발명의명칭:알부민이결합된， SLIT3단백질의 LRRD2를

포함하는근육질환예방또는치료용조성물 기술분야

[1] 본발명은알부민이결합된, Slit3단백질의 LRRD2를포함하는근육질환예방 또는치료용조성물에관한것으로,보다구체적� �로알부민이결합된, Slit3 단백질의 LRRD2를포함하는융합단백질,상기융합단백질을 암호화하는 핵산분자,상기핵산분자를포함하는재조합벡� �,상기재조합벡터를포함하는 형질전환체,상기형질전환체를이용한융합단� �질의제조방법,상기융합 단백질을포함하는근육질환예방또는치료용조 성물,및상기융합단백질을 포함하는 Slit3단백질의 LRRD2의생체내반감기증진용조성물을제공한다. 배경기술

[2] Slit단백질은신경계의발생과정동안에뉴런과� �손의이동을조절하는

것으로서잘알려져 있는단백질이다. Slit단백질은 Robo수용체와작용하여 생리학적활성을조절할수있으며 ,심장,폐 ,신장,유방조직등다양한조직에서 다양한세포내과정을조절하는인자로서역할을 하는것으로알려졌으며,최근 세포의생장,부착능및이동능의조절에중요한� �할이 있음이보고되면서 세포의분화과정에서의이동및암의발생과전이 과정에 Slit단백질이관여할 수있음이보고된바있다.구체적으로,척추동물� ��배아발달단계에서 Slit 단백질및 Robo단백질이발현되며, Slit3, Robol및 Robo2단백질의발현이근육 조직에서증가하는것이보고된바있다 (Neil Vargesson et. al., Mechanisms of development 106.1 (2001): 175-180).이보고에따르면, Slit3단백질은배아뒷다리 근육조직의근육모세포에서발현이증가하나,� �동능 (migration)에관여될뿐 근육모세포의분화에는관련하지않을것으로언 급하고있다.

[3] 본발명자들은 Slit3단백질의 LRRD2가근육모세포의분화를촉진시켜

근육량의증가를유도함으로써근감소증의예방 또는치료에사용할수있음을 밝힌바있다 (대한민국공개특허제 10-2017-0138920호). LRRD2는주사제로 환자가병원에내원하여투여받아야하지만,생� �내반감기가매우짧아이의 약효가발휘되기위해서는투여주기가짧아질수 밖에없고,이에따른과도한 약제사용으로효능이감소되는문제가발생할것 으로예상된다.

[4] 이에본발명자들은 LRRD2의생체내반감기를증진함으로써이의효능� �� 개선시킨 HSA-Slit3 LRRD2융합단백질 (HSA-Slit3 LRRD2 fusion protein)을 개발하고,본발명을완성하였다.

발명의상세한설명

기술적과제

[5] 본발명의목적은 Slit3단백질의 LRRD2의생체내반감기를개선시기키위한 2020/175931 1»（：1^1{2020/002809 융합단백질을제공하는것이다.

[6] 본발명의다른목적은전술한융합단백질을암호 화하는핵산분자,상기

핵산분자를포함하는재조합벡터 및상기 재조합벡터를포함하는

형질전환체를제공하는것이다.

[7] 본발명의또다른목적은전술한융합단백질의 제조방법을제공하는것이다.

[8] 본발명의다른목적은 Slit3단백질의 LRRD2의근육질환의 예방또는

치료효능을개선시킨조성물을제공하는것이다 .

[9] 본발명의다른목적은 Slit3단백질의 LRRD2의 생체내반감기를증진시킨 조성물을제공하는것이다.

과제해결수단

[1이 상술한과제를해결하기위해,본발명은알부민� � 결합된, Slit3단백질의

LRRD2의융합단백질을제공한다.

[11] 본발명의 바람직한일실시예에 따르면,상기 알부민은인간혈청

알부민 (human serum albumin)일수있다.

[12] 본발명의 바람직한또다른일실시예에 따르면,상기융합단백질은상기 인간 혈청 알부민은 Slit3단백질의 LRRD2의 N-말단에 결합된것일수있다.

[13] 본발명의 바람직한또다른일실시예에 따르면,상기 인간혈청 알부민은

서열번호 2의아미노산서열을포함할수있다.

[14] 본발명의 바람직한다른일실시예에따르면,상기 Slit3단백질의 LRRD2는 서열번호 3의아미노산서열을포함할수있다.

[15] 본발명의 바람직한또다른일실시예에 따르면,상기 알부민과 Slit3단백질의 LRRD2사이에 링커를추가로포함할수있다.

[16] 본발명의 바람직한다른일실시예에따르면,상기 링커는 (GGGGS)n

(서열번호 5)이고,여기서 n은 1내지 W의 정수일수있다.

[17] 본발명은또한,전술한융합단백질을암호화하� �핵산분자를제공한다.

[18] 본발명은또한,전술한핵산분자를포함하는재� �합벡터 및 이를포함하는 형질전환체를제공한다.

[19] 본발명은또한,전술한형질전환체를배양하는� �계를포함하는,융합

단백질의 제조방법을제공한다.

[2이 본발명은또한,전술한융합단백질을근육질환� �방또는치료용약학

조성물을제공한다.

[21] 본발명의 바람직한다른일실시예에따르면,상기 약학조성물은주사제로 투여될수있다.

[22] 본발명의 바람직한또다른일실시예에 따르면,상기근육질환은

긴장감퇴증 (atony),근위죽증 (muscular atrophy),근이영양증 (muscular dystrophy), 근무력증,악액질 (cachexia)및근감소증 (sarcopenia)으로이루어진군으로부터 선택되는어느하나이상일수있다. 2020/175931 1»（：1/10公020/002809 본발명은또한,알부민이결합된, Slit3단백질의 LRRD2를포함하는, Slit3 단백질의 LRRD2의 생체내반감기증진용조성물을제공한다.

발명의효과

24] 본발명의 알부민이결합된, Slit3단백질의 LRRD2는알부민이 결합되지 않은 Slit3단백질의 LRRD2와동일한세포학적효능을나타내고,알부민 이결합되지 않은 Slit3단백질의 LRRD2와비교하여 생체내반감기가현저하게증가되어 골 관련질환을보다효과적으로예방또는치료할수 있다.

도면의간단한설명

도 1은본발명의 알부민이 Slit3 LRRD2의 N-말단에 결합된융합단백질의 구성 및이의 아미노산서열을나타낸다.

도 2는 SP시스타틴 S-HSA-Slit3 LRRD2융합단백질을분리정제후 SDS-PAGE를시행한결과를나타낸것이다.

도 3은다양한형태의 HSA-Slit3 LRRD2융합단백질 (HSA-Slit3 LRRD2 fusion protein)의수용체결합능을그래프로나타낸것이� ��.

도 4는단식시킨수컷 ICR마우스에서 Slit3 LRRD2 (·,” Slit3”)와 HSA-Slit3 LRRD2 (■,”HSA-Slit3”)의 IV투여후 Slit3 LRRD2의 혈장농도시간프로파일을 나타낸것이다.

발명의실시를위한최선의형태

[29] 상술한바와같이, Slit3단백질의 LRRD2는근육모세포의분화를촉진시켜 근육량의증가를유도함으로써근감소증의 예방또는치료에사용할수있으나, 생체내반감기가매우짧아이의 약효가발휘되기위해서는투여주기가짧아질 수밖에 없고,이에 따른과도한약제사용으로효능이감소되는문제 가발생할 것으로예상되었다.

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231 이에,본발명자들은 LRRD2의 생체내반감기를증진함으로써 이의효능을

22222 33330735681

개선시킨 HSA-Slit3 LRRD2융합단백질 (HSA-Slit3 LRRD2 fusion protein)을 개발함으로써상술한문제의 해결방안을모색하였다.본발명의 알부민이 결합된, Slit3단백질의 LRRD2는알부민의 결합되지 않은 Slit3단백질의

LRRD2와동일한세포학적효능을나타내고,알부민 이결합되지 않은 Slit3 단백질의 LRRD2와비교하여 생체내반감기가현저하게증가되어근육관련 질환을보다효과적으로예방또는치료할수있다 .

