CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con productos para el control biológico de parásitos en rumiantes. En particular, la presente invención se refiere a composiciones parasiticidas a base de estructuras reproductivas de microorganismos fúngicos con la capacidad de capturar nemátodos, y métodos de producción de dichas composiciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En ganadería, el uso de sistemas de producción doble propósito de forma intensiva se ha magnificado a nivel mundial. Esta práctica, cada vez más recurrente, ha incrementado el riesgo de contagio de enfermedades por microorganismos patógenos, lo que ha llevado a la proliferación de problemas reproductivos, la reducción en la producción diaria de leche y la pérdida de peso de los animales, pudiendo incluso en algunas ocasiones desarrollar enfermedades causantes de su muerte.

El control de nemátodos gastrointestinales se ha realizado usualmente mediante la administración de antihelmínticos químicos. Sin embargo, el uso desmedido de este tipo de productos ha ocasionado que los parásitos desarrollen resistencia, lo que ha disminuido la efectividad de su aplicación y ha llevado a que se deban administrar dosis altas con mayor frecuencia.

Así mismo, la proliferación del uso de químicos para enfrentar esta problemática ha llevado a que haya una mayor incidencia de otros inconvenientes, tal como la bioacumulación del principio activo en la carne y la leche del animal, lo que perjudica la inocuidad de los alimentos e incrementa los riesgos sanitarios. Adicionalmente, el constante uso de estos compuestos afecta negativamente el ecosistema del suelo, así como propicia cambios indeseados en la flora microbiana benéfica presente en el estiércol y en los animales.

De esta manera, en el arte se han desarrollado algunas soluciones de control biológico como alternativa al uso de antihelmínticos para garantizar la sostenibilidad de estos sistemas, asegurando la obtención de alimentos inocuos. Estos productos se obtienen a partir de estructuras reproductivas, como conidios y clamidosporas, de hongos con la capacidad de capturar nemátodos, siendo los géneros más estudiados en términos de pruebas de eficacia Duddingtonia y Arthrobotrys.

Así, de acuerdo con este tipo de desarrollos, las esporas del hongo son administradas al animal para que estas pasen por su tracto digestivo y sean expulsadas en la materia fecal. De esta manera, dichas esporas germinan y forman órganos que entrampan las larvas de los nemátodos, interrumpiendo su ciclo de vida y controlando la propagación de los parásitos en el potrero. No obstante, la naturaleza delicada de los agentes biológicos utilizados puede incidir negativamente en el resultado, ya que en este proceso dichos agentes se ven sometidos a diferentes ambientes adversos.

En efecto, las diferentes cavidades del sistema digestivo del animal, tal como la cavidad ruminal, la cavidad abomasal, y el intestino delgado, someten al hongo a ambientes químicos y biológicos diferentes en donde ciertas condiciones, tales como el pH, pueden cambiar radicalmente. De esta manera, existe en el arte la necesidad de proteger apropiadamente las esporas del hongo durante su paso por el tracto gastrointestinal del animal, sin interferir con su germinación en el momento exacto en el que se requiera; garantizando que la efectividad del hongo sea la más alta posible.

Adicionalmente, se ha evidenciado en el arte que la actividad nematófaga de las esporas disminuye gradualmente con el tiempo y es altamente dependiente de los factores ambientales, lo que no solo dificulta las labores de producción, distribución y almacenamiento, sino que reduce en muchas ocasiones el efecto parasiticida que pueda tener el hongo al ser utilizado en campo. Por consiguiente, se requiere además de medios de protección que garanticen la estabilidad del microorganismo y mitiguen el impacto negativo que puede tener el paso del tiempo y la incidencia del ambiente en su efectividad nematófaga final.

De igual manera, se conoce en el arte que la presencia de una alta carga de nemátodos en animales en periodo perinatal tiene una incidencia negativa sustancial en la salud de los animales recién nacidos, impidiendo su ganancia de peso y contribuyendo en gran medida a la mortalidad de los animales al inicio del pastoreo. De esta manera, existe también la necesidad de una composición segura que pueda ser administrada a animales en periodo de lactancia y que permita reducir el riesgo de infección en las crías, propiciando una ganancia de peso adicional en los primeros meses que mejore sus expectativas de supervivencia.

