Es ist bekannt, daß die Komplexierung von DNA mit Polyethylenimin (PEI) erfolgreich eingesetzt werden kann, um Gene in die Zelle zu transportieren (Boussif et al., 1995 ; Boussif et al., 1996 ; Abdallah et al., 1996).

Der Gentransfer erfolgt dabei dadurch, daß die Komplexe ungerichtet an Zellen gebunden und aufgenommen werden.

Um eine Spezifität der Bindung zu erreichen, wurden verschiedene Liganden, z. B. Transferrin (Tf) oder Antikörper kovalent an PEI gekoppelt, um die Gene über den Mechanismus der rezeptorvermittelten Endozytose in die Zelle zu transportieren (Kircheis et al., 1997).

Auch bei dieser Methode bleibt jedoch ein gewisser Anteil des erzielten Gentransfers unspezifisch, was auf eine Aufnahme der Komplexe in die Zelle unabhängig vom Liganden zurückzuführen ist.

Für die effiziente Anwendung der Gentherapie in vivo gibt es, neben der Spezifität, weitere Voraussetzungen, die es zu erfüllen gilt. Dazu zählt für viele Anwendungen eine möglichst geringe Größe der Komplexe.

Das Erfordernis möglichst kleiner Komplexe ist u. a. durch die physikalischen Gegebenheiten im Organismus bedingt, wie zum Beispiel den geringen Durchmesser vieler Blutgefäße ; ein Erreichen bestimmter Gewebe ist nur durch kleine, nicht aggregierende Komplexe möglich.

Soll die Aufnahme der Komplexe durch rezeptorvermittelte Endozytose erfolgen, so ergibt sich eine

Größenlimitierung von max. 200 nm, um eine Aufnahme in die"coated pits"zu ermöglichen (Stryer, 1990).

Polykation/DNA-Komplexe weisen gegenüber viralen Systemen den Vorteil geringer Immunogenität und geringer Risken auf, sind jedoch im Vergleich zu viralen Gentransfermethoden weniger effizient (Hodgson, 1995).

Dieser Nachteil kann grundsätzlich durch den Einsatz größerer Mengen an zu transferierender DNA ausgeglichen werden. In Vorversuchen zur vorliegenden Erfindung zeigte sich jedoch, daß durch Erhöhung der Konzentration an DNA und Polykation die Tendenz zur Aggregatbildung bei der Komplexierung zunimmt.

Ein limitierender Faktor beim Gentransfer ist ferner die unspezifische Immunabwehr im Blutstrom des Organismus durch sog. Opsonisierung, welche eine der ersten Barrieren ist, die Gentransferpartikel in vivo überwinden müssen. Dabei binden Plasmaproteine an eingedrungene Bakterien, Viren oder andere Fremdkörper und lösen dadurch weitere Abwehrmechanismen des Immunsystems aus (Roitt et al. 1991). Die Bedeutung der Proteinbindung an Liposomen, wie sie für den Gentransfer verwendet werden können, wurde von Chonn et al., 1992 gezeigt. Hier konnte ein direkter Zusammenhang zwischen der Menge an gebundenem Protein und der Halbwertszeit der Liposomen im Blutstrom nachgewiesen werden.

Eine weitere wichtige Komponente der unspezifischen Immunabwehr ist die Aktivierung des Komplementsystems.

Viele kationische Lipide und andere Polykationen, die für den Gentransfer verwendet werden, zeigen eine starke Komplementaktivierung (Chonn, et al., 1991 ; Plank et al., 1996). In der Natur vorkommende sogenannte Dysopsonine können ein Anheften dieser Proteine verhindern (Absolom, 1986). So können zum Beispiel

Bakterien der Opsonisierung entgehen, indem sie an ihrer Oberfläche hoch hydrophile Zuckerreste tragen.

Es wurden bereits verschiedene Methoden entwickelt, um eine Opsonisierung von Partikeln zu verhindern. Eine der am häufigsten angewandten Methoden ist die Verwendung von kovalent gekoppeltem Polyethylenglykol (PEG) (Mori et al., 1991 ; Chonn et al., 1992 ; Woodle et al., 1994).

Dabei konnte sowohl eine reduzierte Proteinbindung als auch eine verlängerte Halbwertszeit der verwendeten Liposomen im Blutstrom gezeigt werden.

Die Menge des eingesetzten PEG betrug meist zwischen 2 und 10 % PEG-gekoppeltem Lipid im Liposom (m/m), das Molekulargewicht von PEG zwischen 750 und 5000 D (Klibanov et al., 1990. ; Blume et al, 1990 ; Mayhew et al, 1992 ; Papahadjopoulos et al, 1991 ; Senior et al, 1991 ; Mori et al, 1991 ; Yoshioka, 1991). Für die sterische Stabilisierung von Partikeln wurde von Woodle et al., 1994, die Bedeutung des Molekulargewichts gezeigt. Dabei erwiesen sich PEG-Derivate ab einer Größe von 2000 D bis 5000 D geeignet ; in der Arbeit von Torchilin et al., 1992 zeigten sich PEG-Derivate mit einem Molekulargewicht 5000 D als geeignet.

Klibanov et. al 1991 beschrieb die stabilisierende Wirkung von PEG 5000 D in Liposomen, die spezifische Liganden enthalten (sog. Immunoliposomen). Dabei konnte aber festgestellt werden, daß dieses PEG zu einer etwas verschlechterten Bindung des Liganden an den Rezeptor führt. In Torchilin et. al 1992, wird jedoch gezeigt, daß die verlängerte Halbwertszeit der Immunoliposomen durch PEG-coating und somiteine Verringerung der unspezifischer Aufnahme durch das RES (retikuloendotheliale System) die verschlechterte Ligand-Rezeptor Interaktion mehr als kompensiert.

Von Kirpotin et. al., 1997, wird die Anwendung bifunktioneller PEG s, deren Herstellung von Zalipsky et. al., 1997, näher dargestellt wird, für die nachträgliche Kopplung von Liganden an PEG-Liposomen gezeigt.

Ähnliche Ergebnisse wie mit PEG konnten für Liposomen mit Gangliosiden von Mori et al., 1991), und für Polystyren-und Goldpartikel mit Co-Polymeren aus Polyoxyethylen und Polyoxypropylen (Moghimi et al., 1993) erreicht werden. Um die Aktivierung des Komplementsystems zu verringern, wurden DNA/Polylysinkomplexe ebenfalls mit PEG modifiziert (Plank et al., 1996). Eine Erhöhung der Spezifität sogenannter Immunoliposome konnte von Torchilin et al., 1992, gezeigt werden. Dabei zeigten Liposomen, die sowohl Antikörper für ein bestimmtes Gewebe als auch PEG enthalten, eine deutlich bessere Spezifität als Liposomen ohne PEG.

Versuche von Torchilin et al., 1994, ergaben, daß amphiphile Vinylpolymere die Halbwertszeit von Liposomen in vivo deutlich verlängern können. Torchilin und Papisov, 1994, zeigten, daß für den Schutzeffekt von PEG und die dadurch bewirkte längere Halbwertszeit von Liposomen die Beweglichkeit der Polymerkette verantwortlich sein dürfte.

Die bisherigen Versuche zur Verringerung der Interaktion von DNA/Polykationkomplexen mit dem Komplementsystem beschränkten sich auf Polylysin enthaltende Komplexe (Plank et al., 1996). Dabei wurde der Effekt beobachtet, daß durch das Koppeln von PEG an positiv geladene DNA/Polylysin Komplexe eine Verringerung der Komplementaktivierung erreicht werden kann.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein alternatives Gentransfersystem bereitzustellen, das

effizient und sehr spezifisch sowie für in vivo Anwendungen geeignet ist.

Die Lösung dieser Aufgabe besteht in Komplexen aus Nukleinsäure und Polyethylenimin, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das Polyethylenimin mit einem daran kovalent gekoppelten hydrophilen Polymeren modifiziert ist.

Im folgenden werden die erfindungsgemäßen Komplexe der Einfachheit halber als DNA/PEI/Polymer-Komplexe bezeichnet.

Das Verhältnis von DNA zu PEI wird im folgenden durch die Angabe des molaren Verhältnisses der Stickstoffatome im PEI zu den Phosphatatomen in der DNA angegeben (N/P-Wert) ; ein N/P-Wert von 6.0 entspricht einer Mischung von 10 ug DNA mit 7,5 ug PEI. Im Falle von freiem PEI ist unter physiologischen Bedingungen nur etwa jedes sechste Stickstoffatom protoniert. Ergebnisse mit DNA/PEI Komplexen zeigen, daß diese bei einem N/P- Verhältnis von 2 bis 3 annähernd elektroneutral sind.

Der N/P-Wert der Komplexe kann über einen breiten Bereich schwanken, er kann im Bereich von etwa 0.5 bis etwa 100 gelegen sein. Bevorzugt beträgt das Verhältnis etwa 2 bis etwa 20, besonders bevorzugt beträgt das Verhältnis 3 bis 10.

Im einzelnen kann der N/P-Wert für den speziellen Anwendungsfall, z. B. für den zu transfizierenden Zelltyp, durch Vorversuche ermittelt werden, indem unter ansonsten identischen Bedingungen das Verhältnis erhöht wird, um das im Hinblick auf die Transfektionseffizienz optimale Verhältnis festzustellen und einen für die Zellen toxischen Effekt auszuschließen.

Das in den Komplexen enthaltene PEI weist ein Molekulargewicht von ca. 700 D bis ca 2000000 D auf.

Größere PEI-Moleküle ergeben nach Komplexierung mit DNA bereits bei niedrigeren N/P Verhältnissen ein Optimum der Transfektioneffizienz, sie resultieren im allgemeinen in einer sehr guten Transfektionseffizienz.

Kleinere Moleküle, von denen pro vorgebenener DNA-Menge eine größere Menge zur Komplexierung erforderlich ist, haben, bei geringerer Effizienz, den Vorteil einer geringeren Toxizität. Welches PEI-Molekül im einzelnen verwendet wird, kann in Vorversuchen ermittelt werden.

Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind PEI-Moleküle im Molekulargewichtsbereich zwischen 2000 und 800000.

