinose et du mannose, de l’arabinose et du galactose, du xylose et du mannose, du xylose et du galactose ou du mannose et du galactose.

Dans un mode de réalisation particulier préféré, la bactérie selon l’invention est apte à fermenter un substrat comprenant au moins deux sucres choisis parmi glucose, arabinose et xylose, par exemple du glucose et de l’arabinose, du glucose et du xylose, ou de l’arabinose et du xylose.

La bactérie modifiée génétiquement selon l’invention peut être avantageusement utilisée pour produire un solvant, par exemple un biocarburant, ou un mélange de solvants, par exemple un mélange de biocarburants, en particulier à l’échelle industrielle. L’invention vise aussi un procédé de fermentation, typiquement un procédé industriel, impliquant F utilisation d’une bactérie selon l’invention.

Grâce à la présente invention, l’utilisation de substrats de seconde génération (« 2G »), notamment de lignocellulose, est désormais grandement facilitée. La présente invention offre une solution bienvenue qui permettra de réduire les tensions entre les secteurs de l’énergie et de l’alimentation.

Une bactérie modifiée génétiquement selon l’invention peut aussi être avantageusement utilisée pour produire un sucre ou une molécule biosourcée à partir d’une biomasse, en particulier une biomasse lignocellulosique, ou à partir d’une culture énergétique dédiée.

Dans le contexte de la présente invention, on entend par « molécule biosourcée » une molécule dont la spécificité est que la matière première utilisée pour sa production est obligatoirement issue de biomasse végétale, préférentiellement de biomasse lignocellulosique, et non pas issue de ressources d’origines fossiles telles que le pétrole, le charbon ou le gaz naturel.

Des exemples non limitatifs de biomasses lignocellulosiques comprennent par exemple les résidus d’exploitation agricole (notamment les déchets de paille, les rafles de maïs, la bagasse de canne à sucre, etc.), mais aussi les résidus d’exploitation forestière, les résidus de scieries (typiquement les copeaux de bois) ou tout autre type de résidus ligneux.

La biomasse cellulosique peut également être le produit d’une culture dédiée particulière telle qu’une culture énergétique, dédiée par exemple à la culture de plantes annuelles (utilisation « plante entière » par exemple du blé ou du maïs). Elle peut autrement être par exemple une culture de plantes pérennes fourragères (par exemple de fétuque, dactyle, ray-grass), une culture d’herbacées (par exemple miscanthus ou « herbe à éléphant », switchgrass ou « panic érigé »), ou une culture arbustive (taillis à courtes ou très courtes rotation par exemple de saule, de peuplier, de châtaignier ou d’eucalyptus).

Une autre biomasse susceptible d’être utilisée dans le cadre de l’invention peut être un substrat IG issus de plantes sucrières (telles que par exemple la canne à sucre ou la betterave à sucre), céréalières (telles que par exemple le maïs ou le blé) et/ou oléagineuses (telles que par exemple le soja, le colza, ou la palme).

L’invention vise par ailleurs un procédé de production d’une bactérie recombinante selon l’invention, comprenant la délétion ou l’inactivation des gènes xylR et araR de manière à empêcher ou diminuer l’expression de protéines XylR et AraR fonctionnelles.

Les procédés de modification connus les plus performants pour obtenir des souches modifiées génétiquement sont basés sur des événements de recombinaison homologue, ceux-ci permettant de modifier le génome de manière précise et stable.

Un procédé de production particulier selon l’invention comprend une étape de transformation de la bactérie par introduction dans ladite bactérie d’un acide nucléique d’intérêt.

Par « acide nucléique », on entend au sens de l’invention, toute molécule d’ADN ou d’ARN naturelle, synthétique, semi-synthétique ou recombinante, éventuellement modifiée chimiquement (i.e. comprenant des bases non naturelles, des nucléotides modifiés comprenant par exemple une liaison modifiée, des bases modifiées et/ou des sucres modifiés), ou optimisée de manière à ce que les codons des transcrits synthétisés à partir des séquences codantes soient les codons les plus fréquemment trouvés chez une bactérie du genre Clostridium en vue de son utilisation chez celle-ci. Dans le cas du genre Clostridium, les codons optimisés sont typiquement des codons riches en bases adénines (« A ») et thymines (« T »).

Dans les séquences peptidiques décrites dans ce document, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre selon la nomenclature suivante : C : cystéine; D : acide aspartique; E : acide glutamique; F : phénylalanine; G : glycine; H : histidine; I : isoleucine; K : lysine; L : leucine ; M : méthionine ; N : asparagine ; P : proline ; Q : glutamine ; R : arginine ; S : sérine ; T : thréonine ; V : valine ; W : tryptophane et Y : tyrosine.

Dans un mode de réalisation particulier décrit, l’acide nucléique d’intérêt comprend au moins deux régions complémentaires chacune d’une séquence cible, identiques à 100% ou identiques à 80% au moins, de préférence à 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% au moins à ladite région/portion/séquence d’ADN ciblée au sein du génome bactérien. Ces régions sont capables de s’hybrider à tout ou partie de la séquence complémentaire de ladite région/portion/séquence, typiquement à une séquence telle que décrite ci-dessus comprenant au moins 1 nucléotide, de préférence au moins 100 nucléotides, typiquement entre 100 et 1000 nucléotides. Les régions complémentaires de la séquence cible présentes au sein de l’acide nucléique d’intérêt peuvent reconnaître, de préférence cibler, les régions flanquantes en 5’ et en 3’ de la séquence ciblée dans un outil de modification génétique connu de l’homme du métier, typiquement tout outil basé sur la recombinaison homologue.

Dans un mode de réalisation particulier préféré, une partie de l’acide nucléique d’intérêt reconnaît en outre (lie au moins en partie), et de préférence cible, i.e. reconnaît et permet la coupure, dans le génome d’une bactérie Clostridium d’intérêt, d’au moins un brin i) d’une séquence cible, ii) d’une séquence contrôlant la transcription d’une séquence cible, ou iii) d’une séquence flanquant une séquence cible. La séquence reconnue est également identifiée dans le présent texte en tant que « séquence cible » ou « séquence ciblée ».

Dans ce même mode de réalisation particulier préféré, l’acide nucléique d’intérêt comprend au moins une région complémentaire de la séquence cible identique à 100% ou identique à 80% au moins, de préférence à 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% au moins à la région/portion/séquence d’ADN ciblée au sein du génome bactérien et est capable de s’hybrider à tout ou partie de la séquence complémentaire de ladite région/portion/séquence, typiquement à une séquence comprenant au moins 5 nucléotides, de préférence au moins 5, 10, 14, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 nucléotides, typiquement entre 15 et 30 nucléotides, de préférence à une séquence comprenant 18 ,19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucléotides.

Le ou les acides nucléiques d’intérêt tels que décrits dans le cadre de la présente l’invention sont capables de supprimer la ou lesdites séquences cibles du génome de la bactérie ou de modifier leur expression, par exemple de les moduler/ réguler, en particulier de les inhiber, de préférence de les modifier de manière à rendre ladite bactérie incapable d’exprimer une ou plusieurs protéines, en particulier une ou plusieurs protéines fonctionnelles, à partir de ladite ou desdites séquences.

