Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neues Verfah¬ ren zur Herstellung von CMP-aktivierten, fluoreszierenden bzw. absorbierenden sowie neue, CMP-aktivierte fluoreszie¬ rende bzw. absorbierende Sialinsäuren.

Sialinsäuren (auch als Acylneuraminsäuren bezeichnet) sind Bestandteile vieler bakterieller und tierischer Glykopro- teine und Glykolipide. Bei Entzündungen, gewebszerstörenden Prozessen und bestimmten Tumorerkrankungen werden auch im Blutplasma höhere Konzentrationen an Sialinsäuren, insbe¬ sondere 5-N-Acetylneuraminsäure, und erhöhte Aktivitäten von sogenannten Sialyltransferasen gefunden. Letztere bauen physiologischerweise intrazellular die Sialinsäure in Glyko- konjugate ein; es handelt sich um Glykoprotein-Enzyme, wel¬ che eine definierte Spezifität für die Glycansequenz des Glykokonjugat-Akzeptors, in welchem die Sialinsäure einge¬ baut wird, und für den glycosidischen Bindungstyp, in wel¬ chem die eingebaute Sialinsäure chemisch gebunden wird, haben. Sowohl der Nachweis der Sialinsäurekonzentration im Blut und Gewebe, insbesondere auch das Sialylierungsmuster auf der Zellmembranoberfläche, als auch der Nachweis der Sialyltransferaseaktivitat und -spezifität in Zellen oder Körperflüssigkeiten wird in zunehmendem Maße für die medizi¬ nische Diagnostik interessant.

Problematisch beim Nachweis solcher Enzyme ist es, daß sie normalerweise in außerordentlich geringer Aktivität vorlie¬ gen, so daß direkte Nachweisraethoden schwierig sind. Nach dem Stand der Technik wurden deshalb radioaktiv markierte

CMP-aktivierte Sialinsäuren als Substrate eingesetzt, um Sialyltransferase-katalysierte Umsetzungen zu bestimmen. (Vgl. Beyer et al. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 52, 23-175 (1981)). Außer, daß es an vielen Orten schwierig ist, radioaktive Substanzen zu handhaben, ist dieses Verfahren zeitaufwendig und teuer.

Es bestand daher ein Bedürfnis nach einer einfacheren, pro¬ blemloser zu handhabenden Markierungssubstanz, mit der auch geringe Mengen an Umsetzungsprodukten der Sialyltransferase- reaktion sicher, einfach und empfindlich nachgewiesen werden können.

In Eur. J. Biochem. 177 583-589 (1988) ist deshalb ein Ver¬ fahren beschrieben, 9-Amino-5-N-acetyl-neuraminsäure mit Fluoresceinyl-Isothiocyanat zu kuppeln, welches gemäß dem von Groß und Brossmer, Glycoconjugate J., (1987), Volume 4, 145-176, bzw. Eur. J. Biochem. (1987) 168. 595-602, beschriebenen Verfahren mit CMP gekuppelt werden kann. Die auf diese Weise hergestellte Fluorescein-markierte CMP- Sialinsäure erweist sich als Indikator den bekannten radio¬ aktiv-markierten CMP-Sialinsäuren gegenüber überlegen. Sowohl die Darstellung der Fluoresceinyl-N-acetylneuramin- säure als auch die anschließende CMP-Aktivierung verlaufen aufgrund der schlechten Umsetzung und vielfältigen Reini¬ gungsschritte nur mit einer Ausbeute von etwa 5 %, bezogen auf die anfangs eingesetzte 9-Amino-5-N-acetylneuraminsäure. Es bestand daher ein Bedürfnis, diese Substanz auf ein¬ fachere Weise und mit höherer Ausbeute herzustellen und damit preiswerter zur Verfügung zu stellen.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß man diese Verbindung sowie andere, bisher nicht bekannte CMP-aktivierte, fluores¬ zierende Sialinsaurederivate auch herstellen kann, indem man zunächst 9-Amino-5-N-acetylneuraminsäure mit CMP verknüpft, wie es in der Literatur beschrieben ist (vgl. Groß et al.

Eur. J. Biochem. (1987) 168. 595-602). Diese Umsetzung ver¬ läuft mit hoher Ausbeute (95 %) und auch die Reinigung des Endproduktes ist vergleichsweise einfach. Anstelle der bevorzugten 5-Acetyl-Gruppe kann auch eine andere Acylgrupp vorhanden sein. Freie 5-Aminogruppen sind nicht geeignet, d diese Verbindungen nicht stabil sind.

