L’invention a trait à une composition d’immunoglobulines G humaines concentrée présentant une stabilité dans le temps améliorée. La composition selon l’invention est particulièrement adaptée pour une utilisation par voie sous-cutanée.

De nombreuses pathologies sont actuellement traitées par des compositions d’immunoglobulines G (IgG). On peut citer par exemple les déficits immunitaires primitifs avec défaut de production d'anticorps, la maladie de Kawasaki, le purpura thrombopénique immunologique de l'enfant et de l'adulte, les déficits immunitaires secondaires avec défaut de production d'anticorps, en particulier la leucémie lymphoïde chronique ou myélome associés à des infections à répétition, l’infection de l'enfant par le VIH associé à des infections bactériennes, les neuropathies motrices multifocales, le syndrome de Guillain-Barré, les infections aiguës sévères ou chroniques à Parvovirus B 19, l'immunodéficience acquise ou constitutionnelle, la dermatomyosite cortico-résistante, la myasthénie aiguë, la polyradiculonévrite chronique idiopathique, le purpura thrombopénique immunologique, par exemple associé à l'infection par le VIH, le syndrome de l'homme raide (Stiffman syndrome), la neutropénie auto-immune, l’érythroblastopénie auto-immune résistante, le syndrome d'anti-coagulation acquise par auto-anticorps, la polyarthrite rhumatoïde, les uvéites, etc.

Pour le traitement de certaines pathologies, l’utilisation de compositions d’IgG aptes à l'administration sous-cutanée (IgSC) peut s’avérer particulièrement avantageuse. Cette voie d’administration offre en effet plus de flexibilité et d'indépendance aux patients, améliorant leur qualité de vie. A cette fin, des compositions d’immunoglobulines comprenant de fortes concentrations en IgG ont été développées. Cependant, il est connu que plus la concentration en IgG augmente, plus les problèmes de stabilité dans le temps augmentent. Notamment, on constate une formation plus importante d’oligomères et polymères dans de telles compositions. Les oligomères et polymères sont susceptibles d'activer le système du complément avec des risques associés de réactions anaphylactiques. Ces oligomères et polymères sont également susceptibles d’induire des phénomènes d’hypotension chez les patients traités. Ceci n’est pas souhaitable et est strictement contrôlé du point de vue règlementaire. De plus, la formation d’agrégats protéiques, due notamment à un stress thermique, mécanique ou chimique, participe à ces problèmes d’instabilité. De plus, il est connu que la présence de certains détergents classiquement utilisés pour l’administration par voie intraveineuse peut induire une réaction locale lorsqu’ils sont administrés par voie sous- cutanée.

A ce jour, les compositions d’IgG concentrées, c’est-à-dire comprenant au moins 16% d’IgG, pour administration par voie sous-cutanée ne donnent pas entière satisfaction en termes de stabilité notamment et de tolérance locale.

Dans ce contexte, les besoins en compositions d'IgG à des concentrations élevées, d’utilisation aisée, persistent.

Résumé de l’invention :

En travaillant sur les problèmes de stabilité et de tolérance propres aux compositions d'IgG concentrées pour administration par voie sous-cutanée, la Demanderesse a mis en évidence qu’il est possible d’obtenir des compositions d’IgG concentrées présentant une très bonne tolérance locale après administration par voie sous-cutanée et avantageusement particulièrement stables dans le temps. Plus précisément, la Demanderesse a mis au point une formulation combinant une concentration élevée d’IgG, à de la glycine et un détergent non- ionique, dans laquelle la glycine et le détergent non-ionique sont dans des concentrations particulièrement faibles, adaptée à une utilisation en sous-cutanée. La combinaison de détergent non-ionique et de glycine dans de telles proportions participent à une grande stabilité de ladite formulation dans le temps. De plus, la Demanderesse a mis en évidence qu’une telle formulation est particulièrement bien tolérée par les patients lors d’une administration par voie sous-cutanée. De manière avantageuse, les compositions d’immunoglobulines concentrées selon l’invention présentent une osmolalité sensiblement physiologique. Avantageusement, aucun autre excipient que la glycine et le détergent non- ionique n’est nécessaire, et notamment pas d’acétate ni de mannitol ni d’albumine, pour garantir une plus grande stabilité durant le stockage.