이하,본발명을보다상세히 설명한다.

본발명은알부민이결합된, Slit3단백질의 LRRD2의융합단백질을제공한다. 본발명의융합단백질에 있어서, "Slit3단백질의 LRRD2”는 Slit3단백질내의 두번째류신풍부반복도메인 (leucine rich repeat domain, LRRD2)을말한다.본 발명자들은이전연구를통해 Slit3단백질또는이 단백질내의 LRRD2가 Robol 또는 Robo2수용체와결합하여 Slit-Robo시스템을통해근육모세포의

M-카데린 (M-caderin)에결합되어있던 (3-카테닌 ((3-catenin)을유리하여 2020/175931 1»（：1^1{2020/002809

(3-카테닌을활성화하고미오게닌 (my 미의발현을증가시켜,

근육모세포 (myoblast)의분화를유도함으로써근육형성을족� �한다는것을 확인하였다.본발명에서,용어 "Slit3 LRRD2”는 "Slit3단백질의 LRRD2”를 의미하며 ,상호호환적으로사용될수있다.

[34] 본발명의융합단백질에있어서 ,상기알부민은인간혈청알부민 (human serum albumin),래서스 (rhesus)혈청알부민 (RhSA),시노몰구스원숭이 (cynomolgous monkey)혈청알부민 (CySA),또는뮤린 (murine)혈청알부민 (MuSA)일수있고, 바람직하게는인간혈청알부민일수있다.상기 Slit3 LRRD2는인간혈청 알부민존재하에 Slit3 LRRD2의생체내반감기는인간혈청알부민부재 하에서의 Slit3 LRRD2의생체내반감기보다적어도 W배이상더길다.본 발명의구체적인일실시예에서,인간혈청알부� �존재하의 Slit3 LRRD2의혈청 반감기는인간혈청알부민부재하의 Slit3 LRRD2보다 14배더길다.

[35] 본발명에따른융합단백질은인간혈청알부민및 Slit3 LRRD2의순서로

결합되거나,그반대일수있다.바람직하게는인� ��혈청알부민및 Slit3

LRRD2의순서로결합된다.예를들어,인간혈청알� �민이 Slit3 LRRD2의 N 말단에결합하는경우, Slit3 LRRD2의생체내반감기및이의근육질환관련 효능이가장우수하며,인간혈청알부민이 C말단에결합하는경우,정도의 차이가있을수있으나유효한효능을나타낼수있 다.

[36] 본발명의융합단백질에있어서 ,상기인간혈청알부민은 609개의

아미노산으로이루어진전장또는이의일부아미 노산서열을포함하는 단편으로사용될수있다.인간혈청알부민의전� �아미노산서열은 NCBI GenBank: AAA98797.1에개시된것으로,본발명의구체적인일� ��시예에서는 609개의아미노산으로이루어진전장의인간혈청 알부민에서 25번째내지 609번째의아미노산 (585개의아미노산)으로이루어진단편의형태를

사용하였다.본발명의융합단백질에서,인간혈� ��알부민은하기서열번호 2의 아미노산서열로이루어진다:

[37] DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAK TCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLF FAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGE RAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADL AKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKD VCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADP HECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVS TPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSD RVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKK QTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLV AASQAALGL (서열번호 2). 2020/175931 1»（：1^1{2020/002809

[38] 본발명의융합단백질에 있어서 ,상기 Slit3 LRRD2는인간유래이며 , 1523개의 아미노산으로이루어진 Slit3단백질내의 LRRD2의전장또는이의일부 아미노산서열을포함하는단편으로사용될수있 다. Slit3단백질의전장 아미노산서열은 NCBI GenBank: AAQ89243.1에개시된것으로,본발명의 구체적인일실시예에서 Slit3 LRRD2는 1523개의아미노산으로이루어진전장의 Slit3단백질에서 278번째내지 486번째의아미노산 (209개의아미노산)으로 이루어진단편의형태를사용하였다.본발명의� �합단백질에서 Slit3 LRRD2는 하기서열번호 3의아미노산서열로이루어진다:

[39] ISCPSPCTCSNNIVDCRGKGLMEIPANLPEGIVEIRLEQNSIKAIPAGAFTQYKK LKRIDISKNQISDIAPDAFQGLKSLTSLVLYGNKITEIAKGLFDGLVSLQLLLLN ANKINCLRVNTFQDLQNLNLLSLYDNKLQTISKGLFAPLQSIQTLHLAQNPFVC DCHLKWLADYLQDNPIETSGARCSSPRRLANKRISQIKSKKFRCS (서열번호 3).

[4이 본발명의융합단백질에 있어서 , "Slit3 LRRD2”는서열번호 3의아미노산

서열과의기능적동등물을포함할수있다.

[41] 상기 "기능적동등물”은단백질또는펩티드의아미� �산부가,치환또는

결실로인해,본발명의서열번호 1내지 4의아미노산서열과적어도 70%이상, 바람직하게는 80%이상,보다바람직하게는 90%이상,더욱바람직하게는 95% 이상의서열상동성을갖는것으로,서열번호 1내지 4의아미노산서열로 구성된단백질또는펩티드와실질적으로동질의 생리활성을나타내는단백질 또는펩티드를말한다.

[42] 구체적으로,상기융합단백질은이의야생형아� �노산서열을갖는단백질 또는펩티드뿐만아니라이의아미노산서열변이 체또한본발명의범위에 포함될수있다.상기아미노산서열변이체란 Slit3 LRRD2의야생형아미노산 서열과하나이상의아미노산잔기가결실,삽입,� ��보존적또는보존적치환 또는이들의조합에의하여상이한서열을가지는 단백질또는펩티드를 의미한다.

[43] 분자의활성을전체적으로변경시키지않는단백 질및펩티드에서가능한

아미노산교환은당해분 ⁶ ᅵ ^: 에공지되어 있다 (H.Neurath, R丄. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).가장통상적으로일어나는교환은아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly간의 교환이다.경우에따라서는인산화 (phosphorylation),황화 (sulMion),

아세틸화 (acetylation),당화 (glycosylation),메틸화 (methylation),

파네실화 (famesylation)등으로수식 (modification)될수도있다.

[44] 본발명의 Slit3 LRRD2,또는이의변이체는천연에서추출하거나

합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963)또는 DNA서열을 기본으로하는유전자재조합방법에의해제조될 수있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 2020/175931 1»（：1/10公020/002809

1989）.

본발명의 Slit3 LRRD2는이의 생체내반감기를증진시키기 위해 ,알부민융합 이외에도 IgG의 Fc단백질융합또는페길레이션（PEGylation）등이 수행될수 있다.

[46] 본발명의융합단백질에 있어서 ,알부민과 Slit3단백질의 LRRD2사이에는 링커가추가로포함될수있다.바람직한링커의� �류로는（GGGGS）n（서열번호 5）일수있고,여기서 n은 1내지 W의 정수일수있으며,바람직하게는 n은 1내지 5의 정수일수있다.

본발명은또한, Slit3 LRRD2의 N말단에 인간혈청 알부민이 연결된형태의 융합단백질을암호화하는핵산분자를제공하며 ,추가로,상기 인간혈청 알부민의 N말단에는시스타틴 S가연결될수있다.

[48] 본발명의 핵산분자에 있어서,시스타틴 S는신호펩티드로서상기시스타틴 S를암호화하는염기서열은인간혈청 알부민을암호화하는염기서열의 5’ 말단에 연결되고,상기 인간혈청 알부민을암호화하는염기서열은 Slit3

LRRD2를암호화하는염기서열의 5’말단에 연결되어시스타틴 S-HSA-Slit3 LRRD2가생산될수있다.