Beispiele für kommerziell erhältliches PEI mit unterschiedlichen Molekulargewichten, das im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet ist, sind PEI 700 D, PEI 2000 D, PEI 25000 D, PEI 750000 D (Aldrich), PEI 50000 D (Sigma), PEI 800000 D (Fluka). Von BASF wird PEI unter dem Markennamen Lupasol@ ebenfalls in verschiedenen Molekulargewichten angeboten (Lupasol@ FG : 800 D ; Lupasol0 G 20 wasserfrei : 1300 D ; Lupasol@ WF : 25000 D ; LupasolX G 20 : 1300 D ; Lupasol@ G 35 : 2000 D ; Lupasol@ P : 750000 D ; Lupasol@ PS : 750000 D ; Lupasol@ SK : 2000000 D).

Das hydrophile, an PEI gebundene Polymere ist vorzugsweise linear bzw. in einem nur geringen Ausmaß verzweigt, so daß seine Beweglichkeit weitgehend erhalten bleibt. (Ohne auf diese Theorie festgelegt sein zu wollen, dürfte die positive Wirkung des Polymeren, neben seiner Hydrophilie, auf seine Beweglichkeit zurückzuführen sein.) Beispiele für hydrophile, an PEI gekoppelte Polymere, sind ausgewählt aus der Gruppe Polyethylenglykole (PEG),

Polyvinylpyrollidone, Polyacrylamide, Polyvinylalkohole, oder Copolymere dieser Polymere.

Bevorzugt als hydrophiles Polymer ist PEG.

Das Molekulargewicht des hydrophilen Polymeren beträgt im allgemeinen etwa 500 bis etwa 20000 D, vorzugsweise werden Moleküle mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 10000 D eingesetzt.

Die Menge an Polymer für die Kopplung an PEI wurde anhand von PEG in Vorversuchen zur vorliegenden Erfindung aus der Analyse der Anzahl primärer Amine im PEI-Molekül mittels Ninhydrin-Assay (Sarin et al, 1981) bestimmt. Dabei konnte festgestellt werden, daß ca. jedes zehnte Stickstoffatom in Form eines primären Amines vorliegt. Daher wurde als Ausgangspunkt ein Gewichtsverhältnis von PEG-5000 D-Derivat zu PEI von 9.2 gewählt. Dieses entspricht größenordnungsmäßig einem molaren Verhältnis PEG : primäre Aminogruppen/PEI-Molekül von 1 : 1.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Experimente sowie Begleitversuche zeigten, daß ein molares Verhältnis Polymer : primäre Aminogruppen/PEI in einem Bereich von 1 : 10 bis 10 : 1 für die sterische Stabilisierung von DNA/PEI Komplexen, je nach Anwendungsfall, geeignet ist. Bevorzugt beträgt der Bereich 1 : 5 bis 5 : 1, besonders bevorzugt 1 : 3 bis 3 : 1.

PEI ist gegebenenfalls mit einem zellulären Liganden modifiziert, um die spezifische Aufnahme der Komplexe durch Bindung an Zelloberflächenproteine, insbesondere Rezeptoren, zu bewirken. Beispiele für Liganden sind in der WO 93/07283 angeführt, bevorzugt wird als Ligand Transferrin oder EGF verwendet.

Das für einen bestimmten Transfektionsansatz jeweils am besten geeignete Polymermolekül kann, nach Typ, Molekulargewicht und Menge, in Vorversuchen ermittelt werden, ebenso die Zweckmäßigkeit der Modifikation von PEI mit einem zellulären Liganden. Bei derartigen Vorversuchen wird von einem vorgegebenen DNA/PEI Komplex ausgegangen und das Polymere hinsichtlich Art und Menge variiert, dann wird die Stabilität der Komplexe unter den gewählten Transfektionsbedingungen verglichen. Im Hinblick auf die Notwendigkeit bzw. Auswahl eines Liganden werden Komplexe, die bis auf das Vorhandensein oder Fehlen eines zellularen Liganden identisch sind, hinsichtlich ihrer Transfektionseffizienz miteinander verglichen.

Der Ligand wird an PEI mittels herkömmlicher Methoden gekoppelt, z. B. auf chemischem Weg, wie in der WO 93/07283 für die Kopplung von Virus, Virusproteinen oder-peptiden mit Polyaminverbindungen beschrieben.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist PEI mit dem Liganden über das hydrophile Polymere verbunden. Diese Ausführungsform weist den Vorteil auf, daß hinsichtlich der Polymergröße geringere Einschränkungen auftreten, weil die Zugänglichkeit des Liganden, der sich in dieser Anordnung außerhalb der Polymerschicht befindet, und dessen Bindung an den Rezeptor nicht durch das Polymere blockiert wird.

Die in den erfindungsgemäßen Komplexen enthaltene Nukleinsäure wird vor allem durch den in der Zelle zu erzielenden biologischen Effekt definiert, im Falle der Anwendung im Rahmen der Gentherapie durch das zur Expression zu bringende Gen bzw. den Genabschnitt, z. B. zwecks Substitution eines defekten Gens, oder durch die Zielsequenz eines zu inhibierenden Gens. Bei den in die Zelle zu transportierenden Nukleinsäuren kann es sich um

DNAs oder RNAs handeln, wobei hinsichtlich der Nukleotidsequenz keine Beschränkungen bestehen.

Die erfindungsgemäßen Komplexe haben den Vorteil, daß sie in geringer Größe herstellbar sind, wobei dieser Effekt durch einen gegebenenfalls an PEI gekoppelten Liganden nicht beeinträchtigt wird.

Die Modifikation mit PEG kann auch an größeren Komplexen durchgeführt werden, ohne dabei ihre Funktionalität zu beeinträchtigen.

Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung der DNA/PEI-Polymer-Komplexe.

Die Herstellung von DNA/PEI/Polymer-Komplexen kann auf unterschiedliche Art und Weise erfolgen.

Bevorzugt werden zuerst DNA und PEI durch Mischen der Lösungen komplexiert und anschließend, z. B. nach einer Reifungszeit von etwa 20-40 Minuten, kann die Reaktion mit dem Polymeren (im Fall der Reaktion mit PEG die "PEGylierung") erfolgen, wie sie in den Beispielen der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde. Im Zuge der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, daß Komplexierung bei hohen Konzentrationen der Komplexpartner einen deutlich höheren Anteil an aggregierten Komplexen liefert (siehe Beispiel 3c). Es wurde festgestellt, daß diese in vielen Fällen unerwünschte Aggregation durch Mischen der Komplexe aus sehr verdünnten Lösungen weitgehend hintangehalten werden kann. Die Verringerung der Salzkonzentration unter den physiologischen Wert verringert den Effekt der Aggregatbildung (Beispiel 1). Die Verwendung von entionisiertem Wasser anstatt physiologischer Salzkonzentration kann die Aggregation verhindern (Beispiel 1). Es hat sich gezeigt, daß physiologische Glukosekonzentrationen keinen Einfluß auf die

Aggregatbildung haben (s. Fig. 1). Es zeigte sich, daß eine Erhöhung der Salzkonzentration auf einen Wert im physiologischen Bereich im Anschluß an die Komplexierung sich nicht negativ auf die Stabilität der Komplexe auswirkt, während Komplexe ohne PEG rasch Aggregate bildeten (Fig. 2a). Es zeigte sich ferner, daß die PEGylierung der Komplexe auch zu einer verringerten Oberflächenladung der Komplexe führt (Fig. 14).

In einer alternativen, bevorzugten Methode wird daher die Komplexierung bei niedrigen Konzentrationen der Komplexpartner, vorzugsweise bei ca. 5 bis 50 ug DNA/ml, insbesondere 10 bis 40 ug DNA/ml, durchgeführt. Die PEI- Konzentration wird, entsprechend dem jeweiligen N/P-Wert, auf die DNA-Konzentration abgestimmt ; sie beträgt z. B. 1,25 ug/ml PEI 800000 D bei einem N/P-Wert von 2 und einer DNA-Konzentration von 5 ug/ml ; bei einer DNA-Konzentration von 50 ug/ml entsprechend 12,5 ug/ml PEI 800000 D. Die Komplexierung wird außerdem bei möglichst niedriger Ionenkonzentration durchgeführt, um ein Auftreten von Aggregaten bereits bei der Komplexierung oder unmittelbar anschließend daran zu verhindern. Gegebenenfalls wird, im Hinblick auf die weitere direkte Verwendung der Komplexe in vivo, die Komplexierung in Gegenwart physiologischer Zuckerkonzentration (Dextrose, Glukose, Saccharose) durchgeführt.

Die Verhinderung der Aggregation der Komplexe ist vermutlich durch die Ausbildung einer dickeren Hydratationshülle bewirkt, die das Zusammenklumpen der Komplexe verhindert.

In einer alternativen Methode werden Komplexe aus verdünnten Lösungen erhalten, wobei PEI eingesetzt wird, das bereits mit dem Polymeren, z. B. PEG, kovalent gekoppelt ist (Beispiel 2b). Auch hier zeigte sich der

stabilisierende Effekt von PEG, welches das Aggregieren der Komplexe auch nach Salzzugabe verhindert.

Die kovalente Kopplung des Polymeren an PEI kann mittels herkömmlicher Methoden durchgeführt werden, wobei Polymer-Derivate verwendet werden, die an die freien Aminogruppen von PEI binden können. Unterschiedliche Derivate sind kommerziell erhältlich, z. B. die entsprechenden PEG-Derivate (Shearwater Polymers, USA) : N-Hydroxysuccinimidylaktivester (Abuchowski et al, 1984 ; Klibanov et al, 1990 zeigten die Verwendbarkeit der entsprechenden PEG-Derivate für die Modifizierung von Liposomen) ; Beispiele für kommerziell erhältliche PEG- Derivate dieses Typs sind Methoxy-SS-PEG, MW 5000 D ; Methoxy-SSA-PEG, MW 5000 D) ; Succinimidylsuccinat- Proprionsäure-Derivate (Methoxy-SPA-5000, MW 5000 D ; Methoxy-SPA-20000, MW 20000 D ; Methoxy-SSPA-PEG, MW 5000) ; Oxycarbonylimidazol-Derivate, die unter Urethanbildung reagieren (die Bindung von PEG-Derivaten dieses Typs an Proteine wurde von Beauchamp et al, 1983, gezeigt, die Verwendung zur PEGylierung von Liposomen von Allen et al, 1991 ; Beispiele für Handelsprodukte sind Methoxy-PEG-CDI, MW 5000 D) ; Glycidylether (Pita et al, 1970 ; Elling et al, 1991) ; Tresylate (die Bindung von PEG-Tresylaten an Proteine und Liposomen wurde beschrieben von Nilsson et al, 1984 ; Yoshinaga et al, 1989 ; Delgado et al, 1990 ; Dust et al, 1990 ; Senior et al., 1991 ; Klibanov et al, 1991 ; Beispiele für kommerziell erhältliche PEG-Tresylate sind Methoxy-PEG- Tres, MW 5000 ; Methoxy-PEG-Tres, MW 200) ; Aldehyde, deren Bindung mit Natriumcyanborhydrid an Aminogruppen erfolgt (Wirth et al, 1991 ; Handelsprodukte sind Methoxy-PEG-ald, MW 5000 ; M-ALD-PEG-200 : Methoxy-PEG- ald, MW 2000).