Erfindungsgemäß kann das so erhaltene Produkt nunmehr mit einer aktivierten fluoreszierenden Verbindung, beispiels¬ weise mit Fluorescein-isothiocyanat gekuppelt werden. Auch diese Umsetzung verläuft überraschenderweise mit sehr hoher Ausbeute und vergleichsweise einfacher Reinigung der End¬ produkte, obwohl zu vermuten gewesen war, daß zahlreiche Nebenreaktionen durch die Vielzahl der möglichen reaktiven Zentren eintreten würden und daß eine erhebliche Zersetzung der CMP-Glykoside eintreten würde. Weitere Untersuchungen zeigten, daß dieses Verfahren nicht nur bei Fluoresceinver- bindungen eingesetzt werden kann, sondern daß auch praktisc alle anderen fluoreszierenden Verbindungen, welche eine kupplungsfähige Hydroxy-, Amino-, Carboxy-, Triazinyl- oder Sulfonsäuregruppe enthalten mittels geeigneter Aktivatoren bzw. kuppelnder Verbindungen an eine CMP-aktivierte 9-Amino N-acetylneuraminsäure gebunden werden könnten. Es hat sich weiterhin gezeigt, daß die biochemische Aktivität (d.h. die enzymkinetischen Daten) solcher Verbindungen sogar noch gesteigert wird, wenn die fluoreszierende Gruppe nicht über die Aminogruppe in 9-Stellung, sondern über eine Aminogrupp in der 5-Stellung der N-Acylneuraminsäure gebunden wird, wobei in letzterem Fall zuerst noch eine Omega-Amino-Acyl¬ gruppe, beispielsweise ß-Aminoacetyl, als Spacer an die 5- Aminogruppe ankondensiert wird. Obwohl dieser fluoreszente Rest dann dem glycosidischen Zentrum und damit der bedeuten sten Position für die enzymatische Katalyse räumlich näher kommt, und obwohl bis dato die N-Acetyl-Gruppe an dieser Position stets als wichtiges Strukturmerkmal für die Enzym- Substrat-Interaktion angesehen wurde, weisen verschiedene Sialyltransferasen zu solchen Verbindungen im Vergleich zu

der entsprechenden Substitution in der 9-Stellung jeweils sogar eine höhere Affinität (d.h. kleinere Michaelis-Kon¬ stante) auf. Gleichermaßen hat sich gezeigt, daß die fluo¬ reszierenden Gruppen, welche relativ hydrophob sind, die Affinität der meisten Sialyltransferasen zum CMP-Glykosid erhöhen, und somit als Indikatoren mit Vorteil eingesetzt werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht demgemäß darin, eine 5-Acylamido-9-amino-3,5,9-tridesoxy-ß-D-glycero-D-galacto- nonulosonsäure oder 5-Arainoacylamido-3,5-didesoxy-ß-D - glycero-D-galacto-nonulosonsäure der Formel I (im folgenden kurz als 9-Amino-5-N-acyl-Neu bzw. 5-Aminoacyl-Neu bezeich¬ net) _f der Formel I

in der R 1 eine Aminogruppe und R 0 eine Acylgruppe oder R eine Hydroxygruppe oder Acylaminogruppe und R eine Aminoacylgruppe darstellt

mit Cytidintriphosphat (CTP) in Gegenwart einer CMP-Sialin- säuresynthase zu CMP-aktivierten Sialinsäuren der Formel II

in der R ¹ und R die obige Bedeutung haben, umzusetzen, und diese mit einer fluoreszierenden Verbindung der Formel III

Fl - Sp - X (III )

in der Fl eine fluoreszierende Verbindung,

Sp eine Valenz oder eine kuppelnde Spacergruppe und

X eine aktivierte Carboxy- oder T iocarbonyl-, Triazinyl- oder Sulfonsäuregruppe bedeutet,

zu CMP-aktivierten, fluoreszierenden Sialinsäuren der For¬ mel IV umzusetzen

wobei entweder R ³ die Gruppe Fl - Sp - X' - NH und

R ⁴ eine Acylgruppe oder

R ³ eine Hydroxy- oder Acylamino-Gruppe und

R ⁴ die Gruppe Fl - Sp X' NH Acyl bedeutet, und

Fl und Sp jeweils die obige Bedeutung haben und

X' eine -CO-, -CS* -SO ₂ - oder Triazinyl-Gruppe bedeutet.

Die aktivierte Säuregruppe X ist eine mit einer Aminogruppe chemisch reagierende Gruppe, und zwar entweder zu einem

Amid, z.B. ein Ester, Säurechlorid, Saureazid, oder zu einem Harnstoff bzw. Thioharnstoff, z.B. ein Isocyanat, Isothiocyanat oder zu einem Aminotriazin, z.B. eine Triazinyldichlorid-Gruppe. Entsprechende Reaktionen sind für die Bildung von Säureamiden gut bekannt. Äquivalente Gruppen sollen daher ebenfalls mit umfaßt sein.

Die Gruppe Sp ist überwiegend eine Valenz, da die absorbie¬ renden bzw. fluoreszierenden Verbindungen häufig eine kupp¬ lungsfähige Gruppe X' direkt am Chromophor enthalten. In anderen Fällen kann jedoch auch eine Seitenkette, insbeson¬ dere eine Alkylkette mit 1-10, vorzugsweise 2-6 C-Atomen, zwischengeschaltet sein. Mittels einer Halogenalkylcarbon- säure oder Halogenalkylsulfonsäure läßt sich eine solche Gruppe leicht zusammen mit einer kuppelnden Gruppe X an eine Hydroxy- oder Aminogruppe des Chromophors anknüpfen.

