ETAT DE LA TECHNIQUE.

Les polysaccharides qui contiennent du mannose sont fréquemment présents dans les parois cellulaires des végétaux supérieurs en particulier chez les légumineuses et sont considérés comme une réserve de carbohydrates dans les graines.

Dans plusieurs plantes, il a été montré que l'activité endo-p-mannanase est principalement détectée dans 1'endosperme des graines en cours de germination (Bewley, Trends Plant Sci L 464-469,1997).

Dans le grain de café, on trouve notamment des galactomannanes. Ces dernières représentent environ 24% du poids sec du grain (Bradbury and Halliday, J Agric Food Chem 38,389-392,1990). Ces polysaccharides sont formés d'une chaîne linéaire de résidus mannosyl qui sont liés entre eux par des liaisons de type (3-1->4 et sur laquelle sont fixés des monomères de résidus a-galactosyl. Il est également connu que 1'enzyme appelée endo-p-mannanase (E. C 3.2.1.78) est une hydrolase qui dégrade les polymères de (1->4)-P-mannanes, ainsi facilitant la sortie de la radicelle pendant la germination et libérant des petits oligosaccharides qui sont utilisés ensuite comme source d'énergie pour la croissance de la jeune plante.

Dans les procédés industriels, lors du traitement du café, les molécules de mannanes et leurs dérivés constituent une partie importante des sédiments insolubles. De plus, la fraction de ces molécules qui entre en solution lors de la première extraction (environ 50 %) est aussi très faiblement soluble, et est donc responsable pour la majorité des précipitations secondaires se manifestant pendant les étapes suivantes. Ainsi dans le brevet EP 0676145A, il a été démontré qu'il est

possible d'hydrolyser les galactomannanes de café en utilisant une mannanase immobilisée extraite d'Aspergillus niger.

Ainsi à ce jour, aucun gène ou groupe de gènes codant pour au moins une enzyme issue du café impliquée dans l'hydrolyse des polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes simples ou ramifiées et liées entre elles par une liaison P (1->4) n'a été identifié et/ou séquence.

Ainsi il serait intéressant d'isoler de telles enzymes issues de la graine café.

RESUME DE L'INVENTION : L'invention se destine donc à fournir de nouveaux moyens pour contrôler, modifier et/ou restaurer l'hydrolyse des polysaccharides de café constitués au moins de molécules de mannanes simples ou ramifiées et liées entre elles par une liaison ß (1->4).

A cet effet la présente invention concerne tout fragment d'ADN issu du café codant pour au moins une enzyme impliquée dans l'hydrolyse de tels polysaccharides.

La présente invention concerne également l'utilisation de tout ou partie de tels fragments d'ADN comme amorce pour faire une PCR ou comme sonde pour détecter in vitro ou modifier in vivo au moins un gène de café codant pour au moins une endo-p-mannanase.

La présente invention concerne également toute protéine issue de la graine de café codée par un gène de café et impliquée dans l'hydrolyse des polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes simples ou ramifiées et liées entre elles par une liaison P (1->4) et ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 2 ou toute séquence en acides aminés homologue à cette dernière.

Un autre objet de l'invention concerne tout micro-organisme et de toute cellule végétale comprenant, intégré dans son génome ou par le moyen d'un plasmide replicable, un fragment d'ADN selon la présente invention.

Enfin l'invention concerne une composition alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique comprenant un fragment d'ADN ou une protéine selon l'invention.

DESCRIPTION DES FIGURES : La figure 1 représente le plasmide pMANl de 3,58 kb.

La figure 2 représente le plasmide pMAN2 de 2,98 kb.

La figure 3 représente le plasmide pMAN3 de 3,78 kb.

La figure 4 représente le plasmide pMAN4 de 4,56 kb.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION : Au sens de la présente invention, on entend par"séquence homologue" toute séquence nucléique ou d'acides aminés ayant une fonction identique, ne différant des séquences selon l'invention que par la substitution, la délétion ou l'addition d'un petit nombre de bases nucléiques ou d'acides aminés, par exemple 1 à 500 paires de bases (pb) ou 1 à 150 acides aminés.

Dans ce cadre, on considérera en particulier comme homologues deux séquences d'ADN qui, du fait de la dégénérescence du code génétique, codent pour un mme polypeptide. De mme, on considérera comme homologues deux protéines fonctionnelles qui sont reconnues par un mme anticorps, le rapport des valeurs d'intensité de reconnaissance des deux protéines par l'anticorps n'excédant pas 100, par exemple.

On considérera aussi comme séquence homologue, celle qui présente plus de 70% d'homologie avec les séquences selon l'invention, en particulier plus de 80% ou 90%. Dans ce dernier cas, l'homologie est déterminée par le rapport entre le nombre de bases ou d'acides aminés d'une séquence homologue qui sont identiques à celles d'une séquence selon l'invention, et le nombre total de bases ou d'acides aminés de ladite séquence selon l'invention.

Au sens de la présente invention, on entend par"fragment qui s'hybride" tout fragment capable de s'hybrider aux fragments selon l'invention par la méthode de Southern-Blot (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U. S. A., 1989, chapitres 9.31 à 9.58). De préférence, l'hybridation est conduite dans des conditions stringentes de manière à éviter des hybridations aspécifiques ou peu stables.

Enfin, le terme"fragment"ou"fragment d'ADN"doit tre compris comme un ADN double brin d'origine chromosomique, qui peut tre synthétisé, reproduit in-vitro par exemple par la méthode connue appelée"Polymérase Chain Reaction", ou reproduit in-vivo dans une bactérie du type Escherichia coli, par exemple.