Im Falle der Gegenwart eines zellulären Liganden in den Komplexen wird bei der Herstellung wie folgt vorgegangen : In einer Ausführungsform wird das PEI an den Liganden gekoppelt, wie in der EP-A1 388 758 bzw. von Kircheis et al., 1997, beschrieben, im Anschluß daran wird die Komplexierung mit den übrigen Reaktionspartnern vorgenommen, wie oben beschrieben.

Um Komplexe herzustellen, in denen die Bindung des Liganden an PEI über das Polymere erfolgt, werden bifunktionelle Polymere verwendet, die an beiden Molekülenden unterschiedliche reaktive Gruppen aufweisen. Dazu können Polymere, z. B. PEG, verwendet werden, wie sie bisher für die Kreuzvernetzung unterschiedlicher Makromoleküle verwendet wurden, z. B. für die Vernetzung von Cofaktor und Apoenzym (Nakamura et al, 1986), Zielsteuerung polymerer Wirkstoffe (Zalipsky und Barany, 1990) oder PEG-Beschichtung von Oberflächen und Proteinen (Harris et al, 1989). Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung u. a. verwendbaren bifunktionellen Derivate sind kommerziell erhältlich, sie enthalten Aminogruppen, Hydroxygruppen oder Carbonsäuregruppen an den Molekülenden, z. B. wie von Shearwater Polymers erhältliche Produkte. Ebenfalls verwendbare Derivate sind NHS-Maleinimid-und NHS- Vinylsulfonderivate, die ihre Reaktionsoptima bei unterschiedlichen pH-Werten haben. Auch Biotin-PEG- Maleinimid oder-NHS Derivate können verwendet werden, wobei an die MAL bzw. NHS Gruppe eine kovalente Kopplung erfolgen kann und die biotinylierte Seite mit Streptavidin enthaltenden Molekülen oder Partikel reagieren kann.

Bei Verwendung bifunktioneller Polymere ergeben sich für die Bildung von DNA/PEI/Ligand/Polymer-Komplexen mehrere

Möglichkeiten : Dabei kann die Kopplung von bifunktionellem Polymer, z. B. PEG, an PEI erfolgen und ein Ligand mit passender funktioneller Gruppe an die zweite, freigebliebene funktionelle Gruppe am Polymer, wahlweise vor oder nach Komplexierung mit DNA, gekoppelt werden. Die Bindung PEG-PEI kann über die primären Amine des PEI erfolgen, wobei jedoch auch die vorhergehende Kopplung anderer reaktiver Gruppen, wie SH-Gruppen, an PEI möglich ist, die als Reaktionspartner für PEG-Derivate fungieren können. Auch ist die vorhergehende Kopplung von Liganden an bifunktionelles PEG möglich, wobei die weitere Bindung an PEI vor oder nach Komplexierung mit DNA möglich ist. In all diesen Fällen ergeben sich dabei, besonders bei der Verwendung kleiner Liganden, Vorteile, die bei einer eventuellen nachträglichen PEGylierung durch das PEG abgeschirmt werden können.

Durch die Verwendung bifunktioneller PEG Derivate funktioniert das lineare, hydrophile Polymer-Molekül gewissermaßen als Abstandhalter zwischen PEI und Ligand.

Für bestimmte in vivo Anwendungen ist es im Hinblick auf eine hohe Gentransfereffizienz erforderlich, daß die erfindungsgemäßen Komplexe in hoher Konzentration, zweckmäßig in einer Konzentration von mindestens ca.

200 ug DNA/ml, vorliegen. Die Komplexkonzentration kann, bei höherem Gehalt an hydrophilem Polymer, bis zu ca.

1 mg/ml betragen.

Die erfindungsgemäßen Komplexe weisen überrascherweise den Vorteil auf, daß sie aus verdünnten Lösungen auf die erforderliche hohe Konzentration gebracht werden können, ohne daß eine nennenswerte Aggregatbildung, die die Gentransfereffizienz beeinträchtigen würde, auftritt. Es konnte auch gezeigt werden, daß die Modifikation der Komplexe mit PEG zu einer erhöhten Beständigkeit der

Komplexe im Blut von Mäusen führt. Dieser Effekt trägt auch dazu bei, daß nach z. B. intravenöser Applikation der Komplexe ein Gentransfer im subkutanen Tumor erzielt wird.

Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt eine Zusammensetzung für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen, die DNA/PEI/PEG Komplexe in einer Konzentration, bezogen auf DNA, von etwa 200 ug/ml bis etwa 1 mg/ml enthält.

Insbesondere liegt die Zusammensetzung in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung vor. In dieser Ausgestaltung dient die Zusammensetzung zur Transfektion von Säugetierzellen in vivo ; sie enthält als aktiven Bestandteil einen Komplex, der eine therapeutisch wirksame Nukleinsäure enthält. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann, bei lokaler Anwendung, eine hohe Konzentration an therapeutisch wirksamer DNA im Gewebe erzielt werden.

Bei der systemischen Anwendung hat die Zusammensetzung den Vorteil, daß die Komplexe wegen der Verhinderung der Opsonierung weder unspezifischer Bindung noch Abbau unterliegen.

Durch Verhinderung bzw. Verringerung von unspezifischen Bindungen und durch das Einbringen von (zelltypspezifischen) zellbindenden Liganden in die Komplexe kann ein spezifisches Targeting zu bestimmten Zellen, Organen oder Geweben (z. B. Tumorgewebe) und damit eine zielgerichtete Genexpression (z. B. im Tumorgewebe) nach systemischer Verabreichung erzielt werden (Beispiel 12).

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, daß die erfindungsgemäßen, durch PEGylierung stabilisierten Komplexe aufgrund ihrer längeren Zirkulationszeit im Blut die Möglichkeit haben, in Bereichen mit erhöhter

Gefäßpermeabilität bzw. Gefäßschädigungen aus dem Blutgefäßsystem in die umliegenden Gewebe auszutreten und dort zu akkumulieren. Bereiche, wo ein solches "passives Targeting"verstärkt auftritt, sind gut durchblutete Tumore sowie Entzündungsbereiche.

Die pharmazeutische Zusammensetzung kann u. a. vorteilhaft für die Therapie von Tumorerkrankungen verwendet werden, um intratumoral DNA zu verabreichen, enthaltend, insbesondere auf einem Plasmid, eine Sequenz, kodierend für ein oder mehrere Zytokine, wie Interleukin-2, IFN-a, IFn-y, TNF-a, oder ein Selbstmordgen, das in Kombination mit dem Substrat zur Anwendung kommt, wie das Herpes Simplex Thymidinkinase- Gen (mit Ganciclovir) oder das Linamarase-Gen (mit Linamarin), oder eine DNA, kodierend für ein apoptoseinduzierendes Protein, wie p53 oder Apoptin, oder für ein Toxin, wie das Diphterietoxin, oder für ein zytotoxisch wirkendes Enzym.

Eine weitere Anwendung, bei der die Vorteile der erfindungsgemäßen Zusammensetung zum Tragen kommen, ist die sog. genetische Tumorvakzinierung. Die dabei zur Anwendung kommenden Komplexe enthalten DNA, kodierend für ein oder mehrere Tumorantigene oder Fragmente davon, gegebenenfalls in Kombination mit DNA, kodierend für ein oder mehrere Zytokine.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung liegt bevorzugt als Lyophilisat vor, gegebenfalls unter Zusatz von Zucker, wie Saccharose oder Dextrose, in einer Menge, die in der gebrauchsfertigen Lösung eine physiologische Konzentration ergibt. Die Zusammensetzung kann auch in Form eines Kryokonzentrats vorliegen.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auch tiefgefroren (kryokonserviert) oder als gekühlte Lösung vorliegen.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung für die Transfektion von Såugetierzellen, bei dem zunächst Komplexe aus verdünnten Lösungen der Komplexpartner hergestellt und anschließend auf eine Konzentration von mindestens 200 ug/ml gebracht werden.

Das Aufkonzentrieren der Komplexe kann mittels herkömmlicher Methoden, z. B. durch Ultrafiltration oder durch Ultrazentrifugation, vorgenommen werden.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können gegebenenfalls in Form eines Kits vorliegen, wobei die Einzelkomponenten DNA einerseits und Polymer- modifiziertes PEI, an das gegebenenfalls ein Ligand gekoppelt ist, andererseits, in getrennten Behältern vorliegen.