Reaktionsprinzip:

Die AusgangsSubstanz für die Synthese von CMP-aktivierten fluorescenten Neurarainsäureanaloga ist CMP-9-Amino-N-acetyl- neuraminsäure oder CMP-5-Aminoacetamido-neuraminsäure; außerdem eignen sich alle 5-substituierte Analoga mit länge¬ ren Ketten (z.B. N-(e-Aminocaproyl) -neuraminsäure) an C-5 analog zur 5-Arainoacetyl-Gruppe.

Die Reaktion erfolgt durch Verknüpfung der Ausgangsmateria¬ lien über die primäre Aminogruppe an Position C-9 oder C-5 mit verschiedenen reaktiven fluoreszenten oder absorbieren¬ den Substanzen, die leicht mit einer Aminofunktion reagie¬ ren. Aktivierte Substituenten können vorliegen als Isothiocyanate, Isocyanate, als N-Hydroxysuccinimidester, p-Nitrophenylester, Sulfonsäurechloride, als Triazinchloride oder als Säureazide.

Die Reaktion erfolgt in teilweise wässrigem Milieu im neu¬ tralen oder alkalischen pH-Bereich (7.5 - 10; am besten

erfolgt die Reaktion bei pH 8.5 - 9) bei 20" C oder besser 37 ^* C, mit Zusatz von organischem Lösungsmittel zur Solubi- lisierung der reaktiven Substanz (z.B. 30 % - 80 % Methanol, DMF, DMSO, Aceton oder Acetonitril, o.a.). Das CMP-Glykosid Ausgangsmaterial und das gebildete CMP-NeuAc Analogon bleibt im genannten pH- Bereich stabil (weniger als 5 % Zerset¬ zung) . Der Überschuß an aktiviertem fluoreszentem Agens kann bei Isothiocyanaten nur 2-fach betragen, um über 90 % umge¬ setztes CMP-Glykosid zu erreichen; bei N-Hydroxysuccinimid- estern liegt er besser bei 3-5 fach um den gleichen Umsatz zu erreichen; prinzipiell ist ein 10-facher Überschuß gün¬ stig zur Verkürzung der Reaktionszeit (bei Isothiocy&aaten im Regelfall 10 - 15 min bei 37" C, bei N-Hydroxysuccinimid- estern bis 20-30 min) . Bei Triazinyldichlorid als reaktive Gruppe empfiehlt sich ein höherer Überschuß (6 bis 15-fach), die Reaktionszeit bis zum kompletten Umsatz (90 %) beträgt mindestens 15-20 h bei 37" C.

In allen Fällen wird eine Umsetzung zum fluoreszenten bzw. absorbierenden CMP-NeuAc Analogon von 90 % oder mehr er¬ reicht. Anschließend wird das synthetisierte fluoreszente bzw. absorbierende CMP-NeuAc Analogon über präparative HPLC gereinigt (vgl. Groß und Brossner, Eur. J. Biochem 177, 583- 89). ("Spherisorb NH ₂ " (Zinsser), Aminoprepyl (Serva) , "Lichroprep NH ₂ " (E. Merck) als stationäre Phase und 15 mM KH ₂ P0 ₄ in Wasser / 50-70 % Acetonitril als mobile Phase) .

Vorteile der neuen Methode

Zum ersten Mal wurden mit; lieser Methode neue CMP-NeuAc Ana¬ loga direkt aus einem CMP-Glykosid chemisch dargestellt. De Vorteil der hier gezeigten Methode ist die direkte Verknüp¬ fung des reaktiven Substituenten mit einer Aminogruppe eine CMP-Glykosids; dadurch entfällt eine langwierige und aufwen¬ dige chemische Synthese zuerst der entsprechenden freien NeuAc Analoga, deren Reinigung und die anschließende enzyma

tische Aktivierung jedes freien NeuAc Analogons mit CMP- Sialinsäuresynthase mit nachfolgender, weiterer Reinigung. Nach der erfindungsgemäßen chemischen Synthese muß lediglich eine einfache Reinigungsprozedur durchgeführt werden. Außer¬ dem liegen die Ausbeuten bei dieser enzymatischen Umsetzung von freien NeuAc Analoga mit großen fluoreszenten Substitu¬ enten an C-9 oder C-5 wesentlich niedriger (etwa 15 %), wie an der enzymatischen Synthese von CMP-9-Fluoresceinyl-NeuAc gezeigt wurde. Dagegen kann CMP-9-Amino-NeuAc mit optimaler Ausbeute von 95 % über CMP-NeuAc Synthasereaktion herge¬ stellt werden. Die Knüpfungsreaktion von fluoreszenten Sub¬ stituenten an CMP-9-AminoNeuAc verlaufen ebenfalls mit Urasatzraten von 90 % und mehr, so daß die neue Methode opti¬ male Ausbeute garantiert. Die Methode ist also ökonomisch, einfach und zeitsparend, und ermöglicht eine Vielfalt von CMP-NeuAc Analoga durch die Vielfalt der möglichen, akti¬ vierten Substituenten herzustellen. Die bekannte Instabili¬ tät der CMP-Glykoside stellt dabei keinen Hinderungsgrund dar, da speziell CMP-9-Amino-NeuAc im geschilderten pH-Be¬ reich (pH 7.5 -9.5) überraschend stabil ist.

