[001] A presente invenção refere-se de forma geral à combinação entre Crotamina e fármacos utilizados na terapia. Mais especificamente, a presente invenção refere-se à combinação de Crotamina, toxina do veneno de animais peçonhentos a fármacos utilizados na terapia antileishmania clássica. A presente invenção ainda provê uma composição farmacêutica, um medicamento, método para tratar Leishmaniose e uso da composição. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] As leishmanioses formam um complexo de doenças transmitidas por vetores chamados flebotomínios do género Lutzomunia no novo mundo e pelo género Phlebotomus no velho mundo. Este complexo de doenças afeta 12 milhões de pessoas no planeta (DESJEUX, 2004).

[003] Segundo a WHO/OMS (2010), 90% dos casos de

Leishmaniose Visceral ocorrem em Bangladesh, Brasil, índia, Nepal e Sudão e 90% dos casos da forma cutânea ocorrem no Afeganistão, Brasil, , Peru, Arábia Saudita e Síria. Por sua vez, a forma mucocutânea está presente em países como a Bolívia, Brasil e Peru (STUART et al., 2007; MS, 2007; WHO/OMS, 2010 e 2011). A WHO/OMS enquadra essa doença como uma das seis doenças infecto-parasitárias endémicas de maior relevância, pelo seu alto coeficiente de detecção e capacidade de produzir deformidades (CHAPPUIS et al., 2007; WHO/OMS/TRS, 1990).

[004] As leishmanioses se manifestam em duas formas clínicas principais: leishmaniose visceral (I), que pode ser fatal se deixada sem tratamento, e tegumentar (Π), cujas formas mucocutânea e cutânea causam lesões que geralmente se curam espontaneamente, mas podem deixar cicatrizes ou deformidades, o que leva essa doença infecciosa a ser classificada como uma das seis mais importantes do planeta dada a sua gravidade e prevalência (MAHNKE, 2014).

[005] A forma visceral é considerada a mais grave dentre as leishmanioses. Como o seu nome sugere, acomete as vísceras, afetando principalmente órgãos com alta concentração de leucócitos com destaque para medula óssea, fígado, baço e linfonodos levando frequentemente a anomalias no tamanho desses órgãos. Esta doença pode levar a óbito até 90% das pessoas acometidas pela doença se deixadas sem tratamento.

[006] O tratamento de primeira escolha para leishmaniose visceral são os antimoniais pentavalentes. Em casos mais graves, ou em pacientes que não respondem adequadamente ao tratamento com os antimoniais, a Anfotericina B é a segunda escolha. Em último caso, o fármaco de escolha é a Pentamidina. Todos esses tratamentos apresentam inadequações como baixa taxa de cura, efeitos adversos tais como nefrotoxidade, esplenotoxidade, pancreotoxidade, cadiotoxidade, que sugerem a urgência na descoberta ou desenvolvimento de novas medicações ou alternativas para aumentar a eficiência e diminuir a toxidade ao paciente.

[007] A forma cutânea apresenta lesões clássicas que correspondem à ulceração de bordas elevadas, enduradas e de fundo com tecido de granulação, que pode evoluir para a forma mucosa por disseminação hematogênica ou linfática do parasita (REY, 2008; MARZOCHI, 1992).

[008] O parasito causador da Leishmaniose é um protozoário patogênico da família Trypanosomatidae. Atualmente, as Leishmanias que afetam o homem são classificadas em dois complexos fenotípicos agrupados em dois subgêneros, englobando várias espécies cada um deles. O complexo Viarmia que inclui o complexo brasiliensis, gutanensis, lainsoni, naifi e o Leishmania que inclui mexicana, infantum, amazonensis, enrietii e hertigi (MARZOCHI, 1992).

[009] Morfologicamente, o parasito pode apresentar três formas distintas: amastigota, promastigotas e paramastigota.

[0010] A forma amastigota é obrigatoriamente intracelular, habitando o interior das células do sistema fagocítico mononuclear de hospedeiros mamíferos. Possui forma arredondada ou ovalada, com cinetoplasto apresentando vacúolos e é aflagelada. (MARZOCHI, 1992).

[0011] A forma promastigota é alongada, apresenta flagelo livre, é móvel com núcleo localizado na região central da célula, o cinetoplasto entre a região anterior e o núcleo apresenta granulações e pequenos vacúolos. Esta forma habita o trato digestório dos hospedeiros invertebrados (MARZOCHI, 1992; MICHALICK e RIBEIRO, 2011).

[0012] As formas paramastigotas apresentam forma ovaladas ou arredondadas semelhantemente às amastigotas, com cinetoplasto margeando o núcleo ou posterior a este, pequeno flagelo livre e são encontradas aderidas ao trato digestório do vetor.

[0013] O ciclo do parasito causador da Leishmaniose inicia com a fêmea do flebotomínio, quando realiza o repasto sanguíneo em um hospedeiro mamífero infectado, acaba ingerindo formas amastigotas do parasito livres na circulação ou no interior de macrófagos. Se o sangue ingerido durante esse processo possuir parasitos, ele vai para o intestino médio do inseto e as amastigotas transformam-se em promastigotas procíclicas, após cinco dias transformam-se em promastigotas metacíclicas voltando a ser infectante aos hospedeiros mamíferos. [0014] As promasti gotas metacíclicas migram para a probóscide do vetor e durante o hematofagismo são inoculadas no hospedeiro vertebrado (BATES, 1994). A presença de moléculas como a lipopolisacaridase e a proteína GP63 fazem com que estas formas resistam à ação lítica do complemento permitindo rápida fagocitose por células do sistema imune como Neutrófilos, Células Dendríticas e, principalmente, Macrófagos que foram atraídos até o local da inoculação iniciando uma reação inflamatória à infecção como afirmou Gueirard et ah, (2008).

[0015] Após o processo de internalização e formação do vacúolo parasitóforo, as formas promasti gotas deste parasito diferenciam-se em formas amastigotas, aptas a se multiplicarem. Essas formas multiplicam-se em divisão binária até a ruptura da célula liberando na circulação as amastigotas que poderão infectar novas células vizinhas e novos vetores que venham a realizar o repasto neste hospedeiro infectado, podendo inclusive infectar animais domésticos que funcionarão como reservatórios da doença (SAKTHIANANDESWAREN et al. 2009).

[0016] O sistema imunológico do hospedeiro possui papel essencial na patogênese e no controle da infecção (NOVAIS, 2013). O parasita intracelular deve ser contido, enquanto a resposta imunitária patológica tem de ser controlada (LAKHAL-NAOUAR, 2015). Vários mecanismos estão envolvidos na resposta imunológica do hospedeiro dependente especialmente da produção de IL-12 que pode direcionar a uma resposta do tipo Thl, produção de IFN-γ e de NO (LAKHAL-NAOUAR, 2015; CARVALHO, 2015) que, em conjunto com IL-6 e IL-7 majoritariamente, poderão induzir a uma resposta imunológica celular e humoral favoráveis ao controle da infecção (HEZARJARIB, 2014). Em contraste, TGF-β, IL-10 e IL-13 representam algumas das mais importantes citocinas relacionadas à promoção da doença podendo direcionar à resposta do tipo Th2 do hospedeiro (MARTINS, 2013).

[0017] A qualidade da resposta de células T, definida pelo padrão de produção de citocinas, sugere a importância de células CD4 e de células T que produzem especificamente o IFN-γ, TNF-α e IL-2 para a proteção. Além disso, o envolvimento das células T reguladoras e de memória podem influenciar significativamente a evolução da leishmaniose, no entanto, sem a intervenção quimioterápica, somente o sistema imunológico não se mostra suficiente para o controle da doença (LAKHAL-NAOUAR, 2015; CARVALHO, 2015).

[0018] Os tratamentos para as Leishmanioses são pouco justificáveis por possuírem uma efetividade abaixo da desejada. Eles podem ser tópicos ou sistémicos, em que a tomada de decisão para a escolha é baseada na espécie de Leishmania envolvida na infecção, região geográfica e apresentação clínica dos sintomas (MONGE-MAILLO, 2013).

[0019] Para muitos casos de leishmaniose cutânea localizada ou difusa com no máximo de quatro ulcerações menores que 4 centímetros os tratamentos locais podem ser administrados, como termoterapia, crioterapia, paromomicina, infiltração local de antimoniais, pois, essas opções vêm mostrando-se eficientes e garantem menor toxidade e possibilidade de tratamento ambulatorial, reservando os tratamentos sistémicos a casos mais complexos (MONGE-MAILLO, 2013)

[0020] As drogas preconizadas para o tratamento sistémico das leishmanioses são os antimoniais pentavalentes: estibogluconato de sódio (Pentostam ^® , produzido pela GlaxoSmithKline (GSK) e antimoniato de meglumina (Glucantime ^® ), produzido pela Aventis, além de outros agentes antileishmaniais como Pentamidina, produzido pela Aventis e a Anfotericina B, produzido pela Bristol-Myers Squibb (CROFT, 2003).

[0021] No entanto, essas drogas apresentam elevada toxicidade para vários órgãos e sistemas, fato este que limita a sua utilização, sugerindo uma urgência no desenvolvimento de novas drogas que curem a leishmaniose de maneira eficaz e com menores efeitos colaterais para os pacientes (PETERNSEN, 2012; TIUMAN, 2011).

[0022] O alvo das drogas é a forma amastigota intracelular do parasito que reside no interior do vacúolo parasitóforo de células fagocitárias, especialmente macrófagos. Esse vacúolo possui um ambiente pH entre 4,5 e 5,0, fato que modifica as estratégias de nutrição e homeostase iônica do parasito envolvendo uma série de transportadores que podem mediar a entrada e saída de drogas desse ambiente, determinando a suscetibilidade do parasito ao tratamento. Não obstante, diferentes espécies podem ter desenvolvido as suas estratégias de evasão que podem afetar profundamente a sensibilidade ao tratamento (BURCHMORE, 2001).

[0023] O mais recente interesse na classe de drogas antiparasitárias está focado no aumento da eficácia, diminuição dos efeitos colaterais e nos baixos custos das drogas genéricas (CROFT, 2003). Por exemplo, a utilização da Pentamidina apresenta severas limitações devido a sua toxicidade. Não obstante, desde a sua introdução em 1952, essa droga possui valor no tratamento da Leishmaniose Cutânea, Leishmaniose Visceral e Leishmaniose Cutânea Difusa, embora normalmente seja utilizada como a segunda linha de tratamento quando os antimoniais pentavalentes mostram- se ineficazes (CROFT, 2003).

[0024] O antibiótico poliênico, Anfotericina B mostra-se excelente opção contra L donovani resistente ao tratamento com os antimoniais pentavalentes, embora a AnB apesente alta toxicidade e necessite que seja feita uma infusão lenta que dura horas por via parenteral, fato que sugere cuidados médicos durante a aplicação do tratamento (LIMA et al., 2007).

[0025] Mesmo apresentando limitações, a Anfotericina B vem se beneficiando de formulações lipídicas que reduzem a sua toxicidade e estende a meia-vida da droga em comparação com a droga usada no tratamento antifungico. A formulação lipídica (Ambisome ^® , incorporado em um complexo lipídico) ou em colesterol (Ampholin ^® , como um dispersor coloidal) vem apresentando bons resultados para Leishmaniose Visceral ou Leishmaniose Cutânea Difusa atingindo até 90% de cura. No entanto, o alto custo desse medicamento limita severamente o seu uso, o que prejudica os países mais pobres, justamente aqueles que mais necessitam da droga devido à incidência de Leishmaniose. (BAGINSK et al., 2005; MURRAY et al., 2005).

[0026] Casos de insucesso na quimioterapia com antimoniais pentavalentes vêm sendo relatados em Leishmaniose Mucocutânea e Visceral há muitas décadas (GROGL et al., 1992). Já é bem postulado que a resposta imune do hospedeiro vertebrado é importante para a cura desta doença (WILSON, 1990), mas dados recentes sugerem que a falha terapêutica pode estar relacionada a fatores mediados pelo parasito (BERMAN et al., 1982).

[0027] Berman et. Al., (1985) demonstraram que os antimoniais pentavalentes na quimioterapia das leishmanioses apresentam vários fatores que limitam o seu uso, como sua alta cardiotoxicidade e regimes de tratamento muito prolongados nem sempre efetivos. Um paciente que apresenta lesões resistentes ao tratamento não significa que seja portador de uma cepa resistente, fato muitas vezes argumentado, mas difícil de ser demonstrado. O mais provável é que os pacientes refratários ao tratamento sejam, em geral, indivíduos que apresentam estado imunitário deficiente. O Glucantime ^® não age senão à medida em que os macrófagos estejam estimulados e o doente comece a se defender contra o parasita. Neste sentido, os imunodeprimidos não respondem bem ao tratamento. Por esse motivo a OMS tem estimulado as pesquisas com drogas alternativas, sendo propostos multicentros de investigações no Mediterrâneo e África para leishmaniose Visceral e na América do Sul para Leishmaniose Tegumentar, visto que a associação do vírus AIDS com a Leishmaniose tem tido sua casuística aumentada especialmente em países africanos (MACHADO et al., 1992).

[0028] Diversos estudos demonstraram que diferentes mecanismos celulares podem mediar a resistência às drogas em células eucariotas. A resistência aos quimioterápicos nestas linhagens pode ser mediada por quatro mecanismos principais, como: a redução da captação de droga pelas células resistentes (I), aumento da produção da enzima alvo da droga (Π), diminuição da afinidade da enzima alvo pela droga (ΙΠ) e a extrusão da droga citotóxica pelas células resistentes (IV) (ENDICOTT, 1989). A investigação da resistência às drogas em Leishmania spp. Tem sido realizada, sendo seleção in vitro de linhagens resistentes por aumento gradual de concentração de drogas um modelo interessante. Vários autores desenvolveram estudos realizando esta metodologia, empregando como modelo, drogas relacionadas ao tratamento desta doença como os antimoniais pentavalentes (BERMAN et al., 1982) ou drogas citotóxicas não relacionadas com a quimioterapia da Leishmaniose (CODERRE et al., 1983; OUELLETTE et al., 1990). [0029] Diferentes autores sugerem mecanismos prováveis de resistência aos compostos antimoniais, dentre eles podem ser citados: a redução da capacidade de conversão do SbV em SblII; a formação de conjugado entre Sb e o tiol intracelular (tripanotiona (TSH)) por conjugase/transferase não identificadas; e a extrusão de Sb por transportadores de efluxo ABC (LIMA et al., 2007). Esta resistência ao Sbm parece ser semelhante ao arsenito e podendo ocorrer resistência cruzada do SblII com o Asm (HAIMEUR et al., 2000). Por outro lado, o tratamento incompleto ou subdose da terapia por pacientes em locais com focos endémicos, podem resultar no aparecimento de Leishmania com baixa sensibilidade aos antimoniais pentavalentes (LUCUMI et al., 1998). A inerente resistência do parasito ao antimonial ou defeitos sutis na farmacocinética ou sistema imune do hospedeiro podem também ser importantes (BERMAN, 1988). Desjeux (2005) afirmou haver cerca de 60% de não responsivos ao SbV em Binar, na índia, onde recomenda-se prolongado tratamento e uso de fármacos alternativos.

[0030] Antimoniais Pentavalentes

[0031] Nos últimos 90 anos, o antimonial pentavalente (Sb+5) é a droga de primeira escolha recomendada para o tratamento das leishmanioses, estando disponíveis em duas formulações: o ant moniato de N-metilglucamina (Glucantime ^® ) e o estibogluconato de sódio (Pentostam ^® ) (LIMA et al, 2007).

[0032] Os antimoniais pentavalentes, como o estibogluconato de sódio (Pentostam ^® ) e o antimoniato de N-metil glucamina (Glucantime ^® ), ainda são as principais drogas utilizadas no tratamento das Leishmanioses. Na França e no Brasil emprega-se o Glucantime ^® , apresentado em ampolas de 5mL, enquanto que nos países de língua inglesa utilizam o Pentostam ^® , que apresenta a vantagem de ser administrado pela via intravenosa.

[0033] No antimoniato de meglumina, o Sb foi identificado complexado à metil glucamina nas estequiometrias 1:1, 1:2, 2:2 e 2:3 sendo que, em soluções concentradas presentes nas preparações comerciais, a mistura predominante consiste de complexos Sb-meglumina de estequiometria 2:2, 2:3 e 2:1 (FRÉZARD et al., 2008).

[0034] A estrutura química dos antimoniais pentavalentes é complexa. O N-Metilmeglumina, possui peso molecular de 333,33432 g/mol, fórmula molecular C14H23NO8, 8 ligações doadoras e 9 receptoras de hidrogénio, carga 0 e 2 ligações covalentes. Seu nome de acordo com a IUPAC é Mdroxi(ílioxo)- ⁵ -estibano;(2R,3R,4R,5S)-6-(metílamino)hexano- 1,2,3,4,5-pentol.

[0035] O Estibogluconato de Sódio apresenta peso molecular de

925,895288 g/mol, fórmula molecular Ci2H35Na3026Sl¾, 16 ligações doadora de hidrogénio e 27 aceitadoras, carga 0 e 13 ligações covalentes.

[0036] A farmacocinética indica que mais que 80% da dose administrada é excretada dentro de 24 horas na urina na forma inalterada. É eliminada em duas fases. Na primeira fase, a meia-vida é pequena e aproximadamente de 2 horas e na segunda fase, a meia-vida é mais lenta, cerca de 76 horas. O estibogluconato de sódio e N-metilglucantime apresentam farmacodinâmica e farmacocinética semelhantes.

[0037] O mecanismo de ação preciso dos antimoniais pentavalentes permanece incerto. É pressuposto que várias enzimas de Leishmania spp. sejam inibidas seletivamente. Esses agentes também parecem inibir a fosfofrutoquinase, com subsequente bloqueio da produção de adenosina trifosfato. [0038] O que se sugere sobre o mecanismo de ação dessas drogas é que o antímônio pentavalente pode ser uma pró-droga, sendo convertido a antimônio trivalente após sua administração (ROBERTS, 1998). Dessa forma, poderia interferir no processo de b-oxidação de ácidos graxos e glicólise do parasita, levando à uma depleção dos níveis de ATP intracelular do parasito (BALANÃ-FOUCE, 1998). Além disso, existe na forma amastigota uma metaloprotease zinco dependente, que poderia ser inativada se o antimônio substituísse o zinco nesta enzima, essencial para o desenvolvimento do parasita (BANGS,2001).

[0039] Os antimoniais podem ser absorvidos após aplicação por via parenteral, intravenosa ou intramuscular. A dose padrão para a leishmaniose cutânea é de 20mg ^~1 por dia, durante 20 dias e por 28 dias para leishmaniose visceral, podendo variar até 40 dias. Os antimoniais pentavalentes são rapidamente eliminados pela urina e a administração é feita por via parenteral, intramuscular ou endovenosa. (LIMA et ai, 2007; CROFTS e COOMBS, 2003).

[0040] Os antimoniais utilizados no tratamento da Leishmaniose apresentam severos efeitos colaterais, tais como arritmias cardíacas, nefrotoxidade, pancreotoxidade e hepatotoxicidade.

[0041] Motta (2012) e Kato (2014) relatam que a N-metilglucamina e estibogluconato de sódio na dose de 15 mg Sb V/kg/dia por 20 dias, apresentaram eficácia similar apesar do grupo tratado com estibogluconato de sódio ter apresentado maior toxicidade, visto que os níveis de ALT, AST, amilase e lipase foram significativamente maiores para esse grupo.

[0042] Um estudo com hamsters tratados por 20 dias com as doses de 120, 160 ou 240 mg Sb V/kg/dia com os compostos antimoniais pentavalentes para avaliação da toxicidade e efeitos colaterais dos fármacos, nos dias 0, 5, 10, 20 e 25 dias após o tratamento, demonstrou que não há diferenças em relação ao grupo sem tratamento nos valores séricos de ALT, AST, amilase e creatinina (KATO, 2014), embora o Pentostam ^® tenha apresentado maior toxicidade que o Glucanlime ^® em relação às alterações produzidas no local de aplicação do fármaco e pelo aumento nos valores da enzima creatino quinase (CK) (KATO, 2014; HENAO et al., 2004).

[0043] Em relação às alterações hepáticas, o aumento nos teores das enzimas hepáticas tem sido observado em pacientes com o uso de compostos antimoniais (LAWN e ARMSTRONG et al., 2006; LIMA et al., 2007). Elevações de duas a três vezes em relação aos valores basais são frequentemente observados durante a terapia (FRÉZARD, 2009). O estibogluconato de sódio está associado a danos hepáticos agudos e diminuição na capacidade funcional metabólica do fígado, os quais são normalmente reversíveis com interrupção do tratamento (HEPBURN et al., 1993).

[0044] Em relação às alterações pancreáticas relacionadas à toxicidade do tratamento com antimoniais pentavalentes, um estudo com 65 sujeitos infectados pelo subgênero L (Viannia), assintomática, demonstrou ocorrência de pancreotoxicidade em 67% dos pacientes que utilizaram, 20 mg/kg de SbV Pentostam ^® uma vez ao dia por 21 (LC) ou 28 (LM) dias, principalmente após a segunda semana de tratamento (LAWN e ARMSTRONG et al., 2006). Deps et al. (2000), em ensaio clínico com 63 pacientes que receberam 15 mg Sb V/kg/dia de estibogluconato de sódio ou antimoniato de meglumina por 20 dias, revelou toxicidade pancreática através do aumento dos níveis de amilase e lipase nos dois grupos terapêuticos. [0045] Com relação às alterações renais, os compostos antimoniais alteram reversivelmente a capacidade de concentração urinária (VEIGA et al. 1990). Neste sentido, Goodwin et al. (1943) apontaram a membrana tubular como sítio de predição dos efeitos funcionais dos metais pesados no rim, fato que explicaria a diminuição da concentração da urina.

[0046] O tratamento de ratos com antimoniais pentavalentes na dose de 30 mg/kg do antimoniato de meglumina ou estíbogluconato de sódio, durante trinta dias, induziu disfunção tubular caracterizada por diminuição da capacidade de concentração urinária, porém tais alterações parecem ser reversíveis após suspensão do uso desses fármacos e, nessa dose, não foram observadas alterações histopatológicas renais. Estudo realizado com antimonial pentavalente na dose de 40mg Sb V/kg/dia mostrou efeitos nefrotóxicos através da diminuição da depuração de creatinina, elevação da fração de excreção de sódio e diminuição na capacidade de concentração urinária (SAMPAIO, DE PAULA et al., 1997)

[0047] As alterações cardiovasculares também são uma grande preocupação nos tratamentos com antimoniais pentavalentes. Thakur e Sinha et al. (1998) relataram que entre 1995-1996 morreram mais pacientes em decorrência do tratamento que por causa da Leishmaniose em Binar.

[0048] Anfotericina B (AnB)

[0049] A AnB é a droga de segunda escolha em muitos países, mas no Estados Unidos e Europa é utilizada como a primeira escolha do tratamento. Mesmo as drogas usadas na segunda linha de tratamento também apresentam elevada toxicidade, podem não curar e causar resistência (LIMA et al, 2007). A AnB é considerada como droga de primeira escolha no tratamento da leishmaniose em gestantes e de segunda escolha quando não se obtém resposta ao tratamento com o antimonial pentavalente ou na impossibilidade de seu uso (BRASIL, 2007).

[0050] A molécula de AnB apresenta aproximadamente 24 À de comprimento, com peso molecular de 923,48 g/mol, uma de suas extremidades encontra-se um resíduo micosamina (lactona) com um grupamento amina livre, formando uma cadeia lateral frequentemente designada como "cabeça polar" da molécula (FILLIPPIN e SOUZA, 2006; OLIVEIRA, 2008; JUNG, et al., 2009).

[0051] A Anfotericina B atua na inibição da síntese de ésteres de membrana interagindo diretamente com o ergosterol ocasionando a morte celular do parasito (BAGINSK et al., 2005; LIMA et al., 2007).

[0052] A AnB incorporada em lipossomos é fagocitada pelos macrófagos, aumentando assim a sua eficácia e tolerabilidade, reduzindo o tempo de uso no tratamento (BAGINSK et al., 2005; MURRAY et al.,

2005).