Un objet de l’invention est donc une composition pharmaceutique comprenant :

200 g/L +/-5% d’immunoglobulines G (IgG)

entre 200 et 250 mM de glycine

entre 15 et 25 ppm de détergent non ionique le pH de la composition étant compris entre 4,6 et 5,0.

Dans un mode de réalisation particulier, la composition est seulement constituée d’eau, d’IgG, glycine et détergent non ionique.

La composition selon l’invention comprend avantageusement 20% (200 g/L) d’IgG. D’une manière générale, dans le contexte de l’invention, les concentrations en IgG s’entendent +/- 5% de la concentration en g/L.

Selon un mode de réalisation préféré, les IgG sont des IgG humaines, notamment obtenues à partir de plasma ou de fractions plasmatiques.

Dans un mode de réalisation particulier, la concentration en glycine est de 215 mM, +/- 5%. Une telle concentration en glycine est particulièrement adaptée pour les compositions d’IgG 20% pour une utilisation en sous-cutané.

Dans un mode de réalisation particulier, le détergent non-ionique est choisi parmi les poloxamères, et notamment le Pluronic F68®, et les polysorbates, de préférence le polysorbate 20 ou le polysorbate 80, de manière encore préférée le polysorbate 80.

Préférentiellement le détergent non-ionique est à une concentration d’environ 20 ppm+/-

10% .

L’invention a également pour objet une telle composition d’IgG pour son utilisation par voie sous-cutanée pour le traitement d’un dysfonctionnement du système immunitaire, une maladie auto-immune et/ou inflammatoire, une infection ou une maladie neurologique.

Description détaillée:

Définitions

On entend par « Immunoglobulines G » ou « IgG » dans le cadre de l'invention, des immunoglobulines polyvalentes qui sont essentiellement des IgG, incluant éventuellement des IgM. Il peut s’agir d’immunoglobulines entières, ou de fragments tels que F(ab')2 ou F(ab) et toute fraction intermédiaire obtenue au cours du procédé de fabrication des immunoglobulines polyvalentes. Le terme « stabilité » correspond à la stabilité physique et/ou chimique des IgG. Le terme « stabilité physique » se réfère à la réduction ou l’absence de formation d’agrégats insolubles ou solubles des formes dimériques, oligomériques ou polymériques des Ig, ainsi qu’à la réduction ou l’absence de toute dénaturation structurale de la molécule. Le terme « stabilité chimique » se réfère à la réduction ou l’absence de toute modification chimique des IgG pendant le stockage, à l’état solide ou sous forme dissoute, dans des conditions accélérées. Par exemple, les phénomènes d’hydrolyse, déamidation, et/ou oxydation sont évités ou retardés. L’oxydation des acides aminés contenant du soufre est limitée. La stabilité d’une composition d’IgG peut s’évaluer par inspection visuelle à l’aide notamment d’un dispositif à fibre optique (opalescence, formation de particules), par mesure de la turbidité au moyen d’un spectrophotomètre mesurant l’absorbance ou densité optique à 400 nm, par exemple, et/ou par mesure de la lumière diffusée (« dynamic light scattering (DLS) ») permettant de mesurer les particules en solution de tailles comprises entre 1 nm et 1 pm environ.

Dans le contexte de l’invention, l’expression « compris entre x et y » signifie que les valeurs x et y sont incluses.

Formulations :

De préférence, la concentration en IgG est de 200 g/L, +1- 5%.

Dans le contexte de la présente invention, les concentrations s’entendent au niveau de la composition finale, prête à l’emploi. Les concentrations sont déterminées vis à vis des compositions sous forme liquide, avant dessication, ou après reconstitution sous forme de préparation injectable.

De manière particulièrement avantageuse, la Demanderesse a mis en évidence qu’il est possible d’obtenir des compositions comprenant 20% d’IgG particulièrement stables dans le temps en utilisant un minimum d’excipients. Ainsi, selon l’invention, les compositions d’IgG 20% comprennent avantageusement entre 200 et 250 mM de glycine, de manière préférée entre 200 et 230 mM, préférentiellement entre 210 et 220 mM. Dans un mode de réalisation particulier, la composition d’IgG 20% comprend 215 mM de glycine, +/- 5%.