Figurenübersicht Fig. 1 : Unterdrücken der Aggregatbildung von DNA/PEI- Komplexen durch Mischen unter salzfreien Bedingungen Fig. 2 : Stabilisieren von DNA/PEI-Komplexen mit Polyethylenglykol (PEG) a) Kovalente Kopplung von PEG nach der Komplexierung der DNA mit PEI b) Kovalente Kopplung von PEG an PEI vor der Komplexbildung mit DNA c) Abhängigkeit der Partikelgröße von der Konzentration an DNA und PEI bei der Komplexbildung

Fig. 3 : Für die Stabilisierung der Komplexe ist die kovalente Bindung von PEG entscheidend Fig. 4 : Konzentrierung von PEG-stabilisierten DNA/PEI Komplexen Fig. 5 : Interaktion von DNA/PEI Komplexen mit humanem Plasma (Immunoblot) Fig. 6 : Verringerung der Proteinbindung an DNA/PEI Komplexe durch Modifizierung mit PEG A) Silberfärbung B) Überprüfung der Filtrierbarkeit Fig. 7 : Effekt der PEG-Modifizierung auf den Gentransfer in K562-Zellen Fig. 8 : Effekt der PEG-Modifizierung auf den Gentransfer in murine Neuroblastomzellen Fig. 9 : Verringerung der unspezifischen Aufnahme der Komplexe durch P388 Mausmakrophagen durch Modifizieren der Komplexe mit PEG Fig. 10 : Verringerung der Wechselwirkung mit Plasmaproteinen durch Modifizieren von DNA/Tf-PEI Komplexen mit PEG Fig. 11 : PEGylierung von DNA/TfPEI-Komplexen erhöht die Beständigkeit der Komplexe im Blut nach der in vivo Anwendung Fig. 12 : Bestimmung der Bioverteilung von PEGylierten DNA/TfPEI-Komplexen nach systemischer Verabreichung mittels Southern-Blot A) intaktes plus teilweise abgebautes Reportergen-Plasmid B) intaktes Reportergen-Plasmid

Fig. 13 : Zielgerichtete Genexpression im Tumorgewebe nach systemischer Verabreichung von PEGylierten DNA/TfPEI-Komplexen Fig. 14 : Messung des Zeta-Potentials : verringerte Oberflächenladung von PEGylierten DNA/TfPEI-und DNA/PEI-Komplexen Fig. 15 : Effekt der PEG-Modifizierung kleiner und großer Komplexe auf den Gentransfer in Säugerzellen Fig. 16 : Effekt der PEG-Modifizierung auf den EGF- vermittelten Gentransfer in Säugerzellen Beispiel 1 : Unterdrücken der Aggregatbildung von DNA/PEI-Komplexen durch Mischen unter salzfreien Bedingungen Die Bildung der Komplexe erfolgte durch Mischen von gleichen Volumina (250 ul) verdünnter Lösungen von Plasmid-DNA, enthaltend die für das Reportergen Luciferase kodierende Sequenz (10ug des Plasmids pCMVL, beschrieben in der WO 93/07283) und 7,5 ug PEI (N/P- Wert : 6.0) bzw. 9 ug PEI (N/P-Wert 7,2) durch rasches, mehrfaches Auf-und Abpipettieren der Lösungen, um eine möglichst schnelle Mischung der beiden Komponenten zu erreichen. Es wurde PEI mit einem Molekulargewicht von 800000 Dalton verwendet (Fluka). Die Endkonzentration an DNA im Komplex betrug 20 ug/ml. Für Transferrin (Tf) enthaltende Komplexe wurden Konjugate mit kovalent an PEI gebundenem Tf verwendet, deren Herstellung von Kircheis et al., 1997, beschrieben wurde. Es wurden zwei verschiedene Konjugate verwendet : Tf2PEI (molares Verhältnis von Tf/PEI 2/1) und Tf4PEI (molares Verhältnis von Tf/PEI 4/1). Der Vergleich der

Komplexmischung in HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,3) ; in entionisiertem Wasser (MQ) allein und in MQ mit 5 % Glukose ist in Fig. 1 dargestellt. Die mittlere Partikelgröße wurde nach verschiedenen Zeiten mittels quasielastischer Laserlichtstreuung (Brookhaven BI-90) gemessen. Es zeigte sich, daß Komplexe in HBS schon nach kurzer Zeit aggregierten, während Komplexe, die in entionisiertem Wasser hergestellt wurden, eine stabile Größe aufwiesen, die durch eine physiologische Glukosekonzentration nicht wesentlich beeinträchtigt wurde.

Beispiel 2 : Stabilisieren von DNA/PEI-Komplexen mit Polyethylenglykol (PEG) a) Kovalente Kopplung von PEG nach der Komplexierung der DNA mit PEI Die DNA/PEI-Komplexe mit einem N/P Verhältnis von 6.0 wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, gemischt und zur vollständigen Komplexierung 40 min bei Raumtemperatur (RT) gelagert. Anschließend wurden 69 ug Methoxy- succinimidyl-proprionat-PEG (M-SPA-PEG, Molekulargewicht von 5000 Dalton, Shearwater Polymers, Inc., USA, Stammlösung 10 mg/ml in DMSO) in 50ul MQ Wasser zugesetzt. (Dabei entsteht zwischen M-SPA-PEG und den Aminogruppen des PEI eine kovalente Bindung.) Die Reaktionsdauer betrug 20 min bei RT ; das Gewichtsverhältnis (w/w) von PEG zu PEI betrug 9,2.

Die Komplexgröße wurde nach verschiedenen Zeiten mittels quasielastischer Laserlichtstreuung gemessen. Um die erfolgreiche Stabilisierung der Komplexe zu zeigen, wurden der Komplexlösung ein 250ul Aliquot PBS (137 mM NaCl, 2,6 mM KC1,6,6 mM Na2HP04,1,5 mM KH2PO4 ; pH 7,4) zugesetzt. Durch diese Erhöhung der Salzkonzentration

wurde die Aggregation von sterisch nicht stabilen Komplexen hervorgerufen, während die PEG-modifizierten Komplexe keine Größenveränderung zeigten (Fig. 2a). b) Kovalente Kopplung von PEG an PEI vor der Komplexbildung mit DNA Die PEGylierung von PEI vor der Komplexierung ("pre- PEGylierung") wurde wie folgt durchgeführt : 7,5 ug PEI wurden mit 6,9 ul M-SPA-PEG 10 mg/ml in DMSO gemischt und die Reaktion nach 20 min bei RT durch Zugabe von 0,2 uMol Glycin abgestoppt. (Dabei reagiert das noch vorhandene freie M-SPA-PEG mit der Aminogruppe des Glycin.) Nach weiteren 20 min wurde die Lösung mit MQ auf 250 ul aufgefüllt und, wie in Beispiel 2a beschrieben, mit 10 ug DNA komplexiert. Die weitere Vorgangsweise erfolgte ebenfalls wie in Beispiel 2a beschrieben.

Die verwendeten Komplexe wiesen einen N/P-Wert von 6,0 auf, das Verhältnis von PEG/PEI betrug 9,2 (w/w).

Die nachträgliche PEGylierung ("post-PEGylierung") der Komplexe erfolgte wie in Beispiel 2a beschrieben. Die Ergebnisse zeigen, daß auch mit vorhergehender PEGylierung von PEI sterisch stabile Komplexe gebildet werden können, der durchschnittliche Durchmesser der Partikel ist aber etwas größer als bei nachträglicher PEGylierung (Fig. 2b). c) Abhängigkeit der Partikelgröße von der Konzentration und DNA und PEI bei der Komplexbildung Die Komplexe wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, in MQ gemischt, mit PEG modifiziert und der mittlere Partikeldurchmesser mittels LLS gemessen. Die DNA- Konzentration bei der Komplexbildung betrug 20 bzw.

320 ug/ml. Die Größenmessung erfolgte nach der

PEGylierung. Es zeigte sich deutlich, daß durch Mischen in höheren Konzentrationen mehr Aggregate enstehen (Fig. 2c).

Beispiel 3 : Für die Stabilisierung der Komplexe ist die kovalente Bindung von PEG entscheidend In diesem Experiment wurde ein Gewichtsverhältnis von PEG zu PEI von 9,2 gewählt. Es wurde einerseits, wie in den vorigen Beispielen, Methoxy-succinimidyl-proprionat- PEG (M-SPA-PEG 5000) verwendet, andererseits PEG unterschiedlichen Molekulargewichtes ohne reaktive Gruppen (6000 D : Merck, No. 807491 ; 4000 d : Loba Feinchemie, No. 81252 ; 1500 d : Merck, No. 807489) mit mittleren Molekulargewichten von 6000,4000 und 1500 Dalton verwendet. Die Komplexgröße wurde nach verschiedenen Zeiten mittels quasielastischer Laser Lichtstreuung gemessen. Nach PEGylierung wurde der Komplexlösung ein 250 ul Aliquot PBS zugesetzt. Fig. 3 zeigt, daß nur kovalente Bindung von PEG an den Komplex die Aggregierung der Komplexe nach Salzzugabe verhindert.

Beispiel 4 : Konzentrierung von PEG-stabilisierten DNA/PEI Komplexen Die Komplexe wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, gemischt und, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit M-SPA- PEG stabilisiert. Nach der Stabilisierung und Zugabe von 250 ul PBS wurde die Komplexlösung (ca. 800 ul) in Mikrokonzentratoren (Vivaspin 500, molekulares Ausschlußvolumen 100000 Dalton) mit 12000 g bis auf ein Volumen von ca 25 ul und somit eine DNA Konzentration von ca 400 ug/ml DNA konzentriert. Anschließend wurde

mit MQ wieder eine Konzentration von 20 ug/ml eingestellt und die Größe mittels quasielastischer Laser Lichtstreuung gemessen. Fig. 4 zeigt, daß ohne PEG- Modifizierung nach dem Konzentrieren aufgrund Aggregation und/oder Absorption der Komplexe an die Membran keine sinnvollen Partikelgrößen mehr gemessen werden konnten, während die stabilisierten Komplexe auch nach Konzentrierung keine Aggregatbildung aufwiesen.

Beispiel 5 : Interaktion von DNA/PEI Komplexen mit humanem Plasma Dieses Experiment diente dazu, die Interaktion von Plasmaproteinen mit den PEI-Komplexen zu bestimmen, wobei die an die Komplexe gebundenen Proteine zusammen mit diesen abgetrennt wurden.