[0053] A AnB circulante está até 90% ligada às proteínas plasmáticas e é pouco dialisável. Aproximadamente dois terços da concentração plasmática obtida têm sido detectados nos fluidos da pleura inflamada, peritônio, sinóvia e do humor aquoso. As concentrações no líquido cefalorraquidiano raramente excedem a 2,5% daquelas encontradas no plasma ou não são detectáveis. Pequena quantidade de AnB penetra no humor vítreo ou no fluido amniótico normal. Detalhes completos sobre a distribuição tecidual não são conhecidos, entretanto, o fígado parece ser o maior local de armazenagem tecidual.

[0054] A AnB deve ser administrada por infusão intravenosa lenta, aplicando durante um período entre 2 e 6 horas, observando-se as precauções usuais para a terapêutica intravenosa. A concentração recomendada para infusão é de 0,1 mg/mL (lmg/lOmL). Normalmente, a terapia é iniciada com uma dose diária de 0,25 mg/kg de peso corpóreo administrada como descrito (ADLER-MOORE, 2002).

[0055] Um paciente com boa função cardiopulmonar e que tolere a dose teste sem uma reação grave, pode receber 0,3 mg/kg de AnB intravenosamente por um período de 2 a 6 horas. Uma segunda dose menor, i.e., 5 a 10 mg total, é recomendada para pacientes com disfunção cardiopulmonar ou para aqueles que apresentaram reação grave à dose teste. As doses podem ser gradualmente aumentadas em 5 a 10 mg/dia para uma dose diária final de 0,5 a 1,0 mg/kg. A dose diária total pode chegar até 1,0 mg/kg de peso corpóreo ou até 1,5 mg/kg quando administrada em dias alternados, em infecções causadas por patógenos menos sensíveis após avaliação médica ou do profissional que assiste o paciente (ADLER- MOORE, 2002).

[0056] Entre os efeitos adversos estão relacionados anafilaxia, trombocitopenia, dor generalizada, convulsões, calafrio, febre, anemia, anorexia, diminuição da função tubular renal, hipocalcemia e flebite. A AnB lipossomal é incorporada pelo macrófago, onde se abriga o parasito, praticamente não reagindo com o colesterol das células do hospedeiro, o que aumenta sua eficácia e tolerabilidade (ROBERTS, 2003; RIBEIRO et al. 2014).

[0057] A Anfotericina B causa nefrotoxicidade aguda em aproximadamente 50% dos pacientes tratados (SAMPAIO, 1996) e in vitro, demonstrou que até 95% das células sanguíneas sofrem lise (TAKHUR, 1998). Contudo, quando funcionalizada em lipossomos, a nefrotoxicidade diminui a ponto de afetar por volta de 4% dos pacientes e a hemólise também cai para 5% das células. Ainda, a AnB, quando funcionalizada em preparações lipídicas, precisa de uma concentração maior que 175mg/kg para produzir a 50% de morte de animais tratados (DL ₅ 0), enquanto somente 2 a 3 mg/kg de AnB convencional produz o mesmo efeito, demonstrando que preparações biotecnológicas são de grande valor na diminuição da citotoxicidade e toxicidade do tratamento com essa droga (ADLER- MOORE, 2002).

[0058] De modo geral, as reações de hipersensibilidade incluem anafllaxia, trombocitopenia, eritema, dores generalizadas e convulsões. Entre os efeitos tóxicos e irritantes estão febre (às vezes acompanhada de calafrios que ocorrem habitualmente 15 a 20 minutos após o início do tratamento); mal-estar, perda de peso e rubor. Mas podem acontecer erupções cutâneas e prurido, anorexia, náusea, vómitos, diarreia, dispepsia e dor epigástrica espasmódica, anormalidades nos testes da função hepática, icterícia, insuficiência, hepática aguda, gastrenterite hemorrágica, melena, anemia normocrômica e normocítica flebite, tromboflebite nefrotoxicidade (RIBEIRO et al. 2014; MS, 2007; ROBERTS, 2003). Com menor frequência podem ocorrer agranulocitose alterações da coagulação, trombocitopenia, leucopenia, eosinofilia, leucocitose.

[0059] Pentamidina

[0060] As amidinas são compostos orgânicos caracterizados por possuírem grupamentos C=N e C-N que os confere ações biológicas variadas. Os derivados aromáticos destes compostos são os mais intensamente estudados, onde a Pentamidina e o Berenil são os compostos mais representativos dessa classe (BERMAN, 1998).

[0061] As diaminas aromáticas são usadas para o tratamento das

Leishmanioses desde 1939 e são tóxicas para diversos protozoários, especialmente em casos não responsivos aos antimoniais pentavalentes (BERMAN, 1998). Neste contexto, a pentamidina é o composto mais utilizado para o tratamento da Leishmaniose apresentando resultados satisfatórios.

[0062] A Pentamidina é usada no tratamento de Leishmaniose

Visceral e Mucocutânea refratária aos antimoniais pentavalentes (AMATO et al., 2000). É uma diamina aromática que atua interagindo com o cinetoplasto do parasito e fragmentando a membrana mitocondrial (SUNDAR & CHATTERJEE, 2006; LIMA et al., 2007). É usada no tratamento da LTA em áreas endémicas dos continentes americano, asiático e africano, possuindo maior toxicidade que os antimoniais (MURRAY et al., 2005).

[0063] A Pentamidina é um derivado sintético de amidina. Sua fórmula molecular é C19H24N4O2 possui peso molecular de 340,41936 g/mol, sendo um agente antiprotozoal com eficácia em tripanossomíase, leishmaniose, diferentes infecções fúngicas, pneumonia em pacientes com HIV. Possui quatro pontes doadoras e quatro receptoras de hidrogénio, ponto de ebulição de 238°C, solubilidade de 29,2 mg L a 25 ⁰ C)

[0064] A Pentamidina possui uma forma curva ou a capacidade para adotar uma forma diamidínica e terminais com cargas positivas, capacidade de doar ligações de hidrogénio e uma conformação relativamente plana que tem alguma flexibilidade no ajuste de ângulos diedros. A análise destas características, em comparação com agentes semelhantes, sugere que as diamidinas devem ligar-se ao DNA. Os estudos iniciais com diamidinas indicaram que eles se ligam ao DNA e que não se intercalam (LOWN, 1990). Os compostos tipicamente exibiram uma preferência para a ligação com sequências AT, pelo menos, quatro consecutivas, em pares de bases no local de ligação. Em uma importante série de estudos, Tidwellet al., citados por Wilson (2008) prepararam uma pequena biblioteca de compostos relacionados com a pentamidina e avaliadas suas interações de DNA através de experimentos de fusão térmica. Eles descobriram que os compostos com um número par de grupos metileno na cadeia de ligação ligado de forma mais fraca de DNA do que os compostos com um número ímpar de metilenos. Eles correlacionaram as diferenças de afinidade com alterações na curvatura dos compostos de amidina de amidina. Os compostos que se ligam bem a sequências AT tinha uma curvatura adequada para corresponder à forma convexa e torção helicoidal do sulco menor de DNA. As amidinas obtêm ligações de H por meio de grupos ΝΉ para interagir com ligações aceitadoras de N3 O2 do A e T.

[0065] Em análise de alta resolução, Neidle (2001) obteve uma estrutura cristalográflca de raios-X de pentamidina ligada a um de quatro pares de bases AATT ajudando a esclarecer essa ligação.

[0066] A Pentamidina tem sido descrita como propensa a ligar-se especificamente nas sequências do sulco menor (WILSON, 2008). Esta semelhança e a força de interação com o DNA para este composto fornece evidência inicial de ligação ao DNA que pode estar envolvido no mecanismo de ação da droga.

[0067] Seu mecanismo de ação não está claramente definido, pode interferir com a incorporação de nucleotídeos e de ácidos nucléicos do RNA e DNA ao impedir a fosforilação oxidativa, o que ocasiona a inibição da biossíntese do DNA, RNA, fosfolipídeos e proteínas; também pode interferir com a transformação de folato.

[0068] A OMS recomenda que o tratamento com Pentamidina seja de 4 mg/kg ¹ , aplicados por via endovenosa três vezes por semana. Após a administração de 15 injeções (5 semanas de tratamento) foi observado 77% de sucesso do tratamento em pacientes com leishmaniose visceral e após a administração de 27 injeções (9 semanas de tratamento) o percentual foi de 94% (BERMAN, 1997).

[0069] A alta toxicidade desta droga, com relatos de morte repentina, é um fator limitante de seu emprego terapêutico. Os principais efeitos adversos ou colaterais são: dor, induração e abscessos estéreis no local da aplicação, além de náuseas, vómitos, tontura, mialgias, cefaleia, hipotensão, lipotimias, síncope, hipoglicemia e hiperglicemia. Está também relacionada ao tratamento a possibilidade de hipoglicemia, hipotensão, alterações cardiológicas e nefrotoxicidade (RATH et al, 2003).

[0070] Em pacientes com menos de seis meses de vida ou mais de

65 anos torna-se necessária a internação hospitalar. Nesse caso devem ser observados, criteriosamente, os seguintes sinais e sintomas: anemia acentuada, diarreia grave ou prolongada, edema generalizado, desnutrição grave, presença de sangramento, infecções concomitantes. Convém ficar atento à possibilidade do surgimento de doenças associadas ao tratamento com esta droga, tais como: cardiopatia, nefropatia, hepatopatia e hipertensão arterial. Pode também apresentar ausência de resposta ao tratamento (refratariedade primária), casos de recidiva e a presença de icterícia (LIMA et ai, 2007).

[0071] Leucopenia, por exemplo, a neutropenia, ou a trombocitopenia pode ser grave com contagem inferior a 1000 um/ml ³ , plaquetas inferiores a 20,000/mm ³ em pacientes que receberam a terapia parentérica. No entanto, a leucopenia acontece com mais frequência que a trombocitopenia (CUNHA, 2001). Por fim anemia, disfunção hepática e broncoespasmo têm sido relatados ocasionalmente em pacientes que receberam pentamidina por via inalatória, em muitos casos associados com zidovudina (CUNHA, 2001).

[0072] As drogas atualmente utilizadas no tratamento de

Leishmaniose foram descobertas há décadas, apresentam graves efeitos adversos e severas limitações (RENSLO, 2006). Isso porque a Leishmaniose afeta predominantemente pessoas paupérrimas, em regiões igualmente pobres do planeta e, assim, pesquisa e desenvolvimento de novas drogas e/ou alternativas para o tratamento vêm sendo largamente negligenciados.

[0073] Vários centros de pesquisa ao redor do mundo vêm dando suporte de ciência básica no entendimento da biologia dos parasitos compondo um importante conhecimento que facilita a escolha de alvos terapêuticos. Em outra via, o recrutamento de experts realizado por indústrias direciona os esforços na química médica para a descoberta dessas drogas. Dentro desse contexto de descoberta de novas drogas ou quanto à proposta de novas abordagens terapêuticas para drogas já consagradas a biotecnologia emerge como uma valiosa ferramenta. Assim, várias ferramentas biotecnológicas vêm sendo empregadas no desenvolvimento de alternativas terapêuticas que aumentem a eficácia e/ou diminuía a toxicidade do tratamento para a Leishmaniose.

[0074] Crotamina (CTA)

[0075] A crotamina, toxina isolada do veneno da serpente Crotalus durissus terrificus, foi descrita pela primeira vez na década de 50 (GONÇALVES e VIEIRA, 1950). Sua molécula possui o peso molecular de 4883.776 g/mol, massa exata de 4882.284 g/mol e sua fórmula molecular é C2 ₁ 4H326N64O5 ₄ S7. Em 1975, Laure (1975) in Vieira (2006) descreveu a sua estrutura primária como sendo um polipeptídeo composto por 42 aminoácidos (AA), cuja sequência primária é Tyr-Lys-Gln-Cys-His-Lys- Lys-Gly-Gly-His-Cys-Phe-Pro-Lys-Glu-Lys-ne-Cys-Leu-Pro-Pro-S er-Ser- Asp-Phe-Gly-Lys-Met-Asp-Cys-AΓg-Tφ-AΓg-TΓp-Lys-Cys-Cys-L ys-Lys- Gly-Ser-Gly, possuindo muitos AA básicos, sendo 9 li sinas e 2 argininas com uma carga positiva pl> 9,5. Tem a propriedade de resistir à temperatura de 70°C por até 18 horas, sem que haja alteração na sua atividade tóxica (CUNHA, 2012), o seu peso molecular é de 4.889,81 Daltons, tendo a sua estrutura estabilizada por 6 cisteínas envolvidas em três pontes de dissulfetos nas posições, Cys4-Cys36, Cysll-Cys30 e Cysl8-Cys37 (CORONADO, 2013).

[0076] A ponte de dissulfeto Cys4-Cys36 ancora o primeiro seguimento α-hélice para β2. βΐ e α2 são conectados entre si por uma volta flexível formada pelos resíduos Lysl4-Leul9 e a hélice que volta a <x2 é conectada a β2 por uma volta flexível ainda mais extensa formada pelos resíduos Asp24-Arg33. A respeito de sua topologia, ela pode ser classificada como αβ!β2 visto a estrutura secundária que compreende uma oc-hélice N- terminal (resíduos 1-7) e duas fitas - β antiparalelas. A folha β é estabilizada por ligações de hidrogénio entre β1οφ2 envolvendo os resíduos Hisl0-Cys37 e Phel2-Lys35 e pontes de hidrogénio entre β2 e a2, formado por Ser23- Lys38. Duas pontes de hidrogénio conectam β2 com o C terminal como pode ser verificado na Figura 1.

[0077] A crotamina é relativamente pequena, a sua carga, assim como seus resíduos hidrofóbicos, é exposta para fora conferindo a essa molécula forças eletrostáticas e hidrofóbicas na sua superfície. Os seus resíduos mais hidrofóbicos estão localizados no lado com carga positiva da molécula e a maior carga positiva Lys2, Lys6, Lys7, Lysl4, Lysl6, Lys27, Lys35, Lys38, Lys39, Arg31 e Arg33 estão no lado oposto como visto na figura 1(b).

[0078] A Crotamina apresenta similaridades estruturais com outros peptídeos antimicrobianos. A sua superfície altamente positiva pode interagir positivamente com superfícies negativas de membranas com potencial para induzir a formação de passagens através das quais moléculas e/ou íons podem difundir (CORONADO, 2013).

[0079] A estrutura tridimensional da Crotamina é semelhante às β- defensinas que são moléculas ricas em lisina e arginina, porém, apresentam baixa semelhança na estrutura primária, compreendendo entre 15 a 35% de semelhança. No entanto, o arranjo da sua estrutura secundária de alfa hélices, folhas beta e a conservação de seis cisternas com três pontes dissulfídicas da crotamina são típicas de beta defensinas de animais (CORONADO, 2013).

[0080] A crotamina foi a primeira molécula extensamente estudada no Brasil sobre os seus aspectos bioquímicos e farmacológicos. Clinicamente, a intensa paralização dos membros posteriores quando injetada por via peritoneal. Como um dos efeitos mais estudados da crotamina é a sua ação analgésica que chega a ser 30x mais potente que a morfina (MANCIN et al., 1998).

[0081] Ownby et al. (1988) afirmam que as células musculares são as primeiras a responder à crotamina com a redução acentuada do potencial de repouso da membrana, sugerindo ação sobre os canais de sódio e potássio alterando a permeabilidade desses íons, em especial, induzindo a uma forte entrada de sódio no músculo que acaba acarretando potente contração muscular, induzindo lesões e necrose caracterizada pela extensa vacuolização do retículo sarcoplasmático e ruptura dos filamentos de actina e miosina efeito clássico das miotoxinas.

[0082] Todavia, mais recentemente, Rizzi et al. (2007) afirmaram que a crotamina não atua em canais de sódio dependentes de voltagem, porém, provoca espasmos musculares rápidos, sugerindo que os canais de sódio não são o seu principal alvo. Essa contradição na literatura acerca do real mecanismo de ação da crotamina deixa em aberto o mecanismo molecular de ação dessa molécula. Por outro lado, Yount et al. (2009) após um estudo de modelagem afirmam que há a interação da crotamina com canais de potássio dependentes de voltagem bloqueando-os.

[0083] Dal Mas (2015) demonstrou que a crotamina isolada de

Crotalus durissus terrificus apresenta forte atividade antí-helmíntica notando ainda que esse peptídeo é a única molécula célula penetrante com afinidade por vesículas ácidas conjuntamente com atividade antimicrobiana e antitumoral.

[0084] Além disto, outros estudos demonstram que essa molécula não é tóxica para células tronco de mamíferos tanto in vitro (NASCIMENTO, 2007; KERKIS, 2004) quanto i vivo (KERKIS, 2006; HAYASHI, 2008) e, curiosamente, registrou uma ação tóxica seletiva para células tumorais de melanoma de ratos (PEREIRA, 2011), porém, apresenta toxicidade mediada pela permeabilização da membrana lisossomal (HAYASHI, 2008).

[0085] A Crotamina é um nanopeptídeo com interação com o DNA humano, apresentando penetração celular, potencial para o carreamento de drogas, possuindo ação microbicida e atuando como um excelente exemplo de potencial ferramenta biotecnológica (CHEN,2012). [0086] Os peptídeos que demonstram a capacidade de penetrar e se translocar no interior das células são chamados Peptídeo Célula Penetrante (PCP). Podem ser referidos também como domínios de transdução de proteínas (DTP), Peptídeos Tróia ou sequência de translocação de membrana (STM) como postularam Jãrver e Langel (2006). Entre as propriedades que incluem a entrega intracelular de compostos bioativos como fármacos, outras biomoléculas ativas, ácidos nucleicos, DNA, RNA de interferência, peptídeos, proteínas, nanopartículas e fluoróforos utilizados para captação de imagens de microscopia confocal ou de fluorescência (CHEN, 2012).

[0087] Chen (2012) afirma que em análises de gel de agarose em eletroforese e espectrometria de ultravioleta indicam que complexos de crotamina com cadeias longas de DNAs realmente sofrem agregação em baixa força iônica.

[0088] Esses dados em conjunto sugerem que a crotamina tem suporte científico suficiente para ser um promissor carreador de drogas para o interior da célula e do DNA de células proliferativas ativas (CHEN, 2012), especialmente pela habilidade de ligação com substratos macromoleculares negativos, fator essencial para funcionar como veículo de drogas. Assim, o envolvimento de proteoglicanos de sulfato de heparan da superfície celular na captação da crotamina e na interação entre crotamina DNA implicam na ligação com o DNA e polissacarídeos (NASCIMENTO, 2007).

[0089] Em vários casos, a ligação inicial de PCPs com a célula ocorre através dos proteoglicanos de sulfato de heparan (PGHS) da membrana plasmática (negativos) e os resíduos de arginina (positivos) da membrana plasmática estabelecendo um contato eletrostático entre os peptídeos e a superfície celular, seguida por endocitose ou por macropinocitose (ZIEGLER, 2003). Estudo realizado por Nascimento et al. (2007) com crotamina fluorescente visualizou a presença de crotamina na superfície celular de células CHO-K1 ricas em PHGS e o uso de anticorpos anti-PHGS confirmou que esse resultado. Em outros ensaios de competição e inibição realizados por Kerkis et al. (2010), tais como os realizados com heparinase, confirmaram que há interação da crotamina com os HSPGs na superfície da membrana celular. Esses dados são robustos e confirmam essa relação.

[0090] Estudo com microscopia confocal permitiu descobrir que esse peptídeo é capaz de penetrar nas células cinco minutos após a sua adição no meio de cultura com fibroblastos humanos (KERIS, 2004). Este mesmo trabalho demonstrou in vivo que a Crotamina foi encontrada em células do líquido peritoneal e na medula de camundongos com localização perinuclear na célula, no entanto, após 16-24 horas a crotamina não foi mais encontrada na célula, tendo sido degradada ou exocitada.

[0091] Resumidamente, uma vez que a Crotamina entra em contato com a matriz extracelular, pode ocorrer da sua carga positiva interagir com a superfície da membrana através do HSPG formando complexos que são endocitados em vesículas e se fundem com os endossomos/lisossomos. A crotamina se acumula dentro nos lisossomos até ser liberada para os citosol, no entanto, não se sabe se o conteúdo do lisossomo é liberado junto para o citosol. Deste ponto em diante, não se sabe exatamente se a crotamina permanece ligada ao HSPG. Uma vez a crotamina estando no presente no citoplasma há interação com os centríolos, direciona-se ao núcleo e interage com os cromossomas celulares (KERKIS, 2010).

[0092] O mecanismo de penetração celular da crotamina está demonstrado na Figura 2. [0093] Investigações de translocação através da membrana celular indicam que a absorção desse peptídeo acontece independente de energia, receptores de membrana e transportadores podendo penetrar na célula através de caminhos distintos, dependendo das propriedades biofísicas, bioquímicas e carga da molécula de cada PCP (RÃAGEL et al. 2010).

[0094] A crotamina possui a propriedade de transfecção, pois, forma facilmente um complexo com o DNA através de interação eletrostática. Ensaios de microscopia confocal revelou forte sinal de fluorescência verde nas células, sugerindo alta eficiência de transfecção, a qual variou de 30 a 90% de acordo com o tipo de célula utilizado (NASCIMENTO, 2007).

[0095] Em ensaios de microscopia confocal, injeções intraperitoneais em camundongos C57BL/J6 com complexos crotamina/plasmídeo pEGFP revelou que 10 a 20% das células da medula óssea, foram transfectadas in vivo e emitiam sinal de fluorescência verde forte (NASCIMENTO et al., 2007; HAYASHI et al., 2008).

[0096] Assim, diante do aumento da resistência do parasito à ação das drogas utilizadas no tratamento da Leishmaniose, bem como a toxidade de tais drogas, protocolos de tratamento prolongados, acarretando baixa adesão do paciente e/ou alto custo dos fármacos, surge a necessidade de pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos e/ou alternativas terapêuticas para tratamento das Leishmanioses que seja eficaz e com maior tolerabilidade.

[0097] A área de interesse da presente invenção é a obtenção de alternativas para os tratamentos de doenças parasitárias. Sabe-se que este segmento vem sendo beneficiado sobremaneira por abordagens biotecnológicas, embora novas drogas ou abordagens não estejam sendo colocadas no mercado de fármacos há anos. [0098] Neste sentido, a presente investigação baseia-se na possibilidade do polipeptídeo crotamina ser capaz de carrear drogas antileishmaniais para o interior das células alvo do tratamento, concomitantemente diminuindo os seus efeitos colaterais e adversos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0099] Em um aspecto, a invenção provê uma combinação entre

Crotamina e fármacos efetivos.

[00100] Em uma concretização, a Crotamina é uma toxina de veneno de animais peçonhentos.

[00101] Em uma concretização preferencial, o animal peçonhento é serpente.

[00102] Em uma concretização mais preferencial, a serpente é do género Crotalus.

[00103] Em uma concretização ainda mais preferencial, a serpente é Crotalus durissus terrificus.

[00104] Em uma concretização, o fármaco efetivo é um fármaco selecionado do grupo que consiste de: Anfotericina B, Pentamidina, Glucantime ^® , Pentostam ^® , Paromomicina e Miltefosina ou combinações dos mesmos.

[00105] Em uma concretização mais preferida, o fármaco efetivo é Anfotericina B, Pentamidina ou Glucantime ^® .

[00106] Em uma concretização, o fármaco efetivo é para o tratamento das Leishmanioses.

[00107] Em uma concretização preferida, a Leishmaniose é Leishmaniose Visceral ou Leishmaniose Cutânea.

[00108] Em uma concretização mais preferida, a Leishmaniose é a Leishmaniose Tegumentar Americana. [00109] Em outro aspecto da invenção, a invenção provê uma composição farmacêutica que compreende a combinação descrita acima e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00110] Em um outro aspecto, é provido um medicamento que compreende a combinação descrita acima.

[00111] Em um outro aspecto, a invenção provê um método para tratar leishmaniose que utiliza a combinação descrita acima.