Les « acides nucléiques d’intérêt », typiquement les cassettes ou vecteurs d’expression, peuvent être construits par des techniques classiques bien connues de l’homme du métier et peuvent comporter un ou plusieurs promoteurs, origines de réplication bactérienne (séquences ORI), séquences de terminaison, gènes de sélection, par exemple gènes de résistance à un antibiotique, et séquences (« régions flanquées ») permettant l’insertion ciblée de la cassette ou du vecteur. Des séquences ORI d’intérêt peuvent par exemple être choisies parmi pIP404, pAMpi, repH (origine de réplication chez C. acetobutylicum), ColEl ou rep (origine de réplication chez E. colï), ou toute autre origine de réplication permettant le maintien du vecteur, typiquement du plasmide, au sein d’une cellule bactérienne appartenant au genre Clostridium. Des séquences de terminaison d’intérêt peuvent être choisies par exemple parmi celles des gènes adc, thl, de l’opéron bcs, ou de tout autre terminateur, bien connu de l’homme de l’art, permettant l’arrêt de la transcription au sein d’une cellule bactérienne appartenant au genre Clostridium. Des gènes de sélection (gènes de résistance) d’intérêt peuvent être choisis parmi ermB, catP, bla, tetA, tetM, et/ou tout autre gène de résistance à l’ampicilline, à l’érythromycine, au chloramphenicol, au thiamphénicol, à la spectinomycine, à la tétracycline, ou à tout autre antibiotique, bien connu de l’homme de l’art, pouvant être utilisé pour sélectionner des bactéries du genre Clostridium.

L’acide nucléique d’intérêt peut être un ARN naturel, synthétique ou produit par une technique de recombinaison. Cet acide nucléique d’intérêt peut être préparé par toute méthode connue de l’homme du métier telles que, par exemple, la synthèse chimique, la transcription in vivo ou des techniques d’amplification. Lorsque le ou les acides nucléiques d’intérêt sont introduits dans la cellule directement sous la forme de molécules d’ARN (matures ou précurseurs), par exemple d’ARN guide (ARNg), ces molécules peuvent contenir des nucléotides modifiés ou des modifications chimiques leur permettant, par exemple, d’augmenter leur résistance aux nucléases et d’augmenter ainsi leur durée de vie dans la cellule. Ils peuvent notamment comprendre au moins un nucléotide modifié ou non naturel tel que, par exemple, un nucléotide comportant une base modifiée, telle que l’inosine, la méthyl-5-désoxy cytidine, la diméthylarnino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l’hybridation.

Les acides nucléiques d’intérêt utilisés selon l’invention peuvent également être modifiés au niveau de la liaison internucléotidique comme le sont par exemple les phosphorothioates, les H-phosphonates ou les alkyl-phosphonates, ou au niveau du squelette comme le sont par exemple les alpha-oligonucléotides, les 2’-O-alkyl riboses ou les PNA (Peptide Nucleic Acids) (Egholm et al., 1992).

Dans le contexte de la présente description, un exemple particulier d’acide nucléique d’intérêt, utilisé pour transformer et/ou modifier génétiquement une bactérie d’intérêt, est un fragment d’ADN i) reconnaissant une séquence codant, ii) contrôlant la transcription d’une séquence codant, ou iii) flanquant une séquence codant, le répresseur XylR ou le répresseur AraR. Dans un mode de réalisation préféré, l’acide nucléique d’intérêt est sélectionné parmi le plasmide pGRNA- ACA_C1340 de séquence SEQ ID NO : 28, le plasmide pGRNA-ACA_C2613 de séquence SEQ ID NO :

29 ou le plasmide pGRNA-ACA_C3673 de séquence SEQ ID NO : 30.

Un acide nucléique d’intérêt particulier décrit par les inventeurs est par exemple un vecteur, de préférence un plasmide, par exemple le plasmide pGRNA-ACA_C1340 de séquence SEQ ID NO : 28, le plasmide pGRNA-ACA_C2613 de séquence SEQ ID NO : 29 ou le plasmide pGRNA-ACA_C3673 de séquence SEQ ID NO : 30, décrits dans la partie expérimentale de la présente description.

La ou l’une des séquences reconnues (séquence(s) cible(s)) est de préférence l’une des séquences SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3 correspondant aux gènes xylR et araR codant respectivement une protéine XylR et la protéine AraR, ou une séquence d’acides aminés identique à au moins 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% à ladite protéine, ou une séquence comprenant tout ou au moins 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3. Autrement formulé, la séquence reconnue peut être une séquence comprenant au moins 1 nucléotide, de préférence au moins 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 nucléotides, typiquement entre 1 et 40 nucléotides, de préférence une séquence comprenant 14, 15, 16, 17, 18 ,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucléotides de la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3.

Selon un autre exemple particulier, la séquence cible peut aussi être une séquence contrôlant la transcription d’une séquence codante telle que décrite précédemment, typiquement une séquence promotrice, par exemple la séquence promotrice (SEQ ID NO : 10) du gène « XylA » (CA_C2610, SEQ ID NO : 4), ou celle (SEQ ID NO : 11) du gène « XylB » (CA_C2612, SEQ ID NO : 5). L’acide nucléique d’intérêt reconnaît alors, et est donc typiquement capable de se lier à une séquence contrôlant la transcription d’une séquence codante telle que décrite précédemment.

Selon un autre exemple particulier, la séquence cible peut être une séquence flanquant une séquence codante telle que décrite précédemment, par exemple une séquence flanquant la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3, ou une séquence identique à au moins 70% à celle-ci. Une telle séquence flanquante comprend typiquement 1, 10 ou 20 et 1000 nucléotides, par exemple entre 1, 10 ou 20 et 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 ou 200 nucléotides, entre 1, 10 ou 20 et 100 nucléotides, entre 1, 10 ou 20 et 50 nucléotides, ou entre 1, 10 ou 20 et 40 nucléotides, par exemple entre 10 et 40 nucléotides, entre 10 et

30 nucléotides, entre 10 et 20 nucléotides, entre 20 et 30 nucléotides, entre 15 et 40 nucléotides, entre 15 et 30 nucléotides ou entre 15 et 20 nucléotides.

Selon un aspect particulier, la séquence cible correspond à la paire de séquences flanquant une telle séquence codante, chaque séquence flanquante comprenant typiquement au moins 20 nucléotides, typiquement entre 100 et 1000 nucléotides, de préférence entre 200 et 800 nucléotides.

De préférence, le procédé selon l’invention de production d’une bactérie recombinante comprend la transformation de la cellule bactérienne à l’aide d’au moins un acide nucléique d’intérêt, par exemple deux ou trois acides nucléiques d’intérêt tels que décrits précédemment, le ou lesdits acides nucléiques d’intérêt étant capables i) de reconnaître (et capable de lier au moins en partie) une séquence codant, contrôlant la transcription d’une séquence codant, ou flanquant une séquence codant, le répresseur XylR, et ii) de reconnaître (et capable de lier au moins en partie) une séquence codant, contrôlant la transcription d’une séquence codant, ou flanquant une séquence codant, le répresseur AraR.