Es wurde humanes Citratplasma (Sigma) verwendet. In diesem Experiment wurden die Komplexe in folgender Weise gemischt : 12,8 ug DNA in 20 ul MQ wurden mit 9,6 ug PEI in ebenfalls 20 ul MQ gemischt und wie in Beispiel 2 beschrieben modifiziert. Anschließend wurden die Komplexe mit einem Aliquot verdünntem Plasma 30 min bei 37°C inkubiert. a) Identifizierung der an DNA/PEI Komplexe bindenden Plasma-Proteine In diesem Experiment wurden 40 ul Komplex mit einer DNA- Konzentration von 320 ug/ml mit 140 ul 1 : 70 verdünntem Plasma 30 min bei 37°C inkubiert. Die Komplex/Plasma Lösung wurde auf Mikrofiltrationseinheiten mit einer Filter-Porengröße von 0,2 um (Whatman, England, Anopore membrane) aufgetragen. Die Membran wurde vorher mit einer BSA Lösung (1 mg/ml) abgesättigt und dreimal mit HBS (20 mM HEPES pH 7.3,145 mM NaCl) gewaschen, um

unspezifische Proteinbindung zu reduzieren. Die aufgetragene Lösung wurde bei 12000 g filtriert und dreimal mit HBS gewaschen. Das am Filter zurückgebliebene Material (Komplexe plus Plasmaproteine) wurde mit HBS + 5% SDS eluiert ("Eluat") und wie das Filtrat der Komplex/Plasmalösung ("Filtrat") nach Zugabe von einem Aliquot fünffach konzentrierten nichtreduzierendem Probenpuffer (25 % Glyzerin (w/v) ; 290 mM TRIS pH 6,8 ; 0,25 % SDS (w/v) ; 0,1 mg/ml Bromphenolblau) auf einem SDS-Polyacrylamidgel mit einem Polymergradienten von 2,5 bis 12 % aufgetrennt.

Für die immunologische Identifizierung der Proteine wurde das Gel in einer"semi dry"Blot-Apparatur (Bio Rad) auf eine Nitrozellulosemembran geblottet, unspezifische Bindungsstellen mit einer 1% igen Milchpulverlösung abgesättigt und mit den entsprechenden Antikörpern inkubiert. Die Antikörper wurden in TBST (150 mM NaCl ; 10 mM TRIS pH 8,0 ; 0,1 % TWEEN 20) verdünnt.

1. Antikörper : Ziege anti-human Complement C3 (fraktioniertes Antiserum, Sigma, Best. No. C-7761, Lot Number 054H8842), Verdünnung 1 : 3000.

Ziege anti-human Fibrinogen (fraktioniertes Antiserum, Sigma, Best. No. F-2506, Lot Number 115H8828), Verdünnung 1 : 3000. Ziege anti-human Fibronectin (fraktioniertes Antiserum, Sigma, Best. No. F-1909, Lot Number 094H8868), Verdünnung 1 : 3000.

2. Antikörper : Maus anti-Ziege IgG, HRP konjugiert (polyklonal, Jackson Laboratories, Best. No. 205-035-108, Lot Number 33740), Verdünnung 1 : 25000

Nach Inkubation mit dem zweiten Antikörper wurde die Nitrozellulosemembran mehrfach mit TBST gewaschen und anschließend in Luminol/Enhancer Lösung (Pharmacia, No. 1856135) und Stabiler Peroxid Lösung (Pharmacia, No. 1856136) 1/1 (v/v) 10 min bei RT inkubiert, mehrfach mit TBST gewaschen und ein Film auf dem Blot exponiert.

Der Immunoblot ist in Fig. 5 dargestellt. Es zeigte sich, daß Komplement C3, Fibrinogen, und Fibronectin an die DNA/PEI Komplexe im Eluat binden ; ein Effekt, der nach PEGylierung (die Komplexe wurden, wie in Beispiel 2, PEGyliert) deutlich verringert wird (s.

Spuren 4 und 5). Die Kontrollen (Spuren 6 und 7) dienten dazu festzustellen, in welchem Ausmaß diese Proteine ohne Anwesenheit von Komplex an die Filtermembran binden. Bei der Plasmaprobe ohne DNA-Komplexe findet sich das Protein erwartungsgemäß hauptsächlich im Filtrat, im Eluat konnten keine nennenswerte Mengen der Proteine gefunden werden (Spur 1 : Humanplasma, 3 ul, 1 : 50 verdünnt ; Spur 2 : DNA/PEI + Plasma, Filtrat, 6 ul ; Spur 3 : DNA/PEI + Plasma, Eluat, 20 ul ; Spur 4 : 150 ul Plasma, 1 : 70 verdünnt, Filtrat, 6 ul ; Spur 5 : 150 ul Plasma, 1 : 70 verdünnt, Eluat, 20 ul). b) Verringerung der Proteinbindung an DNA/PEI Komplexe durch Modifizierung mit M-SPA-PEG Es wurden Komplexe wie in a) beschrieben gemischt und wie in Beispiel 2 beschrieben mit M-SPA-PEG modifiziert.

Die Inkubation mit Plasma, Filtration, Eluierung und elektrophoretische Auftrennung erfolgte wie in Beispiel 5a beschrieben. Zum semiquantitativen Nachweis wurden die aufgetrennten Proteine mit Silberfärbung (geingfügig modifizierte Methode nach Bloom et al., 1987) angefärbt.

Wie aus Fig. 6a ersichtlich, binden an PEG-modifizierte Komplexe (Spur 5, Eluat) deutlich weniger (nicht

sichtbare) Proteinmengen als an unmodifizierte Komplexe (Spur 3). Spur 1 : Humanplasma, 3 ul, 1 : 50 verdünnt ; Spur 2 : DNA/PEI + Plasma, Filtrat, 6 ul ; Spur 3 : DNA/PEI + Plasma, Eluat, 20 ul ; Spur 4 : DNA/PEI-PEG PEG/PEI 9,2/1 (w/w) + Plasma, Filtrat, 6 ul ; Spur 5 : DNA/PEI-PEG PEG/PEI 9,2/1 (w/w) + Plasma, Eluat, 20 ul ; Spur 6 : 150 ul Plasma, 1 : 70 verdünnt, Filtrat, 6 ul ; Spur 7 : 150 ul Plasma, 1 : 70 verdünnt, Eluat, 20 ul. c) Überprüfung der Filtrierbarkeit von DNA/PEI Komplexen : Um sicherzugehen, daß nach der Filtration ein Großteil der Komplexe auf der Membran zurückgehalten wird, wurden Komplexe (DNA-Konzentration von 320 ug/ml), wie in Beispiel 5a beschrieben, gemischt und PEGyliert.

Anschließend wurden die Komplexe durch eine mit BSA abgesättigte Membran filtriert und 3 mal mit je 300 ul HBS gewaschen. Die Absorption der Lösung (A260 ; (Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren) vor der Filtration (A260 vor Filtration), des Filtrates (A260 Filtrat) und der drei Waschlösungen (Wasch 1 bis Wasch 3) wurde gemessen. Fig. 6b zeigt, daß unmodifizierte Komplexe vollständig und PEGylierte Komplexe zum Großteil zurückgehalten werden.

Beispiel 6 : Effekt der PEG-Modifizierung auf den Gentransfer in Säugerzellen a) Transfektion der humanen Zellinie K562 mit PEG- modifizierten DNA/ (Tf) PEI-Komplexen Die Komplexe wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, gemischt und wie in Beispiel 2 beschrieben mit M-SPA-PEG modifiziert. Die DNA-Konzentration bei der Komplexbildung betrug 20 ug/ml, das Verhältnis von DNA

zu PEI betrug N/P 7,2. Es wurden PEI bzw. Tf-PEI Konjugate zur DNA-Komplexierung verwendet, das molare Verhältnis von Tf zu PEI im Konjugat betrug 2/1 (Tf2PEI). Das Verhältnis von PEG/PEI betrug 2,3/1 bzw.

3,7/1 und 7,4/1 (w/w) ; das entspricht einem molaren Verhältnis von 0.25 : 1,0.4 : 1 bzw 0.8 : 1.

Die Kultivierung der Zellen (ATCC CCL-243 K-562) erfolgte in RPMI 1640 Medium mit 100 iU/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin und 10 % fötalem Kälberserum (FCS). Pro Transfektionsansatz wurden 500000 Zellen in 24-well Platten (Durchmesser 22,6 mm, Costar) ausgesät.

Die Transfektion erfolgte in serumfreiem Medium. Nach vier Stunden wurde das Medium durch serumhaltiges Medium ersetzt. 24 Stunden nach Transfektionsbeginn wurden die Zellen abzentrifugiert, in 100 ul Erntepuffer geerntet (250 mM TRIS, pH 7.2,0,5 % Triton X 100), homogenisiert, zentrifugiert und je 10 ul aus dem Überstand für die Luciferaseaktivitätsbestimmung in 100 ul Probenpuffer (25 mM Glycylglycin pH 7.8,5 mM ATP, 15 mM MgCl2) verdünnt. Die Messung erfolgte nach Injektion von 100 ul Injektionspuffer (200 uM Luziferin (Sigma), 20 mM 25 mM Glycylglycin pH 7.8) in eine Berthold Lumat LB 9507, die Ergebnisse sind in Fig. 7 dargestellt. b) Transfektion einer murinen Neuroblastom-Zellinie mit PEG-modifizierten DNA/ (Tf) PEI Komplexen Die Komplexe wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, gemischt und, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit M-SPA-PEG modifiziert.

Die DNA-Konzentration bei der Komplexbildung betrug 20 ug/ml, das Verhältnis von DNA zu PEI betrug N/P 7,2.

Das Verhältnis von PEG/PEI betrug 3,5/1 bzw. 7,0/1 (w/w) ; das entspricht einem molaren Verhältnis von 0.38 : 1 bzw. 0.76 : 1.

Es wurden PEI bzw. Tf-PEI Konjugate zur DNA- Komplexierung verwendet, das molare Verhältnis von Tf zu PEI im Konjugat betrug 2/1 (Tf2PEI).

Die Kultivierung der Zellen (ATCC CCL 131 Neuro 2A) erfolgte in RPMI 1640 Medium mit 100 iU/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin und 10 % fötalem Kälberserum (FCS). Pro Transfektionsansatz wurden 300000 Zellen in 6-well Platten (Durchmesser 35 mm, Costar) ausgesät. Die Transfektion erfolgte in serumfreiem Medium. Nach vier Stunden wurde das Medium durch serumhaltiges Medium gewechselt. 24 Stunden nach Transfektionsbeginn wurden die Zellen in 100 ul Erntepuffer geerntet (250 mM TRIS, pH 7.2,0,5 % Triton X 100), homogenisiert, zentrifugiert und je 10 ul aus dem Überstand für die Luciferaseaktivitätsbestimmung in 100 ul Probenpuffer (25 mM Glycylglycin pH 7.8,5 mM ATP, 15 mM MgCl2) verdünnt. Die Messung erfolgte nach Injektion von 100 ul Injektionspuffer (200 uM Luziferin (Sigma), 20 mM 25 mM Glycylglycin pH 7.8) in eine Berthold Lumat LB 9507.