[00112] Em um aspecto adicional, a invenção provê o uso da combinação descrita acima para manufatura de um medicamento para tratar leishmaniose.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00113] A descrição detalhada apresentada adiante faz referência às figuras anexas, as quais:

[00114] Figura 1: Estrutura da crotamina. (a) O N- e C- terminais os resíduos de cisteína estão marcados, (b) os resíduos altamente hidrofóbicos em rosa estão localizados na lateral da molécula e os resíduos com carga positiva em azul estão no lado oposto da molécula. (CORONADO, 2013)

[00115] Figura 2: Mecanismo de penetração celular da crotamina.

(1) a crotamina é apresentada na matriz extracelular e a sua carga positiva interage com a carga negativa dos Proteoglicanos de Sulfato de Heparan da Membrana (HSPG). (2) a crotamina e o complexo de HSPG são endoxitados em vesículas as quais são transportadas dentro da célula com o auxílio da Clatrina. (3) essas vesículas se fundem com o endossomo/lisossomo. (4) a crotamina se acumula dentro do lisossomo até ser liberada no citosol. (5) após liberação, a crotamina interage com os centríolos e entra no núcleo. (6) interação com os cromossomos. Adaptado de KERKIS (2010). [00116] Figura 3: ensaio piloto de inibição de promastigotas de L. amazonensis. Este ensaio foi realizado com duas concentrações de cada droga combinadas à três concentrações de CTA totalizando seis concentrações para cada droga. A linha no meio da figura indica 50% de inibição e as setas destacam as combinações de trabalho.

[00117] Figura 4: Ensaio de inibição das formulações com PEN sobre promastigotas de L. amazonensis. Promastigotas de L. amazonensis (5xl0 ⁵ ) incubadas por 48h com CTA (Crotamina lOOmg/ml), PEN (pentamidina 5μg/ml), PI (pentamidina 0,05μg/ml + crotamina 3,125μg/ml), P2 (pentamidina 0,05μg/ml + crotamina 100μg/ml). Utilizou-se a ANOVA ONE-WAY seguido de teste de Tukey com nível de significância de 5%. (** p < 0,01); (***p < 0,001).

[00118] Figura 5: Ensaio de inibição das formulações com AnB sobre promastigotas de L. amazonensis. Promastigotas de L. amazonensis (5xl0 ⁵ ) incubadas por 48h com CTA (Crotamina ΙΟΟμg/ml), AnB (Anfotericina 1μg/ml), Al (AnBlμg/ml + crotamina 100μg/ml) e A2 (AnB Ο,ΟΙμg/ml + crotamina lWμg/ml). Utilizou-se a ANOVA ONE-WAY seguido de teste de Tukey com nível de significância de 5%. (**p < que 0,01).

[00119] Figura 6: Ensaio de inibição das formulações com GLU sobre promastigotas de L. amazonensis. Promastigotas de L. amazonensis (5xl0 ⁵ ) incubadas por 48h com CTA (Crotamina l00μg/ml ), GLU (Glucatime, 300μg /ml), Gl (Glucantime ^® 300μg/ml + CTA ΙΟΟμg/ml), ou G2 (Glucantime ^® 300μg/ml + CTA 3,^g/ml). Utilizou-se a ANOVA ONE-WAY seguido de teste de Tukey com nível de significância de 5%. (*p < que 0,05); (**p < que 0,01 ). [00120] Figura 7: Ensaio de inibição das formulações com ΡΈΝ sobre amastígotas de L. amazonensis. Ensaio de infecção e tratamento de macrófagos peritoniais com L amazonensis. Incubou-se MO infectados por 48h com CTA (Crotamina ΙΟΟμg/ml), PEN (pentamidina 5μg/ml), PI (pentamidina 0,05μg/ml + crotamina 3,125μg/ml), P2 (pentamidina 0,05μg/ml + crotamina lOOμg/ml. Utilizou-se a ANOVA ONE-WAY seguido de teste de Tukey com nível de significância de 5%. (*p < que 0,05); (**p < que 0,01).

[00121] Figura 8: Ensaio de inibição das formulações com AnB sobre amastígotas de L. amazonensis. Ensaio de infecção e tratamento de macrófagos peritoniais com L amazonensis. Incubou-se MO infectados por 48h com CTA (Crotamina 100μg/ml), AnB (Anfotericina ^g/ml), Al (AnBl μg/ml + crotamina ΙΟΟμg/ml) e A2 (AnB 0,0^g/ml + crotamina ΙΟΟμg/ml). Ulilizou-se a ANOVA ONE-WAY seguido de teste de Tukey com nível de significância de 5%. (***p<ou= que 0,0001) ou (**p<ou= que 0,01).

[00122] Figura 9: Ensaio de inibição das formulações com GLU sobre amastígotas de L· amazonensis. Ensaio de infecção e tratamento de macrófagos peritoniais com L amazonensis. Incubou-se MO infectados por 48h com CTA (Crotamina 100mg/ml), GLU (Glucatime, 300mg/ml), Gl (Glucantime ^® 300mg/ml + CTA lOOmg/ml), ou G2 (Glucantime ^® 300mg/ml + CTA 3,125mg/ml). Utilizou-se a ANOVA ONE-WAY seguido de teste de Tukey com nível de significância de 5%. (*p<ou= que 0,05); (**p<ou= que 0,01).

[00123] Figura 10: Ensaio de ELISA demonstrando a diferença na produção de citocinas de células J774 tratadas com as formulações com PEN. (A) IL-12 e (B) TNF-α de macrófagos peritoneais (5x10 ⁵ células) após 48h de incubação do controle negativo (MO); macrófagos infectados (MO Inf), CTA (Crotamina 100mg/ml), PEN (pentamidina 5μg/ml), PI (pentamidina 0,05μg/ml + crotamina 3,125μg/ml), P2 (pentamidina 0,05μg/ml + crotamina ΙΟΟμg/ml). Utilizou-se a ANOVA ONE-WAY seguido de teste de Tukey com nível de significância de 5%. (A) (***P>0,001 vs MO) (**P>0,001 vs PEN) (*P>0,001 vs CTA). (B) (**P<0,01 vs CTA) (***=P<0,0001 vs CTA) (&P<0,0001 vs MO Infectado) (#P<0,001 vs CTA) (0P<O,OO1 vs PI e P2)

[00124] Figura 11: Ensaio de ELISA demonstrando a diferença na produção de citocinas de células J774 tratadas com as formulações com AnB. (A) IL-12 e (B) TNF-α de macrófagos peritoneais (5x10 ⁵ células) após 48h de incubação do controle negativo (MO); macrófagos infectados (MO Inf), CTA (Crotamina lOOmg/ml), AnB (AnBl μg/ml), Al (AnB^g/ml + CTAl(Xμg/ml ) e A2 (AnB0,01μg/ml + CTA100μg/m) por 48h. Utilizou- se a ANOVA ONE-WAY seguido de Tukey com nível de significância de 5%. (A) ***P<0,001 para MO; **P<0,001 para CTA e * P<0,001 para ANF). (B) (***P<0,001 para CTA; **=/ ^> <0,001 para ANF, *P0,001 para MO e #P<0,001 para MO Infectado.

[00125] Figura 12: ensaio de ELISA demonstrando a diferença na produção de citocinas de células J774 tratadas com as formulações com GLU. (A) IL-12 e (B) TNF-α de macrófagos peritoneais (5xl0 ⁵ células) após 48h de incubação do controle negativo (MO); macrófagos infectados (MO Inf), CTA (Crotamina 100mg/ml), GLU (Glucatime 300μg/ml), Gl (Glucantime ^® 300μg/ml + CTA 100μg/ml), ou G2 (Glucantime ^® 300μg/ml + CTA 3,^g/ml). Utilizou-se a ANOVA ONE-WAY seguido de teste de Tukey com nível de significância de 5%. (A) (#.P<0,0001 vs MO) (0P<O,OOO1 vs CTA), (*P<0,0001 vs GLU). (B) (*P<0,05 vs MO), (***P<0,0001 vs MO), (0P<O,O1 vs CTA) ($P<0,0001 GLU).

[00126] Figura 13: Determinação da citotoxiddade das formulações com PEN por MTT. (A) demonstrou-se mudanças na viabilidade de células J774 (5x10 ⁵ células), (B) células C2C12 (4x1o ⁴ ) e (C) células HEP-G2 (5x10 ⁵ células), após incubação de 48h com SDS, controle negativo, CTA (Crotamina 100μg/ml), PEN (pentamidina 5μg/ml), PI (pentamidina 0,05μg/ml + crotamina 3,125μg/ml), P2 (pentamidina 0,05μg/ml + crotamina ΙΟΟμg/ml). Utilizou-se a ANOVA ONE-WAY seguido de Tukey com nível de significância de 5%. (A) (*** P<0,0001 vs SDS, $ P<0,0001 vs CTA, ø P<0,05 vs CTA, # P<0,0001 vs PEN, *P<0,05 vs PI). (B) (***P<0,0001 vs SDS, 0P<O,O5 vs CTA, $ P<0,05 vs PEN, # P<0,01 vs PEN, *P<0,05 vs PI). (C) (***P<0,0001 vs SDS, 0P<O,O5 vs CTA)

[00127] Figura 14: Determinação da citotoxicidade das formulações com AnB sobre por MTT. As células foram incubadas por 48h com SDS, controle negativo; CTA (Crotamina lOOμg/ml), (A) células J774 (5x10 ⁵ células), (B) células C2C12 (4x1o ⁴ células) e (C) HEP- G2(5xlO ⁵ células) após incubação de 48h com SDS, controle negativo; CTA (Crotamina 100mg/ml), AnB (Anfotericina B lmg/ml), Cl (AnB^g/ml + CTA100μg/ml) e C2 (AnB0,01μg/ml + CTA100μg/m) por 48h. Utilizou-se a ANOVA ONE-WAY seguido de Tukey com nível de significância de 5%. (A) (***P< 0,001 vs SDS). (B) (*P<0,05 vs SDS, ***P< 0,0001 vs SDS e 0P<O,O1 vs CTA), (C) (***P<0,0001 vs SDS e ** P<0,01 vs SDS).

[00128] Figura 15: Determinação da citotoxicidade das formulações com GLU sobre por MTT. As células foram incubadas por 48h com SDS, controle negativo; CTA (Crotamina l(Xμg/ml ), (A) células J774 (5x10 ⁵ células) com controle positivo, (B) células C2C12 (4x1o ⁴ células) como controle positivo e (C) HEP-G2 (5xl0 ⁵ células) como controle positivo. GLU (Glucatime, 300μg/ml), Gl (Glucantime ^® 300μg/ml + CTA 100μg/ml), ou G2 (Glucantime ^® 300μg/ml + CTA 3,^g/ml). Utilizou-se a ANOVA ONE-WAY seguido de Tukey com nível de significância de 5%. (***P<0,0001 vs SDS). (B) (***P<0,0001 vs SDS). (C) (***P<0,0001 vs SDS,

[00129] Figura 16: Quantificação de proteínas de vias inflamatórias de células J774 tratadas com as formulações com PEN.

Células J774 (IxlO ⁷ ) infectadas com L. amazonensis após 48h de incubação ou não com PEN (5μg/ml). Mensurou-se NF-kB p65, Phospho NF-kB, SAPK/JNK, Phospho p38, Stat 3 e IkkB. Utilizou-se a ANOVA ONE-WAY seguido de teste de Tukey com nível de significância de 5%. (***/ ^, <0,001).

[00130] Figura 17: Quantificação de proteínas de vias inflamatórias de células J774 tratadas com as formulações com AnB. Células J774 (IxlO ⁷ ) infectadas com L. amazonensis após 48h de incubação ou não com AnB (^g/ml). Foram mensurados NF-kB p65, Phospho NF-kB, SAPK/JNK, Phospho p38, Stat 3 e IkkB. Utilizou-se a ANOVA ONE-WAY seguido de teste de Tukey com nível de significância de 5%. (***P<0,001; ** P< 0,01; *P>0,05).

[00131] Figura 18: Quantificação de proteínas de vias inflamatórias de células J774 tratadas com as formulações com GLU.

Células J774 (IxlO ⁷ ) infectadas com L. amazonensis após 48h de incubação ou não com GLU (300μg/ml). Foi mensurado NF-kB p65, Phospho NF-kB, SAPK/JNK, Phospho p38, Stat 3 e IkkB. Utilizou-se a ANOVA ONE-WAY seguido de teste de Tukey com nível de significância de 5%. (***/ ^, <0,001). [00132] Figura 19: Quantificação da produção de Nitrito de células tratadas com as formulações com ΡΈΝ. Macrófagos peritoneais (5xl0 ⁵ ) após 48h de incubação do controle negativo (MO); macrófagos infectados (MO Infectado), CTA (Crotamina ΙΟΟμg/ml), PEN (pentamidina 5μg/ml), PI (pentamidina 0,05μg/ml + crotamina 3,125μg/ml), P2 (pentamidina 0,05μg/ml + crotamina l00μg/ml . Utilizou-se a ANOVA ONE-WAY seguido de teste de Tukey com nível de significância de 5%. (#P<0,001 vs MO Infectado), (***P<0,001 vs MO), ($P<0,001 vs PEN).

[00133] Figura 20: Quantificação da produção de Nitrito de células tratadas com as formulações com AnB. Macrófagos peritoneais (5xl0 ⁵ ) após 48h de incubação do controle negativo (MO); macrófagos infectados (MO Inf), CTA (Crotamina 100μg/ml), AnB (Anfotericina B ^g/ml), Al (AnB^g/ml + CTA100μg/ml) e A2 (AnB0,01 μg/ml + CTA100μg/m) por 48h. Utilizou-se a ANOVA ONE-WAY seguido de Tukey com nível de significância de 5%. (**P<0,001 vs MO) ou (#P<0,001 vs M0+Leish)

[00134] Figura 21: Quantificação da produção de Nitrito de células tratadas com as formulações com GLU. Macrófagos peritoneais (5x10 ⁵ ) após 48h de incubação do controle negativo (MO); macrófagos infectados (MO Infectado), CTA (Crotamina ΙΟΟμg/ml), GLU (Glucantime ^® 300μg/ml), Gl (Glucantime ^® 300μg/ml + Crotamina 100μg/ml ), G2 (Glucantime ^® 300μg/ml + Crotamina 3,125μg/ml) (***P<0,0001 para MO) ou (#P<0,001 para M0+Leish)

[00135] Figura 22: Imagens de microscopia ótica de campo claro com MO peritoneais de camundongos. (A) demonstra MO não infectados por L amazonensis, a figura (B) demonstra MO infectados por L. amazonensis e a figura (C) demonstra MO infectados e tratados com CTA por 48h.

[00136] Figura 23: Imagens de microscopia ótica de campo claro com MO peritoneais de camundongos. (A) aumento de 400x e (B) aumento de lOOOx de macrófagos tratados por 48h com CTA (Crotamina 100μg/ml).

[00137] Figura 24: Imagens de microscopia ótica de campo claro com MO peritoneais de camundongos. (A) demonstra o macrófago infectado e tratado com PI (pentamidina 0,05μg/ml + crotamina 3,125μg/ml) por 48h, (B) tratamento com P2 (pentamidina 0,05μg/ml + crotamina ΙΟΟμg/ml.ροr 48h e (C) PEN (pentamidina 5μg/ml), por 48h.

[00138] Figura 25: Imagens de microscopia ótica de campo claro com MO peritoneais de camundongos. (A) demonstra o macrófago infectado e tratado com AnB (AnB lμg/ml) por 48h, (B) demonstra o macrófago infectado e tratado com Al (AnB l μg/ml + CTA100μg/ml) por 48h e (C) demonstra o macrófago infectado e tratado com A2 (AnB 0,01μg/ml + CTA100ug/m) por 48h.

[00139] Figura 26: Imagens de microscopia ótica de campo claro com MO peritoneais de camundongos. (A) demonstra o macrófago infectado e tratado por 48h com Gl (Glucantime ^® 300μg/ml + Crotamina ΙΟΟμg/ml) (B) demonstra o macrófago infectado e tratado por 48h por G2 (Glucantime ^® 300μg/ml + Crotamina 3,125μg/ml) (C) demonstra o macrófago infectado e tratado por 48h com GLU (Glucantime ^® 300μg/ml).

[00140] Figura 27: Simulação de interação molecular do Docking entre a AnB e a crotamina. x mostra o esquema de ligação de pontes de hidrogénio da AnB e z mostra modelo 3D de AnB (representação em bastões) e CTA (representação da superfície). Ax mostra uma ampliação de A x. [00141] Figura 28: Simulação de interação molecular do Docking entre o GLU e a crotamina. x mostra o esquema de ligação de pontes de hidrogénio do GLU e z modelo 3D do GLU (representação em bastões) e CTA (representação da superfície). Bx mostra uma ampliação de B x.

[00142] Figure 29: Simulação de interação molecular do Docking entre a PEN e crotamina. x mostra o esquema de ligação de pontes de hidrogénio da PEN e z mostra o modelo 3D de PEN (representação em bastões) e CTA (representação da superfície). Cx mostra uma ampliação de C x.

[00143] Figura 30: Ensaio de ligação policlonal-CTA em sensorchip acoplado com a toxina. Demonstração do sensorgrama da interação molecular da diluição 1:100 (v/v) de soro total de lhama imunizada com CTA. A análise de interação apresentou cerca de 1200 RU's de resposta confirmando a presença da CTA sob a superfície do sensor chip.

[00144] Figura 31: Interação molecular entre AnB e CTA, GLU e CTA e PEN e CTA. (A) análise de interação entre a AnB e CTA foi realizada nas concentrações de 100, 50, 25 e 5 μΜ. (B) a análise de interação entre GLU e CTA foi realizada nas concentrações de 100, 50, 25 e 5 μΜ. (C) a análise de interação entre a PEN e CTA foi realizada nas concentrações de 50, 25 e 5 mg/ml.

[00145] Figura 32: Sensorgrama da interação molecular entre PEN e CTA, GLU® e CTA e AnB e CTA. A análise de interação entre a PEN e CTA foi realizada nas concentrações de 50, 25 e 5 mg/ml. A análise de interação entre GLU e CTA foi realizada nas concentrações de 100, 50, 25 e 5 uM. A análise de interação entre a AnB e CTA foi realizada nas concentrações de 100, 50, 25 e 5 μΜ. [00146] Figura 33: Espectro de massa em AXIMA TOF ² . (A) CTA, (B) Pentamidina, (C) Glucantíme ^® e (D) Anfotericina.

[00147] Figura 34: a espectrometria de massa para detecção de mudanças na estrutura primária dos compostos. Espectro de massa em AXIMA TOF ² da (A) CTA combinada com a PEN, (B) CTA combinada com Glucantíme ^® , (C) CTA combinada com AnB.

[00148] Figura 35: Massa corporal e dos órgãos dos animais. Os animais foram tratados por via intraperitoneal por 21 dias com Gl (PBS 2%), G2 (CTA Smg/kg ¹ ), G3 GLU (3OOmg/kg ¹ ), G4 PEN (4mg/kg ¹ ), G5 GLU (3OOmg/kg ¹ ) + CTA (5mg/kg ¹ ) e G6 PEN (4mg/kg ¹ ) + CTA (Smg/kg ¹ ). (A) massa total dos animais. (B) massa dos fígados dos animais. (C) massa dos rins dos animais. (D) massa do linfonodo dos animais. (E) massa do baço dos animais. Para se determinar as diferenças utilizou-se KRUSKAL-WALLIS e teste posterior de DUNN com significância de 5%. (A) (***P<0,0001 vs (**P<0,01 vs Gl e *P<0,05 vs G2).

[00149] Figura 36: Tamanho e massa das patas de camundongos BALB/C infectados com L· amazonensis e imagens representativas. Os animais foram infectados com L amazonensis (lxlO ⁵ ) e após abertura das úlceras (60 dias), os animais foram tratados por via intraperitoneal por três semana com Gl (PBS 2%), G2 (CTA Smg/kg ¹ ), G3 GLU (3OOmg/kg ¹ ), G4 PEN (4mg/kg ¹ ), G5 GLU (3OOmg/kg ¹ ) + CTA (Smg/kg ¹ ) e G6 PEN (4mg/kg ^_1 ) + CTA (Smg/kg ¹ ). (A) tamanho médio da pata de cada grupo mensurada nos dias de tratamento. (B) massa da pata mensurada no dia da eutanásia após amputação. Imagens, Gl (A-D), G2 (E-H), G3 (I-L), G4 (M- P), G5 (Q-T) e G6 (U-Y). Os dados estão representados pela média e desvio padrão. Para se determinar as diferenças utilizou-se a análise de variância ANOVA ONE-WAY com teste posterior de Tukey com significância de 5%. (A) (***P<0,0001 vs CP, **P<0,01 vs CP, *P<0,05 vs CP). (B) (#P<0,05 vs G2) e ($P<0,05 vs G4).

[00150] Figura 37: contagem de parasites no tecido do animal.

Camundongos BALB/C foram infectados com L. amazonensis (IxlO ⁵ ) e após abertura das úlceras (60 dias), os animais foram tratados por via intraperitoneal por três semana com Gl (PBS 2%), G2 (CTA 5mg/kg ¹ ), G3 GLU (3OOmg/kg ¹ ), G4 PEN (4mg/kg ¹ ), G5 GLU (3OOmg/kg ¹ ) + CTA (Smg/kg ¹ ) e G6 PEN (4mg/kg ¹ ) + CTA (Smg/kg ¹ ). A contagem de parasitos ocorreu em câmara de Neubauer cinco dias após a eutanásia. O número de parasitos foi dividido pela média massa do tecido do grupo. (A) contagem de parasitos no tecido da pata infectada do animal. (B) contagem de parasitos no linfonodo da pata infectada do animal. Para se determinar as diferenças utilizou-se a análise de variância ANOVA ONE-WAY com teste posterior de Tukey com significância de 5%. (A) (***P<0,0001 e ** P<0,01 vs Gl; & P<0,0001 e # P<0,01 vs G2; $ P<0,0001 vs G5 e ø P<0,0001 vs G6) e (B) (**P<0,01 vs Gl; vs G2; # P<0,0001; # P<0,0001 vs G3; $ P<0,01 vs G4; *** P<0,0001 vs Gl, $ P<0,0001 vs G2. & P<0,0001 vs G3, £ P<0,0001 vs G4 e Φ P<0,0001 vs G5)

[00151] Figura 38: Marcadores bioquímicos de lesão cardíaca e muscular. Os animais foram tratados por via intraperitoneal por 21 dias com Gl (PBS 2%), G2 (CTA Smg/kg ¹ ), G3 GLU (3OOmg/kg ^-1 ), G4 PEN (4mg/kg ¹ ), G5 GLU (3OOmg/kg ¹ ) + CTA (Smg/kg ¹ ) e G6 PEN (4mg/kg ¹ ) + CTA (5mg/kg ^_1 ). Para se determinar as diferenças utilizou-se KRUSKAL- WALLIS e teste posterior de DUNN com significância de 5%. (A) analise bioquímica da CK/MB sanguínea após tratamentos. (B) análise bioquímica da CK/Total sanguínea após tratamentos. Para se determinar as diferenças foi utilizado a análise de variância ANOVA ONE-WAY com teste posterior de Tukey com significância de 5%. (A) (***p< 0,0001 vs Gl; $P< 0,0001 vs G2; # P< 0,05 vs G3. (B) (**P< 0,001 vs Gl; *P< 0,05 vs G2; #P< 0,01 vs G3. e $P< 0,05 vs G6).

[00152] Figura 39: Marcadores bioquímicos de lesão renal. Os animais foram tratados por via intraperitoneal por 21 dias com Gl (PBS 2%), G2 (CTA 5mg/kg ¹ ), G3 GLU (3OOmg/kg ¹ ), G4 PEN (4mg/kg ¹ ), G5 GLU (3OOmg/kg ¹ ) + CTA (Smg/kg ¹ ) e G6 PEN (4mg/kg ¹ ) + CTA (Smg/kg ¹ ). Para se determinar as diferenças utilizou-se a análise de variância ANOVA ONE-WAY com teste posterior de Tukey com significância de 5%. Não houve diferença entre os tratamentos.