Comme expliqué plus haut, la séquence codant, contrôlant la transcription d’une séquence codant, ou flanquant une séquence codant, le répresseur XylR ou le répresseur AraR est également identifié dans le présent texte en tant que « séquence cible » ou « séquence ciblée ».

L’acide nucléique d’intérêt tel que décrit dans le cadre de la présente invention est de préférence capable de supprimer ladite séquence cible du génome de la bactérie ou de modifier son expression, par exemple de la moduler/ réguler, en particulier de l’inhiber, de préférence de la modifier de manière à rendre ladite bactérie incapable d’exprimer une protéine (typiquement une protéine AraR ou XylR), en particulier une protéine fonctionnelle, à partir de ladite séquence. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l’acide nucléique d’intérêt est capable de modifier la bactérie de manière à la rendre incapable d’exprimer l’une et/ou l’autre des protéines AraR et XylR.

L’introduction dans la bactérie de tout acide nucléique d’intérêt peut être réalisée par toute méthode, directe ou indirecte, connue de l’homme du métier, par exemple par transformation, conjugaison, microinjection, transfection, électroporation, etc., de préférence par électroporation (Mermelstein et al, 1993).

Par ailleurs, ces acides nucléiques d’intérêt (par exemple les fragments d’ADN, fragments d’ ARN, cassettes d’expression ou vecteurs d’expression) peuvent être intégrés au sein du génome bactérien par des techniques elles-aussi bien connues de l’homme du métier.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie telle que décrite dans le présent texte, comprend une étape de transformation de la bactérie par introduction dans ladite bactérie d’un acide nucléique d’intérêt selon l’invention tel que décrit plus haut et fait intervenir un outil de modification génétique par exemple un outil de modification génétique sélectionné parmi un outil CRISPR, un outil de mutagénèse insertionnelle, par exemple basé sur l’utilisation d’introns de type II (par exemple l’outil Targetron® ou l’outil ClosTron®) etun outil d’échange allélique (par exemple l’outil ACE®).

Le procédé pour transformer, et de préférence en outre modifier génétiquement, une bactérie Clostridium peut comprendre en outre une étape d’obtention, de récupération, de sélection ou d’isolement de la bactérie transformée, i.e. de la bactérie présentant la ou les recombinaisons/modifications/optimisations recherchées.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l’invention est basé sur l’utilisation de (met en œuvre) la technologie / l’outil génétique CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromie Repeats), en particulier l’outil génétique CRISPR/Cas (CRISPR-associated protein). La présente invention peut être mise en œuvre à l’aide d’un outil génétique CRISPR/Cas classique utilisant un unique plasmide comprenant une nucléase, un ARNg et une matrice de réparation tel que décrit par Wang et al. (2015). L’homme du métier peut aisément définir la séquence et la structure des ARNg selon la région chromosomique ou l’élément génétique mobile à cibler en utilisant des techniques bien connues (voir par exemple l’article de DiCarlo et al., 2013). Les inventeurs ont autrement mis au point et décrit un outil génétique de modification de bactéries, adapté aux bactéries du genre Clostridium, utilisable dans le contexte de la présente invention, basé sur l’utilisation de deux plasmides (cf. WO2017/064439, Wasels et al., 2017).

Dans un autre mode de réalisation, le procédé selon l’invention est basé sur l’utilisation d’outil de mutagénèse insertionnelle, par exemple l’utilisation d’introns de type II, et met par exemple en œuvre la technologie / l’outil génétique ClosTron® ou l’outil génétique Targetron®.

La technologie Targetron® repose sur rutilisation d’un intron de groupe II (basé sur l’intron Ll.ltrB de Lactococcus lactis) reprogrammable, capable d’intégrer le génome bactérien rapidement à un locus désiré (Chen et al., 2005, Wang et al., 2013), typiquement dans le but d’inactiver un gène ciblé. Les mécanismes de reconnaissance de la zone éditée ainsi que d’insertion dans le génome par rétro-épissage sont basés sur une homologie entre l’intron et ladite zone d’une part, et sur l’activité d’une protéine (ItrA) d’autre part. La technologie ClosTron® repose sur une approche similaire, complétée par l’ajout d’un marqueur de sélection dans la séquence de l’intron (Heap et al., 2007). Ce marqueur permet de sélectionner l’intégration de l’intron dans le génome, et facilite donc l’obtention des mutants désirés. Ce système génétique exploite également les introns de type I. En effet, le marqueur de sélection (appelé RAM pour retrotransposition- activated marker) est interrompu par un tel élément génétique, qui empêche son expression depuis le plasmide (une description plus précise du système : Zhong et al.). L’épissage de cet élément génétique se produit avant intégration dans le génome, ce qui permet l’obtention d’un chromosome présentant une forme active du gène de résistance. Une version optimisée du système comprend des sites FLP/FRT en amont et en aval de ce gène, ce qui permet d’utiliser la recombinase FRT pour éliminer le gène de résistance (Heap et al., 2010).

Dans un autre mode de réalisation, le procédé selon l’invention est basé sur l’utilisation d’un outil d’échange allélique, et met par exemple en œuvre la technologie / l’outil génétique ACE®.

Fa technologie ACE® repose sur l’utilisation d’un mutant auxotrophe (pour l’uracile chez C. acetobutylicum ATCC 824 par délétion du gène pyrE, qui provoque également une résistance à l’acide 5- fluoroorotique (A-5-FO) ; Heap et al., 2012). Ee système utilise le mécanisme d’échange allélique, bien connu de l’homme de métier. Suite à une transformation avec un vecteur pseudo-suicide (à très faibles copies), l’intégration de ce dernier dans le chromosome bactérien par un premier évènement d’échange allélique peut être vérifiée grâce au gène de résistance présent initialement sur le plasmide. E’étape d’intégration peut être réalisée de deux manières différentes, soit au sein du locus pyrE soit au sein d’un autre locus. Dans le cas de l’intégration au locus pyrE, le gène pyrE est également placé sur le plasmide, sans toutefois être exprimé (pas de promoteur fonctionnel). La deuxième recombinaison restaure un gène pyrE fonctionnel et peut alors être sélectionnée par auxotrophie (milieu minimum, ne contenant pas d’uracile). Le gène pyrE non-fonctionnel présentant également un caractère sélectionnable (sensibilité au A-5-FO), d’autres intégrations sont ensuite envisageables sur le même modèle, en alternant successivement l’état de pyrE entre fonctionnel et non-fonctionnel. Dans le cas de l’intégration à un autre locus, une zone génomique permettant une expression du marqueur de contre-sélection après recombinaison est ciblée (typiquement, en opéron après un autre gène, de préférence un gène fortement exprimé). Cette deuxième recombinaison est alors sélectionnée par auxotrophie (milieu minimum ne contenant pas d’uracile).

Dans les modes de réalisation décrits basés sur rutilisation d’introns de type II, et mettant par exemple en œuvre la technologie / l’outil génétique ClosTron® ou l’outil génétique Targetron®, ou basés sur l’utilisation d’un outil d’échange allélique, et mettant par exemple en œuvre la technologie / l’outil génétique ACE®, la séquence ciblée est typiquement l’une des séquences décrites dans le présent texte.