Por otra parte, a pesar de que en el arte se ha estudiado este tipo de hongos y se ha demostrado su control en ensayos in vitro, su uso a gran escala se ha visto limitado debido a la baja concentración que se obtiene en los sustratos y sistemas de fermentación empleados para su producción, dificultando así su implementación.

Es conocido en el arte que los sistemas de fermentación líquida para la producción de microorganismos presentan como gran ventaja frente a los sistemas de fermentación sólidos la facilidad de escalamiento de la producción. Sin embargo, la morfología de hongos filamentosos es muy variable, desde micelio libremente dispersado hasta pellets de biomasa agregada. Esta complejidad en la morfología es un problema típico de la fermentación en cultivos sumergidos debido a temas de fenómenos de transporte, viscosidad del medio de cultivo y productividad.

En cultivos sólidos se ha reportado que en medios deficientes en nutrientes (como agar harina de maíz) la producción de clamidosporas es escasa o en su defecto se obtienen estructuras inmaduras. Por otra parte, es conocido en el arte que la producción de clamidosporas es una respuesta ante condiciones de crecimiento desfavorables, como la deficiencia de nutrientes. En el caso de hongos predadores, se ha demostrado que la actividad biológica contra nemátodos se incrementa bajo condiciones prolongadas de inanición. Sin embargo, no existe un consenso sobre la influencia del tipo y la concentración de fuentes de carbono y de nitrógeno, sobre la producción de estructuras reproductivas de hongos filamentosos durante cultivos sumergidos.

De esta manera, existe también en el arte la necesidad de proporcionar un método de producción apropiado para la obtención de dichos hongos nematófagos, que no solo permita que la producción de composiciones nematicidas sea viable a mayor volumen, sino que además garantice que las estructuras de las esporas obtenidas sean las más apropiadas para alcanzar un control nematicida efectivo.

Así, a partir de los problemas técnicos presentados en el arte relacionados con la perdida de actividad nematófaga del microorganismo al avanzar en su paso por el tracto gastrointestinal del animal, la estabilidad limitada de las esporas durante su almacenamiento por periodos extensos de tiempo a condiciones ambientales adversas, y la efectividad que se requiere en animales en periodo de gestación para disminuir la mortalidad de las crías, existe la necesidad de una composición que proporcione estas características deseadas. Así mismo, se requiere de un proceso de producción que permita alcanzar las mejores propiedades del microorganismo y producir la composición nematicida a gran escala.

De tal manera que, si bien se ha buscado desarrollar alternativas biológicas diferentes a los antihelmínticos químicos, no existen aún composiciones o procesos como los aquí descritos que solucionen los problemas del arte previo anteriormente mencionados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una composición a base de hongos con la capacidad de capturar nemátodos, para el control de parásitos gastrointestinales en rumiantes. Esta composición comprende una emulsión de recubrimiento que potencia la capacidad del hongo de capturar nemátodos en la materia fecal de los animales al otorgarle una protección apropiada que garantiza su integridad durante su tránsito por las cavidades del tracto digestivo del animal, garantizando que el hongo germine de manera fácil y oportuna cuando se requiere y permitiéndole ejercer su actividad biocontroladora de la forma más eficiente posible.

De esta manera, en un aspecto de la invención, la composición parasiticida comprende una cantidad efectiva del microorganismo fúngico en conjunto con una emulsión de recubrimiento. Dicha emulsión comprende, en proporciones establecidas, excipientes tales como un agente de recubrimiento, un tensoactivo, un solvente y un vehículo oleoso. De esta manera, se logra también que la composición mantenga una capacidad nematicida mayor durante su almacenamiento, incluso a altas temperaturas.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir la composición a base de hongos nematófagos. Este método comprende un proceso de fermentación líquida mediante el cual es posible obtener una mayor concentración de clamidosporas en un corto periodo de tiempo, impactando significativamente y de manera favorable la productividad y posterior aplicación comercial.