Charakteristik der dargestellten CMP-NeuAc Analoga:

Die neuen fluoreszenten oder absorbierenden CMP-Glykoside wurden nach der Reinigung mit verschiedenen Methoden charak¬ terisiert (siehe folgende Tabelle) .

1. Die Retentionszeit im analytischen HPLC-System (275 nm) unterschied sich vom CMP-9-Amino-NeuAc bzw. CMP-5-Aminoace- tamido-Neu, der Absorptionskoeffizient (e) der neuen CMP- Glykoside im HPLC-System bei 275 nm lag über 1.0 (bezogen ^{auf e} 275nm ^{von CMP} > ^•

2. Durch milde saure Hydrolyse (IN HC1, 45 min bei RT) wurden die neuen CMP-Glykoside vollständig zu CMP zersetzt und nachfolgend durch analytische HPLC (275 nm) bestimmt. Im analytischen HPLC-System bei 200 nm erscheint nach saurer Hydrolyse der Peak des freigesetzten, fluoreszenten bzw. absorbierenden NeuAc Analogons.

3. Das Absorptionsspektrum und das Fluoreszenzspektrum der neuen CMP-Glykoside wurde gemessen; die Absorptions- oder Fluoreszenzmaxima der fluoreszenten bzw. absorbierenden Sub¬ stituenten konnten praktisch bei identischer Wellenlänge im neuen CMP-Glykosid wiedergefunden werden (siehe folgende Tabelle) .

4. Die Kontamination mit freiem CMP oder freiem NeuAc Derivat lag bei den neuen CMP-Glykosiden unter 6 %, CTP war kleiner 0,1 %, und anorganisches Phosphat unter 50 %.

Die erfindungsgemäßen neuen Substrate lassen sich für fol¬ gende analytische Methoden einsetzen:

1. Aktivitätsbestimmung von Sialyltransferase

2. Akzeptorspezifitätsbestimraung und Bestimmung der kine¬ tischen Akzeptordaten von Sialyltransferasen

3. Fluoreszenzmarkierung von Zelloberflächen

4. Markierung von Glykoproteinen und Gangliosiden

cnarakteristik einiger Eluorescenter CMP-Glykoside le fluoreszenten CMP-NeuAc Analoga wurden nach dem beschriebenen Verfahren dargestellt uoreszente Absorptions¬ Absorptions Retentionszeit Λbsorptionskoeffizent P-Glykoside maximum * maximum *** im HPLC-System £ (275 nm) im HPLC-System (be¬ omenklatur analog (zw.230-700 nm) (Literatur) (Peakmaximum) zogen auf £ ( 275 nm) von CMP) ite.23..)

P-9-Fluoresceinylamino- 492 nm 495 n 24,5 min 3,2 + 0,2 euAc CMP-9-FITC-NeuAc) MP-5-Fluoresceinylamino- 493 nm 495 nm 44,5 mm 3,2 ± 0,2 cetyl-Neu CMP-5-FITC-Neu) MP-9-N-(Fluoresceinylamino- 1. Max 233 nm 492 nm 21,5 min 4,25 0,35 hlorotriazinyl)-amino-NeuAc 2. Max 493 nm CMP-9-DTAF-NeuAc) MP-9-Tetramethyl- 552 nm 554 nm 20,1 min 2,4 ± 0,3 hodaminylamino-NeuAc CMP-9-TRΪTC-NeuAc MP-9-Resorufinyl-amino- 577 nm 575,6 nm 47,5 min 1,0 ± 0,15 euAc

(CMP-9-RES0S-NeuAc) MP-9-(7-Amino-4-methyl-) 339 nm 345 nm 17,5 min 1,2 ± 0,15 umarinylacetamido-NeuAc CMP-9-AMCA-NeuAc) eferenz CMP 273 nm 273 n 0,5 min 1,0

* gemessen in 50 M Na-Phosphatpuffer pH 7,0 ** HPL _C - _S ystem wie beschrieben: Groß et ai, Eur.J.Diocliem. (1907) 360, 595-602