Dans la suite de la description, les séquences SEQ ID NO : font référence aux séquences présentées dans la liste des séquences ci-après. Les oligonucléotides de synthèse SEQ ID NO : 3 à SEQ ID NO : 7, et SEQ ID NO : 11 à SEQ ID NO : 12 mentionnés dans la description et présentés dans la liste des séquences ci-après, sont fournis par Eurogentec (Parc Scientifique du Sart Tilman-4102 Seraing-Belgium).

On a pu caractériser une séquence d'ADN de 1613 pb issue du café. Aussi la présente invention concerne tout fragment d'ADN issu du café codant pour au moins une enzyme impliquée dans l'hydrolyse de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiées liées entre elles par une liaison P (1->4).

De préférence, le fragment d'ADN issu du café selon l'invention code pour au moins une endo-ß-mannanase.

On a pu montrer que tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 1 permet, suite à une transformation, d'hydrolyser des polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiées liées entre elles par une liaison ß (1- >4) dans une cellule hôte, comme une cellule de plante ou un micro-organisme.

Vu l'intért de la présente invention, l'invention concerne tout fragment d'ADN ayant la séquence nucléique SEQ ID NO : 1 ou tout fragment d'ADN

homologue ou s'hybridant à cette séquence nucléique. De préférence, l'invention concerne le fragment d'ADN délimité par les nucléotides lia 1294 de la séquence nucléique SEQ ID NO : 1.

Ainsi, l'invention concerne aussi les nouvelles enzymes codées par les gènes de la séquence SEQ ID NO : 1, notamment les séquences qui leur sont homologues. On peut ainsi envisager de les utiliser pour modifier ou dégrader in- vitro de tels polysaccharides, par exemple. Pour cela, il est préférable de purifier au moins une de ces enzymes, en surexprimant classiquement leur gène dans une bactérie et en les isolant classiquement, par précipitation et/ou chromatographie du milieu de culture, par exemple.

L'invention concerne également l'utilisation de tout ou partie de fragments d'ADN. On peut notamment utiliser tout ou partie de fragments d'ADN selon l'invention, d'au moins 10 pb, comme amorce pour faire une PCR ou comme sonde pour détecter in vitro ou modifier in vivo au moins un gène de café codant pour au moins une endo-p-mannanase.

Par ailleurs, la présente invention a pour objet une protéine issue de la graine de café codée par un gène de café et impliquée dans l'hydrolyse de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiés liés entre elles par une liaison P (1->4) et ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 2 ou toute séquence en acides aminés homologue à cette dernière. L'endo- P-mannanase pouvant contenir au moins une des séquences en acides aminés suivantes : SEQ ID NO : 8 à 10.

Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'hydrolyse de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiées liées entre elles par une liaison P (1->4), dans lequel (1) on clone dans un vecteur un fragment d'ADN codant pour 1'enzymes selon l'invention, ledit vecteur comprenant en outre une séquence permettant la réplication autonome ou l'intégration dans une cellule hôte, (2) on transforme une cellule hôte par ledit vecteur, (3) puis on cultive la cellule hôte transformée dans des conditions appropriées pour l'hydrolyse de tels polysaccharides.

La présente invention ouvre donc la possibilité d'utiliser des fragments d'ADN selon l'invention pour modifier la production de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiées liées entre elles par une

liaison P (1->4) dans un cellule hôte, notamment une cellule de grain de café. On peut ainsi envisager d'exprimer ou de surexprimer dans une cellule de grain de café 1'expression des ADN selon l'invention, pour produire de tels polysaccharides destinés à modifier l'arôme et la structure des grains de café, par exemple.

La présente invention permet aussi d'avoir des moyens nouveaux pour identifier des gènes de café impliqués dans l'hydrolyse de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiées liées entre elles par une liaison P (1->4).

Enfin, la présente invention fournie aussi de nouvelles enzymes impliquées dans l'hydrolyse de tels polysaccharides. Ces enzymes peuvent tre ainsi avantageusement utilisées pour synthétiser ou modifier in-vitro de tels polysaccharides.

La présente invention concerne également une cellule végétale comprenant, intégré dans son génome ou par le moyen d'un vecteur recombinant, un fragment d'ADN codant pour au moins une enzyme impliquée dans l'hydrolyse de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiés liés entre elles par une liaison ß (1->4).

De préférence, cette cellule végétale comprend un fragment d'ADN ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 ou un fragment d'ADN ayant une séquence nucléique homologue ou qui s'hybride à la séquence nucléique SEQ ID NO : 1 ou un fragment d'ADN comprenant au moins les nucléotides 11 à 1294 de la séquence nucléique SEQ ID NO : 1.

De préférence, cette cellule végétale est une cellule de café. On peut notamment choisir comme cellules de café des cellules issues de plante de Coffea canephora var. robusta, Coffea arabica ou toute autre espèce du genre Coffea.

La présente invention concerne également toute plante ou toute graine constituées de cellules végétales comprenant, intégré dans son génome ou par le moyen d'un vecteur recombinant, un fragment d'ADN codant pour au moins une enzyme impliquée dans l'hydrolyse de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiés liés entre elles par une liaison (3 (1->4).

Tout micro-organisme comprenant, intégré dans son génome ou par le moyen d'un plasmide replicable, un fragment d'ADN selon l'invention, de manière à ce qu'il exprime au moins une enzyme impliquée dans l'hydrolyse de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiés liés entre elles par une liaison P (1->4), est également un objet de la présente invention.

Un autre objet de l'invention concerne toute composition alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique comprenant un fragment d'ADN selon l'invention ou une protéine selon l'invention.

Enfin, la présente invention concerne un procédé de traitement de grains de café, dans lequel on utilise toute ou partie de la protéine selon l'invention. On peut notamment utiliser toute ou partie de la protéine selon l'invention pour augmenter le pourcentage de matière sèche extraite, lors du traitement de grains de café. En utilisant toute ou partie de la protéine selon l'invention, on peut ainsi augmenter le rendement d'extraction tout en diminuant la quantité de sédiments.