본발명의 핵산분자에 있어서,상기시스타틴 S는인간유래이며, 141개의 아미노산으로이루어진전장또는이의 일부아미노산서열을암호화하는 염기서열로사용될수있다.시스타틴 S의 전장아미노산서열은 NCBI GenBank: EAX10135.1에 개시된것으로,본발명의구체적인일실시예에� �는 141개의 아미노산으로이루어진전장의시스타틴 S에서 1번째내지 20번째의

아미노산（20개의 아미노산）으로이루어진단편을암호화하는염 기서열을 사용하였다.본발명의 핵산분자에서,시스타틴 S는하기서열번호 1의 아미노산 서열을암호화하는염기서열이다.

3 ⁴⁷

55 50 ^{4 495} ] MARPLCTLLLLMATLAGALA（서열번호 1）.

본발명은또한,상기융합단백질을암호화하는� �기서열및상기 염기서열에 기능적으로연결된프로모터를포함하는재조합 벡터를제공한다.

52] 용어 "기능적으로연결된”은핵산발현조절서열（� �로모터,신호서열,또는 전사조절인자결합부위의 어레이）및이차염기서열사이가기능적으로연 결된 것을의미하고,상기발현조절서열은이차서열� �상응하는핵산의 전사 및/또는번역에 영향을준다.

본발명의 벡터시스템은문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）]에기재 ¾ ¾-o| 당업계에 잘알려진방법에 따라제조될수있다.

54] 일반적으로,벡터는클로닝또는발현의목적으� �제조될수있다.또한,벡터는 진핵또는원핵숙주세포에서사용하기위해제조 될수있다.예를들어,벡터가 원핵세포에서발현하기 위해제조된다면,전사를개시하기위한강력한 프로모터（예 , pU프로모터 , trp프로모터 , lac프로모터 , tac프로모터및 T7 2020/175931 1»（：1^1{2020/002809 프로모터 ),리보좀결합부위또는번역 개시 및전사/번역중지서열을포함한다. 특히, E. coli가숙주세포로서사용될경우, E. coli에 있는트림토판생합성을 위해프로모터 및오페론에 있는오퍼레이터 (Yanofsky, C., J. BacterioL,

158: 1018- 1024(1984))및파지 X의 왼쪽방향프로모터 (pLX프로모터 , Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가조절서열로써사용될수 있다.숙주세포로서바실러스가사용될경우,바� ��러스츄린겐시스의톡신 단백질을코딩하는유전자에 대한프로모터 (Appl. Environ. Microbiol.

64:3932-3938(1998); and Mol. Gen. Genet. 250:734-741(1996))또는바실러스에 있는다른작동가능한프로모터가조절서열로서 사용될수있다.

[55] 원핵세포에사용가능한수많은통상적인벡터들 은당업자들에게잘알려져 있고,적당한벡터의선별은선별의문제이다.본� ��명에서사용된통상적인 벡터는 pSClOl, pGVl 106, pACYC177, ColEl, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFRl, pHV14, pGEX series, pET series, pUC19,

Xgt · 4XB, X-charon, XAzl및 M13을포함하며,반드시 이에 한정되는것은아니다.

[56] 예를들어,벡터가진핵숙주세포를위해제조될� �우,그중에서도,동물세포, 표유동물세포의 게놈으로부터유래된프로모터 (예,메탈로티오네인프로모터) 또는포유동물의바이러스 (예,아데노바이러스레이트프로모터;백시니아 바이러스 7.5 K프로모터 , SV40프로모터 ,사이토메갈로바이러스프로모터 및 HSV의 tk프로모터)로부터의프로모터가사용될수있다 .벡터는일반적으로 전사체의폴리아데닐화부위를포함한다.상업� �으로이용가능한

바이러스-기초의 벡터의 예는 pcDNA 3 (Invitrogen;사이토메갈로바이러스 프로모터 및폴리아데닐화신호를포함), pSI (Promega; SV 40프로모터 및 폴리아데닐화신호포함), pCI (Promega;사이토메갈로바이러스프로모터 및 폴리아데닐화신호를포함),및 pREP7 (Invitrogen; RSV프로모터 및 SV 40 폴리아데닐화신호포함).

[57] 벡터가효모에 대해제조될경우,포스포글리세레이트키나아� � ,

글리세르알데히드- 3 -포스페이트디하이드로게나아제 ,락타아제 ,에놀라아제 및 알코올디하이드롤라아제에 대한유전자의프로모터가조절서열로서사용될 수있다.

[58] 발현벡터가식물세포에 대해제조될경우,당업계에 알려진다양한

식물체-기능적프로모터가사용될수있으며,콜� ��플라우어모자이크바이러스 (CaMV) 35S프로모터,피그워트모자이크바이러스 35S프로모터,슈가케인 바실리폼바이러스프로모터,코메리나옐로우� �틀바이러스프로모터, 리불로스- 1,5 -비스-포스페이트카르복실라아제의소단위 (ssRUBISCO)로부터의 빛-유도성프로모터,쌀사이토졸릭트리오세포� ��페이트이소머라아제 (TPI) 프로모터 ,아라비돕시스 (Arabidopsis)로부터의 아데닌

포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT)프로모터 ,쌀액틴 1유전자프로모터 및 만노핀신타아제및옥토핀신타아제프로모터를 포함한다. 2020/175931 1»（：1/10公020/002809 또한,본발명의 재조합벡터는발현된융합단백질을간편하게분 리할수있는 염기서열을포함하며 ,반드시 이에 한정되는것은아니지만글루타티온

서열로인해발현된융합단백질은빠르고간편한 방법으로친화

크로마토그래피로분리할수있다.

60] 본발명의구체적인일실시예에서는 서열을사용하였으며 ,

단백질은서열번호 4의 아미노산서열을포함한다.서열번호 4의 아미노산 서열은아래와같다:

(서열번호 4).

62] 본발명의다른일실예에 따르면,융합단백질은친화크로마토그래피에 의해 분리된다.예를들어,글루타치온 트랜스퍼라아제의경우,글루타티온을 포함하는용출완충액이사용되며,외래단백질� �빠르고간편하게분리하기 위해 6 를사용하는경우,

사용된다.

본발명의 발현벡터는형질전환된숙주를선별가능하게할 수있는하나또는 그이상의마커를포함하는것이 바람직하며,예를들어,암피실린,젠타마이신, 클로람페니콜,스트렙토마이신,카나 이신,네오마이신,제네티신및

테트라사이클린과같은항생제에 내성을갖는유전자, 1¾쇼3유전자,금속 이온과같은다른독성화합물에 저항성을가진유전자가있다.

[64] 본발명은또한,상기에기재된본발명의 재조합벡터를포함하는

형질전환체를제공한다.

[65] 형질전환체를제조하는데유용한숙주는당업계 에 잘알려져 있다.예를들어, 원핵세포숙주,及. 001/ JM109,及.이" 61그1,及. 001/ 1^1,及. ^1/ 1止392,及. ^1/ 及.

91

5 6 6 6361 0011 X 1776, ^^3110,바실러스서브틸리스,바실러스츄린겐시� ��,

살모넬라타이피뮤리움,세라티아마르센세스� �다양한슈도모나스, 코리네박테리움및스트렙토마이세스가사용될 수있다.

진핵세포에서 ,효모 (사카로마이세스세레비시애 ),곤충세포,인간세포 (예 , ^0, \V138,：81¾, 008-7, 293, HepG2, 313,요 및 MDCK세포주)및식물체 세포가사용될수있다.

[671 숙주세포의 형질전환은당업계에 알려진수많은방법에 의해수행될수있다. 예를들어,숙주세포로서,원핵세포를사용하는� ��우, 방법,핸슨방법

!、!. 산., ¾0(：. ^1:1. . 801. 9:2110-2114(1973);크 모 I)., 1. Mol. 6101., 166:557-580(1983))및전기영동이 형질전환을위해사용될수있다. 또한,숙주세포로서,진핵세포를사용하는경우, 미세주입,칼슘포스페이트 침전,전기충격,리포좀-매개의 형질감염, -덱스트란처리법,및입자 충격법이 형질전환을위해사용될수있다.또한,식물세포� ��숙주세포로서 사용될경우,아그로박테리움-매개의 형질전환이 가장바람직한방법이며,이는 2020/175931 1»（：1^1{2020/002809 원형질체로부터인접한식물체의재분화를위해 필요한우회를가능하게하기 때문이다.