Flußrate 3 ml/min; Detektion bei 275 nm; 40% 15 mM Kll ₂ P0 ₄ / 60% Acetonitril

Messung der Sialyltransferaseaktivität

Der Test basiert auf dem Einbau der fluoreszierenden Neuraminsäurederivate aus dem entsprechenden CMP-Gly¬ kosid durch eine Sialyltransferase in einen Akzeptor, beispielsweise ein Glykoprotein oder Gangliosid, Tren¬ nung der substituierten und unsubstituierten Akzeptor¬ moleküle von dem Überschuß der Reagenzien durch Gelfil¬ tration oder Ausfällung und Messung der akzeptorgebun¬ denen Fluoreszenz durch ein entsprechendes spektrome- trisches Verfahren. Diese Methode eignet sich zur Bestimmung aller bisher bekannten Sialyltransferasen, trotz unterschiedlicher Bindungs- (α2,3-; α2,6-) und Akzeptorspezifität (Galßl,4GlcNAc-; Galßl,4(3)Glc- NAc-; Galßl,3GalNAc-; GalNAc-), da offenbar generell die Substratspezifität in bezug zur Position C9 oder C5 der CMP-aktivierten Neuraminsäuren gering ausgeprägt ist. Wie vorstehend gesagt, erweisen sich C5-substitu¬ ierte Neuraminsäuren und durch hydrophobe Substituenten substituierte Neuraminsäuren als Substrate mit beson¬ ders hoher Affinität.

Für einen einfachen Test werden normalerweise 30 μl Reaktionslösung, oder gegebenenfalls bis zu nur 10 μl Reaktionslösung benötigt. Diese enzymatische Reaktion wird beispielsweise in einem Puffer mit pH 6 oder 6,5 durchgeführt (je nach dem pH Optimum der Sialyltrans¬ ferase) , wobei 0,1 - 10,0 mg/ml Akzeptor [ (Asialo)Gly- koprotein oder Gangliosid], entsprechend 690 - 1.875 μM Galaktose oder N-Acetylgalaktosaminakzeptorstellen, und 10 - 100 μM der jeweiligen CMP-aktivierten fluores¬ zenten N-Acetylneuraminsäurereagentien zugegeben werden. Die Reaktionslösung wird im Regelfall 10 min bis 45 min bei 37' C gehalten und anschließend an einer Sephadex G50-Säule (0,4 x 12 cm) mit 0,1 M Trispuffer

pH 8,6 getrennt [bei Gangliosidakzeptoren enthält der Puffer zusätzlich 100 mM NaCl und 0,3 % Detergenz (z.B. Triton X-100)]. Das Ausmaß der Reaktion wird über eine Fluoreszenzmessung der makromolekular gebundenen fluo¬ reszenten Neuraminsäure quantifiziert, kann auch gege¬ benenfalls über eine Messung des nicht-umgesetzten fluoreszenten CMP-Glykosids bestimmt werden. Im Gegen¬ satz zu radiometrischen Tests für Sialyltransferase- aktivität reichen wesentlich kleinere Konzentrationen der fluoreszenten CMP-Glykoside (5-15-fach kleiner) aus, um das Enzym mit dem CMP-Glykosid zu sättigen, und die geringen zur Fluoreszenzmessung nötigen Volumina ermöglichen geringe Reaktionslösungen (bis min. 10 μl), was die Methode insgesamt sehr ökonomisch macht. Trotz¬ dem ist die Meßempfindlichkeit des fluororaetrischen Tests in einem radiometrischen Test nur schwer zu erreichen (erfordert sehr hohe spezifische Radiomarkie¬ rung) .

Der Test eignet sich in dieser Form auch besonders zur Messung der geringen Sialyltransferaseaktivitäten in Kulturzellinien, Operations- oder Biopsiematerial und in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Blutplasma oder -serum.

Als Alternative zur Gelfiltration ist bei Glykoprotein- Akzeptoren eine Fällung zur Trennung vom Donor möglich; dazu wird ein Assay wie oben mit 1 ml 1 % PWS in 0,5N HCl bei 4" C und 20 min prazipitiert. Das Sediment wird 2-mal gewaschen mit Ethanol/0,1M Tris pH 7,5 (9/1) und gelöst in einem geeigneten Volumen 1 N NaOH (PWS = Phosphorwolframsäure) .

II. Sialyltransferasen verschiedener Herkunft weisen teil¬ weise erhebliche Unterschiede in ihrer Akzeptorsub- stratspezifität auf. Unter Verwendung der erfindungs- gemäßen Indikatoren läßt sich daher eine leichte Unterscheidungsreaktion darauf aufbauen, den vorste¬ henden Test unter standardisierten Bedingungen jeweils mit verschiedenen Akzeptoren (d.h. Glykoprotein-, Glykolipid- oder Oligosaccharid-Akzeptoren mit unter¬ schiedlichen Glykansequenzen) durchzuführen, und die jeweils gefundene Aktivität zu vergleichen. Der Test ermöglicht auch die Erstellung der enzymkine¬ tischen Daten (Michaelis-Konstante, V _max ) für den jeweiligen Akzeptor. Im Plasma bzw. Serum ermöglicht der Test zum ersten Mal eine Differenzierung von zwei Sialyltransferasen, eine mit Spezifität für die N- gebundene, terminale Glycanse uenz Gal l,4GlcNAc, eine andere für O-gebundene GalNAc-Reste.