Après surexpression du fragment d'ADN selon l'invention dans un micro- organisme, dans un champignon ou dans une cellule végétale indifférenciée, on peut traiter les sédiments avec 1'enzyme plus ou moins purifiée, de manière ainsi à augmenter les rendements d'extraction.

Après surexpression du fragment d'ADN selon l'invention dans un micro- organisme, dans un champignon ou dans une cellule végétale indifférenciée, on peut également traiter la liqueur du café, de manière à diminuer la sédimentation dû aux mannanes qui gélifient.

La présente invention est décrite plus en détail ci-après à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention de fragments d'ADN, de plasmides recombinants et de bactéries transformées selon l'invention. Il va de soi, toutefois, que ces exemples sont donnés à titre d'illustration de l'objet de l'invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. La manipulation de 1'ADN, le clonage et la transformation de cellules bactériennes sont, en l'absence de précisions contraires, effectués selon les protocoles décrits dans l'ouvrage de Sambrook et al. cité plus haut. Les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire.

Test l : Isolement de 1'ADNc de l'endo-ß-mannanase de café 1. Isolement des ARN totaux et des ARN messagers poly A+ à partir du grain de café en germination Les graines de café (Coffea arabica var. caturra 2308) sont récoltées au stade mature, dépulpées immédiatement et séchées pendant trois jours à la température ambiante. Ces grains sont ensuite déparchés, séchés puis stérilisés pour tre mis en germination en culture in-vitro. Pour ce faire, ils sont placés 1 heure dans du Rovral (0.12 % v/v), rincés à l'eau stérile, placés 1 heure dans une solution d'hypochlorite de calcium (6 % p/v) à laquelle on ajoute quelques gouttes d'émulsifiant Teepol, puis sont rincés par 4 passages à l'eau stérile avant d'tre mis en culture dans des tubes à essai sur un milieu agar-eau. La germination se déroule à 25°C en présence de lumière. Le moment où les grains sont mis sur le lit d'agar est considéré comme jour après imbibition zero (JAI = 0).

On extrait les ARN totaux de grains après 22 jours de mise en germination (jours après imbibition d'eau-JAI 22).

Pour ce faire, on broie rapidement le grain dans de l'azote liquide et la poudre obtenue est resuspendue dans 8 ml de tampon à pH 8.0 contenant du Tris HC1 100 mM, 0,1% p/v de SDS et 0,5% v/v de p-mercaptoéthanol, on l'homogénéise avec un volume de phénol saturé en Tris HC1 100 mM pH 8.0, puis on centrifuge à 12000 g pendant 10 min. à 4°C, de manière à extraire la phase aqueuse que l'on centrifuge (i) une fois avec un volume équivalent de phénol, (ii) deux fois avec un volume équivalent de phénol : chloroforme (1 : 1) et (iii) deux fois avec un volume équivalent de chloroforme.

On précipite alors les acides nucléiques totaux pendant 1 h à-20°C en ajoutant à la phase aqueuse 1/10 de volume d'acétate de sodium 3 M, pH 5.2 et 2,5 volumes d'éthanol.

Puis on centrifuge le tout à 12000 g pendant 30 min. à 4°C et l'on reprend le culot dans 10 ml d'H2O, avant de précipiter à nouveau les acides nucléiques en présence de LiCI (2 M final) et d'éthanol (2,5 volumes).

Après centrifugation, on reprend le culot d'ARN totaux dans 1 ml d'H2O et on le digère pendant 1 h à 37°C à la DNAse RQ1 (Promega Corporation, 2800 Woods Hollow Road, Madison, Wisconsin 53711 USA), afin d'éliminer toute trace d'ADN, puis, on déprotéinise les ARN totaux par un traitement au phénol et au chloroforme, avant de les précipiter en présence d'acétate de sodium comme décrit ci-dessus.

On reprend alors les ARN totaux dans 500 p1 d'H2O et on les quantifie par dosage spectrophotométrique à 260 nm. Leur qualité est analysée par électrophorèse en gel d'agarose en présence de formaldéhyde.

Pour ce faire, on purifie ensuite les ARN messagers poly A+ (ARNm) à partir de 500 u. g d'ARN totaux en utilisant le système de purification Oligotex-dT (Qiagen INC., 9600 De Soto Avenue, Chatsworth, California, 91311 USA), puis on évalue la quantité des ARN messagers à l'aide du kit DNA Dipstick (InVitrogen BV, De Schelp 12,9351 NV Leek, Netherlands).

2. Construction et criblage de la banque d'ADNc On réalise la synthèse d'ADN complémentaire (ADNc), nécessaire à la construction des banques, selon les recommandations fournies dans le kit "Riboclone cDNA synthesis system M-MLV (H-)" (Promega, USA), hormis l'étape de ligature des adaptateurs EcoRI. Ceci permet de cloner ces ADNc directement dans le vecteur pPCR-Script Amp SK (+) (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, California 92037, USA). L'efficacité de cette réaction de synthèse d'ADNc est suivie par l'addition d'alpha- (32P)-dCTP lors de la synthèse des deux brins d'ADN.

Après migration sur gel d'agarose alcalin (Sambrook et al., 1989), on estime la taille des ADNc néosynthétisés comme variant de 0.2 à plus de 4.3 kb.

Les quantifications, à l'aide du kit DNA Dipstick (InVitrogen BV, De Schelp 12, 9351 NV Leek, Netherlands),-montrent qu'environ 100 ng d'ADNc sont synthétisés à partir de 1 gag d'ARNm.