[00153] Figura 40: Marcadores bioquímicos de lesão hepática. Os animais foram tratados por via intraperitoneal por 21 dias com Gl (PBS 2%), G2 (CTA Smg/kg ¹ ), G3 GLU OOOmg/kg ¹ ), G4 PEN (4mg/kg ¹ ), G5 GLU (300mg/kg ^"1 ) + CTA (Smg/kg ¹ ) e G6 PEN (4mg/kg ¹ ) + CTA (Smg/kg ¹ ). Para se determinar as diferenças utilizou-se a análise de variância ANOVA ONE-WAY com teste posterior de Tukey com significância de 5%. (A) (***P< 0,0001 vs Gl; $$P< 0,0001 vs G2; 00P< 0,0001 vs G3. ;##P< 0,0001 vs G4 e &P< 0,05 vs G5). (B) (***P< 0,0001 vs Gl; **P< 0,01 vs Gl; $P< 0,01 vs G2. ##P< 0,0001 vs G3, #P< 0,01 vs G3, 00P<O,OOO1 vs G4, 0P<O,O1 vs G4).

[00154] Figura 41: Marcadores bioquímicos de lesão pancreática.

Os animais foram tratados via intraperitoneal por 21 dias com Gl (PBS 2%), G2 (CTA Smg/kg ¹ ), G3 GLU OOOmg/kg ¹ ), G4 PEN (4mg/kg ¹ ), G5 GLU OOOmg/kg ¹ ) + CTA (Smg/kg ¹ ) e G6 PEN (4mg/kg ¹ ) + CTA (Smg/kg ¹ ). Para se determinar as diferenças utilizou-se a análise de variância ANOVA ONE-WAY com teste posterior de Tukey com significância de 5%. Não houve diferença entre os tratamentos. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00155] A não ser que seja definido de maneira diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado entendido por um técnico no assunto ao qual a presente invenção pertence. O relatório descritivo também provê definições de termos para auxiliar na interpretação daquilo que é aqui descrito e das reivindicações. A terminologia utilizada na descrição da invenção tem finalidade de descrever concretizações preferenciais somente, e não tem a intenção de limitar o escopo de seus ensinamentos.

[00156] A não ser que seja indicado de forma diferente, todos os números expressando quantidades, porcentagens e proporções, e outros valores numéricos utilizados no relatório descritivo e nas reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados, em todos os casos, pelo termo "cerca de". Assim, a não ser que seja indicado o contrário, os parâmetros numéricos mostrados no relatório descritivo e nas reivindicações são aproximações que podem variar dependendo das propriedades a serem obtidas.

[00157] Todas as referências bibliográficas patentárias ou não patentárias citadas no presente pedido, são aqui incorporados por referência em sua integralidade.

[00158] A presente invenção soluciona os problemas do estado da técnica ao prover uma combinação entre Crotamina e fármacos utilizados na terapia, de forma que esta combinação melhora ou mantém a eficácia dos referidos fármacos, ao mesmo tempo que diminui a toxicidade dos mesmos.

[00159] O termo "combinação" refere-se à associação de dois ou mais ingredientes ativos na forma de um produto.

[00160] Especificamente, a dita combinação é formada por uma associação sinérgica entre a Crotamina e o fármaco, em que não há formação de nova entidade química quando dispõe-se a Crotamina e o fármaco em solução, já que a afinidade entre a Crotamina e o fármaco é fraca.

[00161] Ademais, a dita combinação sinérgica é capaz de melhorar ou manter a eficácia dos fármacos ao mesmo tempo que diminui efeitos adversos/colaterais e citotoxicidade dos mesmos.

[00162] Adicionalmente, a dita combinação modula a produção de NO, IL-12 e TNF-α, responsáveis por induzir resposta imunológica celular e humoral favoráveis ao controle da infecção.

[00163] A combinação da presente invenção ainda modula importantes proteínas de vias inflamatórias relacionadas ao controle de infecções.

[00164] Os exemplos concretizados abaixo comprovam as melhorias da presente invenção frente ao estado da técnica.

[00165] Em uma forma de concretização, a Crotamina é a Crotamina de SEQ DD NO: 1 e/ou isoformas da mesma.

[00166] Conforme aqui entendido, as referidas isoformas de Crotamina apresentam atividade equivalente a atividade da Crotamina utilizada de forma ilustrativa na presente invenção.

[00167] Para fins desta invenção, a Crotamina apresenta atividade de penetração celular, de forma a carrear drogas para o interior de células sem a necessidade de receptor específico de superfície de membrana e/ou transportadores, com potencial de ação no nível do DNA.

[00168] Especificamente, a Crotamina aqui descrita atua como um nanopeptídeo com interação com o DNA humano, de forma a endereçar os fármacos antileishmaniais para o interior de macrófagos infectados, com a finalidade de melhorar a eficácia farmacológica dos fármacos utilizados para o tratamento de Leishmaniose, assim como reduzir os efeitos colaterais/adversos dos mesmos.

[00169] Em uma forma de concretização, as isoformas de Crotamina possuem de cerca de 50% a cerca de 99%, preferencialmente de cerca de 60% a cerca de 99%, mais preferencialmente de cerca de 70% a cerca de 99%, mais preferencialmente de cerca de 80% a cerca de 99%, mais preferencialmente de cerca de 90% a cerca de 99%, ainda mais preferencialmente de cerca de 95% a cerca 99% de identidade com a Crotamina de SEQ ID NO: 1.

[00170] Em uma outra forma de concretização preferida, a Crotamina é de toxina de animais peçonhentos.

[00171] O termo "animais peçonhentos" aqui é entendido como animais que, por meio de um mecanismo de caça e defesa, são capazes de injetar em suas presas uma substância tóxica produzida em seus corpos, diretamente de glândulas especializadas (dente, ferrão, aguilhão) por onde passa o veneno.

[00172] No contexto da presente invenção, os animais peçonhentos são preferencialmente serpentes, escorpiões, aranhas, lepidópteros (mariposas e suas larvas), himenópteros (abelhas, formigas e vespas), coleópteros (besouros), quilópodes (lacraias), peixes, cnidários (águas-vivas e caravelas), entre outros.

[00173] Em uma forma de concretização preferida, o animal peçonhento é serpente.

[00174] Em uma forma de concretização mais preferida, a serpente é do género Crotalus.

[00175] No contexto da presente invenção, a serpente do género Crotalus é selecionada do grupo de Crotalus adamanteus, Crotalus aquilus, Crotalus atrox, Crotalus basiliscus, Crotalus catalinensis, Crotalus cerastes, Crotalus durissus, Crotalus enyo, Crotalus exsul, Crotalus horridus, Crotalus intermedius, Crotalus lannomi, Crotalus lepidus, Crotalus mitchellii, Crotalus molossus, Crotalus polystictus, Crotalus pricei, Crotalus pusillus, Crotalus ruber, Crotalus scutulatus, Crotalus stejnegeri, Crotalus tigris, Crotalus tortugensis, Crotalus transversus, Crotalus triseriatus, Crotalus vegrandis, Crotalus viridis e Crotalus willardi.

[00176] Em uma forma de concretização ainda mais preferida, a serpente é Crotalus durissus terrificus.

[00177] Em uma forma de concretização, o fármaco efetivo é selecionado do grupo que consiste de: Anfotericina B, Pentamidina, Glucantime ^® , Pentostam ^® , Paromomicina, Miltefosina ou combinações destes.

[00178] Em uma forma de concretização preferida, o fármaco efetivo é Anfotericina B, Pentamidina ou Glucantime ^® ou combinações destes.

[00179] Em uma forma de concretização, o fármaco efetivo é para o tratamento das Leishmanioses.

[00180] Em uma forma de concretização preferida, o fármaco efetivo é para o tratamento da Leishmaniose Visceral e/ou Leishmaniose Tegumentar.

[00181] Em uma forma de concretização mais preferida, a Leishmaniose é a Leishmaniose Tegumentar Americana.

[00182] Particularmente, a Leishmaniose Tegumentar Americana é causada pela espécie L. amazonensis, responsável pela doença na forma cutânea difusa.

[00183] Em outro aspecto da invenção, a invenção provê uma composição farmacêutica que compreende a combinação descrita acima e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. [00184] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são selecionados em função da apresentação final da composição da presente invenção que pode ser na forma de cápsulas, comprimidos ou solução para a administração oral, solução para administração nasal, solução injetável para administração intramuscular, intravenosa, cutânea ou sub-cutânea. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis não apresentam toxicidade ao organismo receptor nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes como ácido ascórbico e metionina; conservantes como cloreto de octadecildimetilbenzil amónio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, fenol, álcool butílico, álcool benzílico, alquil parabenos como metil- e propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol e m-cresol; excipientes poliméricos como polivinilpirrolidonas, Ficoll®, dextrinas e polietileno glicóis; agentes de sabor; adoçantes; agentes anti-estáticos; agentes quelantes como EDTA ou EGTA; sais liberadores de íons como sódio; complexos metálicos; surfactantes não-iônicos como polissorbatos 20 e 80; diluentes como lactose, amido, manitol ou celulose microcristalina; lubrificantes, deslizantes e antiaderentes como estearato de magnésio, lauril sulfato de sódio ou talco; aglutinantes como goma arábica, ácido algíhico, CMC-Na, etilcelulose, ou metilcelulose; desintegrantes como amigo, alginato de sódio ou crospovidona, CMC-Na; agentes molhantes como lauril sulfato de sódio, docusato sódico, polissorbatos 20, 60, 80 (Tweens®), agentes de revestimento como derivados de celulose (metilcelulose, etilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, acetato de celulose). Métodos para preparação de várias composições farmacêuticas são bem conhecidos, ou serão aparentes à luz da presente invenção, pelo especialista da arte em tecnologia farmacêutica.

[00185] Além disto, as composições podem compreender aditivos com o objetivo de aumentar a facilidade de administração, a capacidade de serem estocadas, a resistência à degradação, a biodisponibilidade, a meia vida, prover preparações isotônicas, etc. Aditivos usais para a preparação de composições farmacêuticas são bem conhecidos na arte.

[00186] Ainda, as referidas composições podem compreender sistemas de liberação modificada de drogas. Os sistemas de liberação modificada são selecionados do grupo que compreende lipossomas, bombas osmóticas, revestimentos entéricos, sistemas matriciais poliméricos, sistemas transdérmicos, implantes, micro e nanoemulsões e outros bem conhecidos na arte.

[00187] As composições farmacêuticas devem compreender uma quantidade terapeuticamente efetiva da combinação. Para qualquer composto, a dose terapeuticamente efetiva pode ser estimada inicialmente, quer em ensaios de cultura de células, quer em modelos animais, usualmente camundongos, coelhos, cães ou porcos. O modelo animal também pode ser usado para se determinar a faixa de concentração apropriada e a via de administração. Informação desse tipo pode então ser usada para se determinar doses úteis e vias para administração em humanos.

[00188] Em uma concretização preferida, o fármaco Pentamidina é compreendido na referida composição na faixa de 6 mg/ml até 0,006mg/ml, o fármaco Glucantime é compreendido na referida composição na faixa de 300 mg/ml até 0,03 mg/ml, o fármaco Anfotericina B é compreendido na referida composição na faixa de 2 mg/ml até 0,002mg/ml, a Crotamina é compreendida na referida composição na faixa de 10 mg/ml até 0,001mg/ml. [00189] Conforme a presente invenção, a administração das ditas composições farmacêuticas pode ser realizada pelas vias de administração: oral, sublingual, nasal, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intra- articular, subcutânea, cutânea, transdérmica, não sendo limitada a estas.

[00190] Em um outro aspecto, é provido um medicamento, que compreende a combinação descrita acima.

[00191] Em um outro aspecto, a invenção provê um método para tratar leishmaniose que utiliza a combinação descrita acima.

[00192] A quantidade efetiva precisa para um indivíduo humano dependerá da gravidade do estado de doença, da saúde geral do indivíduo, da idade, do peso, e do sexo do sujeito, da dieta, do tempo e da frequência de administração, da combinação/combinações de drogas, das sensibilidades de reação, e da tolerância/resposta à terapia. Assim, doses a serem fornecidas dependem de um número de fatores que não podem ser mensuradas antes que os estudos de testes clínicos sejam feitos. O técnico no assunto, no entanto, sabe como chegar a doses adequadas para diferentes tratamentos.

[00193] Em um aspecto adicional, a invenção provê o uso da combinação descrita acima para manufatura de um medicamento para tratar leishmaniose.

[00194] Embora várias formas de realização que incorporam os ensinamentos da presente invenção tenham sido aqui mostradas e descritas em detalhes, àqueles versados na técnica será possível vislumbrar prontamente muitas outras formas de realização variadas que possam ainda incorporar esses ensinamentos. Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui se tornarão aparentes àqueles peritos na técnica a partir da descrição precedente. Tais modificações também se destinam a estar dentro do escopo das reivindicações anexa.

[00195] A presente invenção será agora descrita por meio de exemplos, os quais pretendem ser, meramente ilustrativos da presente invenção, não sendo, de forma alguma, limitativos quanto ao escopo e a abrangência da presente invenção.

EXEMPLOS

[00196] Experimentos in vitro [00197] EXEMPLO 01: Animais

[00198] Camundongos da linhagem BALB/c, machos, com 8-10 semanas de idade, pesando de 20-22g, obtidos do Biotério (IPEPATRO FIOCRUZ-RO) foram mantidos em condições padronizadas de biotério e experimentos foram realizados de acordo com as normas estabelecidas pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) do IPEPATRO/ FIOCRUZ-RO. O presente estudo foi aprovado sob o número de protocolo 2013/01.

[00199] EXEMPLO 02: Cepas de Leishmania amazonensis

[00200] Na presente invenção foram utilizadas formas promastigotas de Leishmania amazonensis (IFLA/BR/67/PH8), cuja cultura original foi cedida pelo Dr. Francisco Juarez Ramalho Pinto, da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo. As culturas foram mantidas a partir de camundongos BALB/c, previamente inoculados com 105 promastigotas de L amazonensis.

[00201] EXEMPLO 03: Obtenção da Crotamina de Crotalus durissus terrifícus [00202] A crotamina (CTA) foi purificada a partir da peçonha da serpente Crotalus durissus terríficas e no laboratório de Biomoléculas para Uso na Medicina da Universidade Federal de Rondônia (CEBIO). A concentração de proteína foi determinada através de espectrofotometria a 280 nm, utilizando coeficientes de extinção da composição dos aminoácidos aromáticos de componentes, Trp, Tyr, e Phe, respectivamente: e 280 = 265559 1197 0,7 = 1,236104 M21 CM21. Oligonucleotídeos foram a partir de Midland Certífied Reagent Company, Inc. (Midland, TX): KR-2: d 8C (CCG), KR-1: dG (CGG), 8, 21 +: d (ATGTGGAAAATCTCTAGCAGT), 21 -: d (ACTGCTAGAGATTTTCCACAT), (dT) 7, (dT) 14, e de (dT) 21. DNA de timo de bezerro foi adquirida da Sigma (tipo I, estimado pelo fornecedor a ser 10-15 MDa de comprimento).

[00203] A síntese do Arg-Trp- Arg-Trp-Li s-Leu-NH2 foi realizada manualmente, utilizando padrão Fmoc (N-(9-fluorenil) metoxicarbonilo) química (FIELDS, 1990) em 100 mg de resina de amida Rink (0,7 meq/g, Advanced ChemTech, Louisville, KY, EUA). Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc)- OH, Fmoc-Τφ (Boc)-OH e Fmoc-Arg (Pbf)-OH (Advanced Chemlech) foram utilizados em cerca de 2,5 vezes de excesso molar em relação à derivação de resina nominal. Acoplamentos foram realizadas por utilização de HBTU (O- benzotriazol-N, N, N', N'-tetramelil-urónio hexafluoro-fosfato) / HObt (N- hidroxibenzotriazole mono-hidrato) de uma mistura em presença de N, K- diisopropiletilamina. Remoção de cadeia lateral proteção e a clivagem do peptídeo a partir da resina de amida Rink foram realizados simultaneamente usando 262 mL de ácido trifluoroacético, água, triisopropilsilano, anisolo (88:5:4:3 v / v / v / v) mais de 20 mg de ditiotreitol durante 2 horas à temperatura ambiente. A solução bruta de peptídeo foi obtida concentrada sob vácuo para obtenção de um resíduo oleoso que foi então extraída quatro vezes com 5 mL de éter metil-t-butílico frio para remover subprodutos da reação. A purificação foi realizada através da aplicação do peptídeo em bruto dissolvido em 10 mL de uma solução 0,15 M de NaCl tamponado com 0,03 M de Tris-Q, pH 8,1, numa coluna de 1640 centímetros de CM-Sepharose FF (Amersham Biosciences), equilibrada com tampão de amostra e desenvolvido com um gradiente de NaCl a 1 M . O material correspondente ao último pico de eluição A280 nm foi de caracterizados por análise de aminoácidos após hidrólise ácida, que indica um peptídeo cuja composição tinha a razão molar Leu (1,0), Lys (1,2), Trp (2.0), e Arg (1,8) e um rendimento global de 22%. Alíquotas do peptídeo purificado foram dessalinizadas por cromatografia de fase reversa em C-18 Sep-Pak cartuchos (Millipore Co., MA (EUA), e hofilizado. O tampão padrão usado para a união de ADN-proteína e agregação experiências foi Hepes 0,02 M, pH 7,7, Na2EDTA 0,0001 M, e diferentes níveis de Nad.

[00204] EXEMPLO 04: Drogas antileishmania

[00205] As drogas de interesse da presente invenção foram a N- Metilglucamina (Glucantime ^® (GLU)), Pentamidina (PEN), e Anfotericina B (AnB) foram devidamente acondicionadas em -20°C até o momento da diluição para o seu uso nos experimentos. No momento dos experimentos a AnB e CTA, ou GLU e CTA, ou PEN e CTA.

[00206] EXEMPLO 05: Obtenção dos macrófagos peritoneais de camundongos

[00207] Camundongos BALB/c foram inoculados, por via intraperitoneal, com 2 mL de Tioglicolato 3%. Após 5 dias os foram eutanasiados por deslocamento cervical e 5 mL de meio RPMI gelado foram injetados na cavidade peritoneal e em seguida recuperados com a própria seringa. O lavado peritoneal foi centrifugado a 1000 RPM por 10 min a 4°C e o sobrenadante desprezado. Em seguida, o "pettef foi ressuspendido em 5 mL de meio RPMI e as células obtidas, contadas em câmara de Neubauer. Os macrófagos (SxlO^poço) foram plaqueados em placa de 24 poços contendo lamínulas estéreis e incubados a 37°C em estufa com atmosfera úmida contendo 5% de C02 (Estufa modelo RCO3000TVBB, REVCO Technologies, Asheville, USA).

[00208] EXEMPLO 06: Ensaio de inibição de crescimento de promastigotas de L amazonensis

[00209] Foi realizado o ensaio de inibição de crescimento de L amazonensis. Para tal utilizou-se os seguintes procedimentos:

[00210] Para a diluição das drogas e da nossa molécula de interesse utilizou-se a metodologia de Birinbaum (1978) de maneira que a droga sofre diluição de lOOx enquanto a molécula de interesse de lOx simultaneamente para cada concentração e combinação proposta, portanto, tem- se as seguintes concentrações para a avaliação inicial das concentrações mais promissoras. No entanto, em experimento piloto padronizou- se a utilização das concentrações de 100, 12.5 e 3,125μg/mL. de crotamina tendo sido desprezadas as concentrações de 50, 25 e 6,25μg/mL de crotamina por não terem demonstrado diferenças estatísticas para a concentração acima.

[00211] Para a realização do ensaio foi pipetado em eppendorfs estéreis as concentrações de drogas associadas ou não à crotamina e feito uma encubação de 48 horas como padronizado pelo nosso laboratório em estudo piloto, descartando-se, portanto, 24 e 72 duas horas por não apresentarem diferença entre elas. Cada poço possua 1x105 de promastigotas e a contagem foi realizada em câmara de Neubauer após coloração com Eosina. Esse experimento foi tealizado em duplicata.

Tabela 1. Descrição das concentrações e combinações entre as drogas antileishmaniais e a crotamina.

[00212] Este estudo preliminar determinou as concentrações e combinações mais promissoras a partir da % de inibição de formas extracelulares de L Amazonensis selecionando-se as concentrações que inibiram ao menos

50% do crescimento das promastigotas de L amazonensis. Portanto as combinações, AnB 1 + CTA 100 e AnB 0,01 + CTA 100; GLU 300 + CTA 100 e GLU 300 + CTA 3,125; PEN 0,05 + CTA 100 e PEN 0,05 + CTA 3,125 foram consideradas as mais adequadas seguindo o critério estabelecido.

[00213] A Figura 3 representa o ensaio piloto de inibição de promastigotas de L amazonensis.

[00214] Resultados:

[00215] PEN e suas combinações

[00216] Com a finalidade de determinar a eficácia das formulações com PEN sobre as formas promastigotas de L amazonensis o ensaio de inibição do crescimento de promastigotas foi adotado. A formulação P2 foi capaz de inibir sensivelmente mais promastigotas que a PEN (Figura 4). Embora os tratamentos PI e P2 não tenha se mostrado mais eficientes que a PEN, o desempenho foi igual com destaque para P2 contra promastigotas.

[00217] Foram encubados 5xl0 ⁵ parasitos por poço por 48h com PEN, ou CTA, ou PI, ou P2. A Figura 4 demonstra que PEN inibiu em 90,2% (P<0,0001), a PI inibiu 82,2% (P<0,0001), a P2 inibiu 66,3% (P<0,001) do crescimento das Promastigotas de L amazonensis quando comparadas com CTA e não houve diferença entre si. Os parasitos encubados com CTA exibiram aumento de 29,5%.

[00218] AnB e suas combinações

[00219] Afim de determinar a eficácia das formulações com AnB sobre as formas promastigotas de L. amazonensis realizou-se ensaio de inibição do crescimento de promastigotas. Encubou-se 5x10 ⁵ parasitos por poço por 48h com CTA, AnB, Al ou A2. A Figura 5 demonstra que AnB inibiu em 65,2% (P<0,01), Al inibiu 65,1% (P<0,01), A2 inibiu 47,42% (P<0,01) do crescimento das Promastigotas de L. amazonensis ao serem comparadas com CTA. Os parasitos encubados com CTA exibiram expansão de 29,5%.

[00220] GLU e suas combinações

[00221] Para determinar a eficácia das formulações com GLU sobre as formas promastigotas de L amazonensis realizou-se ensaio de inibição do crescimento de promastigotas. Encubou-se 5x10 ⁵ parasitos por poço por 48h com CTA, ou GLU, ou Gl ou G2. Na Figura 6, o GLU exibiu inibição de 65,2% e se comparado com CTA demonstra diferença (P<0,05), Gl inibiu 65,1% diferença de (P<0,01), G2 inibiu 47,42% (P<0,01) do crescimento das Promastigotas de L amazonensis. Os parasitos encubados com CTA exibiram expansão de 29,5%. Não houve diferença nas outras comparações.