L’invention concerne par ailleurs un kit (trousse) pour transformer et/ou modifier génétiquement une bactérie du genre Clostridium comprenant au moins un acide nucléique d’intérêt tel que décrit dans le présent texte (par exemple deux acides nucléiques d’intérêt, typiquement fragment d’ADN, reconnaissant chacun une séquence cible) pour transformer et de préférence modifier génétiquement une bactérie du genre Clostridium, et éventuellement une ou plusieurs molécules de sélection. Un kit particulier comprend les éléments essentiels au fonctionnement d’un outil CRISPR (typiquement au moins un acide nucléique utilisable en tant qu’ARNg, un acide nucléique utilisable en tant que matrice de réparation, au moins une paire d’amorces, et un inducteur permettant l’expression d’une nucléase de type Cas9 ou MAD7), les éléments essentiels au fonctionnement d’un outil basé sur l’utilisation d’ introns de type II (typiquement au moins un intron de type II, au moins une paire d’amorces et un inducteur permettant l’expression d’un rétrotranscriptase, par exemple type LtrA RT ou Tel4c RT), ou les éléments essentiels au fonctionnement d’un outil d’échange allélique (typiquement au moins deux acides nucléiques utilisables en tant que matrice de recombinaison homologue, et au moins un couple d’amorces).

Les kits selon l’invention peuvent en outre comprendre un ou plusieurs consommables tels qu’un milieu de culture, au moins une bactérie compétente du genre Clostridium (i.e. conditionnée en vue de la transformation), ou encore une notice explicative.

L’invention concerne typiquement un kit pour la mise en œuvre d’un procédé de transformation et/ou de modification génétique décrit dans le présent texte à l’aide d’une bactérie du genre Clostridium.

L’invention vise en particulier la bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium ayant pour caractéristique essentielle de ne pas exprimer les produits des gènes xylR et araR, ou d’exprimer des versions non fonctionnelles de ceux-ci, ainsi que toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de celle-ci, et leurs utilisations. La demande décrit aussi la souche IFP 967, enregistrée le 13 juin 2022 sous le numéro de dépôt LMG P- 32702 auprès de la collection BCCM-LMG, dans laquelle, le gène araR a été inactivé, ainsi que toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de celle-ci, typiquement dépourvues des gènes xylR et araR, ou dans lesquels lesdits gènes ont également été inactivés.

Elle vise en particulier l’utilisation d’une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas le produit du gène xylR ou araR, ou exprime une version non fonctionnelle du gène xylR ou araR, par exemple la souche IFP 967, enregistrée le 13 juin 2022 sous le numéro de dépôt LMG P-32702 auprès de la collection BCCM-LMG, pour préparer une bactérie modifiée génétiquement selon l’invention n’exprimant pas les produits des gènes xylR et araR, ou exprimant des versions non fonctionnelles de ceux-ci.

L’invention concerne par ailleurs un kit pour produire un solvant, un sucre ou une molécule biosourcée à l’aide d’une bactérie appartenant au genre Clostridium, comprenant i) une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium selon l’invention, par exemple IPF968, et ii) un milieu, typiquement un milieu de conservation ou un milieu de culture de ladite bactérie. Le kit peut en outre comprendre une notice explicative.

Le milieu de conservation ou de culture de la bactérie modifiée génétiquement (appartenant au genre Clostridium) selon l’invention présent au sein du kit est de préférence supplémenté en une source de carbone composée de glucose et d’au moins un pentose, de préférence i) de glucose et ii) d’ arabinose et/ou de xylose. Ce milieu comprend de préférence entre 0,1 et 250 g/L, plus préférentiellement entre 1 et 100 g/L, de ladite source de carbone (composée de glucose et d’au moins un pentose).

Le milieu de conservation ou de culture de la bactérie modifiée génétiquement est de préférence un milieu de culture de type RCM, plus préférentiellement un milieu de culture de type GAPES, encore plus préférentiellement un milieu de culture de type CGM.

L’invention concerne aussi un kit particulier pour produire un solvant ou un biocarburant, ou un mélange de solvants ou de biocarburants, à l’aide d’une bactérie appartenant au genre Clostridium, ledit kit comprenant i) une bactérie (appartenant au genre Clostridium) modifiée génétiquement selon l’invention, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas les produits des gènes xylR et araR, ou exprime des versions non fonctionnelles de ceux-ci, et ii) un milieu de culture riche, préférentiellement un milieu de culture de type RCM, plus préférentiellement un milieu de culture de type GAPES, encore plus préférentiellement un milieu de culture de type CGM, contenant au moins du glucose et un pentose, préférentiellement de F arabinose et/ou du xylose.

L’invention concerne par ailleurs les utilisations possibles du procédé ou du kit selon l’invention pour transformer et/ou modifier génétiquement une bactérie du genre Clostridium, typiquement une bactérie solvantogène du genre Clostridium, par exemple pour générer des variants améliorés de ladite bactérie. Elle concerne enfin les utilisations possibles du procédé, du kit ou d’une bactérie du genre Clostridium transformée et de préférence modifiée génétiquement selon l’invention, en particulier pour permettre la production de solvants ou biocarburants, ou de mélanges de ceux-ci, typiquement à l’échelle industrielle.

Les exemples et figures ci-après ont pour but d’illustrer plus pleinement l’invention sans pour autant en limiter la portée. En particulier, ces exemples présentent l’obtention et la caractérisation de bactéries selon l’invention, dans lesquels l’inactivation de gènes araR et/ou xylR est réalisée selon un mode de réalisation particulier préféré à l’aide d’un outil CRISPR-Cas9. Lesdits gènes peuvent être inactivés selon d’autres modes de réalisation particuliers, bien connus de l’homme de métier, basés par exemple sur l’inactivation de gène par recombinaison homologue ou par mutagénèse insertionnelle, comme expliqué ci-dessus.

FIGURES

[Fig 1] La Figure 1 représente la Carte du plasmide pBANak

[Fig 2] La Figure 2 représente la Carte du plasmide pGRNA_ACA_C1340

[Fig 3] La Figure 3 représente la Carte du plasmide pGRNA_ACA_C2613

[Fig 4] La Figure 4 représente la Carte du plasmide pGRNA_ACA_C3673

[Fig 5] La Figure 5 montre la Cinétique de croissance sur milieu CGM xylose 30 mM

[Fig 6 A] La Figure 6 A représente la cinétique de consommation d’un mélange de glucose, arabinose et xylose chez la souche C. acetobutylicum DSM 792 sauvage, sur un milieu CGM contenant 25 mM de glucose, 25 mM d’ arabinose et 70 mM xylose

[Fig 6B] La Figure 6B représente la cinétique de consommation d’un mélange de glucose, arabinose et xylose chez la souche C. acetobutylicum DSM 792 ACA_C2613 ACA_C3673, sur un milieu CGM contenant 25 mM de glucose, 25 mM d’ arabinose et 70 mM xylose

[Fig 6C] La Figure 6C représente la cinétique de consommation d’un mélange de glucose, arabinose et xylose chez la souche C. acetobutylicum DSM 792 ACA_C1340, sur un milieu CGM contenant 25 mM de glucose, 25 mM d’ arabinose et 70 mM xylose