En un aspecto de la invención, como parte de dicho método, se emplean medios de cultivo que comprenden ingredientes tales como glucosa, extracto de levadura, cloruro de sodio, sulfato de magnesio, talco, entre otros. Dicho medio de cultivo, con sus componentes y proporciones específicas, permite también la obtención de clamidosporas de estructura robusta con paredes gruesas en siete días.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra la actividad nematófaga obtenida para composiciones parasiticidas de acuerdo con algunas modalidades de la presente invención, en una simulación in vitro de las cavidades del tracto digestivo ruminal.

La figura 2 muestra la capacidad nematófaga obtenida para composiciones parasiticidas de acuerdo con una modalidad de la presente invención, almacenadas durante 6 meses a la temperatura de 20°C, en tres tipos de empaque. La figura 3 muestra la capacidad nematofaga obtenida para composiciones parasiticidas de acuerdo con una modalidad de la presente invención, almacenadas durante 6 meses a la temperatura de 30°C, en tres tipos de empaque.

La figura 4 muestra la capacidad nematofaga obtenida para composiciones parasiticidas de acuerdo con una modalidad de la presente invención en comparación con el hongo sin emulsión de recubrimiento, durante los primeros 210 días, a una temperatura de 20°C.

La figura 5 muestra la capacidad nematofaga obtenida para composiciones parasiticidas de acuerdo con una modalidad de la presente invención en comparación con el hongo sin emulsión de recubrimiento, durante los primeros 210 días, a una temperatura de 29°C.

La figura 6 muestra la cantidad de huevos de parásitos por gramo de material fecal obtenida en ovinos luego de administrar a los animales composiciones parasiticidas de acuerdo con algunas modalidades de la presente invención.

La figura 7 muestra el promedio de larvas en la pradera (L3/Kg) en una parcela del potrero antes del pastoreo y durante 2 ciclos de rotación, luego de administrar composiciones parasiticidas de acuerdo con una modalidad de la presente invención.

La figura 8 muestra la ganancia de peso quincenal de corderos lactantes luego de que a las madres se les administraran composiciones parasiticidas de acuerdo con algunas modalidades de la presente invención.

La figura 9 muestra el efecto del incremento de glucosa sobre la producción de clamidosporas en medios de cultivo de acuerdo con algunas modalidades de la presente invención. La figura 10 muestra el efecto de la presencia de talco sobre la producción de clamidosporas en medios de cultivo de acuerdo con algunas modalidades de la presente invención.

La figura 11 muestra el efecto de combinar condiciones de glucosa y talco para la producción de clamidosporas en medios de cultivo de acuerdo con algunas modalidades de la presente invención.

La figura 12 muestra el efecto del medio y de la escala de fermentación (Incubadora y Biorreactor) sobre la producción de clamidosporas en medios de cultivo de acuerdo con algunas modalidades de la presente invención.

La figura 13 muestra las clamidosporas tipo B (a) y tipo C (b) observadas en el medio de cultivo en biorreactor, y estructuras parecidas a pellets conformadas por micelio y clamidosporas (c), obtenidas mediante algunas modalidades del método de producción de acuerdo con la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a composiciones para el control de nemátodos gastrointestinales en rumiantes, y métodos para producir dichas composiciones.

Un primer aspecto de la invención corresponde a composiciones que comprenden un ingrediente activo en conjunto con una emulsión de recubrimiento, en donde dicha emulsión de recubrimiento permite que el ingrediente activo sobreviva, en las mejores condiciones, su paso por el tracto gastrointestinal de un animal. Además, la emulsión de recubrimiento de acuerdo con la presente invención le otorga una buena estabilidad a la composición, permitiendo que la actividad del ingrediente activo se mantenga durante varios meses, aun cuando la temperatura de almacenamiento sea considerable y/o se utilicen diferentes tipos de envases. De acuerdo con la presente invención, el ingrediente activo corresponde a cualquier microorganismo fúngico con capacidad nematicida. En efecto, cualquier género de hongos que tenga la capacidad de capturar nemátodos puede ser utilizado en la composición de acuerdo con la presente invención.