Fig. 7 und 8 zeigen, daß Modifizieren von DNA/PEI und DNA/TfPEI Komplexen den unspezifischen Gentransfer (über PEI vermittelt) stark reduziert, während der rezeptorvermittelte spezifische Gentransfer (über TfPEI vermittelt) nicht (Fig. 7) bzw. in Abhängigkeit vom Zelltyp nur geringfügig (Fig. 8) beeinträchtigt wird.

Beispiel 7 : Verringerung der unspezifischen Aufnahme der Komplexe durch P388 Mausmakrophagen durch Modifizieren der Komplexe mit PEG Die Aufnahme der Komplexe durch die Zellen wurde mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsorter (FACS) durchgeführt (FACScan, Becton Dickinson). Die

Anregungswellenlänge des Lasers betrug 488 nm. Die Fluoreszenz wurde bei 515 nm gemessen.

Die DNA-Konzentration bei der Komplexbildung betrug 320 ug/ml, der N/P-Wert 6,0. Das Verhältnis von PEG/PEI betrug 9,2 : 1 ; das entspricht einem molaren Verhältnis von 01 : 1.

Die Komplexe wurden, wie in Beispiel 5a beschrieben, gemischt und, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit M-SPA-PEG modifiziert. Die DNA wurde vor der Komplexierung mit YOY01 (1,1'- (4,4,7,7,-tetramethyl-4,7- <BR> <BR> <BR> diazaundecamethylen)-bis-4- [3-methyl-2, 3-dihydro- (benzo- 1,3-oxazol)-2-methyliden]-quinolinium tetraiodid ; Molecular Probes) in einem molaren Verhältnis von 100 : 1 (Basenpaare DNA : YOY01) markiert. Die Kultivierung der Zellen erfolgte in DMEM (Dulbeccos modified eagle medium) mit 4500 mg/ml Glucose, 100 iU/ml Penizillin, 100 ug/ml Streptomycin und 10 % fötalem Kälberserum (FCS). Pro Ansatz wurden 300000 Zellen in 35 mm Petrischalen (Falcon No 1008) ausgesät. Die Inkubation mit den Komplexen erfolgte in serumfreiem Medium bei 37°C. Nach einer Stunde wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit 5 mM EDTA in PBS geerntet.

Das Ergebnis der FACS-Analyse ist in Fig. 9 dargestellt (A : DNA/PEI +/-M-SPA-PEG 37°C, PEG/PEI 9,2/1 w/w).

B : DNA/Tf2PEI +/-M-SPA-PEG 37°C ; PEG/PEI 9,2/1 w/w).

Die X-Achse zeigt die Fluoreszenzintensität der gemessenen Zellen, die Y-Achse die Anzahl der gemessenen Ereignisse. Die FACS Daten zeigen, daß durch die PEGylierung die Bindung und Aufnahme der Komplexe an Makrophagen deutlich reduziert wird. Dies zeigt sich in der deutlich verringerten Fluoreszenz der Zellen.

Beispiel 8 : Verringerung der Wechselwirkung mit Plasmaproteinen durch Modifizieren von DNA/Tf-PEI Komplexen mit PEG Es wurden DNA/Tf2-PEI-Komplexe hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben (in Wasser gemischt), und, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit PEG modifiziert. Die DNA- Konzentration betrug 20 ug/ml, der N/P-Wert betrug 7,2.

Das Verhältnis von PEG : PEI betrug 3,5 : 1 bzw. 7,0 : 1 (w/w) ; das entspricht einem molaren Verhältnis von 0,38 : 1 bzw. 0,76 : 1. Nach der PEGylierung wurden 500 ul Komplex mit 7,2 ul Plasma bei 37°C inkubiert. Zu den in Fig. 10 angegebenen Zeitpunkten wurde die Partikelgröße mittels LLS gemessen. Es wurde festgestellt, daß unmodifizierte Komplexe nach Inkubation mit Plasma Aggregate bilden, während PEGylierte Komplexe hinsichtlich ihrer Größe nicht von verdünntem Plasma unterscheidbar waren. Da die Versuche in entionisiertem Wasser durchgeführt wurden, konnte ein etwa durch Salz hervorgerufener Effekt ausgeschlossen werden.

Beispiel 9 Herstellung von Transfektionskomplexen DNA/TfPEI-Komplexe wurden hergestellt und PEGyliert, wie in den Beispielen 1 bzw. 2 beschrieben. Standard- DNA/TfPEI-Komplexe (TfPEI-Konjugat : molares Verhältnis von ca. 4 Transferrinmolekülen, gebunden an PEI, 800 kDa) wurden mit einem N/P-Verhältnis von 6.0 bei einer DNA-Konzentration von 100 ug/ml gemischt. Die Komplexe wurden in Wasser oder 0.5 x HBS (75 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7.4) gemischt. Um Iso-Osmolarität zu gewährleisten, wurde Glukose bei einer Endkonzentration von 5 % bzw. 2.5 % (w/v) zugegeben.

PEGylierte DNA/TfPEI-Komplexe (DNA/TfPEI/PEG ; N/P 6.0, PEG/PEI 10/1 w/w, 1 h PEGylierung bei Raumtemperatur)

wurden bei einer DNA-Konzentration von 50 ug/ml gemischt. Die Komplexe wurden in Wasser, 0.3 x HBS (50 mM NaCl, 7 mM HEPES pH 7.4) oder 0.5 x HBS gemischt. Um Iso-Osmolarität zu gewährleisten, wurde Glukose bei einer Endkonzentration von 5 %, 3.3 % bzw.

2.5 % (w/v) zugegeben. Die PEGylierten DNA/TfPEI- Komplexe wurden mittels VIVA-spin-4000- Microkonzentrator auf eine DNA-Endkonzentration von 200 ug/ml konzentriert, wie in Beispiel 4 beschrieben.

Beispiel 10 PEGylierung von DNA/TfPEI-Komplexen erhöht die Beständigkeit der Komplexe im Blut nach der in vivo Anwendung a) Anwendung der Transfektionskomplexe in vivo im Tiermodell 250 ul PEGylierte Komplexe (enthaltend 50 ug DNA) oder 250 ul Standardkomplexe (enthaltend 25 ug DNA) wurden in die Schwanzvene von weiblichen A/J Mäusen (9-12 Wochen alt) injiziert. Zu den in Fig. 11 angegebenen Zeiten nach der Verabreichung der Transfektionskomplexe wurden die Tiere mittels zervikaler Dislokation getötet. Das Blut wurde in Eppendorf-Röhrchen gesammelt und sofort mit Natriumcitrat bei einer Endkonzentration von 25 mM gemischt. Das Plasma wurde von den Blutzellen durch Zentrifugation (10 min, 1000 g bei Raumtemperatur) getrennt. b) Isolierung von genomischer und Plasmid-DNA aus Blut und Plasma Die Isolierung der DNA wurde nach dem QIAamp Tissue Kit Protokol (Quiagen Cat. No. 29304) durchgeführt. Zu jedem Aliquot (100 ul) von Blut bzw. Plasma wurden

während der anfänglichen Inkubation bei 70°C 10 ul Heparin (Heparin"Novo", 1000 IE/ml, Novo Nordisk) gegeben, um die quantitative Isolierung von Plasmid-DNA zu gewährleisten (es hatte sich gezeigt, daß die Komplexe in Gegenwart von Heparin dissoziieren). c) Southern Blotting Das Agarose-Gel wurde nach Standardvorschrift (Sambrook et al., 1989) 45 min lang denaturiert (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH), mit destilliertem Wasser gewaschen und 30 min lang in 1 M Tris/1.5 M NaCl 30 min lang gespült.

Der Transfer auf Nylonmembranen (Gene Screen, DuPont, NEF983) wurde mittels Kapillartransfer in 10 x SSC vorgenommen ; die DNA wurde mittels UV-Strahlung auf die Filter quervernetzt. Die Hybridisierung und das Waschen wurde nach den Empfehlungen des DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Boehringer Mannheim ; Cat. No. 1585614) durchgeführt. Die Filter wurden 4 h lang prähybridisiert und über Nacht mit der DIG-markierten Sonde bei 42°C in 50 % Formamid, 5 x SSC, 0.1 % N-Lauroylsarcosin, 0.02 % SDS, 2 % Blockierungsreagens und 100 ug/ml Hefe-tRNA hybridisiert. Die abschließende Waschung wurde in 0.5 x SSC, 0.1 % SDS bei 68°C vorgenommen.

Die Hybridisierungssonde wurde vom Plasmid pCMVL (Plank et al., 1992) mittels DIG-Markierung nach Vorschrift des Herstellers (DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II ; Boehringer Mannheim) erhalten.

Der immunologische Nachweis wurde mit dem im Kit enthaltenen Substrat oder bevorzugt mit Vistra ECF Substrat (Amersham Cat. No. RPN5785), das in einem Phosphor Imager (Molecular Dynamics) quantitativ bestimmt werden kann, durchgeführt. Die Inkubation mit dem Vistra-Substrat wurde über Nacht durchgeführt.

Schätzung der Plasmid-DNA-Menge : auf jedes Agarose-Gel wurden unterschiedliche Mengen von pCMVL (5 ng, 500 pg, 50 pg, 5 pg bzw. 0.5 pg) geladen, um die Intensität der auf den Blots nachgewiesenen Banden direkt zu vergleichen. Die Gesamtmenge an DNA im Plasma wurde aus den erhaltenen Werten berechnet. Das Ergebnis ist in Fig. 11 dargestellt. Es zeigt, daß mit Standard- DNA/TfPEI-Komplexen (ohne PEGylierung) nach 30 min nur 1 % der injizierten DNA (ca. 300 ng) im Plasma nachweisbar ist. Zum selben Zeitpunkt können im Fall der PEGylierten DNA/TfPEI-Komplexe noch mehr als 20 % DNA (10000 ng) nachgewiesen werden. Zwei Stunden nach der Injektion kann mit PEGylierten Komplexen eine mehr als 10-fach höhere DNA-Menge (1500 ng) nachgewiesen werden als mit nicht-PEGylierten Standard- Komplexen (100 ng). In beiden Fällen ist ein Teil der DNA abgebaut. Bei Einsatz von nicht-PEGylierten Standardkomplexen mit 50 ug (statt 25 ug) DNA wurden vergleichbare Ergebnisse (0.5% DNA im Plasma) wie mit 25 ug erzielt.