[68] 본발명은또한, 쇼- 此 011102의융합단백질을생산하는방법을제공한다 . 상기방법은知）상기기재된형질전환체를발현 시키기위한조건하에서 배양하는단계;및 ）생산된융합단백질을수득하는단계를포함한 다.

[69] 본발명의융합단백질을제조하기위한형질전환 체의배양은당업계에알려진 적당한배지와배양조건에따라이루어질수있다 .이러한배양과정은

당업자라면선택되는균주에따라용이하게조정 하여사용할수있다.세포 배양은,세포의성장방식에따라현탁배양과부� �배양,배양방법에따라회분식 , 유가식및연속배양식의방법으로구분된다.배� �에사용되는배지는특정한 균주의요구조건을적절하게만족시켜야하다.

이 동물세포배양에사용하는상기배지는다양한탄 소원,질소원및미량원소 성분을포함한다.사용될수있는탄소원의 예는,포도당,자당,유당,과당, 말토오스,전분및셀룰로오스와같은탄수화물,� ��두유,해바라기유,피마자유 및코코넛유와같은지방,팔미트산,스테아린산� ��리놀레산과같은지방산, 글라이세롤및에탄올과같은알코올,그리고아� �트산과같은유기산을 포함한다.이들탄소원은단독또는조합되어사� �될수있다.사용될수있는 질소원의 예는,펩톤,효모추출물,육즙,맥아추출물,옥수� ��침지액 8니및 대두밀과같은유기질소원및요소,황산암모늄,� ��화암모늄,인산암모늄, 탄산암모늄및질산암모늄과같은무기질소원을 포함한다.이들질소원은단독 또는조합되어사용될수있다.상기배지에는인� �으로서,인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨및대응되는소둠-함유염이포� �될수있다.또한,

황산마그네슘또는황산철과같은금속염을포함 할수있다.그외에,아미노산, 비타민,및적절한전구체등이포함될수있다.

1] 배양중에수산화암모늄,수산화칼륨,암모니아, 인산및황산과같은화합물을 배양물에적절한방식으로첨가하여，배양물의 !^를조정할수있다.또한,배양 중에는지방산폴리글리콜에스테르와같은소포 제를사용하여기포생성을 억제할수있다.또한,배양물의호기상태를유지� ��기위하여 ,배양물내로산소 또는산소-함유기체（예,공기）를주입한다.배 양물의온도는보통 20°0내지 45°0 바람직하게는 25°0내지 40ᄋ（：이다.

[72] 본발명의 쇼- 此 011102의융합단백질을생산하는방법에 있어서,상기

（비단계의수득은분리된형태에있는융합단 백질을수득하기위해수행될수 있다.예를들어,융합단백질이대용량으로형질� ��환된박테리아에의해발현될 경우,일반적으로는프로모터유도후에발현되� �,그러나발현은지속되고, 단백질이불용성침전물을형성하게된다（즉,� �클루젼바디）.인클루젼바디의 분리를위한적합한몇가지프로토콜이있다.인� �루젼바디를형성한융합 단백질은적합한완충액을이용하여희석또는투 석을통해재형성될수있다. 그리고난뒤,융합단백질은암모늄설페이트,크� ��차별여과 2020/175931 1»（：1^1{2020/002809

（울트라필트레이션）및컬럼크로마토그래 피（크기,네트표면전하,소수성또는 친화도에의존）의사용에의해용해도분획화를 포함하는당업계에알려진기본 방법으로수행될수있다.

3] 본발명의융합단백질은식물체에서발현될수도 있다.식물세포의

형질전환은당업계에알려진통상적인방법에따 라수행할수있으며,전기충격, 입자충격및아그로박테리움-유도된형질전환� �따라수행될수있다.이들 중에서,아그로박테리움-유도된형질전환이가� ��바람직하다.

아그로박테리움-유도된형질전환은일반적으� �잎절편및자엽및배축과같은 다른조직을이용하여수행할수있다.

4] 형질전환된세포의선별은형질전환된배양을대 사저해제（metabolic inhibitor）, 항생제및제초제와같은선별제제에노출시킴으 로써수행할수있다.세포가 형질전환되고선별유전자에저항성을갖는마커 유전자를안정적으로

발현하면배양동안에성장및분화한다.예를들� �마커는반드시이에한정되는 것은아니지만글리코포스페이트저항성유전자 및네오마이신

포스포트랜스퍼라아제（nptll）시스템이있다. 식물원형질제또는다양한외래 물질로부터의식물체의발생또는재분화는당업 계에잘알려져있다.생산된 형질전환발근된신초는적합한식물체성장배지 에치상된다.

아그로박테리움에의해유도된외래유전자를포 함하는식물체의발생또는 재분화는당업계에알려진방법에의해수행될수 있다.

5] 본발명은알부민이결합된 Slit3단백질의 LRRD2를포함하는근육질환예방 또는치료용약학조성물을제공한다.

6] 본발명의약학조성물은경구또는비경구의여러 가지제형일수있다.상기 약학조성물을제형화할경우에는하나이상의완 충제（예를들어,식염수또는 PBS）,항산화제,정균제,킬레이트화제（예를들 어, EDTA또는글루타치온）, 충진제,증량제,결합제,아쥬반트（예를들어,� �루미늄하이드록사이드）,현탁제, 농후제습윤제,붕해제또는계면활성제,희석제� ��는부형제를사용하여조제될 수있다.

刀 경구투여를위한고형제제에는정제,환제,산제, 과립제,캡슐제등이

포함되며,이러한고형제는하나이상의화합물� �적어도하나이상의부형제 예를들면,전분（옥수수전분,밀전분,쌀전분,� �자전분등포함）,

칼슘카보네이트（calcium carbonate）,수크로스（sucrose）,락토오스（lactos e）, 덱스트로오스,솔비톨,만니톨,자일리톨,에리� �리톨말티톨,셀룰로즈,메틸 셀룰로즈,나트륨카르복시메틸셀룰로오즈및� �이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는젤라틴등을섞어조제된다.예컨대,활성성� ��을고체부형제와배합한 다음이를분쇄하고적합한보조제를첨가한후과 립혼합물로가공함으로써 정제또는당의정제를수득할수있다.

8] 또한,단순한부형제이외에스테아린산마그네� �,탈크등과같은윤활제들도 사용된다.경구투여를위한액상제제로는현탁� �,내용액제,유제또는시럽제 2020/175931 1»（：1^1{2020/002809 등이 해당되는데,흔히사용되는단순희석제인물,리� ��드파라핀이외에 여러 가지부형제,예를들면습윤제,감미제,방향제또 는보존제등이포함될수 있다.또한,경우에 따라가교결합폴리비닐피롤리돈,한천,알긴산� ��는나트륨 알기네이트등을붕해제로첨가할수있으며 ,항응집제 ,윤활제 ,습윤제 ,향료, 유화제 및방부제등을추가로포함할수있다.

P9] 비경구투여를위한제제에는멸균된수용액,비� �성용제,현탁용제，유제, 동결건조제제또는좌제등이포함된다.비수성� �제 및현탁용제로는

프로필렌글리콜 (propylene glycol),폴리에틸렌글리콜,올리브오일과같은 식물성 기름,에틸올레이트와같은주사가능한에스테� �등이사용될수있다. 좌제의 기제로는위텝솔 (witepsol),마크로골,트윈 (tween) 61,카카오지 , 라우린지,글리세롤,젤라틴등이사용될수있다.

[8이 본발명의 약학조성물은경구또는비경구로투여될수있으 며,비경구투여시 피부외용;복강내,직장,정맥,근육,피하,자궁내 경막또는뇌혈관내주사하는 주사제 ;경피투여제 ;또는비강흡입제의 형태로당업계에공지된방법에따라 제형화할수있다.