III. Es ist ferner möglich, die Sialinsäureakzeptoren auf

Zellmembranen auf einfache Weise mit den erfindungsge- raäßen Indikatoren zu markieren, indem man eine entspre¬ chende Reaktionslösung der CMP-aktivierten fluoreszen¬ ten Sialinsäuren in Gegenwart von Sialintransferase einwirken läßt, den Überschuß des Indikators auswäscht und am Ausmaß der Fluoreszenz der isolierten Zellen Oberflächeneigenschaften bestimmter, zu untersuchender Zellen bestimmt. Außerdem kann die Zelle auf diese Weise selektiv im Glykanteil fluoreszenzmarkiert werden, ohne eine chemische Wärmebehandlung. Die Messung der oberflächengebundenen Fluoreszenz erfolgt sehr einfach im Durchflußcytometer, kann aber auch unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden.

IV. Die erfindungsgemäßen Verbindungen erweisen sich ferner als vorteilhaft, wenn gewisse, in ihrer räumlichen Struktur besonders empfindliche Proteine fluoreszenz- markiert werden sollen, um sie bei Einsatz in einem biologischen System anhand der Fluoreszenz verfolgen zu können. Eine solche Markierung kann enzymatisch relativ schonend und vollständig durchgeführt werden, läßt die eigentliche Aminosäuresequenz des Proteins unmodifi- ziert, erfolgt selektiv in bestimmten Glykansequenzen und ermöglicht, die überflüssige IndikatorSubstanz leicht wieder abzutrennen. Die Verfahrensweise ist prinzipiell die gleiche wie unter I. geschildert.

Bevorzugte fluoreszente bzw. absorbierende CMP-Glykoside

(Abgekürzte Nomenklatur analog Seite 23)

CMP-9-TRITC-NeuAc: diese Substanz wird praktisch nur von Galßl,4GalNAc α2,6Sialyltrans- ferasen auf Glykoproteine übertra¬ gen, könnte also zur Differenzie¬ rung dienen; außerdem andere Exci- tation und Emission (rot-fluores- zent) .

CMP-9-DTAF-NeuAc: stark hydrophob, bessere kinetische Daten für verschiedene Sialyltrans- ferasen, besonders für Galßl,3Gal- NAc α2,3-Sialyltransferase ist V _maχ /Kin 6,5 fach höher als für CMP-Fluores-ceinyl-NeuAc.

CMP-9-RESOS-NeuAc: sehr gute Absorption im sichtbaren Bereich; bei Fluoreszenz andere Emmission auch Excitation als FITC; Fluoreszenz auch im sauren pH- Bereich im Gegensatz zu FITC.

CMP-9-AMCA-NeuAc; Anregung im UV-Bereich, geringer "Innerer Quench" durch 100 nm Abstand zwischen Excitation und Emission; Fluoreszenz nicht pH- abhängig in einem weiteren Bereich.

CMP-9-DAB-NeuAC: Anregung im UV-Bereich; hohe Absorption im UV-Bereich, daher gute Eignung für einen Absorptions- assay für UV-Durchflußspektrophoto- meters.

CMP-5-FITC-Neu: Günstige Emission und Excitations- frequenzen bei hoher Fluoreszenz- ausbeute. Kinetische Daten bei Sialyltransferasen verschiedendster Akzeptorspezifitat stets denen von CMP-9-Fluoresceinyl-NeuAc überlegen (V _maχ /Kin: 2,8-20 fach höher).

CMP-Sialinsäurederivate ausgewählt aus der Gruppe jweils: Trivialname exakte chemische Nomenklatur abgekürzter Trivialname

CMP-9-Tetramethylrhodaminylamino-NeuAc

CMP-[5-Acetamido-9-(3-Tetramethylrhodaminylthioureido)-3, 5,9- tridesoxy]-ß-D-glycero-D-galacto-nonulosonsäure

(CMP-9-TRITC-NeuAc) siehe Abb.: Struktur 2, Rest C

CMP-9-Rhodamin 1amino-NeuAc

CMP-[5-Acetamido-9-(3-Rhodaminylthioureido)-3,5,9-trideso xy] ß-D-glycero-D-galacto-nonulosonsäure

CMP-9-Eosinylamino-NeuAc

CMP-[5-Acetamido-9-(3-Eosinylthioureido)-3,5,9-tridesoxy] -ß- D-glycero-D-galacto-nonulosonsäure

CMP-9-(4-N,N -Dimethylaminoazobenzo-4)amino-NeuAc

CMP-[5-Acetamido-9-(4-N,N'-Dimethylaminoazobenzo-4'- thioureido)-3,5,9-trideoxy]-ß-D-glycero-D-galacto- nonulosonsäure

(CMP-9-DAB-NeuAc) siehe Abb.: Struktur 2 , Rest D

CMP-9-Fluoresceinyl-(5,6)carboxamido-NeuAc

CMP-5-Acetamido-[9-fluoresceinyl-(5,6)carboxamido]-3,5,9- tridesoxy-ß-D-glycero-D-galacto-nonulosonsäure

(CMP-9-F1U0S-NeuAc)

CMP-9-Rhodaminyl-(5,6)carboxamido-NeuAc

CMP-5-Acetamido-[9-rhodaminyl-(5,6)carboxamido]-3,5,9- tridesoxy]-ß-D-glycero-D-galacto-nonulosonsäure