Les ADNc ligaturés dans le vecteur pPCR-Script Amp SK (+) (Stratagene, USA) ont été utilisés pour transformer la souche d'Escherichia coli XL2-Blue MRF' (Stratagene, USA). On sélectionne les bactéries qui contiennent des vecteurs recombinants sur boîtes de milieu LB (Luria-Bertani) contenant 20 gag. ml-1 d'ampicilline, 80 ug. ml-1 de méthicilline et en présence d'IPTG et de X-Gal (Sambrook et al., 1989). On les cultive alors sur boîtes de pétri, pour obtenir environ 300 clones par boîte. On transfère ces clones sur filtre Nylon et on les traite ensuite selon les recommandations fournies par Boehringer Mannheim (Boehringer Mannheim GmbH, Biochemica, Postfach 310120, Mannheim 31, DE). On extrait également les plasmides de cette banque d'ADNc à partir d'une culture de nuit de ces transformants, en présence de 25 ml milieu LB contenant 50 llg. ml~l d'ampicilline, et en utilisant le kit"QiaFilter Plasmid MidiKit" (Qiagen INC., USA).

3. Isolement de 1'ADNc codant pour l'endo-ß-mannanase de café Dans une expérience préliminaire, on réalise la synthèse du premier brin d'ADNc selon les recommandations fournies dans le kit"Riboclone cDNA synthesis system M-MLV (H-)" (Promega, USA). L'efficacité de cette réaction est suivie par l'addition d'alpha- (32P)-dCTP lors de la synthèse d'ADNc.

On effectue ensuite la synthèse du deuxième brin de 1'ADNc en effectuant une réaction de RT (Reverse Transcription)-PCR (US Patent 4,683,195 et US Patent 4,683,202) en utilisant l'oligonucléotide de synthèse MAN2, ayant la séquence nucléique SEQ ID NO : 3, et l'oligonucléotide de synthèse DT15, ayant la séquence nucléique SEQ ID NO : 4. L'oligonucléotide de synthèse MAN2 correspond à la séquence en acides aminés localisée entre les acides aminés 206 et 212 de la séquence protéique de Lycopersicon esculentum (Bewley et al., Planta 203,454-459,1997) qui est également conservée au sein des séquences protéiques d'endo-p-mannanase de Trichoderma reesei (Stalbrand et al., GenBank Accession Number L25310,1993) et d'Aspergillus aculeatus (Christgau et al., Biochem Mol Biol Internat L 917-925,1994) On réalise la réaction de PCR en présence de 1 à 10 ng de premier brin d'ADNc, dans un volume final de 50 gel contenant 50 mM KC1,10 mM Tris-HCl pH 8.8,1.5 mM MgCl2,0. 1 mg. ml-1 gélatine, 0.2 mM de chaque dNTP, 0,25 uM de chaque oligonucléotide (MAN2 et DT15) et 3 unités d'ADN polymérase Taq (Stratagene, USA). On recouvre le mélange réactionnel avec 50 ul d'huile

minérale et on l'incube pendant 35 cycles (94° C-30 s, 45° C-30 s, 72° C-3 min.) suivi d'une extension finale à 72° C pendant 7 min. A l'issue de cette réaction, on obtient un produit majoritaire de PCR d'environ 600 pb qui a été purifié sur gel d'électrophorèse en utilisant le système d'extraction d'ADN « Gel Nebulizer- Micropure 0.22 u. m » (Amicon INC., 72 Cherry Hill Drive, Beverly, Massachusetts 01915 USA). Ce fragment est traité avec 1'ADN polymérase Pfu (Stratagene, USA) pour convertir ses extrémités cohésives en extrémités franches. Cette réaction s'effectue dans un volume final de 131 contenant environ 200 ng de fragment d'ADN, 1 mM de dNTP, 10 mM KC1,6 mM (NH4) 2SO4, 20 mM Tris-HCl pH 8.0,0.1% Triton ug. ml''BSA et 2.5 unités d'ADN polymérase Pfu. On recouvre le mélange réactionnel avec 20 ul d'huile et on l'incube à 72°c pendant 30 min. Le mélange obtenu est dessalé sur cartouche Microcon 50 (Amicon INC., USA) et ligaturé dans le vecteur pPCR-Script Amp SK (+) (Statagene, USA).

Pour cela, on ajoute 50 ng de fragment de PCR dans un mélange de ligature qui comprend 10 mM KC1,6 mM (NH4) 2SO4,20 mM Tris-HCl pH 8,0,1% Triton X-100,2 mM MgCl2, 10, ug. ml~l BSA, 10 ng du vecteur de clonage pPCR- Script SK (+), 5 unités de 1'enzyme de restriction SfrI, 4 unités de T4 ADN ligase et 5 mM de rATP. Cette réaction est incubée pendant 60 min. à 25° C puis est utilisée pour transformer la souche d'Escherichia coli XL2-Blue MRF' (Stratagene, USA). On sélectionne les bactéries qui contiennent des vecteurs recombinants, sur boîtes de milieu LB, contenant 20 gg. ml-'d'ampicilline, 80 pg. ml-1 de méthicilline et en présence d'IPTG et de X-Gal (Sambrook et al., 1989).

A l'issu de la transformation, on a isolé un clone qui abrite le plasmide recombinant pMANl, décrit à la figure 1 ci-après. Ce vecteur contient le fragment de PCR obtenu précédemment, qui est clone au site SfrI du vecteur pPCR-Script (SK+). Cet ADNc a été séquence selon le protocole « T7 sequencing kit » (Amersham Pharmacia Biotech AB, SE-751 84 Uppsala, Suède), en présence d'alpha-(35S)-dATP.(35S)-dATP. L'analyse de sa séquence montre qu'il est localisé entre les nucléotides 743 et 1369 de la séquence SEQ ID NO : 1 et est bordé à ses extrémités 5'et 3'par les séquences respectives homologues à l'oligonucléotide MAN2. Par comparaison avec la séquence protéique de la mannanase de Trichoderma reesei et d'Aspergillus aculeatus, on déduit que 1'ADNc ainsi clone correspond à un ADNc partiel de 1'endo-p-mannanase de café.