[81] 상기주사제의 경우에는반드시 멸균되어야하며 박테리아및진균과같은

미생물의오염으로부터보호되어야한다.주사� �의경우적합한담체의 예로는 이에 한정되지는않으나,물,에탄올,폴리올 (예를들어 ,글리세롤,프로필렌 글리콜및 액체폴리에틸렌글리콜등),이들의혼합물및/또 는식물유를 포함하는용매또는분산매질일수있다.보다바� �직하게는,적합한담체로는 행크스용액,링거용액,트리에탄올아민이함유� �� PBS (phosphate buffered saline)또는주사용멸균수, 10%에탄올, 40%프로필렌글리콜및 5%

덱스트로즈와같은등장용액등을사용할수있다 .상기주사제를미생물 오염으로부터보호하기위해서는파라벤,클로� �부탄올,페놀,소르빈산, 티메로살등과같은다양한항균제 및항진균제를추가로포함할수있다.또한, 상기주사제는대부분의 경우당또는나트륨클로라이드와같은등장화제 를 주가로포함할수있다.

[82] 경피투여제의 경우연고제,크림제,로션제,겔제,외용액제,파� ��타제,

리니멘트제 ,에어롤제등의 형태가포함된다.상기에서경피투여는약학 조성물을국소적으로피부에투여하여 약학조성물에함유된유효한양의 활성성분이 피부내로전달되는것을의미한다.

[83] 흡입투여제의 경우,본발명에 따라사용되는융합단백질은적합한추진제, 예를들면,디클로로플루오로메탄,트리클로로� ��루오로메탄,

디클로로테트라플루오로에탄,이산화탄소또� �다른적합한기체를사용하여 , 가압팩또는연무기로부터 에어로졸스프레이 형태로편리하게전달할수있다. 가압에어로졸의경우,투약단위는계량된양을� �달하는밸브를제공하여 결정할수있다.예를들면,흡입기또는취입기에� ��용되는젤라틴캡슐및 카트리지는화합물,및락토즈또는전분과같은� �합한분말기제의분말 2020/175931 1»（：1^1{2020/002809 혼합물을함유하도록제형화할수있다.비경구� �여용제형은모든제약화학에 일반적으로공지된처방서인문헌 (Remington’s Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에기재되어 있다.

[84] 본발명의 약학조성물은약제학적으로유효한양으로투여 한다.본발명에

있어서 ,”약제학적으로유효한양”은의학적치료에 적용가능한합리적인 수혜/위험 비율로질환을치료하기에충분한양을의미하며 ,유효용량수준은 환자의 질환의종류,중증도,약물의 활성,약물에 대한민감도,투여시간,투여 경로및배출비율,치료기간,동시사용되는약물� ��포함한요소및기타의학 분야에 잘알려진요소에따라결정될수있다.본발명의 약학조성물은개별 치료제로투여하거나다른치료제와병용하여투 여될수있고종래의

치료제와는순차적또는동시에투여될수있으며 ,단일또는다중투여될수 있다.즉,본발명의조성물의총유효량은단일투� ��량 (single dose)으로환자에게 투여될수있으며 ,다중투여량 (multiple dose)으로장기간투여되는분할치료 방법 (fractionated treatment protocol)에의해투여될수있다.상기한요소들을 모두고려하여부작용없이최소한의 양으로최대효과를얻을수있는양을 투여하는것이중요하며,이는당업자에의해용� �하게결정될수있다.

[85] 본발명의 약학조성물의투여량은환자의 체중,연령,성별,건강상태，식이, 투여시간,투여방법，배설율및질환의중증도� �따라그범위가다양하다.일일 투여량으로는,비경구투여시 HSA-Slit3 LRRD2를기준으로하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01내지 50 mg,더바람직하게는 0.1내지 30 mg의 양으로

투여되도록,그리고경구투여시는본발명의 HSA-Slit3 LRRD2를기준으로 하루에 체중 1 kg당바람직하게 0.01내지 100 mg,더바람직하게는 0.01내지 10 mg의 양으로투여되도록 1내지수회에나누어투여할수있다.그러나투여 경로,비만의중증도,성별,체중,연령등에 따라서증감될수있으므로상기 투여량이 어떠한방법으로도본발명의 범위를한정하는것은아니다.

[86] 본발명의 약학조성물은단독으로,또는수술,방사선치료, 호르몬치료,화학 치료및생물학적 반응조절제를사용하는방법들과병용하여사용 할수있다.

[87] 본발명의 약학조성물은또한외용제의 제형으로제공할수있다.본발명의 근육질환예방및치료용약학조성물을피부외용 제로사용하는경우,추가로 지방물질,유기용매,용해제,농축제 및겔화제,연화제,항산화제,현탁화제, 안정화제,발포제 (foaming agent),방향제,계면활성제,물,이온형유화제, 비이온형유화제,충전제,금속이온봉쇄제,킬레 이트화제,보존제,비타민, 차단제,습윤화제,필수오일,염료,안료,친수성� ��성제,친유성 활성제또는 지질소낭등피부외용제에통상적으로사용되는 임의의다른성분과같은피부 과학분야에서통상적으로사용되는보조제를함 유할수있다.또한상기 성분들은피부과학분야에서 일반적으로사용되는양으로도입될수있다.

[88] 본발명의근육질환예방및치료용약학조성물이 피부외용제로제공될경우, 2020/175931 1»（：1^1{2020/002809 이에 제한되는것은아니나,연고,패취,겔,크림또는� �무제등의 제형일수 있다.

[89] 본발명의근육질환은근기능저하,근육소모또� �근육퇴화로인한근육 질환으로당업계에보고된질병인것이 바람직하며,구체적으로

긴장감퇴증（atony）,근위죽증（muscular atrophy）,근이영양증（muscular dystrophy）, 근육퇴화,근무력증,악액질（cachexia）및근육� �소증（sarcopenia）으로이루어진 군으로부터선택되는어느하나이상인것이보다 바람직하나,이에 한정되지 않는다.

[9이 상기근육소모또는퇴화는선천적요인,후천적� �인,노화등을원인으로 발생하며,근육소모는근육량의 점진적손실,근육,특히 골격근또는수의근및 심장근육의 약화및퇴행을특징으로한다.

[91] 보다구체적으로,상기근육은심줄,근육,건을포 괄적으로지칭하고,근기능 또는근육기능은근육의수축에 의해힘을발휘할수있는능력을의미하며, 근육이 저항을이겨내기 위하여최대한의수축력을발휘할수있는근력 ;근육이 주어진중량에 얼마나오랫동안또는얼마나여러 번수축과이완을반복할수 있는지 나타내는능력인근지구력 ;및단시간내에강한힘을발휘하는능력인 순발력을포함한다.상기근기능은근육량에 비례하며,용어근기능개선은근 기능을보다긍정적인방향으로향상시키는것을 의미한다.

[92] 본발명은또한,알부민이결합된, Slit3단백질의 LRRD2를포함하는근육질환 예방또는개선용건강기능식품조성물을제공한 다.본발명의 건강기능식품 조성물에포함되는유효성분의구성 및 이의효과는전술한약학조성물에 대한 것과동일하므로,그기재를생략한다.