(CMP-9-RHODOS-NeuAc)

CMP-9-Resorufinyl-amino-NeuAc

CMP-5-Acetamido-9-[ (N-resorufin-4-carbonyl)-piperidin-4- carboxamido) ]-3,5,9-tridesoxy-ß-D-glycero-D-galacto- nonulosonsäure

(CMP-9-RESOS-NeuAc) siehe Abb. : Struktur 1, Rest A

CMP-9-(7-Amino-4-methyl-cumarinylacetamido)-NeuAc

CMP-5-Acetamido-9-(7-amino-4-methyl-coumarinylacetamido)- 3,5,9-tridesoxy-ß-D-glycero-D-galacto-nonulosonsäure

(CMP-9-AMCA-NeuAc) siehe Abb.: Struktur 1, Rest B

CMP-9-N-(Fluoresceinylamino-chlorotriazinyl)-amino-NeuAc

CMP-5-Acetamido-9-fluoresceinylamino-chlorotriazinylamino - 3,5,9-tridesoxy-ß-D-glycero-D-galacto-nonulosonsäure

(CMP-9-DTAF-NeuAc) siehe Abb.: Struktur 3, Rest E

CMP-9-Dansylamino-NeuAc

CMP-5-Acetamido-9-(dansylamido)-3,5,9-tridesoxy-ß-D-glyc ero- D-galacto-nonulosonsäure siehe Abb.: Struktur 3, Rest F

CMP-9-(Texas-Red)amino-NeuAc

CMP-5-Acetamido-9-N-(Texas-Red)amino-3,5,9-tridesoxy-ß-D - glycero-D-galacto-nonulosonsäure

CMP-5-Fluoresceinylaminoacetyl-Neu

CMP-3,5-Didesoxy-5-(fluoresceinylthioureido)-acetamido-ß -D- glycero-D-galacto-nonulosonsäure

(CMP-5-FITC-NeuAc) siehe Abb.: Struktur 4, (Fluoresceinyl-Isomer I)

CMP-5-Tetramethylrhodaminylaminoacetyl-Neu

CMP-3,5-Didesoxy-5-(tetramethylrhodaminylthioureido)- acetamido-ß-D-glycero-D-galacto-nonulosonsäure

(CMP-5-TRITC-Neu)

CMP-5-Rhodaminylaminoacetyl-Neu

CMP-3,5-Didesoxy-5-(rhodaminylthioureido)-acetamido-ß-D- glycero-D-galacto-nonulosonsäure

CMP-5-Eosinylaminoacetyl-Neu

CMP-3,5-Didesoxy-5-(eosinylthioureido)-acetamido-ß-D-gly cero- D-galacto-nonulosonsäure

CMP-5-Xanthenrhodaminylaminoacetyl-Neu

CMP-3,5-Didesoxy-5-(xanthenrhodaminylthioureido)-acetamid o-ß- D-glycero-D-galacto-nonulosonsäure

(CMP-5-XRITC-Neu)

CMP-5-(4-N,N ^, -Dimethylaminoazobenzo-4'-)aminoacetyl-Neu

CMP-3,5-Didesoxy-5-(4-N,N'-Dimethylaminoazobenzo-4'- thioureido)-acetamido-ß-D-glycero-D-galacto-nonulosonsäure

(CMP-5-DAB-Neu)

CMP-5-Fluoresceinyl-(5,6)carboxamido-acetyl-Neu

CMP-3,5-Didesoxy-5-fluoresceinyl-(5,6)carboxa ido-acetamido- ß-D-glycero-D-galacto-nonulosonsäure

(CMP-5-FLUOS-Neu)

CMP-5-Rhodaminyl-(5,6)carboxamido-acetyl-Neu

CMP-3,5-Didesoxy-5-rhodaminyl-(5,6)carboxyamido-acetamido -ß- D-glycero-D-galacto-nonulosonsäure

(CMP-5-RH0D0S-Neu)

CMP-5-Resorufinylacetyl-Neu

CMP-3,5-Didesoxy-5-N-(resorufin-4-carbonyl)-piperidin-4- carboxamido)-acetamido-ß-D-glycero-D-galacto-nonulosonsäur e

(CMP-5-RES0S-Neu)

CMP-5-(7-Amino-4-methyl-cumarinylacetamido)-acetyl-Neu

CMP-3,5-Didesoxy-5-N-(7-amino-4-methyl-cumarinylacetamido )- acetamido-ß-D-glycero-D-galacto-nonulosonsäure

(CMP-5-AMCA-Neu)

CMP-5-Fluoresceinylamino-chlorotriazinyl-aminoacetyl-Neu

CMP-3,5-Didesoxy-5-N-(fluoresceinylamino-chlorotriazinyl) - aminoacetamido-ß-D-glycero-D-galacto-nonulosonsäure

(CMP-5-DTAF-Neu)

CMP-5-Dansyl-aminoacetyl-Neu

CMP-5-Dansylamino-acetamido-ß-D-glycero-D-galacto- nonulosonsäure

CMP-5-(Texas-Red)-aminoacetyl-Neu

CMP-3,5-Didesoxy-5-N-(Texas-Red)amino-acetamido-ß-D-glyc ero- D-galacto-nonulosonsäure

S T R U K T U R * ^•** (

R = S T R U K T U R 2.