[00222] EXEMPLO 07: Infecção, tratamento de macrófagos peritoneais e inibição de amastigotas de L amazonensis

[00223] Para avaliação da atividade leishmanicida, foram realizados ensaios de infecção em macrófagos peritoneais, obtidos de camundongos. Os ensaios de infecção foram realizados conforme descrito por Silva- Jardim (2004). Os macrófagos, depois de vinte e quatro horas de incubação, foram lavados duas vezes com meio RPMI e, em seguida, infectados com promastigotas de L amazonensis na proporção de 5 parasitas x 1 macrófago. As células infectadas foram incubadas "overnight" a 33°C em estufa com atmosfera úmida contendo a 5% de CO2. Após esse período os poços foram novamente lavados com RPMI. As drogas Antimoniato de meglumina, Anfotericina B, Pentamidina também sofreram os mesmos procedimentos. Foram utilizadas células infectadas não tratadas, como controle negativo da infecção. As culturas infectadas e tratadas foram mantidas por 48 horas a 34°C. Após esses períodos, o sobrenadante das culturas foi coletado e congelado para posterior dosagem de citocinas. A taxa de infecção e o número de parasitas intracelulares foram avaliados pela contagem de 100 macrófagos, em microscópio óptico - aumento de 1000X, após coloração das lâminas pela técnica May Grunwald-Giemsa (MGG). As células foram lavadas com RPMI sem suplemento e imobilizadas com soro fetal bovino até a lamínula secar naturalmente em temperatura ambiente. Depois de secas, o corante May Griinwald foi adicionado sobre as lamínulas por 10 segundos e, em seguida foi adicionada água destilada por 1 minuto. A solução corante/água foi removida e o corante Giemsa, preparado no momento do uso, foi acrescentado por 5 segundos, (1 gota corante/mL água destilada). Finalmente a lamínula foi lavada rapidamente com água destilada e, depois de seca, montada com bálsamo sobre uma lâmina de vidro para realização da contagem de amastigotas intracelulares. O índice fagocítico foi determinado por meio da fórmula: índice fagocítico: (% de macrófagos infectados x no total de leishmania)

Fórmula 1: fórmula para a determinação do índice fagocítico. [00224] Resultados:

[00225] PEN e suas combinações

[00226] Com a finalidade de determinar a eficácia das formulações com PEN sobre as formas amastigotas de L amazonensis foi realizada inicialmente a infecção de macrófagos peritoneais por 24h com uma taxa de 5:1 parasitos por macrófago. Logo, os macrófagos foram infectados por 48h com CTA, ou PEN, ou PI, ou P2. A PEN inibiu o crescimento das amastigotas de L amazonensis 55,4% (P<0,01) ao se comparar com MO, PI inibiu 51,6% (P<0,05) e (P<0,0001) com CTA e P2 inibiu 49,7% (P<0,05) contra MO e CTA. Dessa forma, a formulação PI foi ligeiramente mais eficiente do que P2 e os controles (Figura 7). Os parasitos encubados com CTA exibiram expansão de 4,6% como demonstrado na Figura 7. Não houve diferença entre PEN, PI e P2.

[00227] AriB e suas combinações

[00228] Com a finalidade de determinar a eficácia das formulações com AnB sobre as formas amastigotas de L. amazonensis realizou-se inicialmente a infecção de macrófagos peritoneais por 24h com uma taxa de 5:1 parasitos por macrófago. Logo, encubou-se os macrófagos infectados por 48h com CTA, ou AnB, ou Al, ou A2. A Figura 8 demonstra que AnB inibiu em 68,6%, (P<0,0001) exibindo diferença se comparada com MO (P<0,0001) e CTA (P<0,0001). Al inibiu 66,7% (P<0,0001) e ao ser comparado com MO e CTA (P<0,0001). A2 inibiu 58,6% que ao ser comparado com MO demonstrou diferença (P<0,01) assim como com CTA (P<0,0001) no crescimento das amastigotas de L. amazonensis. Os parasitos encubados com CTA exibiram expansão de 4,6%. Não houve diferença na comparação entre si. [00229] GLU c suas combinações

[00230] Com a finalidade de determinar a eficácia das formulações com GLU sobre as fornias amastigotas de L amazonensis realizou-se inicialmente a infecção de macrófagos peritoneais por 24h com uma taxa de 5:1 parasitos por macrófago. Logo, encubou-se os macrófagos infectados por 48h com CTA, GLU, Gl ou G2. A Figura 9 demonstra que o GLU permitiu expansão de 15,1% e ao ser comparado com MO e CTA apresentou diferença (P<0,05). Gl inibiu em 8,7% e quando comparado com MO apresenta diferença (P<0,0001) e para CTA (P<0,0001) o G2 inibiu em 3% com diferença (P<0,05) para MO e (P<0,0001) para CTA o crescimento das amastigotas de L amazonensis. Os parasitos encubados com Crotamina 100mg/ml exibiram expansão de 4,6%.

[00231 ] EXEMPLO 8: Determinação da produção de citocinas

[00232] As citocinas IL-12 e TNF-α são produzidas em resposta a infecções. A IL-12 está relacionada com o estímulo um conjunto de reações que vão direcionar o sistema imunológico do hospedeiro a uma resposta do tipo Thl que é esperada e desejada para o controle da infecção. O TNF-a possui uma maior relação com as respostas inflamatórias que propiciam o combate a infecções, como a Leishmaniose.

[00233] Para determinação da produção de citocinas, as citocinas TNF-α e IL-12 foram quantificadas nos sobrenadantes de macrófagos peritoneais coletados no experimento Infecção, tratamento de macrófagos peritoneais e inibição de amastigotas de L amazonensis, previamente descrito. Para cada citocina mensurada foi adotado o método imunoenzimático ELISA de captura. [00234] Para esta finalidade, foi utilizado o kit BD OptEIA de acordo com as instruções dos fabricantes. Este experimento foi realizado em triplicata.

[00235] Resultados

[00236] Produção de citocinas de células tratadas com PEN e suas combinações

[00237] Para se determinar as respostas imunológicas celulares de macrófagos infectados por L. amazonensis tratados ou não com PEN, CTA, ou as formulações de PEN e CTA utilizou-se o método ELISA. Para tanto, encubou-se macrófagos infectados por 48 horas com as drogas ou com as combinações referidas.

[00238] A PEN não se mostrou capaz de estimular as células infectadas a produzir IL-12 e TNF-α, no entanto, as formulações PI e P2 mostraram-se um potente estímulo para produção de IL-12, que provavelmente ajudará no controle da doença, porém, o mesmo não acontece para TNF-a.

[00239] A Figura 10A demonstra que MO Infectado produziu mais 870,64% (P<0,001) de IL-12 que PEN. Os macrófagos tratados com PI ou P2 demonstram aumento de 860,71% (P<0,001) e 885,47% (P<0,001), respectivamente na produção de IL-12 quando comparadas com o MO, PEN produziu 646,55% (P=0,001) se comparado à CTA, porém, não apresentam diferença para MO infectados (P>0,05).

[00240] A Figura 10B demonstra que PEN produziu 84,58% (P<0,001) mais TNF-α se comparados MO, mais 47,51% (P=0,01) que MO Infectado e mais 711,42% (/^Ο,ΟΟΙ) que CTA em resposta à infecção por L· amazonensis. Se comparados com PI ou CTA demonstram aumento de 8,22% (P>0,05) e 8,1% (P>0,05), respectivamente na produção de TNF-a quando comparadas com o MO, e menos 40,82% (P<0,05) e 41,43% (P<0,01) que PEN, porém, não apresentam diferença para MO Infectado (P>0,05) e se PI comparado com P2 não apresentou diferença (P>0,05).

[00241] Produção de citocinas de células tratadas com AnB e suas combinações

[00242] Afim de se determinar as respostas imunológicas celulares de macrófagos infectados por L. amazonensis tratados ou não com AnB, CTA, ou as formulações de AnB e CTA o método ELISA foi utilizado. Para tanto, macrófagos infectados foram encubados por 48 horas com as drogas ou com as combinações referidas.

[00243] A produção de IL-12 e TNF-α sofreram forte modulação pelos tratamentos Al e A2 diferentemente do que acontece com a AnB sozinha indicando potente estímulo celular para a produção dessas citocinas.

[00244] A Figura 11A demonstra que MO Infectado produziu mais 660,27% (P<0,001) IL-12 que AnB. Os macrófagos tratados com Al demonstraram aumento de 1029,97% (P<0,001) na produção de IL-12 comparado com MO, 996,63% (P<0,001) para CTA e 778,23% (P<0,001) para AnB. O tratamento com A2 demonstrou aumento de 964,81% (P=0,001) na produção de IL-12 para MO, 933,39% (P<0,001) para CTA e 727,55% (P<0,001) para AnB.

[00245] A Figura 11B demonstra que MO produziu mais 75,52% (P<0,001) TNF-α que CTA e mais 77,61% (P<0,001) que AnB. O MO infectado produziu mais 80,43% (P<0,001) TNF-α que CTA e 82,11% (P<0,001) que AnB. Os macrófagos tratados com Al comparado com CTA produziu mais 114% (P<0,001) TNF-α que MO, mais 71,05% (P<0,001) que macrófagos infectados, mais 774% que (P<0,001) que CTA, mais 855,93% (P<0,001) que AnB e mais 68,83% (P<0,001) que A2. Os macrófagos tratados com A2 exibem um aumento de 48,77% (P<0,001) para MO, 18,9% (P<0,001) para MO infectado, 507,72% (P<0,001) para CTA e 564,71% (P<0,001) para AnB.

[00246] Produção de citocinas de células tratadas com GLU e suas combinações

[00247] Com a finalidade de se determinar as respostas imunológicas celulares de macrófagos infectados por L. amazonensis tratados ou não com GLU, CTA, ou as formulações de GLU e CTA utilizou-se o método ELISA. Para tanto, encubou-se macrófagos infectados por 48 horas com as drogas ou com as combinações referidas.

[00248] O GLU não foi capaz de modular IL-12 e TNF-α, no entanto, as células sofreram forte estímulo para produzir TNF-α com destaque especial para a formulação G2 embora Gl tenha obtido o mesmo desempenho.

[00249] A Figura 12A demonstra que MO Infectado produziu mais 801,04% (P<0,001), mais 600,27 % (P=0,001) e 642,9% (P=0,001) IL-12 que MO, CTA e GLU respectivamente. Gl induziu a um aumento de 539,0% (P=0,001), 396,62% (P=0,001) e 389,61% (P=0,001) para MO, CTA e GLU respectivamente. G2 produziu mais 493, 83 (P=0,001), 361,51 (P=0,001) e 426,86% (P=0,001) para MO, CTA e GLU respectivamente. Não houve diferença (P< 0,05) para todas as outras comparações.

[00250] A Figura 12B demonstra que MO Infectado produziu mais 66,39% (P=0,001) de TNF-que macrófagos tratados com GLU. O tratamento com Gl e G2 demonstram aumento de 197,36% (P=0,001) e 327,85% (P=0,001), respectivamente, na produção de IL-12 quando comparadas com o MO, mais 881,55% (P=0,001) e 1464,39% (P=0,001) que CTA, porém, G2 apresenta uma produção de IL-12 262,03% (P<0,001) maior que MO Infectado, e Gl não apresenta diferença para MO Infectado (P>0,05) e se compararmos G2 com G2 há uma diferença de 60,2% (P<0,05).

[00251] EXEMLO 9: Determinação do IC 50

[00252] Os resultados dos valores de absorbância referentes à inibição de promastigotas em ensaio de diluição seriada foram convertidos em porcentagem de viabilidade celular onde as células em presença de DMSO correspondiam a 100% viabilidade. A análise de regressão foi realizada nos resultados de viabilidade, resultando em uma equação usada para calcular a concentração de substância necessária para produzir 50% de redução de viabilidade celular (IC50) por meio do software GraphPad Prism 5.0.

[00253] Com isso tentou-se determinar o IC50 para todos os tratamentos, no entanto, como normalmente acontece ao se trabalhar com venenos ou toxinas de venenos de serpentes, não foi possível encontrar uma curva de concentração dependente e o IC50 geralmente não pode ser determinado.

[00254] EXEMPLO 10: Ensaio de citotoxidade por MTT

[00255] A partir desse experimento foi determinado as concentrações de trabalho e seguindo para o ensaio de citotoxidade. O objetivo desse experimento foi determinar a citotoxidade de cada droga, da crotamina e de cada combinação entre droga e crotamina (Al, A2, Gl, G2, PI e P2). Para tal foram utilizadas células de linhagem J774 (lxl 0 ⁵ ), HEP-G2 (lxlO ⁵ ), VERO (lxlO ⁵ ) e C2C12 (4x1o ⁴ ) através do método de MTT (brometo de 3- metil-[4-5-dimetiltiazol-2-il]-2,5difeniltetrazólio), como descrito por (NICOLETE et ai., 2009). Os cálculos foram determinados utilizando a média da absorbância dos controles e os valores expressos em porcentagem conforme a fórmula abaixo.

Fórmula 2: fórmula para a determinação da citotoxidade celular

[00256] Resultados:

[00257] Os ensaios de citotoxidade são utilizados na descoberta da possível toxidade que uma substância ou composto podem possuir sobre células podendo inviabilizar o seu emprego em tratamentos in vitro ou in vivo. Com esse objetivo selecionou-se células J774, alvo do tratamento, C2C12 e HEP-G2 que são originárias de tecidos afetados pelas drogas ou pela CTA.

[00258] Citotoxicidade de PEN e suas Combinações

[00259] Para determinar a citotoxidade da PEN, da CTA e formulações com PEN utilizou-se células de linhagem J774, C2C12 e HEP- G2 encubadas por 48h com as drogas, ou CTA ou combinações entre PEN e CTA através do método de MTT. Como controle, utilizou-se o surfactante dodecil sulfato de sódio (SDS).

[00260] A PEN chama atenção pela toxidade contra células J774 fato que demonstra especial destaque para as formulações PI e P2 que são potencialmente menos tóxicas do que as drogas sozinhas (Figura 13A) com especial importância para essas células visto que são o alvo principal do tratamento. Em relação às células C2C12 e HEP-G2 nem a PEN, PI, ou P2 mostrou toxicidade. [00261] A CTA não demonstra citotoxidade contra as três linhagens celulares ao demonstrar proliferação de 12,61%, 108,35% e 66,57% respectivamente para células J774, C2C12 e HEP-G2. A PEN demonstra alta toxicidade contra células J774 inibindo em 92,55%, no entanto, não é tóxica à C2C12 e HEP-G2 ao demonstrar proliferação de 60,51% e 49,34%. Semelhantemente à CTA o tratamento PI, respectivamente, permitiu proliferação de 13,69, 118,87 e 87,6% e P2 28,99, 130,64 e 80,17% para J774, C2C12 e HEP-G2. Na Figura 13A CTA apresenta diferença (P<0,0001) para SDS e igualmente PEN para CTA. PI apresenta diferença (P<0,0001) para SDS, (P<0,0001) para PEN e (P<0,05) para CTA. P2 apresenta diferença (P<0,0001) para SDS, CTA, PEN e (P<0,05) para PI. A Figura 13B evidencia que todos os tratamentos apresentam diferença para SDS (P<0,0001), para CTA (P<0,05), PI demonstra diferença (P<0,05) e P2 de (P<0,01) para PEN e P2 (P<0,05) para PI. A Figura 13C demonstra que todos os tratamentos apresentam diferença (P<0,0001) para SDS e que PEN e PI (P<0,05) para CTA.

[00262] Citotoxicidade de AnB e suas Combinações

[00263] Afim de se determinar a citotoxidade da AnB, da Crotamina e das formulações de Anb com crotamina utilizou-se células de linhagem

J774, C2C12 e HEP-G2 encubadas por 48h com as drogas, ou CTA ou combinações entre drogas AnB e CTA através do método de MTT. Como resultado, A AnB, Al ou A2 não demonstrou citotoxidade.

[00264] A CTA demonstra não ser tóxica com proliferação de 7,49.

108,35 e 64,89%, a AnB permitiu proliferação de 2,37, 97,01 e 97,51%, Al de 17,84, 163,23 e 77,11% e A2 35,76, 135,04 e 91,61% respectivamente, para as células J774, C2C12 e HEP-G2. A Figura 14A demonstra que se compararmos AnB, Al e A2 com SDS há diferença (P<0,0001). A Figura 14B demonstra que CTA, AnB e A2 apresentam diferença (P<0,05) para SDS e Al ainda apresenta diferença (P<0,0001) para CTA. A Figura 14C demonstra que a AnB apresenta diferença (P<0,0001) e A2 (P<0,01) para SDS.

[00265] Citotoxicidade de GLU e suas Combinações

[00266] Com a finalidade de determinar a citotoxidade do GLU, da Crotamina e das formulações de GLU com crotamina utilizou-se células de linhagem J774, C2C12 e HEP-G2 encubadas por 48h com as drogas, ou CTA ou combinações entre GLU e CTA através do método de MTT. Em nenhum dos experimentos a GLU, as formulações Gl ou G2 foram citotóxicas contra células J774, C2C12 ou HEP-G2. A CTA não demonstrou citotoxidade para J774, C2C12 e HRP-G2 ao permitir proliferação celular de 7,49%, 98,99% e 64,89%. A GLU inibiu em 4,86% as células J774, mas permitiu proliferação de 99,21% de C2C12 e 68,68% para HEP-G2. Gl inibiu o crescimento de J774 em 8,4% mas permitiu proliferação de C2C12 em 115,57% e de 92,55% de HEP-G2. G2 permitiu proliferação de 5,49, 115,57 e 91,47% respectivamente para J774, C2C12 e HEP-G2. Estes resultados estão demonstrados na Figura 15. A Figura 15C demonstra que todos os tratamentos apresentam diferença para SDS (Ρ<0,0001) e PI e P2 (P<0,0001) para CTA.

[00267]

[00268] EXEMPLO 11: Quantificação de Proteínas de Vias Inflamatórias por meio de Ensaio de Path Scan Inflammation

[00269] A resposta inflamatória é uma das primeiras respostas do sistema imunológico do hospedeiro a infecções, pode ser mediada por citocinas, quimiocinas e são caracterizadas por dor, calor, rubor e edema no local da inflamação que, pode resultar no controle da infecção ou na liberação de fatores de crescimento promovendo a reconstituição de tecidos danificado após a remoção dos patógenos do local.

[00270] O PathScan® Inílammation Multi-Target (Celi Signaling Technology, Inc Danvers, MA, EUA) é uma metodologia que utiliza a técnica de Elisa para substituir a detecção de fatores de transcrição fosforilados pela técnica de western blot. Esse kit detecta níveis endógenos de NF-κΒ p65, NF-κΒ p65 fosforilado (Ser536), SAPK/JNK fosforilado (Thrl83/Tyrl85), MAPK p38 fosforilado (Thrl80/Tyrl82), Stat3 fosforilado (Tyr705) ΙκΒ-α fosforilado (Ser32).

[00271] Para tal procedimento infectou-se 2,5 xlO ⁶ células J774 com L amazonensis em uma relação de 5:1 parasitos por célula por 4 horas. Então, a cada dois poços, de uma placa de 24 poços, utilizou-se as seguintes preparações: Partícula controle, J774 infectada, J774 infectada + PEN 5μg/ml, J774 infectada + AnB ^g/ml e J774 infectada + GLU 300μg/ml.

[00272] Após 48 horas de incubação em atmosfera úmida com 5% de CO ₂ , o sobrenadante foi coletado e às células aderidas foi adicionado um inibidor de protease. Posteriormente as células foram retiradas dos poços por força mecânica e transferidas para um eppendorf contendo 300 μΙ~. de PBS Ix. As células foram Usadas em sonicador de ponta com amplitude e frequência para que os fatores de transcrição fossem liberados.

[00273] O procedimento de Elisa ocorreu utilizando soluções e anticorpos disponibilizados com o kit. Brevemente, os lisados foram diluídos 1:1 em diluentes de amostra para um volume final de 100 μϋ, e adicionados em poços de placa de 96 poços com anticorpo primário específico para cada proteína já previamente adsorvido e identificado. A placa foi incubada a 37°C por duas horas e posteriormente lavada manualmente com tampão de lavagem quatro vezes. Posteriormente, foi adicionado o anticorpo de detecção, também específico para cada proteína, por uma hora a 37°C. A placa foi novamente lavada e incubada com anticorpo conjugado com peroxidase (HRP) por 30 min a 37°C e após este período foi adicionado o substrato 3,3^5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) para desenvolvimento de cor a temperatura ambiente. Após 30 minutos a reação foi interrompida, adicionando-se uma solução de para de e as amostras foram lidas em espectrofotômetro a 450nm.

[00274] Resultados

[00275] Tratamento com PEN e suas Combinações

[00276] A PEN inibe a Phospho NF-kB e foi incapaz de estimular as proteínas das outras vias investigadas. A Figura 16 evidencia que o tratamento com a PEN (5μg/wl) foi capaz de diminuir a NF-kB p65 em

46,36% (P< 0,0001), no entanto, a Phospho NF-kB, SAPK/JUK, Phospho p38, Stat 3 e IkkB não sofreram alterações (P>0,05).

[00277] Tratamento com AnB e suas Combinações

[00278] O tratamento com AnB inibiu a NF-kB p65, no entanto, estimulou Phospho NF-Kb, Sapk/JUK e IkkB, orientando três vias inflamatórias.

[00279] Na Figura 17 os valores de Phospho p38 e Stat 3 mostraram- se inalterados entre células J774 infectadas com L amazonensis tratadas ou não com AnB. No entanto, MO infectados tratados com AnB produziram menos 54,27% NF-kB p65 (P<0,0001), mais 22,85% Phospho NF-kB (P<0,05), mais 25,39% SAPK/JNK (P<0,01) e mais 33,72% de IkkB (P<0,01) que MO infectados não tratados produziram mais que os MO não infectados.

[00280] Tratamento com GLU e suas Combinações [00281] O GLU inibiu a NF-kB p65, no entanto, não alterou nenhuma das outras proteínas de vias inflamatórias distintas.

[00282] A Figura 18 explicita que tratamento com o GLU (300μΛ¾ιη1) foi capaz de diminuir a NF-kB p65 em 65,6% (P< 0,0001), no entanto, a Phospho NF-kB, SAPK/JUK, Phospho p38, Stat 3 e IkkB não sofreram alterações (P>0,05).

[00283] EXEMPLO 12: Mensuracão da produção de Nitrito (NO)

[00284] O NO é um gás produzido pela célula com objetivo de eliminar patógenos que habitam o meio intracelular, representando uma das mais potentes ações da célula nesse sentido. Trata-se, portanto, de uma importante medida para investigar respostas celulares a infecções.

[00285] Para determinar a resposta da produção de NO encubou-se macrófagos peritoniais com CTA, PEN, AnB, GLU e suas formulações. A concentração de nitrito foi mensurada pelo método colorimétrico de Griess (GREEN et al, 1982). O reagente de Griess é uma mistura 1:1 de 1% de sulfanilamida e 0.1% de naftiletilenodiamino-bicloridrato em ácido ortofosfórico (H3P04) a 5%.

[00286] Resultados

[00287] Produção de Nitrito de células tratadas com PEN e suas combinações

[00288] A PEN não se mostrou capaz de estimular a produção de NO, no entanto, a CTA, PI e P2 foram capazes de estimular maior produção de NO. A Figura 19 demonstra que o tratamento PI comparado com MO produziu mais 19,53% (P<0,001), mais 62,68% (P<0,001) que MO Infectado, mais 10,21% (P<0,001) que CTA e comparado com PEN mais 57,37% (P<0,001). Já P2 comparada com MO produziu menos 7,14% (P<0,001), mais 26,83% CP<0,001) que MO Infectado, menos 14,37%

(P<0,001) que CTA e mais 22,26% (P<0,001) para PEN.

[00289] Produção de Nitrito de células tratadas com AnB e suas combinações

[00290] As formulações Al e A2 foram capazes de modular a produção de NO com destaque para A2, sugerindo melhor resposta para o combate da infecção intracelular.

[00291] O MO Infectado produziu 34,2% (P<0,001) menos NO que MO. Os macrófagos infectados com L. cunazonensis e tratados com CTA, após 48h produziram 10,61% (P<0,001) mais NO que os macrófagos não infectados. Comparando-se os tratamentos, a Figura 20 demonstra a formulação de Al comparada a AnB demonstra uma produção de 33,82% maior (P<0,001), a combinação A2 comparada com a AnB apresenta aumento de 92,02% CP<0,001) e A2 se comparado com Al demonstra aumento de 32,42% na produção de NO (P<0,001).