De même, les compositions d’IgG 20% comprennent entre 15 et 25 ppm de détergent non ionique. Dans un mode de réalisation particulier, la composition d’IgG 20% comprend 20 ppm de détergent non ionique, +/- 10%. Dans un mode de réalisation, le détergent non ionique utilisé dans la composition selon l’invention est avantageusement choisi parmi les polysorbates et notamment parmi le polysorbate 80 (ou Tween®80 qui est du polyoxyéthylènesorbitanne-monooléate), et le polysorbate 20 (ou Tween®20 qui est du polyoyéthylènesorbitanne-monolaurate). Dans un autre mode de réalisation, le détergent non-ionique est choisi parmi les poloxamères, et notamment le Pluronic®F68 (polyéthylènepolypropylène glycol). Dans un autre mode de réalisation, le détergent non-ionique est choisi parmi le Triton® X 100 (octoxinol 10), les polyoxyéthylène alkyl éthers et les blocs copolymères d’éthylène/polypropylène. Les détergents non ioniques peuvent également être combinés entre eux.

Dans un mode de réalisation, la composition est dépourvue de mannitol et/ou albumine et/ou acétate. La Demanderesse a en effet montré que le mannitol et/ou l’acétate et/ou l’albumine ne sont pas nécessaires à la stabilisation d’une composition d’IgG 20%.

Selon un mode de réalisation préféré, la composition ne contient ni mannitol ni albumine. Selon un autre mode de réalisation préféré, la composition ne contient pas d’acétate. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la composition selon l’invention ne contient ni mannitol, ni acétate, ni albumine. Dans un mode de réalisation alternatif ou complémentaire, la composition ne contient pas de sucre.

De manière avantageuse, la Demanderesse a mis en évidence que les compositions selon l’invention présentent une osmolalité particulièrement adaptée à l’administration par injection, notamment sous-cutanée, et cela sans ajout en nombre et/ou quantités d’excipients. Ainsi, l’invention propose des compositions d’IgG 20% présentant une osmolalité mesurée comprise entre 300 et 400 mOsm/kg environ, ajustée par la glycine. Dans le contexte de l’invention, et sauf mention contraire, l’osmolalité de la composition s’entend de l’osmolalité mesurée dans ladite composition.

L’osmolalité est avantageusement mesurée à l’aide d’un osmomètre calibré avec des solutions étalons, et notamment selon la méthode préconisée par la Pharmacopée Européenne, (Pharmacopée Européenne 5.0 de 2005 -01/2005:2.2.35.). Bien entendu, toute autre méthode de mesure de l’osmolalité peut être utilisée.

Dans un mode de réalisation préféré, les seuls excipients de la composition d’IgG 20% selon l’invention sont la glycine et le détergent non-ionique. Une telle formulation permet une bonne stabilisation des compositions d’immunoglobulines dans le temps et une réduction des durées et des coûts de préparation à l'échelle industrielle grâce à la présence d'un nombre et d’une quantité minimums efficaces d’excipients. Avantageusement, une telle composition présente une osmolalité compatible avec l’administration par injection, en particulier par voie sous-cutanée.

Dans un mode de réalisation particulier, la composition consiste essentiellement en des IgG, de la glycine, un détergent non-ionique et de l’eau, en ce sens que tout autre excipient qui pourrait être présent ne le serait qu’à l’état de trace.

Selon l’invention, le pH final de la composition est avantageusement compris entre 4,6 et 5,0. Préférentiellement, le pH est d’environ 4,8 +/- 0,1. Un pH de 4,8 +/- 0,1 donne en effet des résultats particulièrement satisfaisants en termes de stabilité dans le temps. Le pH final s’entend du pH de la composition après formulation, c’est-à-dire dans la composition prête à l’emploi. Sauf mention contraire, dans la présente description, le pH de la composition désigne le pH final.