En este sentido, aunque las especies pertenecientes a estos géneros pueden presentar diferencias genéticas entre sí, estas comparten características fisiológicas, estructurales y morfológicas relacionadas con la capacidad de captura de nemátodos. Por consiguiente, la composición de la presente invención, que proporciona una emulsión de recubrimiento conveniente, puede servir a cualquier especie perteneciente a géneros que tengan esta facultad, ya que su funcionalidad depende de la capacidad de formar redes de captura; capacidad que es común a estos microorganismos. Por lo tanto, cualquier especie perteneciente a tales géneros puede ser empleada en la composición de la presente invención. No obstante, en una modalidad de la invención, el microorganismo fúngico es Duddingtonia sp o Arthrobotrys sp.

Ahora bien, la emulsión de recubrimiento desarrollada le permite al hongo nematófago atravesar en las mejores condiciones los diferentes ambientes a los que se ve sometido en su paso por el tracto gastrointestinal (tales como el rumen, el abomaso y el intestino delgado) hasta ser expulsado en la materia fecal. Una vez allí, el recubrimiento se desvanece sin impedir la efectividad del ingrediente activo, permitiéndole al microorganismo desarrollarse y crear las estructuras tridimensionales que capturan a los nemátodos; evitando así su proliferación en la pradera.

De esta manera, la aplicación de la composición de acuerdo con la presente invención reduce sustancialmente las larvas infectivas, presentando efecto contra diversos parásitos gastrointestinales, entre los que se encuentran Haemonchus contortus, Ostertagia spp., Haemonchus spp., Trichostrongylus spp., Ostertagia spp, Oesophagostomum spp., Nematodirus spp., Bunostomum spp., Coopería spp., Parascaris eguorum, Strongyloides westeri y Oxyuris egui. De acuerdo con una modalidad de la presente invención, la composición para el control de parásitos gastrointestinales en rumiantes comprende al menos 1 x 10 ³ estructuras de reproducción/g del hongo con la capacidad de capturar nemátodos. En una modalidad preferida de la invención la composición cuenta con al menos 1 x 10 ⁵ estructuras de reproducción/g de dicho hongo. Dentro de las estructuras de reproducción que pueden emplearse en la composición de la presente invención se encuentran esporas, micelio y especialmente clamisdosporas.

En otra modalidad de la invención, la composición incluye una emulsión de recubrimiento que comprende al menos un agente de recubrimiento, un tensoactivo, un solvente y/o un vehículo oleoso.

En una modalidad preferida de la invención, el agente de recubrimiento, que se encarga de brindar protección a las estructuras reproductivas del hongo frente al pH ácido del abomaso, se encuentra entre el 1 y el 15% p/p, más preferiblemente entre el 2 y el 11% p/p, y aún más preferiblemente entre el 4 y el 6% p/p, de la emulsión de recubrimiento. En otra modalidad preferida dicho agente de recubrimiento se selecciona del grupo que consiste en goma arábiga, poli (ácido metacilico -co-metil metacrilato) 1:2, copolímeros metil metacrilato, gelatina de hueso bovino (130 bloom), acetato-ftalato de celulosa, hidroxipropil metil celulosa ftalato, hidroxipropil metil celulosa acetato succionato, polivinil acetato ftalato, o combinaciones de los mismos.

En una modalidad preferida de la invención, el tensoactivo, que reduce la tensión superficial entre la fase acuosa y la fase oleosa y permite que estas se mezclen y formen una emulsión, se encuentra entre el 1 y el 20% p/p, más preferiblemente entre el 2 y el 5% p/p, de la emulsión de recubrimiento. En otra modalidad preferida dicho tensoactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 60, polisorbato 80, monooleato de sorbitan 20, monooleato de sorbitan 40, monooleato de sorbitan 60, monooleato de sorbitan 80, éter laurílico polioxietileno 30, éter laurílico polioxietileno 35, éter laurílico polioxietileno 52, éter laurílico polioxietileno 56, éter laurílico polioxietileno 58, éter laurílico polioxietileno 72, éter laurílico polioxietileno 76, éter laurilico polioxietileno 99, acido de polioxietileno 52, acido de polioxietileno 45, acido de polioxietileno 53, ácido de polioxietileno 59, o combinaciones de los mismos.