Pour isoler 1'ADNc pleine longueur de l'endo-ß-mannanase de café, on a ensuite réalisé une hybridation sur colonies en testant 1800 transformants d'Escherichia coli XL2-Blue MRF'de la banque d'ADNc réalisée à partir des grains de café en germination.

Les transformants sont transférés sur un filtre de Nylon Hybond N+ (Amersham International plc., Amersham place, Little Chalfont, Buckinghamshire HP7 9NA, UK) selon les recommandations du fournisseur et analysés par hybridation moléculaire avec la sonde MAN1 (50 ng). Cette sonde est obtenue après digestion du vecteur pMANl par 1'enzyme de restriction SmaI. Elle a été purifiée sur gel d'électrophorèse et marquée par extension d'amorce au hasard avec 50 tCi d'alpha- (32P)-dCTP selon le protocole du kit Megaprime (Amersham, UK). Après hybridation, lavage et autoradiographie des filtres, on détecte un clone positif qui abrite le vecteur recombinant pMAN2, décrit à la figure 2 ci-après. Ce vecteur contient un fragment d'ADN d'environ 1000 pb qui a été séquence sur les deux brins (Eurogentec Bel s. a- Parc Scientifique du Sart Tilman-4102 Seraing- Belgium). Il comprend en fait les 1022 dernières paires de base de la séquence SEQ ID NO : 1, mais ne constitue à nouveau qu'un ADNc partiel de l'endo-ß- mannanase de café.

Pour isoler l'extrémité 5'de 1'ADNc de la mannanase de café, on a réalisé une réaction de PCR selon les conditions décrites précédemment, mais à l'exception des paramètres suivants. On a utilisé 20 ng de la banque d'ADN plasmidique (22 JAI), l'oligonucléotide de synthèse MAN60, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 5 et les oligonucléotides universels Fort 13 et RevM13, qui correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO : 7.

Ces amorces sont chacune localisés à environ 100 pb de part et d'autre du site de clonage SfrI du vecteur pPCR-Script Amp SK (+). L'amorce MAN60 est quant à elle localisée entre les nucléotides 803 et 819 de la séquence SEQ ID NO : 1.

Après cette réaction, on a obtenu un fragment d'amplification MAN60/ForM13 d'environ 900 pb qui a été digéré par 1'enzyme de restriction SmaI, afin d'éliminer les séquences du plasmide pPCR-Script Amp SK (+). Cet ADN digéré a été ligaturé dans le vecteur pPCR-Script Amp SK (+) pour donner le vecteur pMAN3 décrit à la figure 3 ci-après. L'analyse de sa séquence révèle qu'il correspond à l'extrémité 5'de 1'ADNc codant pour la mannanase de café et qu'il est localisé entre les nucléotides 1 et 819 de la séquence SEQ ID NO : 1.

Comme ces expériences ne nous ont pas permis d'isoler un ADNc pleine longueur codant pour la mannanase de café, nous avons décidé de cribler à nouveau la banque d'ADN plasmidique (22 JAI), en utilisant cette fois le kit "ClonCapture cDNA Sélection Kit" (Clontech Laboratories Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto California 94303-4230 USA). Dans ce cas, on utilise la sonde MAN3 que l'on obtient par une double digestion du plasmide pMAN3, avec les enzymes de restriction BamHI et SacI. On effectue la biotinylation de cette sonde selon le protocole défini par Clontech (USA) et on l'utilise pour enrichir la banque d'ADNc en plasmide contenant tout ou partie des séquences de l'ADNc codant pour la mannanase de café. Cette banque enrichie a été amplifiée dans Escherichia coli, puis a été criblée en utilisant la sonde d'ADNc MAN3 décrite précédemment qui a été marqué par extension d'amorce au hasard selon le protocole du kit Megaprime (Amersham, UK).

A l'issu de ce crible, on a sélectionné notamment un clone positif qui contient un ADNc d'environ 1600 pb clone dans le vecteur pPCR Script Amp SK (+). Ce plasmide recombinant est nommé pMAN4, décrit à la figure 4 ci-après., et 1'ADNc qu'il abrite a été séquence. Son analyse dans la banque de donnée Genbank (release 106.0) (Genetics Computer Group Inc., University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin 53711 USA) a montré qu'il correspond à la totalité de la séquence SEQ ID NO : 1.

4. Analyse de 1'ADNc pleine longueur codant pour l'endo-, B-mannanase de café L'analyse de la séquence nucléique montre que cet ADNc pleine longueur contient à son extrémité 5'une courte séquence transcrite non traduite de 10 pb et une très longue séquence (36 pb) correspondant à la queue de poly A+ dans l'extrémité 3'transcrite non traduite de 280 pb. Au sein de cette dernière séquence, on observe l'absence de motifs de AATAAA supposés intervenir dans les mécanismes de polyadénylation mais on constate en revanche la présence de plusieurs motifs nucléiques riches en GT (position) qui pourraient jouer ce rôle (Mogen et al., Plant Cell 2 : 1261-1272,1190) On constate également la présence de deux séquences répétées inversées, très conservées entre elles ainsi que l'existence de deux grandes séquences répétées directes de 34 pb, en position 1383-1417 et 1440-1474, qui contiennent

plusieurs des répétions du motif nucléique AGT (C/A) A (T/A) (G/A). Les fonctions précises de ses séquences sont inconnues mais l'on peut supposer qu'elles interviennent dans des mécanismes de stabilité des ARN messagers ou d'efficacité de la traduction par exemple (Gallie, Plant Mol Biol, 32,145-158,1996).

La séquence SEQ ID NO : 1 contient une phase ouverte de lecture de 428 codons, qui commence par le codon ATG en position 11 et se termine par un codon TGA (A en position 1294). La protéine déduite de cet ADN complémentaire a un poids moléculaire approximatif de 48349 Da et possède un segment protéique très hydrophobe qui correspond au 30 premiers acides aminés de la séquence SEQ ID NO : 1. Cette séquence protéique pourrait correspondre à une séquence de type peptide signal. Dans ce cas, on s'attend à ce que le poids moléculaire de la protéine soit inférieur ou égal à 45000 Da sous sa forme mature.