[93] 본발명에 따른건강기능식품조성물은당업계에 공지된통상적인방법에따라 다양한형태로제조할수있다.일반식품으로는� �에 한정되지 않지만 음료（알콜성 음료포함）,과실및그의가공식품（예:과일통� ��림,병조림,잼, 마아말레이드등）,어류,육류및그가공식품（� ��:햄,소시지콘비이프등）,빵류 및면류（예:우동,메밀국수,라면,스파게이트,� ��카로니등）,과즙,각종드링크, 쿠키,엿,유제품（예:버터,치이즈등）,식용식� ��유지 ,마아가린,식물성단백질, 레토르트식품,냉동식품,각종조미료（예:된장 ,간장,소스등）등에본발명의 HSA-Slit3 LRRD2융합단백질을첨가하여 제조할수있다.또한,

영양보조제로는이에 한정되지 않지만캡슐,타블렛,환등에본발명의

HSA-Slit3 LRRD2융합단백질을첨가하여 제조할수있다.또한,

건강기능식품으로는이에 한정되지 않지만예를들면,본발명의 HSA-Slit3 LRRD2융합단백질자체를차,쥬스및드링크의 형태로제조하여

음용（건강음료）할수있도록액상화,과립화,� ��슐화및분말화하여 섭취할수 있다.또한,본발명의 HSA-Slit3 LRRD2융합단백질을식품첨가제의 형태로 사용하기 위해서는분말또는농축액 형태로제조하여사용할수있다.또한,본 발명의 HSA-Slit3 LRRD2융합단백질과근육질환예방및근기능개선� ��과가 2020/175931 1»（：1^1{2020/002809 있다고알려진공지의활성성분과함께혼합하여 조성물의형태로제조할수 있다.

[94] 011102융합단백질을건강음료로이용하는경우,� �기 건강음료조성물은통상의음료와같이여러가지 향미제또는천연탄수화물 등을주가성분으로함유할수있다.상술한천연� �수화물은포도당,과당과 같은모노사카라이드;말토스,슈크로스와같은� ��사카라이드;덱스트린, 사이클로덱스트린과같은폴리사카라이드;자� �리톨,소르비톨,에리트리톨 등의당알콜일수있다.감미제는타우마틴,스테� ��아추출물과같은천연 감미제 ;사카린,아스파르탐과같은합성감미제등을사� ��할수있다.상기천연 탄수화물의비율은본발명의조성물 100 ₁₁ 止당일반적으로약 0.01~0.04 바람직하게는약 0.02-0.03은이다.

[95] 또한, 단백질은근육질환예방및근기능 개선용식품조성물의유효성분으로함유될수있 는데,그양은근육질환예방 및근기능개선용작용을달성하기에유효한양으 로특별히한정되는것은 아니나,전체조성물총중량에대하여 0.01내지 100중량%인것이바람직하다. 본발명의건강기

질환예방및근기능개선용조성물에효과가있는 것으로알려진다른활성 성분과함께혼합하여제조될수있다.

[96] 상기외에본발명의건강기능식품조성물은여러 가지영양제，비타민,전해질, 풍미제,착색제,펙트산,펙트산의염,알긴산,알� ��산의염,유기산,보호성 방부제 ,글리세린,알코올또는탄산화제 등을함유할수있다.그밖에본발명의건강식품� �천연과일주스,과일주스 음료,또는야채음료의제조를위한과육을함유� �수있다.이러한성분은 독립적으로또는혼합하여사용할수있다.이러� �첨가제의비율은크게 중요하진않지만본발명의조성물 0중량부당 0.01 ~ 0.1중량부의범위에서 선택되는것이일반적이다.

[97] 또한,본발명은 011102융합단백질을포함하는,근기능개선용

화장료조성물을제공한다.본발명의화장료조� �물에포함되는유효성분의 구성및이의효과는전술한약학조성물에대한것 과동일하므로,그기재를 생략한다.

[98] 상기화장료조성물은특히제한되는것은아니나 ,피부외용으로사용할수 있다.

[99] 단백질을유효성분으로

함유하며피부학적으로허용가능한부형제와함 께기초화장품조성물（화장수, 크림,에센스,클렌징폼및클렌징워터와같은세� ��제,팩,보디오일）,색조 화장품조성물（화운데이션,립스틱,마스카라, 메이크업베이스）,두발제품 조성물（샴푸,린스,헤어컨디셔너,헤어젤）및 비누등의형태로제조될수있다.

[100] 상기부형제로는이에한정되지는않으나예를들 어,피부연화제,피부침투 2020/175931 1»（：1^1{2020/002809 증강제,착색제,방향제,유화제,농화제및용매� �포함할수있다.또한,향료, 색소,살균제,산화방지제,방부제및보습제등을 추가로포함할수있으며 , 물성개선을목적으로점증제 ,무기염류,합성고분자물질등을포함할수있다. 예를들면,본발명의화장료조성물로세안제및� �누를제조하는경우에는 통상의세안제및비누베이스에 HSA-Slit3 LRRD2융합단백질을첨가하여 용이하게제조할수있다.크림을제조하는경우� �는일반적인

수중유적형 (0/W)의크림베이스에 HSA-Slit3 LRRD2융합단백질을첨가하여 제조할수있다.여기에향료,킬레이트제,색소,� �화방지제,방부제등과 물성개선을목적으로한단백질,미네랄,비타민� ��합성또는천연소재를 추가로첨가할수있다.

[101] 본발명의화장료조성물에함유되는 HSA-Slit3 LRRD2융합단백질의함량은 이에한정되지않지만전체조성물총중량에대하 여 0.001내지 10중량%인것이 바람직하고, 0.01내지 5중량%인것이더욱바람직하다.상기함량이 0.0이중량% 미만에서는목적하는효과를기대할수없고, W중량%초과에서는안전성또는 제형상의제조에어려움이 있을수있다.

[102] 본발명은또한,알부민이결합된, Slit3단백질의 LRRD2를포함하는근기능 개선용사료첨가물을제공한다.본발명의사료� �가물에포함되는유효성분의 구성및이의효과는전술한약학조성물에대한것 과동일하므로,그기재를 생략한다.

[103] 본발명의사료첨가물은사료관리법상의보조사 료에해당한다.

[104] 본발명에서용어,”사료”는동물이먹고,섭취� ��며,소화시키기위한또는이에 적당한임의의천연또는인공규정식 ,한끼식등또는상기한끼식의성분을 의미할수있다.

[105] 상기사료의종류는특별히제한되지아니하며,� �해기술분야에서

통상적으로사용되는사료를사용할수있다.상� �사료의비제한적인예로는, 곡물류,근과류,식품가공부산물류,조류,섬유� �류,제약부산물류,유지류, 전분류,박류또는곡물부산물류등과같은식물� �사료;단백질류,무기물류, 유지류,광물성류,단세포단백질류,동물성플랑 크톤류또는음식물등과같은 동물성사료를들수있다.이들은단독으로사용� �거나 2종이상을혼합하여 사용될수있다.

[106] 또한,상기사료첨가물은추가적으로단위동물� �허용되는담체를함유할수 있다.본발명에있어서는상기사료첨가물을그� �로또는공지의담체,안정제 등을가할수있으며，필요에따라비타민,아미� �산류,미네랄등의각종양분, 항산화제및기타의첨가제등을가할수도있으며 ,그형상으로서는분체,과립, 펠릿,현탁액등의적당한상태일수있다.본발명� ��사료첨가물을공급하는 경우는단위동물에대하여단독으로또는사료에 혼합하여공급할수있다.

[107] 본발명은또한,알부민이결합된, Slit3단백질의 LRRD2를포함하는, Slit3 단백질의 LRRD2의생체내반감기증진용조성물을제공한다. 2020/175931 1»(：1^1{2020/002809

[108] 이하,실시예를통하여본발명을더욱상세히설� �하고자한다.이들실시예는 오로지본발명을예시하기위한것으로서,본발� �의범위가이들실시예에 의해제한되는것으로해석되지않는것은당업계 에서통상의지식을가진자에 있어서자명할것이다.

[109] 하기실시예에사용된약어및이의의미는아래표 1에나타낸바와같다.

[11이 [표 1]

발명의실시를위한형태

[111] [실시예 1]

[112] HSA-S1U3 LRRD2융합단백질 (HSA-S1U3 LRRD2 fusion protein)의제조

[113] PC DNA 3.1벡터 SP시스타틴 S-HSA-Slit3 LRR D2-FLAG DNA 1.6mg/ml를 Expi293F현탁액세포에트랜스펙션시켜발현을진� ��하였다. 125ml 293F세포 현탁액에서세포를 4.5 ~ 5xl0 ⁶ 세포/ ml까지배양하고배지만새로교체한후, 엑스피펙타민 (Expifectamine) 400 _[ xl와 Opti-mem 7.5ml(A샘늘)을상온에서 5분 반응하고, DNA 150ug, Opti-mem 7.5ml(B샘플)을상온에서 5분반응후 A와 B 샘플을서로섞어 20분상온반응하여트랜스펙션을진행하였다. 24시간후, 인핸서 1과 2를섞어처리한후, 7일동안배양하였다.