Une composition d’IgG préférée selon l’invention comprend :

- 200 g/L, +/- 5%, d’IgG

200 à 250 mM de glycine,

15 à 25 ppm de détergent non ionique, le pH de la composition étant compris entre 4,6 et 5,0.

Une autre composition d’IgG préférée selon l’invention comprend :

- 200 g/L, +/- 5% d’IgG

200 à 230 mM de glycine,

15 à 25 ppm de détergent non ionique, préférentiellement du polysorbate 80 ou du Pluronic F68® le pH de la composition étant compris entre 4,6 et 5,0.

Une composition d’IgG particulièrement préférée selon l’invention comprend :

200 g/L, +/- 5% d’IgG 215 mM de glycine, +/- 5%

20 ppm de détergent non ionique, +/- 10%, préférentiellement du polysorbate 80 ou du Pluronic F68®, le pH de la composition étant de 4,8 +/- 0,1.

Une autre composition d’IgG particulièrement préférée selon l’invention comprend :

- 200 g/L d’IgG

environ 215 mM de glycine

environ 20 ppm de détergent non ionique, préférentiellement du polysorbate 80 ou du Pluronic F68® le pH de la composition étant de 4,8.

L’osmolalité mesurée de cette composition à 20% d’IgG est avantageusement d’environ 300- 400 mOsm/kg, +/- 2%, de manière préférée d’environ 340 mOsm/kg, +/- 2%.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la composition selon l’invention comprend

- 200 g/L d’IgG

environ 215 mM de glycine

environ 20 ppm de détergent non ionique, préférentiellement du polysorbate 80 ou du Pluronic F68® le pH de la composition étant de 4,8, et son osmolalité étant de 340 mOsm/kg, +/- 2%, ladite composition étant dépourvue de sels d’acétate, de mannitol et d’albumine.

De manière surprenante et avantageuse, la demanderesse a mis en évidence qu’une concentration en glycine d’environ 215 mM, +/- 5% combinée à une concentration en polysorbate 80 ou Pluronic F68® de 20 ppm, est suffisante pour maintenir la stabilité de la composition d’immunoglobulines 20% dans le temps, tout en maintenant une osmolalité comprise entre 300 et 400 mOsm/kg dans la composition, alors que des concentrations supérieures auraient été attendues pour garantir la stabilité, augmentant parallèlement l’osmolalité desdites compositions. Or, une trop forte osmolalité peut être à l’origine d’une déshydratation des cellules (sortie de l’eau intracellulaire vers le milieu extracellulaire) préjudiciable au patient. Par ailleurs, l’augmentation de la quantité des excipients, et notamment des détergents non ioniques, peut entraîner une diminution de la tolérance locale de la composition administrée par voie sous-cutanée. La composition mise au point par la Demanderesse, dans laquelle le nombre et la quantité des excipients sont faibles, est donc particulièrement avantageuse pour une administration par voie sous-cutanée.

Les compositions selon l’invention comprennent avantageusement des immunoglobulines G humaines. Les IgG humaines sont généralement obtenues par fractionnement du plasma sanguin humain, et présentées dans un milieu aqueux. Le milieu aqueux est composé d'eau pour préparation injectable (eau PPI) pouvant contenir des excipients pharmaceutiquement acceptables et compatibles avec les IgG. Les compositions d'IgG peuvent au préalable subir des étapes spécifiques d'inactivation/élimination de virus, tel qu’un traitement solvant détergent, une pasteurisation et/ou une nanofiltration. La composition selon l’invention comprend des IgG qui peuvent être polyclonales ou monoclonales. Les IgG peuvent être isolées à partir du sang humain ou animal ou produites par d’autres moyens, par exemple par des techniques de biologie moléculaire, par exemple dans des systèmes cellulaires bien connus de l’homme du métier. La composition selon l’invention est particulièrement adaptée aux IgG hautement purifiées. Avantageusement, les IgG de la présente invention sont obtenues par fractionnement du plasma humain. Des méthodes de fractionnement préférées du plasma humain sont décrites par Cohn et al (J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946), Kistler et al. (Vox Sang., 7, 1962, 414-424), ou Steinbuch et al (Rev. Franç. Et. Clin et Biol., XIV, 1054, 1969). Une méthode de préparation d’une composition d’immunoglobulines G est également décrite dans la demande de brevet W02002/092632.