On note aussi l'existence de plusieurs sites potentiels de glycosylation (Asn /X/Ser ou Thr). Les deux premiers sont localisés dans le peptide signal potentiel, en position 8 et 11 de la séquence SEQ ID NO : 2, et sont donc supposés tre absents dans la forme mature de la mannanase. Les deux autres sont localisés en position C-terminale, en position 389 et 412 de la séquence SEQ ID NO : 2.

Test 2 : Mesure du pic d'activité de l'endo-ß-mannanase durant la germination Des grains de la variété Coffea arabica var. caturra 2308 sont récoltés au stade mature et traités comme défini précédemment lors de l'isolement des ARN.

Les lots de grains sont récoltés à différents stades de germination (JAI 7,14 ...) puis sont broyés dans l'azote liquide. Ensuite la poudre est homogénéisée à raison de 1 g pour 5 ml dans un tampon d'extraction (phosphate-citrate 200/100 mM pH 5.0, métabisulfite Na2S205 10 mM, EDTA 5 mM, inhibiteur de protéase 'Complete' [cat. n° 1836 145, Boehringer Mannheim, Mannheim, Allemagne] 1 comprimé/50 ml) pendant 20 min. à 4°C. L'homogénat est ensuite centrifugé à 12000 g pendant 20 min. à 4°C, et le surnageant est repris et centrifugé une deuxième fois. Le surnageant, correspondant à l'extrait enzymatique brut, est ensuite aliquote et congelé à-80°C.

L'activité enzymatique de l'endo-ß-mannanase est dosée selon la méthode suivante. Un extrait enzymatique brut de 400 gel est ajouté à 1.6 ml de tampon de

réaction (NaCl 100 mM, acétate de sodium 200 mM pH 5.0) contenant du substrat insoluble (AZCL-Galactomannane, Megazyme, Co. Wicklow, Ireland) en quantité finale de 1 % p/v. La réaction débute par l'ajout de l'extrait, et se déroule à 37°C sous agitation. Pour calculer la pente initiale de la réaction, un aliquote de 400 1 de milieu est prélevé toutes les 15 min. pendant 1 h, chauffé à 100°C pendant 5 min. puis centrifugé à 12000 g pendant 2 min. La mesure de la densité optique du surnageant se fait à 590 nm et l'activité spécifique est exprimée en UA (unités d'absorption optique) min~l mg protéine~l, après avoir dosé la concentration protéique dans chaque extrait par la méthode de Bradford (Bradford, Anal.

Biochem. 72,248-254,1976). Ainsi on trouve que l'activité est quasiment nulle pendant les 14 premiers jours après imbibition (JAI), et augmente après progressivement jusqu'à un pic maximum autour de 28 JAI. Après 28 JAI, l'activité baisse lentement.

Test 3 : Etapes de purification de l'endo-ß-mannanase Selon les résultats décrits précédemment, la stratégie de purification se poursuit en utilisant 16 ml d'un extrait d'enzyme brut de 28 JAI ayant une activité autour de 0.2 UA, min l. mg protéine~l x 10-2, un contenu de protéines totales d'environ 48 mg, et une activité totale de 9.6 UA min~l x 10-2.

1. Précipitation au sulfate d'ammonium.

Dans un premier temps, 1'extrait enzymatique brut est fractionné par une précipitation au sulfate d'ammonium à 4°C. Le sulfate d'ammonium est ajouté lentement sous agitation jusqu'à un niveau de saturation de 35 % et la solution est ensuite centrifugée à 12000 g à 4°C pendant 20 min. Le culot ainsi obtenu est repris dans un minimum (1 ml) de tampon d'extraction (voir ci-dessus). Dans cet extrait, la concentration protéique est estimée à 11 mg. ml-1. L'activité spécifique endo-ß-mannanase est de 0.87 UA miri '. mg'1 x 10-2, ce qui correspond à un enrichissement de 1'enzyme d'un facteur 4 par rapport à 1'extrait brut et une récupération de 10 UA min''de l'activité totale, soit 100 %.

2. Séparation sur colonne d'interaction hydrophobe

L'échantillon décrit ci-dessus est ensuite séparé sur une colonne d'interaction hydrophobe (Hiload HR 16/10 phényl sépharose High performance, Amersham Pharmacia Biotech, Suède). La colonne est préalablement équilibrée avec un tampon d'équilibration (phosphate de sodium 50 mM, 400 mM sulfate d'ammonium, pH 7.0). L'échantillon (1 ml) est ensuite injecté sur la colonne qui est ensuite lavée avec 5 volumes de colonne du tampon d'équilibration. Un gradient de 0 à 99.5 % d'eau en 0.5 volumes de colonne est appliqué suivit d'un autre de 99.5 à 100 % en 5 volumes de colonne. L'activité est concentrée principalement dans trois fractions qui sont utilisées pour continuer la purification.

Le rendement de purification de cette étape est de 79 % par rapport à l'étape précédente. L'activité spécifique est de 27 UA min~l. mg~l, soit un enrichissement d'environ 137 fois par rapport à 1'extrait brut. L'activité totale récupérée est d'environ 9 UA mini'x 10-2 soit 90 % de l'activité initiale.