[114] 7일된배양액을원심분리기 4°C 8000rpm에서 20분동안세포를침전시킨뒤에 상증액을코닝 (coming)사의 0.22 _[ xm필터로여과하여사용하였다.레진은 시그마 (Sigma)사의항- FLAG레진을사용하여진행하였다.레진을각각 1.2ml씩 사용하였으며정제는 4 ^O C 1ml/분속도에서진행하였다. TBS (Tris Glycine pH 2020/175931 1»(：1^1{2020/002809

7.4）를이용한워싱버퍼를레진의 20배로흘려넣어주었다.용출은시그마사의 FLAG펩티드 200나1와 TBS 9.8ml를섞어사용하였는데,분획（fraction）당 500 씩 8개를얻었고,단백질분획을모아버퍼를 DPBS로바꿔농축한다음,농도를 측정하였다.

[115] 도 2는상기과정으로융합단백질을분리정제후 SDS-PAGE를시행한결과를 나타낸것으로,본실시예에서제조된도 1에도시된융합단백질의크기가 75 KDa임을확인하였다.

[116] [실시예 2]

[117] 다양한형태의 HSA-S1U3 LRRD2융합단백질（HSA-S1U3 LRRD2 fusion

protein）의수용체결합능확인

[118] 2-1.다양한형태의 HSA-Slit3 LRRD2유함다백짐제조

[119] 실시예 1의제조방법을바탕으로,하기표 2와같이 12종의다양한 HSA-Slit3 LRRD2융합단백질을제조하였다.링커는（GGGGS） ₃ （서열번호 6）을

사용하였다.

[12이 [표 2]

2020/175931 1»（：1/10公020/002809

[121] 단백질의아미노산서열은표 3에

나타내었다.

2020/175931 1»(：1/10公020/002809

[122] [표 3]

2020/175931 1»（：1^1{2020/002809

[123] *상기표 3에서밑줄로표시된서열은 HSA와 LRRD2를연결하는 GS링커이며, 볼드체로표시된서열은융합단백질을최종형태 로발현시키기위해 C-말단에 부가되는서열을연결하는 GS링커이다.

[124] 2-2.다양하형태의 HSA-S1it3 LRRD2유함다백짐 rHSA-S1it3 LRRD2 fusion protein、의수용체 합능환이

[125] Slit3 LRRD2는 Robol또는 Robo2수용체와결합하여 Slit-Robo시스템을통해 근육모세포의 M-카데린에결합되어있던 (3-카테닌을방출시켜 (release)

(3-카테닌을활성화하고미오게닌의발현을증가 시킴으로써,근육모세포의 분화를유도하여근육형성을족진한다.따라서,� ��실시예에서는실시예

2-1에서제조된 12종의 HSA-Slit3 LRRD2융합단백질의수용체결합능을 확인하였다. 12종의 HSA-Slit3 LRRD2융합단백질과 Robol수용체의결합능은 ELISA시스템을사용하여정량하였다.상세한조건 은다음과같다.

[126] 12종의 HSA-Slit3 LRRD2융합단백질은분자량을고려하여웰당 0, 1, 10, 100, 1000 nM이되게 4°C에서 18시간동안 96 -웰미량정량판 (microtiter plates)

(NUNC사)에코팅하였다.코팅된물질은 0.05% Tween 20이포함된 PBS

(PBST)를사용하여 3번세척하였다.비특이적인바인딩을차단하기� ��해 1% BSA가첨가된 PBST로실온에서 2시간동안블러킹을하였다.블러킹버퍼를 제거하기위해 PBST로 3번세척하였다.세척후해당세포주로부터얻어� ��단백 30 ug을 (용해버퍼 (lysis buffer): 0.5% NP40, 50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, ImM EDTA, 0.2mM NaF, ImM Na ₃ V0 ₄ , ImM DTT, ImM PMSF,단백분해효소 억제제칵테일 (Proteinase inhibitor cocktail))실온에서 2시간동안부착시켰다. PBST를사용하여 3번세척한후 0.1% BSA로 1:1000희석시킨 Robol항체

(abeam: ab7279)를실온에서 2시간동안부착시켰다. PBST를사용하여 3번 세척한후 0.1% BSA로 1:2000희석시킨 HRP결합항체 (cell signaling: 7074)를 실온에서 2시간동안부착시켰다. PBST를사용하여 5번세척한후

TMB용액으로 37 ^O C에서 30분동안반응시켰다.상기반응을중지시키기위 해 100M의 1N H ₂ S0 ₄ 를사용하였고 450nm에서흡광도를측정하였다.

[127] 그결과,도 3에나타난바와같이 LRRD2-3과 LRRD2-6의수용체결합능이

가장우수한것으로확인되었다.

[128] [실시예 3]

[129] 마우스에서 Slit3 LRRD2및 HSA-S1U3 LRRD2융합단백질의약물동태연구

[130] 본실시예에서는실시예 2의결과를바탕으로,수용체결합능이가장우수� �� LRRD2-3를선정하여,약물동태연구를수행하였다.

[131] 약동학연구는신약개발과정중의한부분으로,� �간에따른체내의약물

농도의변화평가를통해시험약물의흡수,분포,� ��사및배설에대한정보를 2020/175931 1»（：1^1{2020/002809 얻는것을목표로한다.본실시예에서는 此 1요10 ⁾ 2-3및 1요10 ⁾ 2 융합단백질 (011102-3)의 1회정맥투여후마우스에서약물동태특성을 확인하였다.

[132] 3-1.화학물짐및용매

[133] 본실시예에서사용된카르바

구입하였고,아세토니트릴과메

구입하였다.

[134] 3-2.동물및투여조거

[135] 본실시예에서는체중 30~32.5은범위의 1이계웅성마우스 (6주령,

(주)오리엔트바이오,성남,대한민국)를사용하� ��다.마우스는실험전 4시간동안 절식하였고,투여후 4시간까지절식을유지하였다.사육장은 12시간씩명암을 주며적정온도 (20~25ᄋ 0및습도 (40~60%)를유지하였다.

[136] [표 4]

약물동태시험

[137] Slit3 LRRD2를 1 mg/mL의용량으로 PBS에녹여준비하였다. HSA-Slit3 LRRD2 (LRRD2-3)의경우,분자량을고려하여 3.5 mg/mL의용량 (Slit3 LRRD2로서 1 mg/mL)으로 PBS에녹여준비하였다.투여용량은두군모두 W mL/kg으로, 좌측미정맥을통해투여하였다.

[138] 3-3.약물동태시험

[139] 약물동태시험의경우,절식시킨마우스에 Slit3 LRRD2와 HSA-Slit3 LRRD2 (LRRD2-3)를각각 10 mg/kg및 35 mg/kg의용량으로미정맥을통해각각 투여하였다.투여후각각 0.05, 0.12, 0.33, 1, 3, 7, 10, 24, 48,및 72시간에 마우스를손으로고정한후헤파린코팅된모세관 으로우측안와정맥총에서 혈액 70ᅡ 를채혈하였다.취해진혈액은 5분간원심분리한후혈장을분리하여 분석전까지 -20 에서냉동보관하였다.