[Fig 6D] La Figure 6D représente la cinétique de consommation d’un mélange de glucose, arabinose et xylose chez la souche C. acetobutylicum DSM 792 ACA_C1340 ACA_C2613 ACA_C3673, sur un milieu CGM contenant 25 mM de glucose, 25 mM d’ arabinose et 70 mM xylose EXEMPLES

EXEMPLE n°l : Souche C. ACA C2613 ACA C3673

Matériels et méthodes

Conditions de culture

C. acetobutylicum DSM 792 a été cultivée en milieu 2YTG (Tryptone 16 g L ¹ , extrait de levure 10 g L ¹ , glucose 5 g L ¹ , NaCl 4 g L ¹ ) et CGM (KH ₂ PO ₄ , 0,75 g; K ₂ HPO ₄ , 0,75 g; MgSO ₄ -7H ₂ O, 0,40 g; MnSO ₄ H ₂ O, 0,01 g; FeSO ₄ -7 H ₂ O, 0,01 g; NaCl, 1,0 g; asparagine, 2,0 g; extrait de levure, 5,0 g; (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 2,0 g ; source de carbone comme précisé). Escherichia coli NEB 10-beta a été cultivée en milieu LB (Tryptone 10 g L ¹ , extrait de levure 5 g L ¹ , NaCl 10 g L ¹ ). Les milieux solides ont été réalisés en ajoutant 15 g L ¹ d’ agarose aux milieux liquides. De l’érythromycine (à des concentrations de 40 mg.L ¹ en milieu 2YTG), du chloramphénicol (25 ou 12,5 mg L ¹ respectivement en milieu LB solide ou liquide), du thiamphénicol (15 mg L ¹ en milieu 2YTG) ont été utilisés si nécessaire.

Acides nucléiques et vecteurs plasmidiques

La liste des amorces ayant servies à l’ensemble des constructions (nom/séquence d’ADN) est détaillée ci- dessous :

C A_C2613_LH A_Fwd : A A A A A AG A ATTC ATTTGTCC ACTTAT ACC A ATTCCT (SEQ ID NO : 31 )

CA_C2613_LHA_Rev : TCCTACTAGATACGGCGGAGTAAAATTAGT (SEQ ID NO : 32)

CA_C2613_RHA_Fwd : CTCCGCCGTATCTAGTAGGAATCTCCCACT (SEQ ID NO : 33)

CA_C2613_RHA_Rev : AAAAAAGTCGACAAAGAGAAAATAAGAGGAATACAAAAG (SEQ ID NO : 34) gRNA_CA_C2613_Fwd : TCATGTTACACTTGGAACAGGCGT (SEQ ID NO : 35) gRNA_CA_C2613_Rev : AAACACGCCTGTTCCAAGTGTAAC (SEQ ID NO : 36)

CA_C3673_LHA_Fwd : AAAAAAGGATCCAGAAAGACTTGTTACATCTCTAAGT (SEQ ID NO : 37)

CA_C3673_LHA_Rev : TGATATAGACTTAATTGAACAAGATGTAATTTGAAATTAGT (SEQ ID NO : 38)

CA_C3673_RHA_Fwd : GTTCAATTAAGTCTATATCAAACATATCGCACCAACC (SEQ ID NO : 39)

CA_C3673_RHA_Rev : AAAAAAGTCGACATGATAATGGGAAATATATAGGAACTTT (SEQ ID NO : 40) gRNA_CA_C3673_Fwd : TCATGGAGTAGCAAGCTCTACAGG (SEQ ID NO : 41) gRNA_CA_C3673_Rev : AAACCCTGTAGAGCTTGCTACTCC (SEQ ID NO : 42) CA_C2613_verif_Fwd : TCGGC AGO AAAAACTCC AGT (SEQ ID NO : 43) CA_C2613_verif_Rev : GCAATTGCTGGCGGAATGAA (SEQ ID NO : 44) CA_C3673_verif Fwd : TACTTCATACATATCTAACGCACTCT (SEQ ID NO : 45) CA_C3673_verif Rev : AAATAACTTCTACTATGAGACAAGCA (SEQ ID NO : 46) Les vecteurs plasmidiques suivants ont été construits :

- Plasmide N°1 : pBANak (SEQ ID NO : 47)

Il contient l’origine de réplication pl5A, ainsi que les gènes ampR et kanR, permettant respectivement de conférer les résistances à l’ampicilline et la kanamycine. Il contient également une cassette d’expression de la phi 3T I methyltransferase de Bacillus subtilis, nécessaire à la méthylation des vecteurs d’édition génétique avant transformation dans C. acetobutylicum.

- Plasmide N°2 : pGRNA_ACA_C2613 (SEQ ID NO : 29)

Il contient tous les éléments du pGRNAhd avec une substitution de F ARN guide permettant de cibler CA_C2613 (Oligo-20-mer obtenu par hybridation des primers gRNA_CA_C2613_Fwd (SEQ ID NO : 35) et gRNA_CA_C2613_Rev (SEQ ID NO : 36) et intégré au plasmide par la technique du « golden gate assembly », après digestion par BsaL II contient également une matrice d’édition permettant l’inactivation de CA_C2613. Cette matrice d’édition a été construite par clonage des fragments LHA et RHA obtenus respectivement par amplification avec les couples de primers CA_C2613_LHA_Fwd (SEQ ID NO : 31)/ CA_C2613_LHA_Rev (SEQ ID NO : 32) et CA_C2613_RHA_Fwd (SEQ ID NO : 33) / CA_C2613_RHA_Rev (SEQ ID NO : 34) à partir de l’ADNg de C. acetobutylicum DSM 792. La matrice d’édition a été clonée entre les sites de restriction BamHI et Sali.

- Plasmide N°3 : pGRNA_ACA_C3673 (SEQ ID NO : 30)

Il contient tous les éléments du pGRNAhd avec une substitution de F ARN guide permettant de cibler CA_C3673 (Oligo-20-mer obtenu par hybridation des primers gRNA_CA_C3673_Fwd (SEQ ID NO : 41) et gRNA_CA_C3673_Rev (SEQ ID NO : 42) et intégré au plasmide par la technique du golden gate assembly, après digestion par Bsal. Il contient également une matrice d’édition permettant l’inactivation de CA_C3673. Cette matrice d’édition a été construite par clonage des fragments LHA et RHA obtenus respectivement par amplification avec les couples de primers CA_C3673_LHA_Fwd (SEQ ID NO : 37) / CA_C3673_LHA_Rev (SEQ ID NO : 38) et CA_C3673_RHA_Fwd (SEQ ID NO : 39) / CA_C3673_RHA_Rev (SEQ ID NO : 40) à partir de l’ADNg de C. acetobutylicum DSM 792. La matrice d’édition a été clonée entre les sites de restriction BamHI et Sali.

Transformation des souches de C. acetobutylicum

Les plasmides préparés dans la souche NEB 10-beta ont été méthylés par transformation dans une souche NEB 10-beta contenant également le plasmide pBANak. Les plasmides méthylés ainsi extraits seront ensuite utilisés pour transformer la souche C. acetobutylicum. La transformation est réalisée selon le protocole décrit par Wasels et al. 2020.