Les compositions selon l’invention sont avantageusement sous forme liquide.

La composition d'IgG 20% selon l’invention, sous forme liquide et après un stockage durant une période de 6 mois à 25 °C présente un taux de polymères bien inférieur au taux maximum autorisé fixés par la Pharmacopée Européenne (3%), avantageusement inférieur à environ 1%.

Les compositions de l’invention sont des compositions pharmaceutiques, c'est-à-dire adaptées à un usage thérapeutique. Les compositions pharmaceutiques de l’invention sont ainsi utiles comme médicaments, notamment pour le traitement d’un dysfonctionnement du système immunitaire, une maladie auto-immune et/ou inflammatoire, une infection ou une maladie neurologique. Les composition selon l’invention sont notamment particulièrement adaptées au traitement de troubles tels que les déficits immunitaires primitifs avec défaut de production d'anticorps, la maladie de Kawasaki, le purpura thrombopénique immunologique de l'enfant et de l'adulte, les déficits immunitaires secondaires avec défaut de production d'anticorps, en particulier la leucémie lymphoïde chronique ou myélome associés à des infections à répétition, l’infection de l'enfant par le VIH associé à des infections bactériennes, les neuropathies motrices multifocales, le syndrome de Guillain-Barré, les infections aiguës sévères ou chroniques à Parvovirus B 19, l'immunodéficience acquise ou constitutionnelle, la dermatomyosite cortico-résistante, la myasthénie aiguë, la polyradiculonévrite chronique idiopathique, le purpura thrombopénique immunologique, par exemple associé à l'infection par le VIH, le syndrome de l'homme raide (Stiffman syndrome), la neutropénie auto-immune, l’erythroblastopénie auto-immune résistante, le syndrome d'anti-coagulation acquise par auto-anticorps, la polyarthrite rhumatoïde, les uvéites. Une telle utilisation est avantageusement par injection en sous-cutané.

La composition selon l’invention est adaptée pour le traitement d’un sujet humain, quel que soit son âge, et plus particulièrement un sujet adulte, enfant ou nourrisson.

Les compositions selon l’invention peuvent être avantageusement soumises à une méthode d’élimination ou d’inactivation des agents infectieux, par exemple par traitement solvant- détergent ou par nanofiltration. De telles méthodes d’élimination ou d’inactivation des agents infectieux sont bien connues de l’homme du métier.

Voies d’administration :

La composition d'IgG 20% selon l’invention est utile en thérapie, et notamment sous forme injectable, en particulier, par voie sous-cutanée.

La voie sous-cutanée pour le traitement de maladies auto-immunes chroniques présente plusieurs avantages, comme l'amélioration du confort du patient et une diminution des effets secondaires.

L'administration sous-cutanée ne nécessite pas d'accès veineux ce qui constitue, dans certains cas, un avantage décisif lorsque l'absence d'abord veineux bloque l'accès au traitement, notamment pour les jeunes enfants. L'usage des immunoglobulines par voie sous-cutanée réduit également certains effets secondaires associés aux perfusions par voie intraveineuse, en particulier le risque de réactions systémiques. Les grandes variations de taux circulants observées par voie intraveineuse sont évitées, permettant une meilleure régulation du taux sérique dans la fourchette physiologique entre les perfusions. En dépit d'une biodisponibilité naturellement plus faible par la voie sous-cutanée, les immunoglobulines administrées par voie sous-cutanée (IgSC) ont une efficacité au moins équivalente à celle des immunoglobulines administrées par voie intraveineuse (IglV).

Enfin, la disponibilité des IgSC pour le traitement à domicile constitue un avantage important sinon décisif pour certains traitements. Elle offre plus de flexibilité et d'indépendance au patient, améliorant la qualité de vie des patients.

L'accroissement de la concentration contribue au confort du patient en réduisant la fréquence d'injection. La concentration de l'IgSC est une caractéristique déterminante qui conditionne le volume d'injection et le nombre de sites d'injection et en conséquence la fréquence d'administration.