[140] 3-4.분석 방법

[141] 혈장시료중 Slit3 LRRD2의농도는 HPLC/MS/MS시스템을이용하여

정량하였다.시료전처리전,혈장시료는 Ni-NTA마그네틱비드를이용하여 정제하였다.정제된 Slit3 LRRD2및 HSA-Slit3 LRRD2 (LRRD2-3)에 6M의 요소와 18 mM의디티오트레이톨 (DTT)을가해변성시킨후, 225 mM의 요오드아세트아미드를이용하여알킬화를유도 하였다.이후,시그니처 펩타이드 (signature peptide)를얻기위해, 850 ng의재조합돼지트립신 (V5117, 2020/175931 1»(：1^1{2020/002809

Promega, Madison, WI, USA)을가해 24시간동안 37 ^O C로설정된워터배스 (water bath)에서반응시켰다.반응후생성된트림신소화 물 70 에 MeOH에용해한 3%의포름산 50 _[ 를가한후,볼텍스믹서 (vortex mixer)를이용하여 W분간 혼합시료를현탁하고 13,500 rpm에서 W분간원심분리하여상징액 160ᅡ 을 취해분석용기에옮겨이중 5ᅡ 를 HPLC/MS/MS시스템에주입하여분석을 진행하였다

[142] 상세한분석조건은다음과같다.

[143] - HPLC시스템 : Agilent 1100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)

[144] -컬럼 : ZORBAX ^® C ₈ 3.5 [xm, 2.1*50 mm (Agilent)

[145] -이동상 (Mobile phase):

[146] A:증류수에용해한 0.1%의포름산

[147] R아세토니트릴

[148] (등용매용리)

[149] , ,

시간 0 ® Q . 1 ® 1 . 0 ® 1 . 5 ® 2. 5 ® 3 ® 5

B (% ) 一 5 ® 5 ® 5 ® 95 ® 95 ® 5 ® 5

[150] -유속: 300 [xL/min-온도:컬럼에서 20°C,및자동샘플기트레이 (autosampler tray)에서 1(TC

[151] -런타임: 5분

[152] -검출:탠덤사중극자질량분석기 (API 4000, QTRAP®, A抑 lied Biosystems/ MDS SCIEX, Foster City, CA, USA)

[153] -커튼가스 (curtain gas): 20 psi

[154] -이온소스가스 l(ion source gas 1): 50 psi

[155] -이온소스가스 2(ion source gas 2): 60 psi

[156] -이온스프레이전압 (ionspray voltage): 5500 V

[157] -온도: 600°C

[158] -다중반응모니터링 (multiple-reaction-monitoring, MRM)모드:양성

[159] Silt3 LRRD2의시그니처펩타이드 (P6)의분자이온은 23V의충돌

에너지 (collision energy)에의해조각화되었으며 ,중돌가스 (collision gas)는 장비에서 'medium (8 psi)’으로설정하였다.이온의검출은 ESI양성 MRM모드로 진행하였고, P6는 m/z 587.97 ® 491.50에서정량하였다.검출피크의적분은 Analyst software version 1.4.2 (Applied Biosystems/MDS SCIEX)을이용하여 진행하였다.혈장중 Silt3 LRRD2의정량가능범위는 1니 00 ^ig/mL이었고, HSA-Silt3 LRRD2 (LRRD2-3)의경우, 3 ~ 100 ^ig/mL이었다.해당분석에서 Slit3 LRRD2는 3.29분의피크머무름시간을나타내었다.

[16이 3-5.데이터분석

[161] 시간에따른혈장중 CNC00000의농도를상기실시예 3-4에기재된 LC-MS/MS 분석법을이용하여구하고, WinNonlin ^® 4.2 (Pharsight Corp., Cary, NC, USA) 2020/175931 1»（：1^1{2020/002809 소프트웨어의 비구획적분석법 (non-compartmental analysis)으로약동학적 매개변수 (PK parameters)를계산하였다.최고농도 (C _max )와최고농도도달시간 (T m _ax )은혈중약물농도대비시간에따른곡선에� �경시적으로구하였고, 소실속도상수 (K _e )는로그스케일 (log scale)의최종단계 (terminal phase)에서 선형회귀분석을통해계산하였다.반감기 (T _1/2 )는 LN2를 K _e 로나누어구하였고, 혈중약물농도대시간곡선하면적 (AUC _q- )및혈중약물모멘트대시간 곡선하면적 (AUMCV _oo )은선형사다리꼴법 (linear trapezoidal rule)과표준면적 외삽법 (standard area extrapolation method)으로계산하였다.클리어런스 (clearance, CL)와분포용적 (steady state volume of distribution, Vss)는다음의 ［식 1］내지 ［식

3］으로계산하였다:

[162] ［식 1］

[163]

Dose

AUC _{0 -¥}

[164] [식 2]

[165]

V _ss = MRT X CL

[166] [식 3]

[167]

농도는도

4및표 5와 6에 나타내었고,약동학파라미터는표 7에 나타내었다.관련된 파라미터와모든값들은개체별로산출한후평균 으로나타내었다.시간에 따른 혈중농도패턴과동물실험 기록지를참고하여 이상이 있는개체군은데이터 분석에서 배제하였으며,데이터해석에사용된실험군은� �소 ₁₁ =3이상이 되도록하였다. 2020/175931 1»(：1^1{2020/002809

[17이 [표 5]

比3의정맥내투여후혈장농도

[171] =¾（ :정량한계미만은”0”으로처리함. ）2-3）의정맥투여후혈장농도

[173] =¾（ :정량한계미만

[174] 하기표 7에확인되는

011102대비약 14배개선된반감기를나타내었다. 2020/175931 1»(：1^1{2020/002809

［175］ ［표 7］

[176] [실시예 4]

[177] HSA-결합 Slit3 LRRD2의생체효능확인

[178] 9주령의 Balbc-nude마우스를 9주령에난소절제한후 11주령부터 4주간

알부민이결합되지않은 Slit3 LRRD2또는 HSA-Slit3 LRRD2융합단백질 (LRRD2-3)를처리하였다.각약물은하루한번,주당 5회정맥주사로 투여하였고, Slit3 LRRD2는매일 10 mg, HSA-결합 Slit3 LRRD2 (LRRD2-3)는 매일 37.13 mg (Slit3 LRRD2는매일 10 mg에해당)주사하였다.투여완료후 가자미근 (Soleus muscle)을채취하여근육무게를측정하였고,그결� ��를하기표 8에나타내었다.

[179] [표 8]

[180] * I ⁾ < 0.05, vs.너 1처리대조군

[181] 표 8에나타난바와같이,알부민이결합되지않은 81113 1^10)2와 쇼 -결합 比3 1^10)2모두가자미근의근육량을유의하게증가시 켰다.그러나 -결합 81113 1^10)2가알부민이결합되지않은 81113 1^10)2보다더강한치료효능을 보였다.

산업상이용가능성 2020/175931 1»（：1^1{2020/002809

[182] 본발명의알부민이결합된, Slit3단백질의 LRRD2는알부민이결합되지않은 Slit3단백질의 LRRD2와동일한세포학적효능을나타내고,알부민 이결합되지 않은 Slit3단백질의 LRRD2와비교하여생체내반감기가현저하게증가� ��어골 관련질환을보다효과적으로예방또는치료할수 있다.

[183]

[184] 본발명을지원한국가연구개발사업은하기와같 다.

[185] (1) [이발명을지원한국가연구개발사업]

[186] [과제고유번히 2017-1229 (HI15C0377010017)

[187] [부처명]보건복지부

[188] [연구관리전문기관]한국보건산업진흥원

[189] [연구사업명]질병중심중개중점연구

[19이 [연구과제명]골형성촉진작용을가지는거핵세� ��분비인자발굴

[191] [기여율] 75/100

[192] [주관기관]서울아산병원

[193] [연구기간] 2017.09.07 ~ 2018.09.06

[194]

[195] (2) [이발명을지원한국가연구개발사업]

[196] [과제고유번히 2013-2234 (HI 13C 1634060018)

[197] [부처명]보건복지부

[198] [연구관리전문기관]한국보건산업진흥원

[199] [연구사업명]질병중심중개중점연구

[20이 [연구과제명 ] Slit3 LRRD2의약동학연구및 Slit3 TG마우스를이용한 in vivo 독성검증

[201] [기여율] 25/100

[202] [주관기관]충남대학교산학협력단

[203] [연구기간] 2013.11.01 ~ 2019.06.30