[00292] Produção de Nitrito de células tratadas com GLU e suas combinações

[00293] Para o ensaio com GLU, notou-se que CTA, GLU, Gl e G2 apresentam desempenho muitos próximos, com destaque para um ligeiro aumento para G2. A Figura 21 demonstra que o tratamento com Gl comparado com MO produziu menos 9,47% (P<0,001), mais 23,20% (P<0,001) que MO Infectado, menos 17,85% (P<0,001) que CTA e comparado com GLU menos 3,11% (P<0,05). Já G2 comparada com MO produziu mais 17,05% (P<0,001), e mais 59,31% (P<0,001) que MO Infectado, mais 6,21% (P<0,001) que CTA e mais 25,26% (P<0,001) que GLU. [00294] EXEMPLO 13: Aquisição de imagens de microscopia ótica de campo claro

[00295] Imagens de microscopia de campo claro foram obtidas representando alterações na morfologia do MO infectado, na integridade da membrana e no número de amastigotas a partir das lâminas que foram produzidas para ensaio de inibição de amastigotas.

[00296] As lâminas analisadas foram macrófago não infectado, macrófago infectado com L. amazonensis e não tratado, macrófago infectado e tratado com CTA, PEN, AnB ou GLU e suas combinações. Utilizou-se aumento de de 400X ou 1000X para todas as imagens.

[00297] Resultados

[00298] A Figura 22A representa o MO não infectado, a Figura 22B representa MO infectado com L. amazonensis e a Figura 22C demonstra o macrófago infectado e tratado com CTA. As Figuras 22B e 22C demonstram que o macrófago possui capacidade fagocítica.

[00299] A Figura 23A representa o macrófago infectado e tratado com Crotamina 100μg/ml. A Figura 23B representa o macrófago infectado e tratado com Crotamina 3,125μg/ml. O macrófago demonstra integridade da membrana e morfologia normal mesmo após tratamento com concentração de ΙΟΟμg/ml ou 3,125μg/ml.

[00300] A Figura 24A representa o macrófago tratado por 48h com PI, a Figura 24B representa o macrófago tratado por 48h com P2 e a Figura 24C representa o macrófago tratado por 48h com PEN. As imagens 24A e 24B sugerem que a combinação de PEN com CTA mantém a integridade da membrana celular se comparada com a PEN sozinha (Figura 24C). Além disso, comparado com CTA e PEN, a combinação diminui o número de parasitas intracelulares e de macrófagos infectados. Sabidamente, a PEN sozinha diminui a integridade da membrana celular.

[00301] A Figura 25 A representa o macrófago tratado por 48h com AnB, a Figura 25B representa o macrófago tratado por 48h com Al e a Figura 25C representa o macrófago tratado por 48h com A2. As Figura 25B e 25C sugerem que a combinação de AnB com a CTA mantém a integridade da membrana do MO quando comparadas com o MO tratado com AnB sozinha (Figura 25A). Além disso, comparado com CTA e AnB, a combinação diminui o número de parasitas intracelulares e de macrófagos infectados. A AnB sozinha parece diminuir a integridade da membrana celular.

[00302] A Figura 26A representa o macrófago tratado por 48h com Gl, a Figura 26B representa o macrófago tratado por 48h com G2 e a Figura 26C representa o macrófago tratado por 48h com GLU. As imagens 26A e 26B sugerem que a combinação de GLU com CTA mantém a integridade da membrana celular se comparada com a PEN sozinha (Figura 26C). Além disso, comparado com CTA e GLU, a combinação diminui o número de parasitas intracelulares e de macrófagos infectados. O GLU sozinho não parece afetar a integridade da membrana celular.

[00303] EXEMPLO 14: Simulação de afinidade molecular por

Bioinformática (Docking)

[00304] O Docking molecular é uma importante ferramenta para simulação de afinidade molecular entre compostos dadas as suas características químicas.

[00305] Para investigar as características estruturais dos aminoácidos, interações entre CTA e moléculas de três drogas (Glucantime ^® , Pentamidina e Anfotericina B), foi realizada o Docking molecular. Para recuperação da estrutura da CTA foi utilizado o Protein Data Bank (PDB) (http://www.pdb.org) (código PDB: 4GV5). As estruturas de drogas foram baixadas do servidor PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). A acoplagem foi efetuada em GEMDOCK programa 2.1, utilizando Genethic Algoritmo (GA) com o tamanho da população (N = 300) e toda a proteína foi considerada como alvo. As estruturas de melhor pontuação de ancoragem foram analisadas e visualizadas no Swiss-PDB espectador, UCSF Chimera [g], ligplot + 1,4 [h] e estruturas imagens com persistência de visão Raytracer (POV-ray) 3,62 (http://www.povray.org /).

[00306] Resultados

[00307] Interação Molecular entre AnB e Crotamina

[00308] A Figura 27Ax mostra o esquema de ligação de pontes de hidrogénio da AnB (linha tracejada verde) com distâncias em angstrons e interações hidrofóbicas (semicírculos em aminoácidos). A Figura 27Az mostra o Modelo 3D de AnB (representação em bastões) e CTA (representação da superfície) colorido por hidrofobia. Vermelho é mais hidrofóbico que azul.

[00309] O Docking demonstrou que há indícios de ponte de hidrogénio (2,74Â) entre a Lisina 35 da crotamina com o Carbono 8 da Anfotericina B, da Aspartato 24 da crotamina com o carbono 10 (2,77Â), da cistina 18 com o mesmo carbono 10 (3,06Â). A energia de ancoragem entre a AnB e a crotamina é de (E= -116,08 kcal / mol).

[00310] Interação Molecular entre GLU e Crotamina

[00311] A Figura 28Bx mostra o esquema de ligação de pontes de hidrogénio do GLU (linha tracejada verde) com distâncias em angstrons e interações hidrofóbicas (semicírculos em aminoácidos). A Figura 28Bz mostra o Modelo 3D do GLU (representação em bastões) e CTA (representação da superfície) colorido por hidrofobia. O vermelho é mais hidrofóbico do que o azul.

[00312] O Docking demonstrou que há indícios de ponte de hidrogénio entre o glutamato 15 com o N ligado ao Cl e C2, a lisina 14 da crotamina e o O ligado ao C3 do Glucantime ^® (3,07Â) da mesma maneira que a Lisina 35 (2,63Â) e com o O do C5 (2,77Â), o aspartato 24 com o mesmo O do C5 (3,11 Â) e com o O do C6 (3,19Â). A cisteína 18 parece possuir afinidade com o O dos carbonos 6 e 7 (2,60 e 3,33Â), respectivamente, a lisina 16 apresenta múltiplas possibilidades de interação com o C3 (3,11Â), O do C4 (2,63Á) e o O do C6)3,35Â). A energia de ancoragem entre o GLU e a crotamina é de (E = -91,64 kcal / mol).

[00313] Interação Molecular entre PEN e Crotamina

[00314] A Figura 29Cx mostra o esquema de ligação de pontes de hidrogénio da PEN (linha tracejada verde) com distâncias em angstroms e interações hidrofóbicas (semicírculos em aminoácidos). A Figura29Cz - Modelo 3D de PEN (representação em bastões) e CTA (representação da superfície) colorido por hidrofobia. O vermelho é mais hidrofóbico do que o azul.

[00315] O Docking demonstrou que há indícios de ponte de hidrogénio entre o glutamato 15 da CTA com um dos N do Cl 8 da PEN (2,76Â), da Cisteína 18 com o O ligado ao C6 e C4 (3,22Â) e o triptofano 34 com o N do C29 (2,59Â). A energia de ancoragem entre a Pentamidina e crotamina é de (E = -96,74 kcal / mol).

[00316] EXEMPLO 15: Ensaio de afinidade molecular por

Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) [00317] Todos os ensaios de interação molecular foram realizados utilizando sistema Biacore T200 (GE Healthcare), que utiliza a tecnologia de Ressonância Plasmônica de Superfície - RPS, para detectar as interações em estudo.

[00318] Para o escalonamento de pH e pré concentração foi utilizado sensor chip série S tipo CM5 carboximetilado para imobilizar o ligante, neste caso a CTA purificada da peçonha de Crotalus durissus terrificus. Previamente a imobilização, se fez necessário estabelecer as condições ideais de pH para a etapa de imobilização do ligante a superfície do sensor chip. O escalonamento de pH e analise de pré concentração foram realizados nas concentrações de 50, 100 e 200 ug/mL de CTA em seis faixas crescentes de pH, utilizando tampão acetato de sódio 10 mM nos pHs 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; e 6,0; tampão fosfato de sódio 66 mM nos pHs 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; tampão carbonato de sódio 100 mM nos pHs 8,5; 9,0; 9,5 e 10. As análises de escalonamento de pH e pré concentração foram realizadas na célula de fluxo 2, com uma taxa de fluxo de 5 uL/min e tempo de contato de 180 segundos para cada ciclo. Para regeneração de pequenos montantes residentes na superfície do sensor chip por atração eletrostática, foi utilizado um pulso de 30s de uma solução de NaOH 50 mM ao final de cada ciclo

[00319] Dentre os possíveis métodos de imobilização da proteína a superfície do sensor chip, optou-se pelo acoplamento amina, que consiste na imobilização da proteína através de uma ligação covalente entre aminas primárias, principalmente de Usina, à matriz de dextrana carboximetilada existente na superfície do sensor chip. O nível de imobilização de ligante (RL) foi previamente calculado segundo a equação 1, em 2210,3 Unidades de Ressonância (RU) para Pentamidina, 3853,7 para Glucantime ^® e 814,3 para Anfotericina B, considerando Rmax igual a 100 RU e estequiometria da ligação 1 :1. Desta maneira foi planejado preparar um sensor chip com 4000 RU de CTA imobilizada, capaz de detectar interação om qualquer uma das três substâncias.

[00320] As informações foram obtidas no Chemspider e NCBI, conforme Tabela 2.

Tabela 2: Dados das moléculas utilizadas na presente invenção.

Equação 1: determinação da resposta de ligação

[00321] Após atingir os níveis de imobilização planejados, o sensor chip teve os sítios ativos remanescentes bloqueado com um pulso de 400 segundos, em fluxo contínuo de 10 uL/min de etanolamina 1M. Paralelamente, as células de fluxo foram preparadas apenas com etanolamina imobilizada, para serem utilizadas como células de fluxo de referência, desta maneira os ensaios foram todos realizados simultaneamente em duas células de fluxo, sendo uma célula de fluxo analítica contendo CTA imobilizada, e outra célula de fluxo de referência contendo apenas etanolamina imobilizada.

[00322] Os sensorgramas foram analisados a partir da subtração entre os sinais de ambas células de fluxo utilizando o programa BIAevaluation versão 1.0.

[00323] Os ensaios de ligação entre o ligante (CTA) e os analítos (PEN, GLU e AnB) foram realizados nas seguintes condições analíticas: tampão PBS IX (lOmM de fosfato de sódio, 2,7 mM cloreto de potássio, 137 mM de cloreto de sódio; pH ajustado para 7,5) (GE Healthcare Cat. # 100672), temperatura de 37°C, fluxo contínuo de 30 uL/min, tempo de contato de 60 segundos e tempo de dissociação de 180 segundos. Para as etapas de regeneração, ao final de cada ciclo, foi utilizado uma solução de glicina pH 2,5, onde foram aplicados pulso sequenciais de 30 segundos de duração em um fluxo de 30uL/min.

[00324] As amostras foram todas analisadas nas concentrações de 100, 50, 25 e 5 μΜ diluídas em tampão de corrida PBS IX. Exceto a PEN que se apresentou insolúvel na concentração de 100 μΜ. Todas as soluções foram centrifugadas a 12000 xg por 10 min antes de proceder com as análises.

[00325] Resultados

[00326] A Figura 30 demonstra o sensorgrama da interação molecular de soro total de lhama imunizada com CTA. A análise de interação apresentou cerca de 1200 RU's de resposta confirmando a presença da CTA sob a superfície do sensor chip comprovando que a imobilização da CTA no chip foi realizada com sucesso permitindo as análises de interação molecular entre CTA e os fármacos de interesse.

[00327] A Figura 31 demonstra a afinidade molecular entre a CTA e AnB (A), CTA e GLU (B) e CTA e PEN (C). A análise de interação entre a CTA e AnB foi realizada nas concentrações de 100, 50, 25 e 5 μΜ, a interação atinge cerca de 100% do valor de Rmax calculado para esta interação e possui um perfil concentração dependente de alta afinidade. A análise de interação entre GLU e CTA foi realizada nas concentrações de 100, 50, 25 e 5 μΜ. A interação atinge cerca de 50% do valor de Rmax calculado para esta interação com boa afinidade. A combinação apresenta perfil dependente da concentração. A análise de interação entre a PEN e CTA foi realizada nas concentrações de 50, 25 e 5 mg/ml. A combinação apresenta perfil de boa afinidade ao tingir cerca de 50% do Rmax calculado e parece ser dependente da concentração.

[00328] As Figuras 32A, 32B e 32C demonstram o sensorgrama da interação molecular entre PEN e CTA, GLU e CTA e AnB e CTA respectivamente. A análise de interação entre a PEN e CTA foi realizada nas concentrações de 50, 25 e 5 mg/ml. A análise de interação entre GLU ^® e CTA foi realizada nas concentrações de 100, 50, 25 e 5 μΜ, a interação atinge cerca de 50% do valor de Rmax calculado para esta interação. A combinação apresenta perfil dependente da concentração. A análise de interação entre a AnB e CTA foi realizada nas concentrações de 100, 50, 25 e 5 μΜ, a interação atinge cerca de 100% do valor de Rmax calculado para esta interação. A combinação apresenta perfil de baixa afinidade devido dissociar-se instantaneamente. Os dados referentes às três drogas sugerem que há uma fraca afinidade entre as três drogas e a CTA indicando que a ação da CTA é sinérgica e não há a formação de uma nova entidade química quando se dispõe essas drogas e a CTA em solução.

[00329] EXEMPLO 16: Ensaio de caracterização molecular por Espectrometria de Massa (MS)

[00330] A espectrometria de massa é uma técnica analítica física para detectar e identificar moléculas de interesse por meio da medida da sua massa e da caracterização de sua estrutura química os separando de acordo com a sua taxa de massa/carga (m/z) e detectá-los qualitativa e quantitativamente, tomando- se assim, importante ferramenta na caracterização de moléculas.

[00331] A espectrometria de massa foi realizada em equipamento de MALDI (Dessorção assistida por ionização da matriz a laser), com dois analisadores TOF (AXIMA TOF/TOF ² Shimadzu Biotech, Riverwood Drive, Columbia, Maryland, USA), operando em modo reflectron e utilizando solução saturada de ácido Alfa-4-ciano-hidroxicinamico como matriz de ionização. As massas moleculares das amostras foram determinadas por comparação com padrões externos de proteínas.

[00332] Resultados

[00333] Todos os experimentos foram utilizados com matriz ionizante de solução saturada de ácido Alfa-4-ciano-hidroxicinamico que foi homogeneizada com a amostra em uma proporção de 1:1 (v/v) e após a co- cristalização na placa do aparelho, esta foi introduzida na câmara a vácuo do ΑΧΓΜΑ-TOF e analisada em modo linear, o espectro representa a média dos pulsos a laser.

[00334] A Figura 33A demonstra que foi determinado a massa da CTA demonstrando que a razão massa/carga (m/z) do íon da CTA é de 4887.23 (m/z). A Figura 33B demonstra que a razão massa/carga (m/z) dos íons presentes na solução de PEN é de 341,92 (m/z). A Figura 33C e Figura 33D demonstram que a razão massa/carga dos íons presentes na solução de GLU e a AnB foram inconclusivos em razão da provável impureza dos fármacos.

[00335] Foi determinada a razão massa/carga (m/z) dos íons presentes nas combinações de drogas com a CTA. Para a CTA combinada à PEN (Figura 34A), CTA combinada ao GLU (Figura 34B) e CTA combinada com a AnB (Figura 34C) foi utilizada uma solução saturada de ácido Alfa- 4-ciano-hidroxicinamico homogeneizada com a amostra em uma proporção de 3:1 (v/v).

[00336] Experimentos in vivo

[00337] EXEMPLO 17: Infecção dos animais

[00338] Para a realização dos ensaios in vivo, 30 camundongos BALB/c foram inoculados na pata traseira direita com 1x10 ⁵ promastigotas de L amazonensis diluídas em PBS. Após oito semanas o tratamento foi iniciado e os camundongos foram separados, de acordo com o tratamento recebido, em seis grupos de seis animais: Gl-PBS, G2- CTA (Smg/kg ¹ ), G3-GLU ^OOmg/kg ¹ ), G4- PEN (4mg/kg ¹ ), G5- GLU + CTA (300 mg/kg ¹ + 5 mg/kg ¹ ) e G6-PEN + CTA (4mg/kg ^_1 + 5 mg/kg ¹ ). A progressão da lesão foi monitorada através da medida do tamanho das patas, com o auxílio de um paquímetro. Os animais infectados e do grupo controle foram avaliados três vezes por semana, após o início do tratamento, por um período de 18 dias, pela comparação do tamanho da lesão da pata infectada com a pata contralateral não infectada. [00339] EXEMPLO 18: Protocolo de tratamento dos animais

[00340] Os animais foram tratados por três semanas e 48 horas após o último dia de tratamento procedeu a eutanásia. Os animais foram selecionados aleatoriamente em grupos de cinco indivíduos por gaiola. O grupo controle infectados e não tratados foi denominado Gl, o grupo tratado somente com CTA (Smg/kg ¹ ) foi denominado G2, os animais tratados com GLU (300 mg/kg ¹ ) foi chamado de G3 e o grupo tratado com PEN (4 mg/kg ¹ ) foi chamado de G4. Quanto aos grupos submetidos aos tratamentos experimentais, o grupo denominado G5 foi tratado com uma combinação de GLU 300 (mg/kg ¹ ) + CTA (Smg/kg ¹ ) e G6 foi tratado com PEN (4 mg/kg ¹ ) + CTA (Smg/kg ¹ ).

[00341 ] EXEMPLO 19: Mensuração da massa corporal e massa dos órgãos dos animais

[00342] O monitoramento da massa dos animais é realizado como uma das medidas de toxidade de drogas.

[00343] Para essa finalidade, foi realizada a mensuração da massa dos animais dois dias antes do início do tratamento experimental. Logo, a cada dia de tratamento, nova mensuração da massa foi realizada imediatamente antes da infusão dos medicamentos. Após a eutanásia dos animais os órgãos foram retirados e pesados. A balança utilizada foi da marca Toledo, modelo MS Precision L com precisão de 0,lg. A mensuração era dada como válida quando a balança apontava o momento de mensuração ao travar a leitura.

[00344] Resultados

[00345] Em relação à massa total dos animais, Figura 35A, a observação intragrupo demonstrou que o grupo Gl antes do início do tratamento apresentava 30,16 + 2,85g e ao fim 30,5 + 3,01g, G2, 34,33 + 2,42g e ao fim 34,66 ± 2,06g, G3, 31,83 ± l,8g ao fim 33,5 ± 1,76, G4, 32,66 + l,96g, G5, 32,75 + l,7g ao fim 32,5 + 2,08g e G6, 34,6 + 2,19 e ao fim 34,8 ± 1,09.

[00346] Para a massa do fígado dos animais, Figura 35B, rim, Figura 35C, linfonodo, Figura 35D não houve diferença (P>0,05) entre os grupos. Entretanto, a massa do linfonodo foi significativamente menor para o Grupo G4 0,08 ± 0,04g comparado ao grupo Gl 0,257 + 0,048g (P<0,01) e com o grupo G20,23 + 0,07 ( <0,05) (Figura 35E) baço.

[00347] EXEMPLO 20: Mensuração do tamanho e massa da lesão da pata infectada dos animais

[00348] Um dos controles sobre a eficácia do tratamento para leishmaniose é o monitoramento do tamanho da lesão.

[00349] Para essa finalidade, a cada dia de tratamento o tamanho da lesão da pata de cada animal foi mensurado por medida simples do local de maior circunferência da pata e após a eutanásia dos animais a pata foi retirada e pesada para identificação da diferença da massa entre os grupos. O volume da pata e a massa estão ligados ao processo inflamatório instalado que costuma estar ligado ao número de parasitos existentes na lesão.

[00350] O tamanho da lesão da pata dos animais foi mensurado em milímetros com paquímetro com precisão de lmm. A mensuração foi aconteceu sempre no ponto de maior volume da pata infectada e realizada do início ao fim pelo mesmo pesquisador.

[00351] Resultados

[00352] Os grupos apresentaram aumento do tamanho médio das patas no decorrer do tratamento, Figura 36A. Na comparação intragrupo, o grupo Gl iniciou o tratamento com o tamanho da lesão em 9,0 + 2mm e ao fim do tratamento era de 10,16 + l,7mm um aumento de 12,88%; G2 6,5 + 0,75mm para 6,83 + l,4mm, aumento de 5,07%. G3 7,16 + 1,16mm para 7,83 + 2,13mm aumento de 9,35%; G4 6,83 + 0,75mm para 7,66 + l,5mm aumento de 12,15; G5 7,83 + 0,98mm para 9,75 + l,25mm aumento de 24,52% e G6 10 + l,67mm para 11,6 + l,81mm aumento de 16%. Na comparação intergrupos há diferença entre todas as comparações ( <0,0001). Para a massa das patas dos animais retiradas e pesadas após a eutanásia o grupo Gl obteve média de 1,26 + 0,15g, G2 0,61 + 0,13g, G3 0,91 ± 0,25g, G4 0,61 ± 0,16, G5 0,71 + 0,59g e G6 1,55 ± 0,16g. Houve somente diferença entre na comparação entre G6 vs G2 (p<0,05) e vs G4 (p<0,05) como evidenciado na Figura 36B.

[00353] EXEMPLO 21: Recuperação de amastigotas dos tecidos da pata e linfonodo de camundongos infectados

[00354] A contagem de parasitos no tecido é uma das maneiras de quantificar a eficácia do tratamento sendo considerado padrão ouro.

[00355] Após os camundongos serem eutanasiados as patas e os linfonodos foram removidos em condições estéreis. Em seguida partes dos tecidos das patas e linfonodos foram maceradas em meio RPMI completo liberando as amastigotas de L. amazonenses e outra parte foi pesados e acondicionados em formol para futura histologia. Ao término, o macerado, foi diluído lOOx em meio RPMI completo e plaqueado em placa de 96 poços com um volume final de 200μΙ-. O macerado concentrado foi centrifugado a 1000 RPM por 10 minutos a 4°C. Parte do sobrenadante foi removido e acondicionado em eppendorf a 20°C para posterior quantificação de citocinas. Após 6 dias uma alíquota destes parasitas foi diluída em eritrosina B (0,04%) e contada em câmara de Neubauer espelhada, em microscópio óptico (aumento de 400X). Os parasitas corados de vermelho foram considerados mortos e aqueles birrefringentes e móveis foram considerados vivos. O cálculo para determinar o número de parasitos na infecção foi realizado por meio da equação a seguir: n°de parasitas = n°de parasitas contados x inverso da diluição 10 ⁴ Equação 2: equação do cálculo para determinar o número de parasitos no tecido da pata e linfonodo.

[00356] Resultados

[00357] A Figura 37A demonstra o número de parasitos no tecido da pata. Gl exibe média de 1260 ± 110,8, G2 925,7 + 69,01, G3 991,4 + 63,09, G4 992,9 ± 140,7, G5 650 ± 145,7 e G6 634,3 ± 115,3. Glcomparado a G2 exibiu menos 26,53% parasitos (P<0,0001), G3 menos 21,31% (P<0,01), G4 menos 27,75% (P<0,0001), G5 menos 48,41% (/^Ο,ΟΟΟΙ) e G6 menos 49,58% (P<0,0001). G2 comparado a G3 e com G4 não houve diferença, mas a G5 exibiu menos 29,78% (P<0,0001) e G6 menos 31,47% (P<0,0001). G3 não mostrou diferença para G4, mas G5 mostrou menos 29,56% (P<0,01) e G6 menos 31,27% (P<0,01). G5 ao ser comparado com G6 não há diferença. A Figura 37B demonstra o número de parasitos no tecido do linfonodo correspondente à pata infectada. Gl exibe média de 1170 ± 108,6 parasitos, G2 1137 + 169,4, G3 1493 ± 212,3, G4 1283 ± 167,5, G5 936,7 + 34,45 e G6 340 ± 119,3. Gl comparado a G2, G4 e G5 não exibiu diferença, no entanto, G3 mais 27,6 % (P<0,01) e G6 menos 70,94%. G2 menos 31,31% (P<0,01) na comparação com G3 e mais 70,09% (P<0,0001) comparado com G6, mas não exibiu diferença para G4 e G5. G3 comparado com G4 não exibiu diferença, no entanto, produziu mais 159,5% para G5 (P<0,0001) e 439,11% (P<0,0001) para G6. G4 exibiu mais 37,07% (Ρ<0,01) para G5 e 377% (P<0,0001) para G6. G5 comparado a G6 exibe mais 275% (P<0,0001).