Edition génétique des gènes CA_C2613 (SEQ ID NO : 1) et CA_C3673 (SEQ ID NO : 2) Les inactivations des gènes CA_C2613 et CA_C3673 dans les souches ACA_C2613-ACA_C3673, ont été réalisées par édition génétique selon le protocole décrit par Wasels et al. 2020, utilisant respectivement les couples d’amorces CA_C2613_verif_Fwd (SEQ ID NO : 43) / CA_C2613_verif_Rev (SEQ ID NO : 44) ; CA_C3673_verif_Fwd (SEQ ID NO : 45) / CA_C3673_verif_Rev (SEQ ID NO : 46) lors de la validation de l’édition. L’emploi d’autres outils génétiques, telle que ceux basés sur la recombinaison homologue ou l’insertion d’éléments génétiques mobiles, peut permettre d’obtenir des mutants possédant des génotypes équivalents, i.e. n’exprimant plus les produits des gènes CA_C2613 et CA_C3673, ou exprimant une version non fonctionnelle de ceux-ci.

Résultats

Cinétique de croissance et détermination du temps de génération

Des suivis de croissance des souches de C. acetobutylicum DSM 792 sauvage et ACA_C2613 ACA_C3673 ont été réalisés en quintuplicat sur du milieu CGM contenant 30 mM de xylose (Figure 5).

Les résultats révèlent une amélioration du temps de génération lors de croissance sur xylose comme source de carbone. En outre, l’inactivation conjointe des gènes CA_C2613 et CA_C3673 permet une amélioration de 33 % du temps de génération par rapport à la souche sauvage.

Suivi de consommation d’un mélange de sucres

Des suivis de consommation d’un mélange de sucre ont été réalisés en triplicats techniques avec les souches C. acetobutylicum DSM 792 sauvage et ACA_C2613 ACA_C3673, sur un milieu CGM contenant 25 mM de glucose, 25 mM d’ arabinose et 70 mM de xylose (Figure 6).

Les résultats indiquent que l’inactivation conjointe de CA_C2613 et CA_C3673 ne présente pas de modification phénotypique significative par rapport à la souche sauvage.

Exemple n°2 : souche IFP 967 (LMG P-32702), C. acetobutylicum ACA C1340

Matériels et méthodes

Conditions de culture

C. acetobutylicum DSM 792 a été cultivée en milieu 2YTG (Tryptone 16 g L ¹ , extrait de levure 10 g L ¹ , glucose 5 g L ¹ , NaCl 4 g L ¹ ) et CGM (KH ₂ PO ₄ , 0,75 g; K ₂ HPO ₄ , 0,75 g; MgSO ₄ -7H ₂ O, 0,40 g; MnSO ₄ H ₂ O, 0,01 g; FeSO ₄ -7 H ₂ O, 0,01 g; NaCl, 1,0 g; asparagine, 2,0 g; extrait de levure, 5,0 g; (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 2,0 g ; source de carbone comme précisé). Escherichia coli NEB 10-beta a été cultivée en milieu LB (Tryptone 10 g L ¹ , extrait de levure 5 g L ¹ , NaCl 10 g L ¹ ). Les milieux solides ont été réalisés en ajoutant 15 g L ¹ d’ agarose aux milieux liquides. De l’érythromycine (à des concentrations de 40 mg.L ¹ en milieu 2YTG), du chloramphénicol (25 ou 12,5 mg L ¹ respectivement en milieu LB solide ou liquide), du thiamphénicol (15 mg L ¹ en milieu 2YTG) ont été utilisés si nécessaire.

Acides nucléiques et vecteurs plasmidiques

La liste des amorces ayant servies à l’ensemble des constructions (nom/séquence d’ADN) est détaillée ci- dessous :

CA_C1340_LHA_Fwd : AAAAAAGGATCCACCAGAAAAACCAACGCCTAGTA (SEQ ID NO : 48) CA_C1340_LHA_Rev : AGAAGTAGAAGAATTAAAATTGAAATAATTTATATTTAGTCCCTTGCC (SEQ ID NO : 49)

CA_C1340_RHA_Fwd : TTTCAATTTTAATTCTTCTACTTCTTCATATTTGTGCT (SEQ ID NO : 50) CA_C1340_RHA_Rev : AAAAAAGTCGACTAATTACTCATTACATACGTTATTTTTCAGT (SEQ ID NO : 51) gRNA_CA_C1340_Fwd : TCATTTTAAGGTCGATGATTCACA (SEQ ID NO : 52) gRNA_CA_C1340_Rev : AAACTGTGAATCATCGACCTTAAA (SEQ ID NO : 53) C A_C 1340_verif_Fwd : CCTACC A AT AGO ATCGCCC A AG A (SEQ ID NO : 54) CA_C 1340_verif_Rev : TTCTAGCATAAAATACTCCTCCCTA (SEQ ID NO : 55)

Les vecteurs plasmidiques suivants ont été construits :

- Plasmide N°1 : pBANak (SEQ ID NO : 47)

Il contient l’origine de réplication pl5A, ainsi que les gènes ampR et kanR, permettant respectivement de conférer les résistances à l’ampicilline et la kanamycine. Il contient également une cassette d’expression de la phi 3T I methyltransferase de Bacillus subtilis, nécessaire à la méthylation des vecteurs d’édition génétique avant transformation dans C. acetobutylicum.

- Plasmide N°4 : pGRNA_ACA_C1340 (SEQ ID NO : 28)

Il contient tous les éléments du pGRNAmd (Wasels et al. 2020) avec une substitution de F ARN guide permettant de cibler CA_C1340 (Oligo-20-mer obtenu par hybridation des amorces gRNA_CA_C1340_Fwd (SEQ ID NO : 52) et gRNA_CA_C1340_Rev (SEQ ID NO : 53) et intégré au plasmide par la technique du « golden gate assembly », après digestion par Bsal. Il contient également une matrice d’édition permettant l’inactivation de CA_C1340. Cette matrice d’édition a été construite par clonage des fragments LHA et RHA obtenus respectivement par amplification avec les couples de primers CA_C1340_LHA_Fwd (SEQ ID NO : 48) / CA_C1340_LHA_Rev (SEQ ID NO : 49) et CA_C1340_RHA_Fwd (SEQ ID NO : 50)/ CA_C1340_RHA_Rev (SEQ ID NO : 51) à partir de l’ADNg de C. acetobutylicum DSM 792. La matrice d’édition a été clonée entre les sites de restriction BamHI et Sali. Transformation des souches de C. acetobutylicum

Les plasmides préparés dans la souche NEB 10-beta ont été méthylés par transformation dans une souche NEB 10-beta contenant également le plasmide pBANak. Les plasmides méthylés ainsi extraits seront ensuite utilisés pour transformer la souche C. acetobutylicum. La transformation est réalisée selon le protocole décrit par Wasels et al. 2020.

Edition génétique du gène CA_C1340 (SEQ ID NO : 3) :

L’inactivation du gène CA_C1340 dans les souches ACA_C1340 a été réalisée par édition génétique selon le protocole décrit par Wasels et al. 2020, utilisant respectivement les couples d’amorces CA_C1340_verif_Fwd (SEQ ID NO : 54) / CA_C1340_verif_Rev (SEQ ID NO : 55) lors de la validation de l’édition. L’emploi d’autres outils génétiques, telle que ceux basés sur la recombinaison homologue ou l’insertion d’éléments génétiques mobiles, peut permettre d’obtenir des mutants possédant des génotypes équivalents, i.e. n’exprimant plus le produit du gène CA_C1340 ou exprimant une version non fonctionnelle de celui-ci.