ERSATZBLATΓ

S T R U K T U R =

Darstellung von fluorogenen CMP-Glykosiden im Detail

a) Synthese CMP-9-Fluoresceinylamino-NeuAc (Nomenklatur analog Seite 23)

Fluoresceinylisothiocyanat (Isomer I oder II wird gelöst in Methanol oder DMF (1-4 mg = ca. 2,5-10 μmol; in 200 μl), dann werden 1,25 umol CMP-9-Amino-NeuAc, gelöst in 200 μl Wasser, zugegeben (2 Mol Fluorescei¬ nylisothiocyanat pro Mol CMP-9-Amino-NeuAc sind aus¬ reichend) ; dann werden 20 μl einer Pufferlösung pH 9-9,5 (z.B. 0,5 M NaHC0 ₃ /Na C03) zugegeben, so daß pH 8,5-9 erreicht wird. Die Reaktion der Amino¬ gruppe an C-9 des NeuAc-Teils des CMP-Glykosids mit dem Fluoresceinylisothiocyanat ist nach spätestens 15 min komplett (größer 90 %) . Die Umsetzung kann über analytische HPLC beobachtet werden, die Retentionszeit von CMP-9-Amino-NeuAc ist wesentlich kleiner als die des gebildeten fluoreszenten CMP-Glykosids. Die Reinigung des erhaltenen CMP-9-Fluoresceinyl-NeuAc erfolgt über präparative HPLC und Ethanolfällung, wie beschrieben (Groß und Brossner (1988), Eur. J. Biochem. 177, 583-89) .

b) Synthese von CMP-9-Resorufinyl-amino-NeuAc

0,5 mg N-(Resorufin-4-carbonyl-)piperidin-4-carbon- säure-N' -hydroxysuccinimidester (RESOS 0,5 mg = ca. 1,1 μmol) wird gelöst in 100 μl DMF; dann werden 20 bis 80 μl einer wäßrigen Lösung von CMP-9-Amino-NeuAc (0,5 μmol) zugegeben, und 20 μl Puffer pH 9-9,5 (siehe Synthese CMP-9-Fluoresceinyl-NeuAc) . Das pH der Reak¬ tionslösung sollte 8,5-9 haben, die Bildung von CMP-9- Resorufinyl-NeuAc (Ausbeute über 90 %) ist nach 20 min komplett (analyt. HPLC wie oben) . Die Reinigung erfolgt wie bei CMP-9-Fluoresceinyl-NeuAc.

c) Synthese vom CMP-5-Fluoresceinylaminoacetyl-Neu

Die Synthese erfolgt exakt wie für CMP-9-Fluoresceinyl- NeuAc oben beschrieben, aber mit CMP-5-Aminoacetamido- Neu als Ausgangsmaterial (2 Mol Fluoresceinylisothio- cyanat/Mol CMP-5-Aminoacetaraido-Neu) . Die Kupplung wird mit über 90 % Ausbeute in 15 min erreicht (analyt. HPLC wie oben) . Die Reinigung wird wie bei CMP-9-Fluorescei- nyl-NeuAc durchgeführt.

d) Synthese von CMP-9-N- (Fluoresceinylamino-chlorotria- zinyl) -amino-NeuAc

2,0 mg (= 3,75 μMol) Dichlorotriazinylaminofluorescein, (DTAF) wurde gelöst in 100 μl DMF; dann wurden 20-50 μl einer wäßrigen Lösung von CMP-9-Amino-NeuAc (max. 0,5 μMol) und 20 μl Puffer pH 9-9,5 (wie Synthese CMP- 9-Fluoresceinyl-NeuAc) zugegeben (7,5-19 Mol DTAF/Mol CMP-9-Amino-NeuAC) . Nach 3 h sind etwa 75 % der CMP-9- Amino-NeuAc umgesetzt, nach 15 h über 90 % (analyt. HPLC wie oben) . Die Reinigung erfolgt wie bei CMP-9- Fluoresceinyl-NeuAc beschrieben.

e) Synthese von CMP-9-(7-Amino-4-methyl-curaarinyl- acetamido) -NeuAc

0,3 mg AMCA-N-hydroxysuccinimidester (ca. 1 μMol) wurde gelöst in 130 μl DMF; dann wurden 70 μl einer wäßrigen Lösung von CMP-9-Amino-NeuAc (ca. 0,5 μMol) u.id 30 μl Puffer pH 9-9,5 (wie Synthese CMP-9-Fluo- resceinyl-NeuAc) zugegeben (2 Mol AMAC/Mol CMP-9-Amino- NeuAc) . Nach 20 min sind etwa 90-95 % der CMP-9-Amino- NeuAc umgesetzt (analyt. HPLC wie oben) . Die Reinigung erfolgt wie bei CMP-9-Fluoresceinyl-NeuAc beschrieben.