[00358] EXEMPLO 22: Mensuração de marcadores bioquímicos de lesão tecidual

[00359] A mensuração de Lipase, Amilase, Alanina Amino Transferase (ALT), Aspartato Amino Transferase (AST), Creatinina, Ureia, Creatina Kinase MB (CK/MB) e Creatina Kinase total (CK Total) foram realizadas por meio de um automatizador da marca Konelab, modelo 60i e com os kits Wiener Lab. seguindo o protocolo do aparelho. O referido automatizador foi calibrado antes das mensurações de acordo com o manual do fabricante. Todos os experimentos foram realizados em duplicata.

[00360] Os valores de referência de enzimas teciduais de camundongos B ALB/c estão descritos no quadro 1 :

Quadro 1: valores de referência de enzimas bioquímicas para camundongos BALB/c. Adaptado de Araújo (2012).

[00361] Cardiotoxicidade e Toxicidade Muscular

[00362] A Creatina Quinase (CK), é uma enzima presente em vários tecidos e tipos de célula. Nas células, as enzimas CK citosólicas consistem de duas subunidades, que podem ser tanto B (do tipo cerebral) ou M (tipo muscular). Existem, portanto, três tipos de isoenzimas: CK-MM, CK-BB e CK-MB. Os padrões de isoenzimas diferem nos tecidos. O músculo esquelético expressa 98% de CK-MM e possui baixos níveis de CK-MB (1%). O miocárdio, em contrapartida, expressa CK-MM a 70% e CK-MB a 25-30%. CK-BB é predominantemente expressado no cérebro e músculo liso, incluindo os tecidos vascular e uterino (WTLLIMANN, 1992).

[00363] Resultados

[00364] Para a determinação da cardiotoxidade in vivo, foi realizada a mensuração de CK-MB e C K/Total do sangue dos animais. A Figura 38A demonstra a quantificação de CK-MB onde o grupo Gl expressou 78 + 4,24 μg/ml, G2 85 ± 7,07 μg/ml, G3 15,5 + 0,7 μg/ml, G4 15,7 + 0,69 μg/ml, G5 33,5 + 0,71 μg/ml e G6 33,8 + 7,1 μg/ml. Ao se comparar Gl com G2 produziu menos 8,97% (P<0,0001), com G3 mais 403,22% (/ ^> <0,0001), com G4 mais 396,81% (P<0,0001), com G5 mais 132,85% (P<0,0001) e com G6 mais 130,23% (P<0,0001). Ao se comparando o grupo G2 com G3 ficou evidente o aumento de expressão 448,38% (P<0,0001), com G4 mais 441,4% (P<0,0001), com G5 mais 153,73% (P<0,0001) e com G6 mais 151,47% (P<0,0001). O grupo G3 ao ser comparado com o grupo G4 evidenciou diminuição de 1,27% (P>0,05), com G5 menos 53,73% CP<0,05) e com G6 menos 53,73% (P<0,05). G4 ao ser comparado com G5 demonstra uma expressão de 53,13% menor (P<0,05) e com G6 menos 53,55% (P<0,05). Finalmente ao se comparar G5 com G6 a expressão foi menor em 0,88% (P>0,05). A Figura 38B demonstra a quantificação de CK/Total de maneira que o grupo Gl expressou 74 + 21,21 μg/ml, G2 92,50 ± 9,19 μg/ml, G3 84 + 4,24 μg/ml, G4 108,5 ± 12,5, G5 226 ± 39,6 μg/ml e G6 115,5 + 1,5 μg/ml. Ao se comparar o grupo G5 exibiu expressão 205,4% maior que Gl (P<0,01), com G2 mais 144.32% (P<0,05), com G3 mais 169,04% (P<0,01) e com G4 mais 109,25% (P<0,05) e com G6 mais 95,67% (P<0,05). Não houve diferença entre qualquer outra comparação.

[00365] Nefrotoxicidade

[00366] O clearance renal, teste que avalia a filtração glomerular, é a medida da velocidade de remoção de uma substância do sangue durante a passagem pelos rins. A diminuição da depuração da creatinina é um indicador da redução de taxa de filtração glomerular, o que ocorre em enfermidades agudas ou crónicas do glomérulo ou de alguns dos seus componentes. A redução do fluxo sanguíneo glomerular diminui a depuração da creatinina e fenómeno semelhante pode ocorrer na lesão tubular aguda (MOTTA, 2003).

[00367] Resultados

[00368] Para a determinação da nefrotoxidade in vivo, foi realizada a mensuração de uréia e creatinina do sangue dos animais. A Figura 39A demonstra a quantificação de ureia onde Gl expressou 49,5 + 2,12 μg/ml, G249,0 ± 2,21 μg/ml, G3 57,5 ± 8,5 μg/ml, G4 54 + 6 μg/ml, G5 58,5 ± 4,5 e G6 67,5 + 1,5 μ^παΐ. Nenhuma das comparações apresentou diferença. A Figura 39B demonstra a quantificação de creatinina onde Gl expressou 0,3 ± 0,02 μg/ml, G2 0,25 + 0,05 μg/ml, G3 0,31 ± 0,03, G4 0,25 ± 0,04 μg/ml, G5 0,21 + 0,02 μg/ml e G6 0,25 + 0,05 μg/ml. Não houve diferença entre todas as comparações. [00369] Hepatotoxicidade

[00370] A Aspartato Amino Transferase (AST) e a Alanina Amino Transferase ALT são enzimas intracelulares presentes em grandes quantidades nos hepatócitos. A ALT é encontrada principalmente no citoplasma do hepatócito, enquanto 80% da AST está presente nas mitocôndrias. Lesões ou destruição das células hepáticas liberam estas enzimas para a circulação. Em dano hepatocelular leve, a forma predominante no soro é a citoplasmática, e em lesões graves, há liberação da enzima mitocondrial, elevando a relação AST/ALT (MOTTA, 2003). A ALT é utilizada para diagnóstico das enfermidades hepatobiliares agudas, já a AST eleva-se em casos de necrose cardíaca. O predomínio da ALT indica somente uma alteração na membrana, enquanto o predomínio da AST revela lesão das organelas citoplasmáticas (MOTTA, 2003).

[00371] Resultados

[00372] Os grupos G5 e G6 exibiram aumento na expressão de proteínas hepáticas, no entanto, ficando dentro da variação aceitável para essa espécie como evocado por Araújo (2012) como esperado.

[00373] Com a finalidade de se determinar a hepatotoxidade in vivo, foi realizado a mensuração de ALT e AST. A Figura 40A demonstra a quantificação de ALT onde Gl expressou de 10,5 + 2,12 μg/ml, G2 20 + 1,41 μg/ml, G3 12 + 1,4 μg/ml, G4 16 ± 1.42 μg/ml, G5 41,5 ± 4,9 μg/ml e G6 30,5 + 0,7 μg/ml. O grupo G5 ao ser comparado com o grupo Gl produziu mais 295,23% (P<0,0001), com G2 mais 107,5% (^Ο,ΟΙ), com G3 mais 245,83% (P<0,0001), com G4 mais 159,37% (P<0,0001) e com G6 mais 36,06% (P<0,05). O grupo G6 ao ser comparado com Gl produziu 190,47% (/ ^> <0,01), com G2 mais 52,5% (P<0,05), com G3 mais 154,16% (P<0,01) e com G4 mais 90% (P<0,01). A Figura 40B demonstra a quantificação de AST onde Gl expressou 59,5 + 2,12 μg/ml, G2 64,5 + 2,1 μg/ml, G3 60 ± 2 μg/ml, G4 53 ± 9 μg/ml, G5 117,0 ± 12,73 e G6 106 ± 4,2μg/ml. O grupo G5 ao ser comparado com Gl produziu mais 96,63% (P<0,0001), com G2 mais 81,39 (/*<0,01), com G3 mais 95,0% CP<0,0001), com G4 mais 120,75% (P<0,0001) e com G6 mais 10,37% (P>0,05). O grupo G6 ao ser comparado com Gl produziu mais 78,15% (P<0,01), com G264.5% (P<0,01), com G3 74,66% (P<0,01) e com G4 100,0% (P<0,01).

[00374] Pancreotoxidade

[00375] A amilase e a lipase séricas são largamente utilizadas como marcadores de inflamação pancreática, contudo a sua elevação nem sempre prediz a presença de doença pancreática, no entanto, elevações acima de três vezes os valores normais indicam alterações no pâncreas (LIU, 2001).

[00376] Resultados

[00377] Na presente invenção, nem as drogas nas concentrações estabelecidas menos tratamentos, apresentam modificação da liberação das proteínas pancreáticas sugerindo pouca toxidade para esse órgão. Portanto, para a determinação da pancreotoxidade in vivo, realizou-se a mensuração de amilase e lipase do sangue dos animais. A Figura 41A demonstra a quantificação de amilase onde Gl expressou 794,0 + 7,07 μg/ml, G2 809,5 + 41,72 μg/ml, G3 795,0 ± 63,64 μg/ml, G4 765,0 ± 12,73 μg/ml, G5 731,0 ± 79,2 e G6 769,5 + 19,09 μg/ml. Nenhuma das comparações apresentou diferença. A Figura 41B demonstra a quantificação de lipase onde Gl expressou 17,0 + 1,41 μg/ml, G2 20,0 + 1,4 μg/ml, G3 17,5 + 2,12, G4 19,5 + 07 μg/ml, G5 22,0 + 2,82 μg/ml e G6 18,5 + 0,5 μg/ml. Não houve diferença entre todas as comparações. [00378] EXEMPLO 23: Análise Estatística

[00379] Os dados, quando paramétricos, foram tratados através da análise estatística ANOVA ONE-WAY seguido de teste de Tukey e quando não paramétricos foram tratados por meio do teste de KRUS KAL- W ALLIS Seguido por Dunn ambos com significância de 5%. Os dados descritivos foram expressos em média e desvio padrão da média e em porcentagem (%).

[00380] Os testes acima confirmam as vantagens da combinação da presente invenção em relação ao estado da técnica.

[00381] Os efeitos da associação entre PEN e CTA sobre as formas promastigotas de L. amazonensis manteve a eficácia da droga mesmo em uma concentração cem vezes menor (0,05 mg/ml) que a maior dose (5mg/ml) utilizada no tratamento dessa doença (Figura 4) e ao mesmo tempo foi capaz de reduzir drasticamente os efeitos citotóxicos da PEN sobre as células de linhagem J774 (Figura 19 A) assim como não demonstrou toxicidade contra células C2C12 e HEP-G2 (Figuras 13B e C). O fato dessa droga apresentar importante diminuição da citotoxidade é importante, uma vez que a dose e frequência do tratamento pode aumentar a toxicidade devendo ser considerado na seleção do tratamento (WANG, 2010). Estudos demonstraram que a pentamidina possui alta toxicidade (WANG, 2010).

[00382] A formulação de crotamina com pentamidina também foi capaz de aumentar a eficácia sobre as formas amastigotas intracelulares de macrófagos peritoneais de camundongos Balb/c (Figura 7) ao mesmo tempo que fica evidente menor lise celular nas imagens de microscópio ótico (Figura 24A e 24B) quando comparado com a pentamidina sozinha (Figura 24C). [00383] Embora, tenha promovido inibição do crescimento de promastigotas e amastigotas de L. amazonensis, a associação da crotamina com a Pentamidina não provocou aumento na produção de diferentes interleucinas anti-inflamatórias. Esse fato contradiz à maioria das literaturas que claramente evidenciam a produção de mediadores proinflamatórios como o TNF-α e IL-12 ao controle da infecção por Leishmania (PETERSEN, 2012)

[00384] Estes dados sugerem que os tratamentos foram capazes de inibir o crescimento de formas amastigotas de L. amazonensis mesmo com baixos níveis de produção de moléculas pró inflamatórias reforçando o fato que a associação da crotamina à pentamidina afeta diretamente o crescimento intracelular de L amazonensis sem possuir a mesma toxidade de droga desassociada.

[00385] A produção de NO de macrófagos infectados com L amazonensis se mostrou significativamente maior que nos macrófagos não infectados (Figura 19) demonstrando que essas células são capazes de produzir espécies reativas de oxigénio em resposta à infecção, no entanto, após 48h de infecção houve decréscimo dessa concentração. Todos os tratamentos se mostraram significantemente maiores que os valores basais de NO ao mesmo tempo que menores que nos macrófagos infectados, sugerindo uma modulação da resposta celular para a produção de NO acentuada em 48h de tratamento (Figura 19). Esses dados também contrariam a literatura que vem associando o aumento da produção de NO ao controle da doença (LAKHAL-NAOUAR, 2015; CARVALHO, 2015; HEZARJARIB, 2014; PETERSEN, 2012).

[00386] A resposta imune aos tratamentos formulados com PEN também demonstrou ser satisfatórias, visto que aumentou a produção de IL- 12 que é um resultado interessante, visto que essa interleucina sinaliza para um direcionamento de respostas imunológicas globais do tipo Thl, que, por sua vez, está relacionada com o controle da infecção (Figura 10A), sem ocorrer um aumento na produção de TNF-α, que seria o esperado (Figura 10B).

[00387] O aumento da IL-12 é importante em razão dessa citocina estar claramente relacionada com o controle da infecção, pois, estudos demonstram que quando IL-12 não é produzida por macrófagos em resposta à infecção a doença aumenta de proporção tornando-se mais grave. (MACEDO, 2015; BARROS, 2015; LAKHAL-NAOUAR, 2015; CARVALHO, 2015; HEZARJARIB, 2014; MARTINS, 2013 e PETERSEN, 2012). No entanto, é esperado que haja o aumento da produção de TNF-α que também vem sendo descrita como uma citocina relacionada com uma resposta inflamatória no local da infecção que ajuda no controle da lesão e parasitemia local (LAKHAL-NAOUAR, 2015; CARVALHO, 2015; HEZARJARIB, 2014; MARTINS, 2013 e PETERSEN, 2012).

[00388] Nesse contexto, a resposta do tipo Thl, necessária para o controle da infecção, é caracterizada pelo envolvimento de linfócitos CD4 e CD8 e citocinas como IL-12, IFN-γ, fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) e algumas quimiocinas produzidas por macrófagos como a MCP1. Esta resposta tem como resultado a ativação de macrófagos, tornando-os capazes de eliminar o parasito via IFN-γ, resultando na síntese de intermediários de nitrogénio e oxigénio reativo e, consequentemente, na morte dos parasites intracelulares controlando a infecção (CUNNINGHAM, 2002; 1999; AWASTHI et al., 2004).

[00389] Em relação às vias inflamatórias, o tratamento com PEN diminuiu a produção de NF-kB p65 se comparado com células infectadas que não receberam esse tratamento (Figura 16), sugerindo que a inibição das formas amastigotas de L. amazonensis está relacionada com menor inflamação. No entanto, o tamanho da lesão da pata dos animais aqui tratados não demonstrou diminuição (Figura 36A) nem na massa da pata se comparado com os controles Gl e G2 (Figura 36B) embora a contagem de parasites no local da infecção e no linfonodo do animal tenha sido consideravelmente menor se comparado aos controles nos animais tratados com as formulações com PEN. Este resultado ajuda a explicar a menor produção de TNF- α para os tratamentos PI e P2.

[00390] Esses dados corroboram em parte com diferentes estudos que demonstraram a diminuição do número de parasitos no sítio da infecção em resposta ao tratamento com PEN (BARROS et al., 2015), ou em outras espécies como a L peruviana (ANDERSEN, 2005), ou quando outros tratamentos experimentais são empregados na terapia (PETERSEN, 2012; LOPES, 2012). No entanto, contraria a literatura que frequentemente relata a diminuição da inflamação associada ao menor número de parasitos (BARROS et al., 2015, PETERSEN, 2012) e, consequentemente o tamanho da lesão, fato que não ocorreu no presente estudo e interessantemente sugere que a diminuição dos parasitos na lesão ocorreu independente de diminuição da inflamação local corroborado pela produção de TNF-α exuberantemente maior no grupo tratado com PEN (Figura 10B).

[00391] Em relação a toxidade subaguda in vivo, os animais não apresentaram perda de massa corporal (Figura 35A), e também não foi notado megalias dos órgãos que foram retirados e pesados (Figura 4B a 44E), inclusive demonstrando que para o linfonodo houve diminuição da massa para o grupo que recebeu PEN (Figura 35D) (ARAÚJO, 2012). [00392] A análise da bioquímica dos animais demonstra que a CK- MB tanto quando a CK-Total estão dentro da variabilidade para animais BALB/C (Figuras 38A e B) não sugerindo toxidade muscular (ARAÚJO, 2012) embora a CK-Total demonstre elevação. Fato semelhante ocorre para a ureia e creatinina demonstrando serem iguais. Já em relação à ALT e AST os grupos G6 demonstrou uma maior expressão dessas enzimas sem considerar hepatotoxidade, pois, embora a ALT e AST estejam aumentadas, fato esperado, estão dentro da variação normal dos seus valores de referência (ARAÚJO, 2012). Finalmente, quanto a amilase e lipase, não há indícios de toxidade ao pâncreas. Estes fatos são particularmente importantes, visto que o pâncreas é o principal órgão regulador da glicose e um dos mais comuns efeitos tóxicos da PEN é a potente perda da homeostase da glicose em pacientes tratados com esta droga como apontou Rath et al, (2003) e Lima (2007) da mesma maneira que o fígado é um importante sítio de metabolização das mais diversas drogas.

[00393] Os dados da toxidade in vivo se mostram adequados em razão de terem ficado dentro da variação normal para camundongos BALB/C como descrito em Araújo (2012) que objetivou determinar os valores de referência para camundongos BALB/C e dentre outros trabalhos que utilizou marcadores bioquímicos como referência para se determinar toxidade de tratamentos sugerindo que a combinação de CTA + PEN, na concentração aqui investigada apresenta maior eficácia assim como toxidade aceitável.

[00394] Quanto à afinidade molecular entre a PEN e a CTA, a simulação de bioinformática por meio de Docking, sugere que para a interação entre a CTA e PEN necessita de baixa energia para que ocorra a ancoragem (Figura 29) sendo corroborado pelo ensaio de afinidade conduzido em ressonância plasmônica de superfície (Figura 31C) que sugeriu afinidade moderada comprovando ligações da droga ao chip funcionalizado com CTA. Quando tomados em conjunto, esses resultados são robustos na determinação de afinidade ajudando a explicar sinergia aqui evidenciada entre a PEN e a CTA tanto no tratamento de células infectadas com L amazonensis quanto quando aplicado administrado em animais demonstrando a robustez da formulação aqui desenvolvida.

[00395] O Glucantime ^® , mesmo sendo a droga de primeira escolha, apresenta incidência de efeitos colaterais severos em aproximadamente 25% dos pacientes. Os parasitos também vêm demonstrando aumento considerável na resistência à essas drogas com falhas terapêuticas chegando à 40%, fato que representa um desafio crescente na descoberta de novas drogas ou alternativas ao tratamento da leishmaniose. (MITROPOULUS, 2010)

[00396] No presente estudo o Glucantime sozinho se mostrou ineficiente em inibir o crescimento de promastigotas, no entanto, a associação com a crotamina aumenta a eficácia dessa droga in vitro (Figura 6) e in vivo. Fato semelhante aconteceu na inibição das amastigotas de macrófagos infectados, de modo que o Glucantime ^® sozinho não foi capaz de inibir o crescimento, porém, quando associado à crotamina essa droga demonstra a capacidade de inibir amastigotas de L. amazonensis em células infectadas (Figura 9).

[00397] A associação com a Crotamina também foi capaz de diminuir a citotoxidade da droga em células J774 (Figura 15 A) como foi corroborado pelas imagens ilustrativas dos tratamentos que sugerem uma melhor integridade da célula quando comparado com o Glucantime ^® somente (Figuras 26A, 26B, 26C) que sugerem uma conservação da membrana celular. Com relação à citotoxidade em células C2C12 e HEP-G2 (Figura 15B e 15C) o Glucantíme , assim como as combinações com esse fármaco não se mostraram tóxicas, embora as combinações tenham permitido melhor proliferação celular de células HEP-G2 do que a CTA (Figura 15C) sugerindo melhor tolerabilidade.

[00398] Os resultados da citotoxidade sobre células HEP-G2 são especialmente importantes por representarem o tecido mais metabolicamente ativo para o Glucantíme ^® . Diferentes autores relataram que há um aumento de até três vezes na liberação das enzimas hepáticas em tratamentos com antimoniais pentavalentes (ARMSTRONG et al., 2006; LIMA et al., 2007) e aqui as células hepatócitos de linhagem HEP-G2 foram conservadas após incubação com combinações contendo GLU. Ainda, Ikeda-Garcia et al. (2007) observaram que a ALT e a AST estavam aumentados em cachorros após 30 dias de tratamento com doses de 75mg/kg ^~1 , porém com ausência de sinas clínicos. Esses dados em conjunto com os níveis de AST e ALT e da massa dos órgãos sugerem toxidade moderada para o fígado. O mesmo efeito ficou evidente em células C2C12 e J774 que são importantes tecidos envolvidos tanto na metabolização das drogas, ou são afetados pela CTA, de maneira que sugere segurança adequada à combinação aqui descrita.

[00399] Com relação à produção de NO, os macrófagos murinos demonstram uma modulação da resposta à infecção por L amazonensis com destaque para a formulação G2 demonstrando acentuada modulação da produção de NO (Figura 21). Estes dados corroboram a literatura que apontam uma associação positiva da produção de NO com o controle da leishmaniose (PETERSEN, 2012) como aqui evidenciado. Em relação à IL- 12, o tratamento com GLU não foi capaz de modular esta citocina (Figura 12A). No entanto, as formulações Gl e G2 estimularam aumento da expressão de IL-12 (Figura 12 A), inclusive, demonstrando que o GLU, de alguma maneira, está inibindo essa citocina, que é um importante indutor da resposta global do tipo Thl do sistema imunológico do hospedeiro.

[00400] Em relação à T F-α, a exemplo do que ficou evidente para a IL-12, as formulações com Gl e G2 foram capazes de estimular potentemente a resposta de TNF-α chamando atenção em especial para G2 que produziu cerca de 2,6 vezes mais TNF-α que o MO infectado, demonstrando que esses tratamentos podem aumentar a resposta celular para a infecção por L amazonensis, embora, por outro lado a mensuração de proteínas inflamatórias tenham demonstrado que o GLU diminua a NF-kB p65 sugerindo inibição de uma via inflamatória importante. O aumento da IL-12 bem como da TNF-α é um importante resultado visto que a essas duas citocinas estão associadas com o controle da doença e eliminação do parasito intracelular (MACEDO, 2015; BARROS, 2015; LAKHAL-NAOUAR, 2015; CARVALHO, 2015; HEZARJARIB, 2014; MARTINS, 2013 e PETERSEN, 2012).

[00401] O volume e massa da pata dos animais não diminuiu com o decorrer do tratamento como esperado (Figuras 36A e B) e ilustrado nas imagens ilustrativas da figura 35 (G5 de Q-T), pois, na contagem de amastigotas advindos do tecido da pata e do linfonodo mostrou diminuição do número de parasitos (Figura 35 A e B), fato que costumeiramente está associado com a diminuição do tamanho da lesão no local da infecção, efeito não observado no presente estudo. Petensen (2012) descreve em seu trabalho que o tamanho da lesão local apresenta relação com o n° de parasitos e foi corroborado por Barros (2015) e Macedo (2015) ao inibir NF-kB notou que, no tecido da pata há uma maior diminuição da parasitemia e concomitante diminuição do tamanho da lesão, mas, por outro lado, a inibição do NF-kB consequentemente também a da TNF-α permitiu migração de parasitos para os linfonodos, descrevendo mais uma vez a importância da TNF-α no controle sistémico e local da infecção.