En una modalidad preferida de la invención, el solvente, que cumple la función de permitir la dispersión homogénea del agente de recubrimiento, se encuentra entre el 30 y el 90% p/p, más preferiblemente entre el 35 al 85% p/p, y aún más preferiblemente entre el 60 y el 80% p/p, de la emulsión de recubrimiento. En otra modalidad preferida dicho solvente se selecciona del grupo que consiste en una solución a base de sales de fósforo o potasio tales como fosfato ácido de sodio, fosfato ácido de potasio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, soluciones HEPES (ácido N-(2-Hidroxietil) piperazina-N-2- etano sulfónico), agua, o combinaciones de los mismos

En otra modalidad preferida de la invención, el vehículo oleoso, que se encarga de proteger a las estructuras reproductivas del hongo de procesos enzimáticos y de la acción de microorganismos encontrados en el tracto digestivo ruminal, se encuentra entre el 5 y el 30% p/p, más preferiblemente entre el 6 y el 26% p/p, y aún más preferiblemente entre el 8 y el 12 % p/p, de la emulsión de recubrimiento. En otra modalidad preferida dicho vehículo oleoso se selecciona del grupo que consiste en aceite de palma, aceite de girasol, aceite de oliva, aceite de aguacate, aceite de almendras, aceite de maní, aceite de ajonjolí, aceite de soya, cera de abejas, cera carnaúba, aceite mineral, o combinaciones de los mismos.

En una modalidad preferida de la invención, la emulsión de recubrimiento puede comprender además un regulador de pH, este componente contribuye a que el agente de recubrimiento se disuelva oportunamente, manteniendo el pH en el rango apropiado. El regulador de pH se encuentra entre el 1 al 5% p/p, más preferiblemente entre el 1 al 3% p/p, de la emulsión de recubrimiento. En otra modalidad preferida dicho regulador de pH se selecciona del grupo que consiste en hidróxido de sodio 6N, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, o combinaciones de los mismos.

En otra modalidad preferida de la invención, la emulsión de recubrimiento puede comprender además un cosolvente. Dicho cosolvente disminuye la viscosidad de la dispersion del agente de recubrimiento, facilitando su aplicación, y se encuentra entre el 0,1 a 40% p/p, más preferiblemente entre el 0,3 a 10% p/p, y aún más preferiblemente entre el 0,5 a 3% p/p, de la emulsión de recubrimiento. En otra modalidad preferida dicho cosolvente se selecciona del grupo que consiste en etanol 96%, alcohol isopropílico, butanol, metanol, acetona, tolueno, cloroformo, o combinaciones de los mismos.

En otra modalidad preferida de la invención, la emulsión de recubrimiento puede comprender además un plastificante, este excipiente evita la ruptura del recubrimiento, mejorando su elongación y flexibilidad, y favorece la adherencia del agente de recubrimiento. Dicho plastificante se encuentra entre el 0,1 a 10% p/p, más preferiblemente entre el 0,2 a 5% p/p, y aún más preferiblemente entre el 0,5 a 1,5% p/p, de la emulsión de recubrimiento. En otra modalidad preferida dicho plastificante se selecciona del grupo que consiste en trietil citrato, ácido oleico, glicerina, triacetina, polietilenglicol (PEG) 300, polietilenglicol (PEG) 400, polietilenglicol (PEG) 600, polietilenglicol (PEG) 1450, polietilenglicol (PEG) 3350, polietilenglicol (PEG) 8000, o combinaciones de los mismos.