3. Séparation par chromatographie échangeuse d'ions Les trois fractions décrites ci-dessus sont mélangées, concentrées et changées de tampon grâce à des tubes Ultrafree (Millipore, Bedford, MA, USA, centrifugation à 4000 g maximum). Le volume récupéré est de 1 ml. Cet échantillon est injecté sur une colonne Resource Q (Amersham Pharmacia Biotech AB SE-751 84 Uppsala Suède) échangeuse d'anions, préalablement équilibrée avec un tampon Tris/HCl 20 mM, pH 8.0. L'élution est réalisée avec un gradient linéaire de 0 à 1 M NaCl en 20 volumes de colonne. L'activité totale récupérée est présente exclusivement dans deux fractions. Le rendement de purification de cette étape est de 58 % par rapport à l'étape précédente. L'activité spécifique est de 167 UA min \ mg'\ soit un enrichissement d'environ 836 fois par rapport à l'extrait brut. L'activité totale récupérée est 0,9 UA min~, soit environ 9 % de l'activité initiale.

4. Séparation par colonne de filtration sur gel A partir de la colonne échangeuse d'anions, les deux fractions récupérées sont concentrées par centrifugation à 4000 g à 100 1 en utilisant les tubes Ultrafree (Millipore Co, 80 Ashby Road Bedford, MA, USA). Cet échantillon est injecté sur une colonne Superdex 75 HR 10/30 (Amersham Pharmacia Biotech, Suède) préalablement équilibrée avec un tampon de phosphate de sodium 50 mM,

NaCl 150 mM, pH 7.0. Les protéines sont éluées avec le mme tampon avec un débit de 0.3 ml. mini'. Une courbe de calibration de la colonne est réalisée dans les mmes conditions grâce à des standards de poids moléculaire. L'activité endo-- mannanase est répartie dans deux fractions, correspondant à un poids moléculaire entre 40 et 55 KDa. Le rendement de purification de cette dernière étape est de 48 %. L'activité spécifique est d'environ 1400 UA min~l. mg~l, soit un enrichissement de 7000 fois par rapport à 1'extrait brut. L'activité totale est de 0.45 UA min'\ soit 4.5 % de l'activité initiale.

5. Analyses par électrophorèse bi-dimensionelle et micro-séquençage des acides aminés de l'enzyme purifiée Les fractions possédant l'activité enzymatique en sortie des colonnes décrites précédemment sont analysées au cours de la purification par des électrophorèses bi-dimensionelles. Pour ce faire, les fractions sont mélangées et concentrées jusqu'à 20 1 par une centrifugation dans les tubes Ultrafree (Millipore, USA) comme décrit précédemment. A ce volume, on ajoute 105 1 de tampon de réhydratation (urée 8 M, CHAPS 3 % p/v, ampholines 0.8 % v/v, DTT 1 % p/v) et on réhydrate un gel strip de 7 cm non-linéaire (pH 3.0 à 10.0) (Immobiline Dry Strip, Amersham Pharmacia Biotech, Suède), selon les instructions du fabricant. Les protéines sont ensuite séparées en fonction de leur point isoélectrique (pI) en utilisant, par exemple, le système IPGphore (Amersham Pharmacia Biotech, Suède) en employant un nombre total de 14 000 volt-heures.

Suivant la séparation des protéines en fonction de leur pI, elles sont ensuite séparées dans une deuxième dimension selon leur poids moléculaires. Cette séparation est réalisé selon les recommandations de Hochstrasser et al. (Anal Biochem, 173,412-423,1989) et de Gorg et al. (Electrophoresis, 8,122-124, 1987). Ainsi, le gel strip de la première dimension est équilibré dans une première solution (urée 6 M, glycérol 30 % v/v, SDS 2 % p/v, DTT 2 %, Tris-HCl 50 mM, pH 8.0) pendant 5 min., puis est équilibré dans une deuxième solution (urée 6 M, glycérol 30 % v/v, SDS 2 % p/v, iodoacétamide 2.5 % p/v, Tris-HCl 50 mM, pH 8.0) pendant 10 min. Le gel strip est ensuite chargé dans un gel de gradient de concentration d'acrylamide 10-20 % (dimensions 10 x 10 x 0.75 cm) avec un seul puit, et recouvert d'une solution d'agarose (agarose 1 % p/v, SDS 0.5 % p/v, traces de bleu de bromophénol) préalablement chauffée à 90°C et maintenue à 40°C. Le gel est monté dans un système d'électrophorèse vertical et est soumis à

une tension de 170 V pendant 2 h. Après la migration, les protéines sont colorées à l'argent selon la méthode de Bjellqvist et al. (Electrophoresis, 14,1357-1365, 1993). Le profil du mélange des trois dernières fractions ainsi obtenu montre la présence d'un seul groupe de protéines qui consiste en une ligne de 5 protéines ayant le mme poids moléculaire approximatif de 48 kDa mais possédant de faibles différences de pI.

Les protéines ainsi purifiées sont analysées par une micro-séquençage des acides aminés. Pour ce faire, elles sont transférées sur une membrane PVDF ('Problot', Perkin Elmer-Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404, USA) en utilisant, par exemple, une cellule de transfert Trans- Blot (Bio-Rad, 2000 Alfred Drive, Hercules, California 94547, USA). Ainsi, suivant la séparation de la deuxième dimension, le gel est récupéré et mis en agitation dans une solution de transfert (méthanol 10 % v/v, CAPS-NaOH 10 mM pH 11.0) durant 10 min. Pendant ce temps deux supports de mousse, deux morceaux de papier Whatman et une membrane PVDF-Problot (Perkin Elmer- Applied Biosystem, USA) sont humidifiés dans le mme solution. Le gel, la membrane et les supports sont montés dans le système Trans-Blot, selon les instructions du fabricant (Bio-Rad, USA), et le transfert est réalisé sous un courant de 100 V pendant une heure à une température de 4°C. A la fin du transfert, les protéines transférées sur la membrane sont révélées avec une coloration légère de bleu de Coomassie selon les instructions du fabricant de la membrane Problot. Les différentes protéines sont excisées de la membrane, mélangées et séquencées ensemble. Le séquençage N-terminal des protéines purifiées et des peptides internes est réalisé avec un séquenceur automatique Beckman (Beckmann Instruments Inc., 250 Harbor Boulevard Box 3100, Fullerton, California, 92634 USA) selon les méthodes décrites dans Teixeira et al. (Electrophoresis, 18,1491- 1497).