[00402] Os experimentos in vivo com a combinação contendo GLU não demonstraram diminuir a massa dos animais, fato que demonstra baixa toxidade da combinação (Figura 35A). Em relação ao peso dos órgãos dos animais, a combinação com GLU não produziu megalias, indicando não haver toxidade subaguda sobre os órgãos investigados (Figuras 35B - E). De maneira semelhante ao que ocorreu com a PEN, a formulação contendo GLU demonstra aumento da expressão de proteínas hepáticas ALT e AST (Figuras 47A e B) verificado pela bioquímica dos animais, sem, no entanto, caracterizar hepatotoxidade.

[00403] O aumento de ALT e AST é um efeito esperado para o tratamento com esta droga. No entanto, estas enzimas, assim como todas as outras aqui estudadas, foram expressas em quantidades que não caracterizam toxidade nos animais tratados com a combinação contendo GLU. Esses dados são diferentes da literatura corrente com exceção das enzimas hepáticas (BERMAN, 1998). No entanto, outros autores demonstraram aumento em marcadores renais (HENAO et al., 2004), ou em marcadores de alterações cardíacas como relatado por Ribeiro et al. (1998) diferentemente ao que ocorreu no presente estudo.

[00404] Em relação à afinidade entre o GLU e CTA (Figura 28), o Docking molecular entre essas duas moléculas demonstra vários sítios de interação e possíveis formações de pontes de hidrogénio com baixa energia para que haja a interação entre as moléculas estudadas, sugerindo moderada afinidade. O dado da análise de bioinformática foi corroborado pela SPR (Figura 31) ao demonstrar um aumento na RU, o que caracteriza moderada afinidade molecular. Os resultados da bioinformática e SPR em conjunto são importantes na medida que sugerem que a formulação estabelecida entre a CTA e GLU possuem ação sinérgica em razão dos resultados biológicos aqui demonstrados.

[00405] A Anfotericina B é a segunda escolha no tratamento das leishmanioses, assim como a Pentamidina. No entanto, essa droga apresenta alta toxidade renal, afetando aproximadamente 50% dos pacientes (DUPONT, 2002). Com isso, diferentes formulações de sistemas de liberação ou encapsulamento dessa droga foram propostos para solucionar os problemas relacionados a sua toxidade (DUPONT, 2002). Esta estratégia elevou consideravelmente o seu custo, resultando na impossibilidade de utilização desse tratamento pela população mais carente. Assim, existe uma urgente necessidade de encontrar novas drogas ou abordagens para este tratamento.

[00406] De maneira semelhante ao que foi demonstrado pela combinação de Pentamidina com a Crotamina, a Anfotericina B combinada com a Crotamina apresenta a mesma eficácia que a droga sozinha na inibição de promastigotas e amastigotas de L amazonensis (Figuras 5 e 8).

[00407] A toxidade em células J774 demonstrou ser menor no ensaio de viabilidade (Figura 14A), assim como nas imagens de microscopia ótica que demonstram menor lise e melhor integridade da membrana celular (Figura 25A, B e C). As células C2C12 e HEP-G2 também não foram afetadas pelas combinações contendo AnB (Figuras 14B e 21C). Assim, a associação de crotamina à AnB demonstra boa tolerabilidade in vitro mesmo na concentração mais alta (^g/ml). Estudos in vivo com doses de 3 mg/Kg ¹ foram capazes de levar camundongos BALB/C à óbito, no entanto, quando a AnB é funcionalizada em formulações lipídicas, doses de até 175 mg/Kg ¹ são toleradas, aumentando em mais de 58 vezes a dose letal (KATO, 2014; LIMA, PORTO et al., 2007; LAWN E ARMSTRONG et al., 2006; HENAO et al., 2004).

[00408] As promastigotas de L amazonensis costumam proliferar exuberantemente em condições ambientais adequadas como as encontradas no organismo humano mesmo após serem fagocitadas pelos macrófagos, pois, as Leishmanias spp. exibem complexo mecanismo de escape que permite o crescimento deste parasito driblando os mecanismos imunológicos do corpo humano (CHOI, 2001).

[00409] O tratamento com AnB não foi capaz de modular o TNF-α e IL-12 (Figura 11A e B). No entanto, as combinações com AnB demonstraram aumento na produção dessas citocinas (Figura 11A e B), tornando o ambiente celular inóspito para a Leishmania. Esses resultados são relevantes, visto que a literatura descreve que essas citocinas são importantes no controle da doença (PETERSEN, 2012, BARROS, 2015).

[00410] A produção de nitrito (NO), importante molécula para a eliminação de infecções intracelulares (LAKHAL-NAOUAR, 2015; CARVALHO, 2015), foi maior para a combinação A2 (Figura 20). Portanto, o aumento da expressão de NO em resposta à terapêutica sugere ser uma das causas da diminuição do número de amastigotas intracelulares (Figura 8).

[00411] A AnB é uma droga potente no tratamento das Leishmanioses muito em parte das reações celulares que estão presentes no tratamento com essa droga. Neste contexto, a AnB chama atenção para o aumento da inflamação local através de três vias inflamatórias onde estão envolvidas a Phospho NF-kB, SAP/JNK e IkkB e, por outro lado, inibe a NF-kN p65 (Figura 28) ajudando a explicar os resultados da formulação entre AnB e CTA. [00412] Quanto a afinidade molecular investigada entre a AnB e CTA, a simulação de bioinformática por meio de Docking demonstra que a AnB possui um perfil de alta afinidade com a CTA através de múltiplas ligações com baixa energia, inclusive a mais baixa entre as três drogas (Figura 27). Esta foi corroborado pela SPR, que demonstra alta afinidade de ligação da AnB com o chip funcionalizado com CTA. Tomados em conjunto, os dados da afinidade molecular e os efeitos biológicos aqui observados sugerem que há uma forte sinergia entre a AnB e a CTA.

[00413] Em vista dos resultados acima, a presente invenção é uma alternativa viável para o tratamento de Leishmaniose, já que foi comprovado que as combinações ora apresentadas são alternativas terapêuticas eficientes, menos tóxicas e de custo acessível.

[00414] É evidente que os exemplos acima foram apresentados apenas em caráter ilustrativo, não sendo, portanto, limitativos quanto à abrangência do escopo da presente invenção. Modificações e variações nas modalidades acima exemplificadas são consideradas como inclusas no escopo da presente invenção, tal como definida nas reivindicações a seguir.

Referências:

1. ADLER-MOORE, Jill; PROFFITT, Richard T. AmBisome: hposomal formlation, structure, mechanism of action and pre-clinical experience. Journal of Antimicrobial Chemoterapy. v. 49, SI, p. 21-30, 2002.

2. AMATO, Valdir S. et al. Use of itraconazole in the treatment of mucocutaneous leishmaniasis: a pilot study. International journal of infectious diseases, v. 4, n. 3, p. 153-157, 2000.

3. ANDERSEN, Eilen M. et al. Comparison of meglumine antimoniate and pentamidine for Peruvian cutaneous leishmaniasis. The American journal of tropical medicine and hygiene, v. 72, n. 2, p. 133-137, 2005. 4. AWASTHI, Amit; MATHUR, Ram Kumar; SAHA, Bhaskar. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medicai Research, v. 119, n. 6, p. 238, 2004.

5. BANGS, James D. et al. In vitro cytocidal effects on Trypanosoma brucei and inhibition of Leishmania major GP63 by peptidomimetic metalloprotease inhibitors. Molecular and biochemical parasitology, v. 114, n. l, p. 111-117, 2001.

6. BARROS, Neuza B. et al. Liposomal-lupane system as alternative chemotherapy against cutaneous leishmaniasis: macrophage as target cell.Experimental parasitology, v. 135, n. 2, p. 337-343, 2013.

7. BATES, P. A. Complete developmental cycle of Leishmania mexicana in axenic culture. Parasitology, v. 108, n. 01, p. 1-9, 1994.

8. BERMAN, Jonathan D. et al. Susceptibility of clinically sensitive and resistant Leishmania to pentavalent antimony in vitro. The American journal of tropical medicine and hygiene, v. 31, n. 3 Pt 1, p. 459-465, 1982.

9. BERMAN, J. D. et al. Efficacy and safety of liposomal amphotericin B (AmBisome) for visceral leishmaniasis in endemic developing countries.Bulletin of the World Health Organization, v. 76, n. 1, p. 25, 1998.

10. BRASIL. Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde. Manual de Vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana / Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde. - 2. ed. atual. - Brasília : Editora do Ministério da Saúde, 2007.

1 1. BURCHMORE, Richard JS; BARRETT, Michael P. Life in vacuoles-nutrient acquisition by Leishmania amastigotes. International journal for parasitology, v. 31, n. 12, p. 1311-1320, 2001. BURCHMORE, Richard JS; BARRETT, Michael P. Life in vacuoles-nutrient acquisition by Leishmania amastigotes. International journal for parasitology, v. 31, n.

12. p. 1311-1320, 2001.

12. CHAPPUIS, François et al. Visceral leishmaniasis: what are the needs for diagnosis, treatment and control?. Nature reviews microbiology, v. 5, n. 11, p. 873-882, 2007. 13. CHEN, Pei-Chun et al. DNA-interactive properties of crotamine, a cell-penetrating polypeptide and a potential drug carrier. PloS one, v. 7, n. 11, p. e48913, 2012.

14. CHOI, Christine M.; LERNER, Ethan A. Leishmaniasis as an emerging infection. In: Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings. Nature Publishing Group, 2001. p. 175-182.

15. CODERRE, Jeffrey A. et al. Overproduction of a bifunctional thymidylate synthetase-dihydrofolate reductase and DNA amplification in methotrexate-resistant Leishmania trópica. Proceedings of the National Academy of Sdences, v. 80, n. 8, p. 2132-2136, 1983.

16. CORONADO, Monika A. et al. Structure of the polypeptide crotamine from the Brazilian rattlesnake Crotalus durissus terrificus. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography, v. 69, n. 10, p. 1958-1964, 2013.

17. CROFT, Simon L.; COOMBS, Graham H. I_«ishmaniasis--current chemotherapy and recent advances in the search for novel drugs. Trends in parasitology, v. 19, n. 11, p. 502-508, 2003.

18. CUNHA, Burke A. Antibiotic side effects. Medicai Clinics of North America, v. 85, n. 1, p. 149-185, 2001.

19. DEPS, Patrícia D. et al. Avaliação comparativa da eficácia e toxicidade do antimoniato de N-metil-glucamina e do Estibogluconato de Sódio BP88® no tratamento da leishmaniose cutânea localizada. Rev Soe Bras Med Trop, v. 33, p. 535-43, 2000.

20. DESJEUX, P. Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases, v. 27, n. 5, p. 305-318, 2004.

21. DUPONT, Bertrand. Overview of the lipid formulations of amphotericin B. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 49, n. suppl l, p. 31-36, 2002.

22. ENDICOTT, Jane A.; LING, Victor. The biochemistry of P- glycoprotein-mediated multidrug resistance. Annual review of biochemistry, v. 58, n. 1, p. 137-171, 1989. 23. FRÉZARD, Frédéric et al. New insights into the chemical structure and composition of the pentavalent antimonial drugs, meglumine antimonate and sodium stibogluconate. Journal of inorganic biochemistry, v. 102, n. 4, p. 656-665, 2009.

24. GONÇALVES, J. M.; VIEIRA, L. G. Estudos sobre venenos de serpentes brasileiras. I. Análise eletroforética. An. Acad. Bras. Cienc, v. 22, p. 141-150, 1950.

25. GOODWIN, L. G.; PAGE, J. E. A study of the excretion of organic antimonials using a polarographic procedure. Biochemieal Journal, v. 37, n. 2, p. 198, 1943.

26. GROGL, Max; THOMASON, Tina N.; FRANKE, Eileen D. Drug resistance in leishmaniasis: its implication in systemic chemotherapy of cutaneous and mucocutaneous disease. The American journal of tropical medicine and hygiene, v. 47, n. 1, p. 117-126, 1992.

27. GUEIRARD, Pascale et al. Trafficking of Leishmania donovani promastigotes in non-lytic compartments in neutrophils enables the subsequent transfer of parasites to macrophages. Cellular microbiology, v. 10, n. l, p. 100-111, 2008.

28. HAIMEUR, Anass et al. Amplification of the ABC transporter gene PGPA and increased trypanothione leveis in potassium antimonyl tartrate (Sbm) resistant Leishmania tarentolae. Molecular and biochemieal parasitology, v. 108, n. 1, p. 131-135, 2000.

29. HAYASHI, Mirian AF et al. Cytotoxic effeets of crotamine are mediated through lysosomal membrane permeabilization. Toxicon, v. 52, n.

3, p. 508-517, 2008.

30. HENAO, Héctor Hernán et al. Efficacy and toxicity of pentavalent antimonials (Glucantime ^® and Pentosan ^® ) in an American cutaneous leishmaniasis animal model: luminometry application. Biomédica, v. 24, n.

4, p. 393-402, 2004.

31. HEPBURN, N. C. et al. Hepatotoxicity of sodium stibogluconate in leishmaniasis. The Lancet, v. 342, n. 8865, p. 238-239, 1993.

32. IKEDA-GARCIA, F. A. et al. Evaluation of renal and hepatic functions in dogs naturally infected by visceral leishmaniasis submitted to treatment with meglumine antimoniate. Research in veterinary science, v. 83, n. l, p. 105-108, 2007.

33. JÀRVER, Peter; LANGEL, ϋΐο. Cell-penetrating peptides— a brief introduction. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, v. 1758, n. 3, p. 260-263, 2006.

34. KATO, Kelly C. et al. Hepatotoxicity of pentavalent antimonial drug: possible role of residual Sb (ΙΠ) and protective effect of ascorbic acid. Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 58, n. 1, p. 481-488, 2014.

35. KERKIS, Alexandre et al. Crotamine is a novel cell-penetrating protein frotn the venom of rattlesnake Crotalus durissus terrificus. The FASEB journal, v. 18, n. 12, p. 1407-1409, 2004.

36. KERKIS, Alexandre et al. Properties of cell penetrating peptides (CPPs).IUBMB Me, v. 58, n. 1, p. 7-13, 2006.

37. KERKIS, Irina et al. Biological versatility of crotamine-a cationic peptide from the venom of a South American rattlesnake. Expert opinion on investigational drugs, v. 19, n. 12, p. 1515-1525, 2010.

38. LAKHAL-NAOUAR, Ines et al. The Immunology of a Healing Response in Cutaneous Leishmaniasis Treated with Localized Heat or Systemic Antimonial Therapy. PLoS NegI Trop Dis, v. 9, n. 10, p. e0004178, 2015.

39. LAWN, Stephen D. et al. Electrocardiographic and biochemical adverse effects of sodium stibogluconate during treatment of cutaneous and mucosal leishmaniasis among returned travellers. Transactions of the Royai Socíety of Tropical Medicine and Hygiene, v. 100, n. 3, p. 264-269, 2006.

40. LIMA, Edson Borges de et al. Tratamento da leishmaniose tegumentar americana. An. bras. dermatol, v. 82, n. 2, p. 1 11-124, 2007.

41. LOPES, R. et al. Lipid nanoparticles containing oryzalin for the treatment of leishmaniasis. European Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 45, n. 4, p. 442-450, 2012. 42. LOWN, J. W. Molecular basis of specificity in nucleic acid-drug interactions. Pullman, B, 1990.

43. LUCUMI, Armando et al. Sensitivity of Leishmania viannia panamensis to pentavalent antimony is correlated with the formation of cleavable DNA-protein complexes. Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 42, n. 8, p. 1990-1995, 1998.

44. MACEDO, Sharon Rose Aragão et al. The pentavalent antimonial therapy against experimental Leishmania amazonensis infection is more effective under the inhibition of the NF-κΒ pathway. International immunopharmacology, v. 28, n. 1, p. 554-559, 2015.

45. MACHADO, Elizabeth S. et al. Disseminated American muco- cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania brasiliensis brasiliensis in a patient with AIDS: a case report. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 87, n. 4, p. 487-492, 1992.

46. MAHNKE, Alexander et al. Hypoxia in Leishmania major skin lesions impairs the NO-dependent leishmanicidal activity of macrophages. Journal of In vestigative Dermatology, v. 134, n. 9, p. 2339- 2346, 2014.

47. MANCIN, Adriana C. et al. The analgesic activity of crotamine, a neurotoxin from Crotalus durissus terrificus (South American rattlesnake) venom: a biochemical and pharmacological study. Toxicon, v. 36, n. 12, p. 1927-1937, 1998.

48. MARTINS, Vivian T. et al. Antigenicity and protective efficacy of a Leishmania amastigote-specific protein, member of the super-oxygenase family, against visceral leishmaniasis. PLoS Negl Trop Dis, v. 7, n. 3, p. e2148, 2013.

49. MARZOCHL Mauro Célio de Almeida. Curso-Doenças infecto- parasitárias: leishmanioses no Brasil: as leishmanioses tegumentares. J. bras. Med, v. 63, n. 5/6, p. 82-104, 1992.

50. MICHALICK, M.S.M. & RIBEIRO, R.R. Género Leishmania. In: NEVES, D.P. Parasitologia Humana. 12 ^a Ed. São Paulo: Editora Atheneu, 2011. Cap 7, p 41-44. 51. MONGE-MAILLO, Begona; LÓPEZ-VÉLEZ, Rogelio. Therapeutic options for old world cutaneous leishmaniasis and new world cutaneous and mucocutaneous MOTTA, J. O. C; SAMPAIO, R. N. R. A pilot study comparing low-dose liposomal amphotericin B with N-methyl glucamine for the treatment of American cutaneous leishmaniasis. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology, v. 26, n. 3, p. 331- 335, 2012.

52. MURRAY, Henry W. et al. Advances in leishmaniasis. The Lancet, v. 366, n. 9496, p. 1561-1577, 2005.

53. NASCIMENTO, Fábio Dupart et al. Crotamine mediates gene delivery into cells through the binding to heparan sulfate proteoglycans. Journal of Biological Chemistry, v. 282, n. 29, p. 21349- 21360, 2007.

54. NEIDLE, Stephen. DNA minor-groove recognition by small molecules.Natural product reporte, v. 18, n. 3, p. 291-309, 2001.

55. NICOLETE, Roberto et al. Budlein A from Viguiera robusta inhibits leukocyte-endothelial cell interactions, adhesion molecule expression and inflammatory mediators release. Phytomedicine, v. 16, n. 10, p. 904-915, 2009.

56. NOVAIS, Fernanda O. et al. Cytotoxic T cells mediate pathology and metastasis in cutaneous leishmaniasis. PLoS Pathog, v. 9, n. 7, p. el003504, 2013.

57. OUELLETTE, Mare; FASE-FOWLER, Francesca; BORST, Piet. The amplified H circle of methotrexate-resistant leishmania tarentolae contains a novel P-glycoprotein gene. The EMBO journal, v. 9, n. 4, p. 1027, 1990.

58. OWNBY, Charlotte L.; AIRD, Steven D.; KAISER, Ivan I. Physiological and immunological properties of small myotoxins from the venom of the midget faded rattlesnake (Crotalus viridis concolor). Toxicon, v. 26, n. 3, p. 319-323, 1988.

59. PETERSEN, Antonio Luis de Oliveira Almeida et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One, v. 7, n. 11, p. e49496, 2012. 60. RENSLO, Adam R; MCKERROW, James H. Drug discovery and development for neglected parasitic diseases. (2006). Nature Chemical Biology. V2. N12. P.701-710. 2006.

61. REY, LUIZ. Parasitologia. Guanabara Koogan, 4a. ed. Rio de Janeiro, 2008.

62. RIBEIRO, Tatiana G. et al. Novel targeting using nanoparticles: an approach to the development of an effective anti-leishmanial drug-delivery system. 2014.

63. RIZZI, Carina T. et al. Crotamine inhibits preferentially fast-twitching muscles but is inactive on sodium channels. Toxicon, v. 50, n. 4, p. 553-562, 2007.

64. ROBERTS WL. Fatty acid and sterol metabolism: potential antimicrobial targets in apicomplexam and trypanosomatid parasitic protozoa. Molecular Biochemical Parasitology. v. 126, p. 129-42, 2003.

65. ROBERTS, William L.; MCMURRAY, Walter J.; RAINEY, Petrie M. Characterization of the antimonial antileishmanial agent meglumine antímonate (Glucantime ^® ). Antimicrobial agente and chemotherapy, v. 42, n. 5, p. 1076-1082, 1998.

66. SAKTHIANANDESWAREN, Anuratha; FOOTE, Simon J.; HANDMAN, Emanuela. The role of host genetics in leishmaniasis. Trends in parasitology, v. 25, n. 8, p. 383-391, 2009.

67. SAMPAIO, R. N. et al. [The evaluation of the tolerance and nephrotoxicity of pentavalent antimony administered in a dose of 40 mg Sb V/kg/day, 12/12 hr, for 30 days in the mucocutaneous form of leishmaniasis]. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 30, n. 6, p. 457-463, 1996.

68. SAMPAIO, Raimunda NR et al. Avaliação da tolerância e nefrotoxicidade do antimonial pentavalente administrado na dose de 40mg Sb v/kg/dia, de 12/12h, por 30 dias na forma cutaneo-mucosa de leishmaniose. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 30, n. 6, p. 457-463, 1997.

69. SILVA-JARDIM, Izaltina; HORTA, M. Fátima; RAMALHO-PINTO, F. Juarez. The Leishmania chagasi proteasome: role in promastigotes growth and amastigotes survival within murine macrophages. Acta trópica, v. 91, n. 2, p. 121-130, 2004.

70. SUNDAR, Shyam; CHATTERJEE, Mitali. Visceral leishmaniasis- current therapeutic modalities. Indian Journal of Medicai Research, v. 123, n. 3, p. 345, 2006.

71. THAKUR, C. P. et al. Do the diminishing efficacy and increasing toxicity of sodium stibogluconate in the treatment of visceral leishmaniasis in Bihar, índia, justify its continued use as a first line drug? An observational study of 80 cases. Annals of tropical medicine and parasitology, v. 92, n. 5, p. 561-569, 1998.

72. TIUMAN, Tatiana S. et al. Recent advances in leishmaniasis treatment.International Journal of Infectious Diseases, v. 15, n. 8, p. e525-e532, 2011.

73. TRIKHA, Mohit; DE CLERCK, Yves A.; MARKLAND, Francis S. Contortrostatin, a snake venom disintegrin, inhibits βΐ integrin-mediated human metastatic melanoma cell adhesion and blocks experimental metastasis. Câncer Research, v. 54, n. 18, p. 4993-4998, 1994.

74. VEIGA, Joel Paulo R. et al. Pentavalent antimonial nephrotoxicity in the rat.Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v. 32, n. 4, p. 304-309, 1990.

75. WANG, Michael Zhuo; et al. Novel Arylimidamides for Treatment of Visceral Leishmaniasis. Antimicrobial agents and chemotherapy, (2010), p. 2507-2516. doi:10.1128/AAC.00250-10

76. WHO (WORLD HEALTH ORGANIZATION). Contrai of the leishmaniases. Technical Report Series. WHO, Geneva, n. 793, p. 158, 1990.

77. WHO, Expert Committee on the Contrai of the Leishmaniases. Π. World Health Organization. ΠΙ. Series, www.who.mt/leishmaniasis/en: Pesquisado em 07/04/11. 2011.

78. WHO/OMS - World Health Cfrganization/Programmes and projects/Leishmaniasis 07/04/2010 79. WILSON, M. E. et al. Immunology of leishmaniasis. Modern parasite biology: cellular, immunological, and molecular aspects., p.

200-221, 1990.

80. WILSON, W. David et al. Antiparasitic compounds that target DNA.Biochimie, v. 90, n. 7, p. 999-1014, 2008.

81. WRIGHT, Samuel D. et al. CD 14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein. Science, v. 249, n. 4975, p. 1431-1433, 1990.

82. ZIEGLER, André et al. Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis. Biochemistry, v. 42, n. 30, p. 9185-9194, 2003.