Résultats

Cinétique de croissance et détermination du temps de génération

Des suivis de croissance des souches de C. acetobutylicum DSM 792 sauvage et ACA_C1340 ont été réalisés en quintuplicat sur du milieu CGM contenant 30 mM de xylose (Figure 5).

Les résultats révèlent une amélioration du temps de génération lors de croissance sur xylose comme source de carbone. En outre, l’inactivation du gène codant le répresseur AraR permet une amélioration de + 152 % du temps de génération par rapport à la souche sauvage.

Suivi de consommation d’un mélange de sucres

Des suivis de consommation d’un mélange de sucre ont été réalisés en triplicats techniques avec les souches C. acetobutylicum DSM 792 sauvage et ACA_C1340 sur un milieu CGM contenant 25 mM de glucose, 25 mM d’ arabinose et 70 mM de xylose (Figure 6).

Les résultats indiquent que l’inactivation de CA_C1340 permet d’obtenir une cinétique de consommation de 1’ arabinose en présence de glucose plus rapide que celle observée chez la souche sauvage. Tl

3 : souche IFP 968 ACA C1340-ACA C2613-

ACA C3673

Matériels et méthodes

Conditions de culture

C. acetobutylicum DSM 792 a été cultivée en milieu 2YTG (Tryptone 16 g L ¹ , extrait de levure 10 g L ¹ , glucose 5 g L ¹ , NaCl 4 g L ¹ ) et CGM (KH ₂ PO ₄ , 0,75 g; K ₂ HPO ₄ , 0,75 g; MgSO ₄ -7H ₂ O, 0,40 g; MnSO ₄ H ₂ O, 0,01 g; FeSO ₄ -7 H ₂ O, 0,01 g; NaCl, 1,0 g; asparagine, 2,0 g; extrait de levure, 5,0 g; (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 2,0 g ; source de carbone comme précisé). Escherichia coli NEB 10-beta a été cultivée en milieu LB (Tryptone 10 g L ¹ , extrait de levure 5 g L ¹ , NaCl 10 g L ¹ ). Les milieux solides ont été réalisés en ajoutant 15 g L ¹ d’ agarose aux milieux liquides. De l’érythromycine (à des concentrations de 40 mg.L ¹ en milieu 2YTG), du chloramphénicol (25 ou 12,5 mg L ¹ respectivement en milieu LB solide ou liquide), du thiamphénicol (15 mg L ¹ en milieu 2YTG) ont été utilisés si nécessaire.

Acides nucléiques et vecteurs plasmidiques

La liste des amorces ayant servies à l’ensemble des constructions (nom/séquence d’ADN) est détaillée ci- dessous :

CA_C1340_LHA_Fwd : AAAAAAGGATCCACCAGAAAAACCAACGCCTAGTA (SEQ ID NO : 48)

CA_C1340_LHA_Rev : AGAAGTAGAAGAATTAAAATTGAAATAATTTATATTTAGTCCCTTGCC (SEQ ID NO : 49)

CA_C1340_RHA_Fwd : TTTCAATTTTAATTCTTCTACTTCTTCATATTTGTGCT (SEQ ID NO : 50)

CA_C1340_RHA_Rev : AAAAAAGTCGACTAATTACTCATTACATACGTTATTTTTCAGT (SEQ ID NO : 51) gRNA_CA_C1340_Fwd : TCATTTTAAGGTCGATGATTCACA (SEQ ID NO : 52) gRNA_CA_C1340_Rev : AAACTGTGAATCATCGACCTTAAA (SEQ ID NO : 53) C A_C 1340_verif_Fwd : CCTACC A AT AGO ATCGCCC A AG A (SEQ ID NO : 54) CA_C 1340_verif_Rev : TTCTAGCATAAAATACTCCTCCCTA (SEQ ID NO : 55)

C A_C2613_LH A_Fwd : A A A A A AG A ATTC ATTTGTCC ACTTAT ACC A ATTCCT (SEQ ID NO : 31 )

CA_C2613_LHA_Rev : TCCTACTAGATACGGCGGAGTAAAATTAGT (SEQ ID NO : 32)

CA_C2613_RHA_Fwd : CTCCGCCGTATCTAGTAGGAATCTCCCACT (SEQ ID NO : 33)

CA_C2613_RHA_Rev : AAAAAAGTCGACAAAGAGAAAATAAGAGGAATACAAAAG (SEQ ID NO : 34) gRNA_CA_C2613_Fwd : TCATGTTACACTTGGAACAGGCGT (SEQ ID NO : 35) gRNA_CA_C2613_Rev : AAACACGCCTGTTCCAAGTGTAAC (SEQ ID NO : 36)

CA_C2613_verif_Fwd : TCGGC AGO AAAAACTCC AGT (SEQ ID NO : 42)

CA_C2613_verif_Rev : GCAATTGCTGGCGGAATGAA (SEQ ID NO : 43)

CA_C3673_LHA_Fwd : AAAAAAGGATCCAGAAAGACTTGTTACATCTCTAAGT (SEQ ID NO : 37) CA_C3673_LHA_Rev : TGATATAGACTTAATTGAACAAGATGTAATTTGAAATTAGT (SEQ ID NO : 38) CA_C3673_RHA_Fwd : GTTCAATTAAGTCTATATCAAACATATCGCACCAACC (SEQ ID NO : 39) CA_C3673_RHA_Rev : AAAAAAGTCGACATGATAATGGGAAATATATAGGAACTTT (SEQ ID NO : 40) gRNA_CA_C3673_Fwd : TCATGGAGTAGCAAGCTCTACAGG (SEQ ID NO : 41) gRNA_CA_C3673_Rev : AAACCCTGTAGAGCTTGCTACTCC (SEQ ID NO : 42) CA_C3673_verif Fwd : TACTTCATACATATCTAACGCACTCT (SEQ ID NO : 44) CA_C3673_verif Rev : AAATAACTTCTACTATGAGACAAGCA (SEQ ID NO : 45)

Les vecteurs plasmidiques suivants ont été construits :

- Plasmide N°1 : pBANak (SEQ ID NO : 52)

Il contient l’origine de réplication pl5A, ainsi que les gènes ampR et kanR, permettant respectivement de conférer les résistances à l’ampicilline et la kanamycine. Il contient également une cassette d’expression de la phi 3T I methyltransferase de Bacillus subtilis, nécessaire à la méthylation des vecteurs d’édition génétique avant transformation dans C. acetobutylicum.

- Plasmide N°4 : pGRNA_ACA_C1340 (SEQ ID NO : 28)

Il contient tous les éléments du pGRNAhd (Wasels et al. 2020) avec une substitution de l’ARN guide permettant de cibler CA_C1340 (Oligo-20-mer obtenu par hybridation des amorces gRNA_CA_C1340_Fwd (SEQ ID NO : 52) et gRNA_CA_C1340_Rev (SEQ ID NO : 53) et intégré au plasmide par la technique du « golden gate assembly », après digestion par Bsal. Il contient également une matrice d’édition permettant l’inactivation de CA_C1340. Cette matrice d’édition a été construite par clonage des fragments LHA et RHA obtenus respectivement par amplification avec les couples de primers CA_C1340_LHA_Fwd (SEQ ID NO : 48) / CA_C1340_LHA_Rev (SEQ ID NO : 49) et CA_C1340_RHA_Fwd (SEQ ID NO : 50)/ CA_C1340_RHA_Rev (SEQ ID NO : 51) à partir de l’ADNg de C. acetobutylicum DSM 792. La matrice d’édition a été clonée entre les sites de restriction BamHI et Sali.