En otra modalidad preferida de la invención, la emulsión de recubrimiento puede comprender además un diluyente sólido. Dicho diluyente sólido aumenta la concentración de sólidos en la formulación de recubrimiento, permitiendo crear una capa de mayor grosor. Este excipiente se encuentra entre el 3 al 25% p/p, más preferiblemente entre el 5 a 20% p/p, y aún más preferiblemente entre el 7 al 13% p/p, de la emulsión de recubrimiento. En otra modalidad preferida dicho diluyente sólido se selecciona del grupo que consiste en caolín, proteína aislada de soya, proteína del suero de la leche, caseína, talco, almidón de maíz, almidón de yuca, almidón de plátano, harina de soya, o combinaciones de los mismos.

En otra modalidad preferida de la invención, la emulsión de recubrimiento puede comprender además un protector enzimático y microbiológico, el cual evita la acción de enzimas digestivas o de microorganismos en las estructuras reproductivas del hongo. Dicho protector enzimático y microbiológico se encuentra entre el 8 al 22% p/p, más preferiblemente entre el 10 a 20% p/p, de la emulsión de recubrimiento. En otra modalidad preferida dicho protector enzimático y microbiológico se selecciona del grupo que consiste en carbonato de calcio, hidróxido de calcio, o combinaciones de los mismos.

Adicionalmente, la composición de acuerdo con la presente invención puede estar en forma de granulado, granulado dispersable, polvo, polvo dispersable, capsulas, tabletas o pellets. En una modalidad preferida de la invención, la composición se encuentra en forma de gránulos con tamaño de partícula entre 100 y 6000 pm, y gravedad específica entre 0,1 y 2, los cuales se pueden mezclar fácilmente con el alimento del animal de tal forma que este no perciba cambios en su alimentación, y que su paso por el tracto digestivo sea lo más rápido posible. En otra modalidad de la invención, la composición puede ser una formulación líquida como una suspensión o una emulsión.

De esta manera, a partir de las modalidades descritas anteriormente, se obtiene una composición que comprende una emulsión de recubrimiento que brinda una capacidad nematófaga superior, al permitir que el ingrediente activo pueda soportar en mejores condiciones su paso por el tracto gastrointestinal. En efecto, las composiciones de acuerdo con la presente invención alcanzan, en promedio, un porcentaje de nematofagia del 89,2%.

Así pues, esta capacidad nematófaga logra que, mediante la administración de la composición de acuerdo con la presente invención, se disminuya hasta un 94% el número de larvas que se encuentran en el potrero. Esto permite que su administración, en conjunto con otras estrategias como pastoreo rotacional y buena nutrición, pueda llegar a eliminar la presencia de nemátodos en la pradera. Lo anterior favorece además la ganancia en peso de animales lactantes, para lo cual la composición consigue un incremento de hasta el 83%.

Adicionalmente, las modalidades de composición de acuerdo con la presente invención obtienen una mejor estabilidad, lo que le permite a la composición mantener su efectividad en condiciones de almacenamiento prolongadas, incluso a temperaturas adversas. De esta manera, composiciones de acuerdo con la presente invención pueden mantener una actividad nematófaga superior al 85% incluso cuando son almacenadas por 6 meses a una temperatura de 30°C.

Igualmente, la composición de acuerdo con la presente invención permite que el efecto controlador del hongo persista en el campo incluso un mes después de suspender su administración. Así mismo, por la naturaleza de los excipientes utilizados y al ser un producto biológico, a diferencia de los antihelmínticos, este no tiene tiempo de retiro y no genera residuos en la carne o la leche del animal, favoreciendo toda la cadena productiva.

Por otra parte, un segundo aspecto de la invención corresponde a métodos para producir la composición para el control de nemátodos gastrointestinales, descrita anteriormente. En particular, se ha desarrollado un proceso que emplea un sistema de fermentación líquida que permite alcanzar una buena concentración de clamidosporas en un menor tiempo, obteniendo además clamidosporas de estructura robusta con paredes gruesas.

De esta manera, el método para producir la composición descrita comprende los pasos de: a) producir un hongo con la capacidad de capturar nemátodos mediante fermentación líquida empleando un medio de cultivo que comprende glucosa y talco, y b) adicionar una emulsión de recubrimiento que comprende al menos un agente de recubrimiento, un tensoactivo, un solvente y un vehículo oleoso.