Les exemples suivants illustrent l’invention sans en limiter la portée.

Exemples :

Exemple 1 : Etude de stress accélérée de compositions d’immunoglobulines

Une composition d’immunoglobulines G est préparée selon le procédé tel que décrit dans la demande EP1385886. Le produit obtenu est ensuite concentré à 200 g/L par ultrafiltration sur membrane en cellulose Ultracel C (Millipore®) de seuil de coupure 30 kDa afin d’obtenir le produit prêt à formuler (PPL).

Les produits concentrés à 200 g/L prêts à formuler sont additionnés de glycine, de polysorbate 80 ou de Pluronic L68® et ajustés au pH désiré afin d’obtenir les compositions suivantes : Tableau 1 : Compositions d’IgG

Les compositions sont soumises à un stress d’agitation (stirring stress) sur plaque magnétique à 440 rpm pendant 6h, les différentes analyses effectuées ensuite sont les suivantes : · Turbidité (DO à 400nm) : la turbidité est déterminée par mesure de l’absorbance à 400 nm. De l’eau pour injection est utilisée comme blanc.

Les résultats obtenus sont les suivants :

Tableau 2 : Mesure de DO à 400 nm avant et après 2h, 4h et 6h de stress d’agitation

• DLS/S LS : cette technique suit l’état d’agrégation de la solution. La DLS (dynamic light scattering) donne la mesure de la taille (diamètre hydrodynamique) des objets en solution, approximativement entre lnm et 1 mih. Chaque population de taille est ainsi suivie. La SLS (static light scattering) suit le phénomène d’agrégation dans son ensemble. La mesure est effectuée par ajout de 40 mM de NaCl à la solution. La mesure est effectuée sur échantillon dilué à 80 g/L en eau pour injection.

Les résultats obtenus sont les suivants :

Tableau 3 : Intensité des monomères à 90° (%) avant et après 2h, 4h et 6h de stress d’agitation.

Tableau 4 : Intensité totale diffusée à 90° (u.a) avant et après 2h, 4h et 6h de stress d’agitation (stirring).

Particules sub visibles (MFI) : les particules sub visibles supérieures à 2 pm, 10 pm et 25 pm sont comptées en utilisant la technique d’imagerie micro fluidique.

Les résultats obtenus sont les suivants :

Tableau 5 : Particules sub visibles mesurées par MFI avant et après 2h, 4h et 6h de stress d’agitation

L’ensemble des résultats ci-dessus permettent d’évaluer la stabilité globale des compositions qui doivent présenter des résultats satisfaisants pour l’ensemble des paramètres étudiés. Les résultats montrent que les compositions Fl, F2 et F3, avec 0 ou 10 ppm de tensioactif, présentent des résultats de stabilité globale non satisfaisants, en particulier sur la mesure de l’aggrégation (DLS) et des particules subvisibles (MFI), démontrant une faible stabilité de la composition.

Les compositions F6 et F7 comprenant 30 ppm de tensioactif présentent des résultats non satisfaisants, en particulier sur la mesure de l’aggrégation (DLS) et des particules subvisibles (MFI), démontrant une faible stabilité de la composition.

A l’inverse les compositions selon l’invention F4 et F5 comprenant 20 ppm de tensioactif permettent d’obtenir une stabilité satisfaisante sur l’ensemble des critères évalués.

Conclusion ; les résultats obtenus par différentes méthodes analytiques complémentaires démontrent qu’une concentration de 20 ppm de polysorbate 80 ou de Pluronic F68® est efficace pour assurer la stabilité de la composition d’immunoglobulines à 200 g/L en présence de 215 mM de glycine à pH 4,8. Exemple 2 : Compositions mises en stabilité long terme

Une composition d’immunoglobulines G est préparée selon le procédé tel que décrit dans la demande EP1385886. Le produit obtenu est ensuite concentré à 200 g/L par ultrafiltration sur membrane en cellulose Ultracel C (Millipore®) de seuil de coupure 30 kDa afin d’obtenir le produit prêt à formuler (PPF).