Beispiel 11 Bioverteilung von PEGylierten DNA/TfPEI-Komplexen nach systemischer Verabreichung Die PEGylierten DNA/TfPEI-Komplexe wurden hergestellt, wie in Beispiel 9 beschrieben ; das verwendete Tiermodell war analog zu dem von Beispiel 10, jedoch wurden diese, sowie alle weiteren in vivo Studien in tumortragenden Mäusen durchgeführt. Dazu wurden weibliche A/J Mäuse subkutan mit 2 x 106 Neuroblastomzellen (Neuro2a, ATCC CCL 131) injiziert.

Nach zwei Wochen, als die Tumore ca. 10 bis 14 mm Größe erreicht hatten, wurden die Transfektionskomplexe in die Schwanzvene injiziert.

a) Verabreichung der Transfektionskomplexe in vivo 250 ul PEGylierte DNA/TfPEI-Komplexe (enthaltend 50 ug DNA ; N/P=4.8 oder 6) wurden in die Schwanzvene von A/J Mäusen injiziert. Einen Tag nach der Verabreichung der Transfektionskomplexe wurden die Tiere getötet und die in Fig. 12 angegebenen Gewebe entnommen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei-80°C gelagert. b) Isolierung von genomischer und Plasmid-DNA Die DNA-Isolierung wurde ähnlich wie in Beispiel 10 nach der Vorschrift des QIAamp Tissue Kit vorgenommen.

Anders als im Beispiel 10, wurde in diesem Fall kein Heparin zugegeben (der im Kit vorhandene Lysepuffer für Gewebe war ausreichend, die Komplexe zu dissoziieren).

Es wurde das genaue Gewicht der Mausorgane bestimmt.

Pro 25 mg (Milz : 10 mg) wurden 80 ul PBS/10 mM EDTA zur Homogenisierung der Gewebe in Dounce-Homogenisatoren verwendet. 100 ul Aliquots (Milz : 250 ul) wurden verwendet, um die DNA zu isolieren.

Um das Blotten der Gesamt-DNA zu erleichtern, wurde die Hälfte der eluierten DNA (1/10 der DNA aus den Mausschwänzen) mit EcoRI (Gibco BRL ; 5 h in einem Gesamtvolumen von 300 ul mit 35 Einheiten EcoRI) verdaut. Die DNA wurde daraufhin mit Ethanol gefällt, einige Stunden in 25 ul TE (4°C) gelöst und auf ein 0.8 % Agarosegel geladen.

Der Southern Blot wurde wie in Beispiel 10 durchgeführt. Die Gesamtmenge an DNA aus jedem Organ wurde unter Berücksichtigung des Gesamtgewichts des Gewebes berechnet.

Fig. 12A zeigt die Mengen von pCMVL (intakt plus teilweise abgebaut), die mittels Southern Blot Analyse in den verschiedenen Geweben nachweisbar waren.

Fig. 12B zeigt die nachweisbaren Mengen von intaktem pCMVL. Nach systemischer Verabreichung von PEGylierten DNA/TfPEI-Komplexe wurden beträchtliche Mengen an DNA in der Leber, der Milz, dem Schwanz, der Lunge sowie im Tumor gefunden (geringe Mengen wurden auch in den Nieren gefunden). Interessanterweise wurden die größten Mengen an intakter DNA im Tumor, gefolgt von Schwanz und Leber, gefunden, während der größte Anteil an Gesamt-DNA, die in anderen Organen nachgewiesen wurde, abgebaut war (Fig. 12A).

Beispiel 12 Zielgerichtete Genexpression im Tumorgewebe nach systemischer Verabreichung von PEGylierten DNA/TfPEI-Komplexen Die PEGylierten DNA/TfPEI-Komplexe wurden hergestellt, wie in Beispiel 9 beschrieben ; das verwendete Tiermodell war identisch mit dem von Beispiel 10. a) Verabreichung der Transfektionskomplexe in vivo PEGylierte DNA/TfPEI-Komplexe (enthaltend 60-80 ug DNA/200-400 ul ; N/P=6 ; Komplexe gemischt in 0.3 x oder 0.5 x HBS) oder nicht-PEGylierten Standard-DNA/TfPEI- Komplexe (enthaltend 80 ug DNA/300 ul ; N/P=6 ; Komplexe gemischt in 0.3 x oder 0.5 x HBS) wurden in die Schwanzvene von A/J Mäusen injiziert. Zwei Tage nach der Verabreichung der Transfektionskomplexe wurden die Tiere getötet und die in Fig. 13 angegebenen Gewebe entnommen. Die Gewebe wurden in einem Puffer, enthaltend 250 mM TRIS pH 7.5 mittels eines IKA- Homogenisators ("Ultraturax") homogenisiert und in

flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Proben wurden bis zum Luciferase-Assay bei-80°C gelagert. b) Luciferase-Assay Die Transfektionseffizienz wurde mittels Luciferase- Assay bestimmt. Dazu wurden Proben von homogenisiertem Gewebe drei Gefrier/Auftauzyklen unterworfen und 10 min bei 10000 g zentrifugiert, um den Niederschlag zu pelletieren. Die Luciferase-Lichteinheiten wurden unter Verwendung eines Lumat LB9501/16 (Berthold, Deutschland) aus einem Aliquot des Überstandes (50 ul) mit 10 s Integration nach automatischer Injektion der Luciferin-Lösung aufgezeichnet. Der Luciferase- Background (300-400 Lichteinheiten) wurde von jedem Wert abgezogen und die Transfektionseffizienz als relative Lichteinheiten (Relative Light Units, RLU) pro Organ/Gewebe ausgedrückt. Fig. 13 zeigt, daß mit nicht- PEGylierten Standard-DNA/TfPEI-Komplexen im Schwanz und in der Lunge eine beträchtliche Reportergenexpression stattfindet. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, daß die Komplexe entweder nahe der Injektionsstelle (Schwanz) lokalisiert bleiben oder daß sie rasch mit Plasmaproteinen aggregieren und folglich durch die Lungenkapillaren ausfiltriert werden. Die Verabreichung der Standard-Transfektionskomplexe ging mit einer schweren akuten Toxizität einher. Diese resultierte in einer ca. 50 % igen Lethalität der Mäuse, die eine Folge der Verstopfung der Lungenkapillaren durch die aggregierten Komplexe sein könnte. Im Tumor wurde nur eine äußerst niedrige Genexpression gefunden. Im Gegensatz dazu resultierte die systemische Verabreichung der PEGylierten DNA/TfPEI-Komplexe in einer beträchtlichen Reportergenexpression im Tumor und im Schwanz. In der Lunge wurde eine nur niedrige Expression nachgewiesen ; in den anderen Organen wurde überhaupt keine Expression festgestellt. Die Toxizität

war im Vergleich zu den Standardkomplexen deutlich verringert.

Beispiel 13 Messung des Zeta-Potentials : verringerte Oberflächenladung von PEGylierten DNA/TfPEI-und DNA/PEI-Komplexen 63 ug DNA in 100 ul Wasser wurden mit verschiedenen Mengen TfPEI (N/P 1.5 : 12 ug ; N/P 3.0 : 23 ug ; N/P 6.0 : 47 ug) in 100 ul komplexiert. Nach 30 min Komplexbildung wurden die Komplexe mit M-SPA-PEG5000 I (N/P 1.5 : 120 ug ; N/P 3.0 : 230 ug ; N/P 6.0 : 470 ug. Stammlösung 20 mg/ml in DMSO) PEGyliert. Nach 1 h PEGylierung wurden die Komplexe mit Wasser (MQ) auf eine End-DNA- Konzentration von 50 ug/ml verdünnt. Die Zeta- Potentialmessung wurde in fünf Serienmessungen mit einem ZetaPALS Zeta-Potential-Analysators (Brookhaven) bei einer Feldstärke von 13.9 V/cm und 10 Hz nach der von Miller et al., 1991, beschriebenen Methode vorgenommen.

Das Ergebnis der Messung, das in Fig. 14 dargestellt ist, zeigt, daß der Einbau von Transferrin in den Komplex bei N/P>3.0 die Oberflächenladung reduziert.

Außerdem führt die PEGylierung zu einer weiteren Abschirmung der Oberflächenladung von negativ und positiv geladenen Komplexen.

Beispiel 14 : Effekt der PEG-Modifizierung auf den Gentransfer in Säugerzellen a) Herstellung von kleinen bzw. großen Transfektionskomplexen Die Komplexe wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, gemischt und wie in Beispiel 2 beschrieben mit M-SPA-PEG modifiziert. 10 ug of pCMVL DNA wurden in 250 ul Puffer

mit 7.5 ug PEI (800 kDa) oder Tf-PEI Konjugat (molares Verhältnis von Tf zu PEI im Konjugat 2/1, Tf2PEI) in 250 ul Puffer gemischt. Als Puffer wurde entweder HBG (5% Glukose in 10 mM HEPES pH 7.4)-für die kleinen Komplexe-oder HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7.4)- für die großen Komplexe-verwendet. Nach 40 Minuten wurden 75ug M-SPA-PEG5000 zugesetzt und eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Als Kontrolle wurden Komplexe ohne PEG-Modifikation hergestellt. b) Transfektion der humanen Zellinie K562 mit PEG-modifizierten kleinen bzw. großen DNA/ (Tf) PEI- Komplexen Die Transfektion der K-562 Zellen (ATCC CCL-243) erfolgte in RPMI 1640 Medium mit 100 iU/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin und Anwesenheit bzw. Abwesenheit von 10 % fötalem Kälberserum (FCS). Pro Transfektionsansatz wurden 500000 Zellen in 24-well Platten (Durchmesser 22.6 mm, Costar) ausgesät. Die Transfektion erfolgte mit je 2.5 ug DNA Komplex in 125 ul (-FCS Ansatz) oder 5 ig DNA Komplex in 250 pl (+FCS Ansatz). Nach vier Stunden wurde das Medium durch serumhaltiges Medium ersetzt. 24 Stunden nach Transfektionsbeginn wurden die Zellen abzentrifugiert, in 100 ul Erntepuffer geerntet und die Luciferaseexpression bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 15 dargestellt (RLU = Relative Lichteinheiten). Die Ergebnisse zeigen, daß die PEGylierung weder bei den kleinen noch den großen DNA-Komplexen einen negativen Einfluß auf die Gentransfereffizienz hat und daß man in beiden Fällen einen wesentlich höheren Gentransfer mit PEG-Transferrin-modifizierten Komplexen erzielt.