- Plasmide N°2 : pGRNA_ACA_C2613 (SEQ ID NO : 29)

Il contient tous les éléments du pGRNAhd avec une substitution de l’ARN guide permettant de cibler CA_C2613 (Oligo-20-mer obtenu par hybridation des primers gRNA_CA_C2613_Fwd (SEQ ID NO : 35) et gRNA_CA_C2613_Rev (SEQ ID NO : 36) et intégré au plasmide par la technique du « golden gate assembly », après digestion par Bsal. Il contient également une matrice d’édition permettant l’inactivation de CA_C2613. Cette matrice d’édition a été construite par clonage des fragments LHA et RHA obtenus respectivement par amplification avec les couples de primers CA_C2613_LHA_Fwd (SEQ ID NO : 31)/ CA_C2613_LHA_Rev (SEQ ID NO : 32) et CA_C2613_RHA_Fwd (SEQ ID NO : 33) / CA_C2613_RHA_Rev (SEQ ID NO : 34) à partir de l’ADNg de C. acetobutylicum DSM 792. La matrice d’édition a été clonée entre les sites de restriction BamHI et Sali. - Plasmide N°3 : pGRNA_ACA_C3673 (SEQ ID NO : 30)

Il contient tous les éléments du pGRNAhd avec une substitution de F ARN guide permettant de cibler CA_C3673 (Oligo-20-mer obtenu par hybridation des primers gRNA_CA_C3673_Fwd (SEQ ID NO : 41) et gRNA_CA_C3673_Rev (SEQ ID NO : 42) et intégré au plasmide par la technique du golden gate assembly, après digestion par Bsal. Il contient également une matrice d’édition permettant l’inactivation de CA_C3673. Cette matrice d’édition a été construite par clonage des fragments LHA et RHA obtenus respectivement par amplification avec les couples de primers CA_C3673_LHA_Fwd (SEQ ID NO : 37) / CA_C3673_LHA_Rev (SEQ ID NO : 38) et CA_C3673_RHA_Fwd (SEQ ID NO : 39) / CA_C3673_RHA_Rev (SEQ ID NO : 40) à partir de l’ADNg de C. acetobutylicum DSM 792. La matrice d’édition a été clonée entre les sites de restriction BamHI et Sali.

Transformation des souches de C. acetobutylicum

Les plasmides préparés dans la souche NEB 10-beta ont été méthylés par transformation dans une souche NEB 10-beta contenant également le plasmide pBANak. Les plasmides méthylés ainsi extraits seront ensuite utilisés pour transformer la souche C. acetobutylicum. La transformation est réalisée selon le protocole décrit par Wasels et al. 2020.

Edition génétique des gènes CA_C2613 (SEQ ID NO : 1), CA_C3673 (SEQ ID NO : 2) et/ou CA_C1340 (SEQ ID NO : 3) :

Les inactivations des gènes CA_C1340, CA_C2613 et CA_C3673 dans la souche ACA_C1340- ACA_C2613-ACA_C3673, a été réalisée par édition génétique selon le protocole décrit par Wasels et al. 2020, utilisant respectivement les couples d’amorces CA_C1340_verif_Fwd (SEQ ID NO : 54) / CA_C1340_verif_Rev (SEQ ID NO : 55) ; CA_C2613_verif_Fwd (SEQ ID NO : 43) / CA_C2613_verif_Rev (SEQ ID NO : 44) ; CA_C3673_verif_Fwd (SEQ ID NO : 45) / CA_C3673_verif_Rev (SEQ ID NO : 46) lors de la validation de l’édition. L’emploi d’autres outils génétiques, telle que ceux basés sur la recombinaison homologue ou l’insertion d’éléments génétiques mobiles, peut permettre d’obtenir des mutants possédant des génotypes équivalents, i.e. n’exprimant plus les produits des gènes CA_C1340, CA_C2613 et/ou CA_C3673, ou exprimant une version non fonctionnelle de ceux-ci.

Résultats

Cinétique de croissance et détermination du temps de génération

Des suivis de croissance des souches de C. acetobutylicum DSM 792 sauvage, et ACA_C1340 ACA_C2613

ACA_C3673 ont été réalisés en quintuplicat sur du milieu CGM contenant 30 mM de xylose (Figure 5). Les résultats révèlent une amélioration du temps de génération lors de croissance sur xylose comme source de carbone. En outre, l’inactivation conjointe des gènes codant les répresseurs AraR et XylR permet une amélioration de + 171 % du temps de génération par rapport à la souche sauvage.

Suivi de consommation d’un mélange de sucres

Des suivis de consommation d’un mélange de sucre ont été réalisés en triplicats techniques avec les souches C. acetobutylicum DSM 792 sauvage et ACA_C1340 ACA_C2613 ACA_C3673, sur un milieu CGM contenant 25 mM de glucose, 25 mM d’ arabinose et 70 mM de xylose (Figure 6).

Les résultats indiquent que la coassimilation simultanée de 1’ arabinose et du glucose, est rendue possible lors de l’inactivation conjointe de CA_C1340 et des gènes CA_C2613 et CA_C3673.

La répression catabolique empêchant la coassimilation du xylose en présence des deux autres sucres est cependant maintenue. Ce résultat inattendu indique que la synergie entre l’inactivation conjointe des gènes codant les répresseurs AraR et XylR permet la levée de la répression catabolique pesant sur 1’ arabinose, tout en la maintenant pour le xylose.

Conclusions

Au cours de ce travail, les inventeurs sont parvenus à démontrer l’intérêt de l’inactivation conjointe des gènes codant les répresseurs AraR et XylR chez la souche C. acetobutylicum DSM 792, décrivant ainsi que la combinaison de ces modifications génétiques permet l’obtention d’une souche de C. acetobutylicum réalisant la coassimilation glucose/arabinose et présentant une croissance accélérée sur xylose seul. L’inactivation du gène araR seule ne permet pas une co-assimilation de l’arabinose et du glucose, qui n’est obtenue que lorsque les copies des gènes codant le répresseur XylR sont également inactivées. De plus, l’inactivation des deux copies du gène codant XylR n’est pas suffisante pour diminuer de façon significative le temps de génération du micro-organisme lorsqu’il croit sur un milieu contenant du xylose comme seule source de carbone. L’inactivation du gène codant AraR est nécessaire.

Ce résultat est important puisque cette souche souffre naturellement d’une incapacité à assimiler simultanément des pentoses et des hexoses tels que le glucose, l’arabinose et le xylose, impactant drastiquement les performances lors de fermentation sur des substrats composés d’un mélange de ces sucres, tels les substrats industriels de procédés de production de sucres à partir de biomasse. REFERENCES

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