En una modalidad de la invención, la biomasa obtenida en el paso a) es separada y concentrada para formar un granulado con una humedad entre el 3% y el 30%, y la adición de la emulsión de recubrimiento del paso b) se realiza recubriendo dicho granulado. En otra modalidad de la invención la adición de la emulsion de recubrimiento del paso b) se realiza mezclando dicha emulsión directamente sobre la biomasa obtenida en el paso a), y dicha mezcla se deja secar posteriormente hasta obtener una humedad entre el 3 y el 30%.

En una modalidad preferida de la invención, la concentración de glucosa en el medio de cultivo es de 10 a 70 g/L, más preferiblemente entre 20 y 40 g/L.

En otra modalidad preferida de la invención, la concentración de talco en el medio de cultivo es de 4 a 30 g/L, más preferiblemente de 15 a 25 g/L.

En otra modalidad de la invención, el medio de cultivo empleado en la producción del hongo mediante fermentación líquida puede además comprender extracto de levadura, sulfato de magnesio y cloruro de calcio.

En una modalidad preferida de la invención, la concentración del extracto de levadura en el medio de cultivo es de 1 a 5 g/L, más preferiblemente entre 1,5 y 3 g/L.

En otra modalidad preferida de la invención, la concentración del sulfato de magnesio en el medio de cultivo es de 0,1 a 2 g/L, más preferiblemente entre 0,1 y 0,9 g/L.

En otra modalidad preferida de la invención, la concentración del cloruro de calcio en el medio de cultivo es de 0,1 a 2 g/L, más preferiblemente entre 0,1 y 0,9 g/L.

En otra modalidad de la invención, el medio de cultivo empleado en la producción del hongo mediante fermentación líquida puede comprender además fosfato ácido de potasio en una concentración de 0,5 a 3 g/L, sulfato de amonio en una concentración de 0,5 a 3 g/L, cloruro de sodio en una concentración de 5 a 40 g/L, cloruro de potasio en una concentración de 5 a 40 g/L, sacarosa en una concentración de 0,1 a 2 g/L y/o fructosa en una concentración de 0,2 a 2 g/L. Adicionalmente, en una modalidad del método, se mantiene durante el proceso un pH de 5 a 7, una temperatura de 28°C, agitación de 150 rpm y flujo de aire de 1 vvm (3L/min).

La adición de varios de los componentes descritos en el medio de cultivo propicia las condiciones de estrés osmótico, lo que obliga a los microorganismos a adoptar respuestas de adaptación que les permitan sobrevivir y proliferar. Las respuestas ante estas condiciones incluyen la producción de compuestos osmoprotectores como el glicerol, la reorganización del citoesqueleto y la biogénesis de la pared celular, lo que les permite a los hongos regular la presión osmótica intracelular. Por otro lado, la adición de sustancias como sales y azúcares disminuye la actividad de agua del medio de cultivo, causando hiperosmolaridad y afectando la morfología del hongo, el crecimiento micelial, la esporulación y la producción de metabolitos. La adición de talco permite la formación de Biopellets (aglomerados esféricos de micelio) durante la fermentación líquida lo que propicia ventajas operativas de escala en cuanto a la aireación/agitación, reología y separaciones de biomasa posteriores.

De esta manera, aunque la respuesta ante distintas condiciones de estrés y de salinidad es altamente dependiente entre géneros e incluso especies de hongos, de acuerdo con el medio de cultivo de la presente invención se encontró que, mediante la adición de los componentes mencionados anteriormente y en las proporciones señaladas, se alcanza una mejor producción de clamidosporas y una viabilidad más alta para hongos nematófagos, especialmente Duddingtonia sp.