Trois séquences sont obtenues par cette méthode. Une séquence N- terminale de 22 acides aminés, appelée SEQ ID NO : 8, et deux autres concernant des peptides internes indépendants de 10 (appelée SEQ ID NO : 9) et 17 (appelée SEQ ID NO : 10) acides aminés. Toutes les séquences obtenues sont sans ambiguïtés, et montrent que les 5 protéines, qui composent la ligne décrite précédemment, sont des isozymes de l'endo-ß-mannanase qui partagent une séquence identique dans les régions concernées.

Les trois séquences SEQ ID NO : 8 à 10 ont une très forte homologie avec la séquence SEQ ID NO : 2. En particulier, la séquence SEQ ID NO : 8 s'aligne avec une forte homologie contre les acides aminés 35 à 50 de SEQ ID NO : 2.

Cette région correspond exactement à la séquence N-terminale de 1'endo-p- mannanase du grain de café sous sa forme mature, qui commence juste après un peptide leader correspondant aux acides aminés 1 à 34 de SEQ ID NO : 2. De plus, les séquences internes SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10 s'alignent avec une très forte homologie avec les régions de SEQ ID NO : 2 correspondant respectivement aux acides aminés 93 à 102 et 259 à 275.

A partir de la purification et l'analyse par micro-sequencage décrit ci- dessus, on peut conclure que 1'enzyme ayant l'activité endo-ß-mannanase dans la graine de café en cours de germination partage la mme séquence que la protéine décrite par la séquence SEQ ID NO : 2.

Test 4 : Expression de la mannananse de café dans Escherichia coli Pour surexprimer et purifier la mannanase de café dans Escherichia coli, on a réalisé une amplification par PCR de la séquence d'ADNc comprise entre les nucléotides 89 et 1313 de SEQ ID NO : 1 avec les oligonucléotides TAM1 et TAM2 qui présentent respectivement les séquences SEQ ID NO : 11 et 12. Ces deux oligonucléotides permettent d'introduire les sites uniques BamHI et PstI dans la séquence de café amplifiée par PCR. Ils permettent également d'amplifier la séquence d'ADN de café codant pour la mannanase de café mais dépourvue de sa séquence d'adressage cellulaire appelée"peptide signal", qui est comprise entre les acides aminés 1 et 26 de la séquence SEQ ID NO : 2. Cette stratégie a été suivie afin de limiter les effets toxiques dus à une surexpression dans Escherichia coli des protéines qui contiennent des séquences très hydrophobes.

Cette réaction s'effectue en présence de 50 ng de vecteur pMAN4, dans un volume final de 100 u. l contenant 1.5 unités d'ADN polymérase Pwo (Boehringer Mannheim), 10 go de tampon 10 x ADN polymérase Pwo (Boehringer Mannheim), 0.1 mM de chaque dNTP et 0.1 p1M de chaque oligonucléotide (TAM1 et TAM2). On incube le mélange réactionnel pendant 30 cycles (94° C-30 s, 40° C-60 s, 72° C-2 min.) suivi d'un cycle extension finale à 72° C pendant 7 min. On digère ensuite 30 p. l du mélange de PCR par les enzymes de restriction BamHI et PstI selon les recommandations fournies par Promega (USA).

Le fragment d'ADN de café (1231 pb) amplifié par PCR est séparé par électrophorèse sur gel d'agarose 0.8% et purifié selon les recommandations fournies dans le kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen, USA). Il est ensuite ligaturé dans le vecteur d'expression pQE31 (Qiagen, USA) préalablement digéré par les enzymes BamHI et PstI et déphosphorylé par un traitement à la phosphatase alcaline d'intestin de veau. L'utilisation du vecteur d'expression pQE31 permet d'introduire 6 histidines (6 His tag) en phase avec l'extrémité N- terminale de la mannanase de café ce qui permet ensuite la purification de cette protéine recombinante après passage sur une colonne de résine Ni-NTA contenant des ions Ni2+ (Hochuli et al, J. Chromatography, 411,177-184,1987).

Le mélange de ligation a été utilisé pour transformer les cellules compétentes de la souche M15 [pREP4] d'Escherichia coli selon les recommandations fournies par Qiagen (USA) et les bactéries recombinantes ont été sélectionnées sur boîtes de milieu LB contenant 25 ug. ml-1 de kanamycine et 100, ug. ml~l d'ampicilline.

Pour tester 1'expression de la mannanase de café dans Escherichia coli, les bactéries sont ensuite cultivées dans 50 ml de milieu LB liquide supplémenté avec les antibiotiques comme indiqué précédemment jusqu'à une DO à 600 nm =1.

L'induction s'effectue par l'addition d'IPTG (concentration finale 1 mM) dans le milieu de culture et les prélèvements de culture sont réalisés toutes les 30 min. Les bactéries sont lysées et les protéines solubles d'Escherichia coli sont extraites en conditions dénaturantes et séparées sur une colonne de résine Ni-NTA en suivant le protocole défini par QIAGEN (QIAexpress system). Les fractions protéiques éluées successivement ont ensuite été analysées par électrophorèse SDS-PAGE.

Nous avons pu ainsi montrer que la seule protéine capable de se fixer sur la colonne Ni-NTA correspond à la mannanase de café. Cette protéine est exprimée dans Escherichia coli avec un poids moléculaire approximatif de 45 kDa qui est en accord à celui observé par électrophorèse sur les fractions purifiées de la mannanase obtenue à partir des grains en germination à 28 JAI, et ceci compte tenu des modifications de séquence protéique qui ont été réalisées lors de la construction du vecteur d'expression.