Beispiel 15 : Effekt der PEG-Modifizierung auf den EGF-vermittelten Gentransfer in Säugerzellen a) Herstellung von EGF-PEI-Konjugaten Konjugate von Epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) mit PEI (25 kDa) wurden hergestellt durch Modifikation der Komponenten mit SPDP (Pharmacia 17-0458-01), Überführung des modifizierten PEI in die Mercaptopropionat-Form und Kopplung über Disulfidbrückenbildung, in analoger Weise wie beschrieben von Kircheis et al, 1997.

4 mg (0.67 umol) EGF (EGF1, Serotec, murin) in 1 ml 16 mM wäßrigem HEPES Puffer (pH 7.9) wurden mit 0.5 ml einer 20 mM ethanolischen h bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Anschließend wurde zwei Tage lang gegen 50% wäßriges Ethanol dialysiert (Membran mit Molekulargewichtsausschlußgrenze MWCO 1 kDa, Spectropor 7). Die Ausbeute an modifiziertem EGF betrug 3.5 mg (87%) bei einem molarem Verhältnis EGF/Pydridinyldithiopropionat von 1 : 0.8. In analoger Weise wurde aus 1 mg EGF modifiziertes EGF in einer Menge von 0.7 mg hergestellt.

Mercaptopropionat-modifiziertes PEI (10.5 mg, molares Verhältnis PEI/Pydridinyldithiopropionat von 1 : 2.8) wurde erhalten durch Modifikation von 50 mg PEI (25 kDa, Aldrich, über Pharmacia Sephadex G25 gelfiltriert, in 0.76 ml 0.25 M NaCl, als Hydrochloridform, pH 7) mit 0.39 ml einer 20 mM ethanolischen SPDP Lösung, nach einer Stunde bei Raumtemperatur gefolgt von einer Gelfiltration (Sephadex G25,10 x 300 mm Säule, Eluens 0.25 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7.3), Umsetzung eines Teils des Zwischenprodukts (20 mg PEI, enthaltend 1.45 umol Pyridinyldithiopropionat) mit 11 mg Dithiothreitol für eine Stunde unter Argon und Reinigung über Gelfiltration

(Sephadex G25,10 x 100 mm Säule, Eluens 0.25 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7.3, Argon-begast).

Pydridinyldithiopropionat-modifiziertes EGF (4.2 mg EGF, 0.56 umol Pyridinyldithiopropionat) in 2.2 ml 50% wäßrigem Ethanol wurde mit Mercaptopropionat- modifiziertem PEI (7.5 mg PEI, 0.90 umol Mercaptogruppen) in 1.1 ml 0.25 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7.3 unter Argon umgesetzt. Nach vier Tagen bei Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung durch Zugabe von 3M NaCl und Wasser auf 0.5 M NaCl und ein Gesamtvolumen von 4 ml eingestellt und mittels Ionenaustauschchromatographie (Biorad Macroprep High S, 100 x 10 mm, Puffer A : 20 mM HEPES pH 7.3 ; Puffer B : 3 M NaCl, 20 mM HEPES pH 7.3 ; Gradient 22% B bis 78% B) aufgetrennt. Die Produktfraktion (Elution zwischen 2-3 M NaCl) wurde gegen HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7.3) dialysiert und ergab ein Konjugat von 1.9 mg EGF modifiziert mit 6.35 mg PEI. Dies entspricht einem molaren Verhältnis EGF/PEI von 1.28 : 1. b) Herstellung von Transfektionskomplexen Die Komplexe wurden, analog wie in Beispiel 1 beschrieben, gemischt und, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit M-SPA-PEG modifiziert. 5 ug of pCMVL DNA wurden in 125 ul Puffer mit 3.75 ug PEI (25 kDa) als unmodifiziertes PEI (Hydrochlorid), oder als 1 : 1 (w/w) Mischung von unmodifiziertem PEI (Hydrochlorid) mit EGF-PEI (siehe a)), in 125 ul Puffer gemischt. Als Puffer wurden entweder HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7.4) oder 0.5x HBS (75 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7.4) verwendet. Nach 30 Minuten wurden 37.5 ug M-SPA-PEG5000 zugesetzt und eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Als Kontrolle wurden Komplexe ohne PEG-Modifikation hergestellt. Um Iso-Osmolarität zu

gewåhrleisten, wurde bei den 0.5 x HBS Komplexen Glukose bei einer Endkonzentration von 2.5 % (w/v) zugegeben. c) Transfektion der humanen Zellinie KB mit PEG-modifizierten DNA/ (EGF) PEI-Komplexen Pro Transfektionsansatz wurden 500000 KB Zellen (ATCC CCL-17) in T25 Flaschen (Costar) ausgesät. Die Transfektion erfolgte in je 2 ml DMEM Medium mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS) mit je 5 ug DNA Komplex in 250ul Lösung. Nach vier Stunden wurde das Medium durch weitere 2 ml an serumhaltigem Medium ergänzt.

24 Stunden nach Transfektionsbeginn wurden die Zellen geerntet und die Luciferaseexpression bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 16 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß auch bei PEGylierung der in HBS bzw 0.5 x HBS hergestellten DNA Komplexen die Gentransfereffizienz erhalten bleibt, und daß man in beiden Fällen einen wesentlich höheren Gentransfer mit EGF-modifizierten Komplexen erzielt.

Literaturliste Abdallah, B., et al., 1996, Hum Gene Ther 7 (16) : 1947-1954 Absolom, D. R., 1986, Methods Enzyme ? 132 ; 281-318 Abuchowski et al, 1984, Cancer Biochem. Biophys 7 : 175 Allen et al, 1991, Biochim Biophys Acta 1066 : 29 Beauchamp et al, 1983, Anal. Biochem 131 : 25 Bloom, H., Beier, H., Gross, H. S., 1987, Electrophoresis 8 : 93-99 Blume et al, 1990, Biochim Biophys. Acta 1029,91-7 Boussif, 0. ; Lezoualc'h, F. ; Zanta, M. A. ; Mergny, M.

D. ; Scherman, D. ; Demeneix, B. ; Behr, J. P., 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92 ; 7297-301 Boussif, 0, et al., 1996, Gene Ther 3 (12) : 1074-1080 Chamow et al, 1994, Bioconjugate Chem., 5 : 133 Chonn, A. ; Cullis, P. R. ; Devine, D. V., 1991, J Immunol 146 ; 4234-41 Chonn, A. ; Semple, S. C. ; Cullis, P. R., 1992, J Biol Chem 267 ; 18759-65 Delgado et al, 1990, Biotech. Appl. Biochem., 12 : 119 Dust et al, 1990, Macromolecules, 23 : 119 Elling et al, 1991, Biotech. Appl. Biochem. 13 : 354 Harris, J. M., et al., 1989, Polymer Preprints 30 (2) : 356 Hodgson, C. P., 1995, Biotechnology 13 ; 222-5.

Joppich et al, 1979, Macromol. Chem., 180 : 408

Kircheis, R. ; Kichler, A. ; Wallner, G. ; Kursa, M. ; Ogris, M. ; Felzmann, T. ; Buchberger, M. ; Wagner, E., 1997, Gene Therapy 4 ; 409-18 Kirpotin, et al., 1997, Biochemistry 36,66-75 Klibanov et al, 1990, FEBS Letters 268 : 235 Klibanov et al, 1991, Biochem. Biophys. Acta, 1062 : 142 Mayhew et al, 1992, Int. J. Cancer 51,1-8 Miller, J., et al., 1991, J Coll Int Sci 143 (2) Moghimi, S. M. ; Muir, I. S. ; Illum, L. ; Davis, S. S. ; Kolb Bachofen, V., 1993, Biochim Biophys Acta 1179 ; 157-65 Mori, A. ; Klibanov, A. L. ; Torchilin, V. P. ; Huang, L., 1991, FEBS Lett 284 ; 263-6 Nakamura, A., et al., 1986, J Biol. Chem 261 : 16792 Nilsson et al, 1984, Methods Enzymol., 104 : 56 Papahadjopoulos et al, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,11460-4 Pita et al, 1970, Eur. J. Biochem. 94 : 11 Plank, C., et al., 1992, Bioconjugate Chemistry 3 (6) : 533-539 Plank, C. ; Mechtler, K. ; Szoka, F. J. ; Wagner, E., 1996, Hum Gene Ther 7 : 1437-1446 Roitt, I. M. ; Brostoff, J., 1991, Male, C. K. : Kurzes Lehrbuch der Immunologie ; Thieme Verlag, 2. Auflage Sarin et al, 1981, Anal. Biochem. 117,147-57 Sambrook, J., et al., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press Senior, J. ; Delgado, C. ; Fisher, D. ; Tilcock, C. ; Gregoriadis, G., 1991, Biochim Biophys Acta 1062 ; 77-82

Stryer, 1990, Biochemie, Kapitel 31, Verlag Spektrum der Wissenschaft, Heidelberg Torchilin, V. P. ; Klibanov, A. L. ; Huang, L. ; S, 0. D. ; Nossiff, N. D. ; Khaw, B. A., 1992, Faseb J 6 ; 2716-9 Torchilin, V. P., et al., 1994, Biochim Biophys Acta 1195,, 181-184 Torchilin, V. P., und Papisov, M. I., 1994, J Liposome Res 4 (1),, 725-739 Wirth et al, 1991, Bioorg. Chem., 19 : 133 Woodle, M. C. ; Newman, M. S. ; Cohen, J. A., 1994, J Drug Target 2 ; 397-403 Yoshinaga et al, 1989, J. Bioactive Comp. Polym., 4 : 17 Yoshioka, 1991, Biomaterials 12,861-4 Zalipsky, S. und Barany, G., 1990, J Bioact Compatible Polym 5 : 227 Zalipsky, S., 1993, Bioconjugate Chemistry 4,296-299 Zalipsky, S., et al., 1997, Bioconjugate Chemistry 8, 111-118