Les produits concentrés à 200 g/L prêts à formuler sont additionnés de glycine, de polysorbate 80 ou de Pluronic F68® et ajustés au pH désiré afin d’obtenir les compositions suivantes pour mise en stabilité :

Tableau 6 : Compositions d’IgG

Après filtration stérilisante sur filtre 0.22pm (Sartopore), les compositions sont réparties aseptiquement en flacons verre (type I), qui sont ensuite bouchés et entreposés, dans une enceinte régulée à

• 25°C ±2°C / humidité résiduelle 60% ±5%, ou

· 40°C ±2°C

Les différentes analyses effectuées sont les suivantes :

• Inspection visuelle : opalescence et formation de particules visibles sont déterminées par inspection visuelle effectuée avec une mireuse Pharmacopée Européenne

• pH : l’évolution du pH peut être signe de la dégradation du produit. Le pH est mesuré directement dans la solution • Concentration en protéines totales : l’absorbance à 280nm permet selon la loi de Beer- Lambert de déterminer la concentration en protéines totales dans la formulation. L’essai est effectué en triplicate, dans des microcellules UV après dilution au 1/400 en eau pour injection par pesée des échantillons. Le coefficient d’extinction moléculaire pour le produit est 1.4 L/g/cm.

• Turbidité (DO à 400 nm) : la turbidité est déterminée par mesure de l’absorbance à 400 nm. De l’eau pour injection est utilisée comme blanc.

• DLS/S LS : cette technique suit l’état d’agrégation de la solution. La DLS (dynamic light scattering) donne la mesure de la taille (diamètre hydrodynamique) des objets en solution, approximativement entre 1 nm et 1 pm. Chaque population de taille est ainsi suivie. La SLS (static light scattering) suit le phénomène d’agrégation dans son ensemble. La mesure est effectuée par ajout de 40 mM de naCl à la solution. La mesure est effectuée sur échantillon dilué à 80 g/L en eau pour injection.

• Particules sub visibles (MFI) : les particules sub visibles supérieures à 2 pm, 10 pm et 25 pm sont comptées en utilisant la technique d’imagerie micro fluidique.

• HPSEC : la chromatographie par exclusion de taille haute performance est utilisée pour évaluer le niveau de fragmentation et d’aggrégation du produit. L’analyse du chromatogramme des mesures de densité optique à 208 nm détermine le % de monomères, dimères, polymères et fragments.

Les résultats obtenus sont les suivants :

❖ Formulation Fl

Tableau 7 : Résultats de stabilité à 25°C entre T0 et Tl2mois pour la composition Fl

Tableau 8 : Résultats de stabilité à 40°C entre TO et T3mois pour la composition Fl

Formulation F2

Tableau 9 : Résultats de stabilité à 25°C entre TO et Tl2mois pour la composition F2

Tableau 10 : Résultats de stabilité à 40°C entre TO et T3mois pour la composition F2 Formulation F4

Tableau 11 : Résultats de stabilité à 25 °C à TO entre Tl2mois pour la composition F4

Tableau 12 : Résultats de stabilité à 40°C entre TO et T3mois pour la composition F4

Formulation F5

Tableau 13 : Résultats de stabilité à 25 °C entre TO et Tl2mois pour la composition F5

Tableau 14 : Résultats de stabilité à 40°C entre TO et T3mois pour la composition F5

Les tests à 40°C permettent d’accélérer les phénomènes observés lors de la mise en stabilité des compositions du fait du fort stress appliqué. Les méthodes utilisées montrent bien une évolution des critères suivis, confirmant la pertinence des méthodes sélectionnées pour l’évaluation des formulations lors du suivi de stabilité.

Les résultats de stabilité long terme montrent que les formulations Fl et F2 avec 0 ou 10 ppm de tensioactif ne permettent pas de maintenir une composition sans particules dès 25°C, démontrant que la stabilité de ces compositions n’est pas satisfaisante.

En revanche, les formulations selon l’invention F4 et F5 avec 20 ppm de tensioactif (Polysorbate 80 ou Pluronic F68) permettent de maintenir les compositions stables dans le temps.