Por consiguiente, empleando el método para producir la composición para el control de parásitos gastrointestinales de acuerdo con la presente invención, se alcanza una buena concentración de clamidosporas en un menor tiempo, obteniendo además clamidosporas de estructura robusta con paredes gruesas. En efecto, este método permite alcanzar un valor mínimo de alrededor de 3 xlO ⁵ Clam mL ^-1 , incluso en periodos de tiempo de tan solo 4 a 7 días, manteniendo la actividad nematófaga del hongo por encima del 90%. Lo anterior, junto con los pasos de adicionar la emulsión de recubrimiento que comprende los excipientes descritos anteriormente, en las proporciones especificadas, permite obtener la composición con las ventajas que han sido expuestas, y producirla a gran escala.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Concentración, viabilidad y actividad nematófaga in vitro Se pusieron a prueba ocho modalidades de composición empleando como ingrediente activo al hongo Duddingtonia sp. Estas composiciones presentaban variaciones en la emulsión de recubrimiento como se muestra en la tabla 1.

Tab a 1

Los prototipos desarrollados se caracterizaron en relación con la concentración (clamidosporas/g), viabilidad (UFC/g) y actividad nematófaga in vitro (% nematofagia), las cuales se determinaron según los siguientes procedimientos:

Concentración (clamidosporas/ ): El conteo se realizó a partir de una dilución de 5g de cada modalidad en 50 mL de agua, se tomó una alícuota de 10 pL y se realizó el conteo de las clamidosporas en una cámara de Neubauer usando un microscopio óptico con el objetivo 40X. Esta lectura se realizo en los 4 cuadros divididos en 16 cuadrantes de la cámara y finalmente se determinó la concentración de clamidosporas mediante la siguiente fórmula. a * 10,000 * b Concentración = - c

Dónde: a, es el número de células (Clamidosporas), 10,000 es el factor de corrección de la cámara de Neubauer, b, es el reciproco de la dilución y c, es el número de cuadros (4) contados en la cámara.

Viabilidad determinada como unidades forma doras de colonia (UFC/a): a partir de una dilución de 5g de cada modalidad en 50 mL de agua se realizaron diluciones seriadas en una solución de Polisorbato 80 al 0,1 % (v/v) de acuerdo con la concentración, posteriormente se inoculó por triplicado 100 pL de las diluciones seleccionadas en cajas Petri con Agar YMA más Tritón X-100 y se distribuyó la muestra con una espátula de Drigalsky estéril. Después de 6 días de incubación a 28 °C ± 2 °C se realizó el conteo de las unidades formadoras de colonia (UFC) por cada dilución sembrada y se determinó la viabilidad de las clamidosporas, reportando el promedio del conteo realizado en las cajas Petri.

Actividad nematófaqa in vitro: Inicialmente se determinó la concentración de clamidosporas de la muestra a evaluar con el fin de determinar el volumen necesario para alcanzar una concentración de l,0xl0 ⁶ clamidosporas por caja, se inoculó por goteo en diferentes áreas de la caja de Petri con agar agua. Se inocularon 8 cajas por tratamiento o muestra a evaluar. Después de 72 horas de incubación a temperatura ambiente y oscuridad, se verificó el crecimiento del hongo mediante observación en microscopio invertido y se adicionó el volumen necesario de una suspensión de nemátodos de Panagrellus redivivus para poner 200 larvas a cada placa que contenía el hongo, adicionalmente se pusieron larvas en cajas Petri con agar agua sin hongo, siendo este el control del ensayo. Después de 48 horas de la interacción hongo-larva a temperatura ambiente y oscuridad, se separaron las larvas libres, es decir, las que no son capturadas por el hongo en el agar utilizando la técnica del embudo de Baermman. Para esto se colocó el agar en el embudo y se cubrió con agua a 37 °C, pasadas 12 horas se recolectó el contenido de los tubos receptores, se adicionaron aproximadamente 100 pL de lugol y se realizó el recuento de larvas recuperadas de cada replica de la muestra evaluada y el control. El porcentaje de nematofagia se calculó mediante la siguiente ecuación. En donde X L3 Control es el promedio de larvas recuperadas del control y X L3 Tratamiento es el promedio de larvas recuperadas en el tratamiento.

La biomasa necesaria para la elaboración de los prototipos se obtuvo a partir del crecimiento del hongo en fermentación sólida, usando como sustrato arroz partido. Los resultados para las composiciones evaluadas se muestran a continuación:

Tabla 2 En la tabla 2 son presentados los resultados de la caracterización de las modalidades de composición de acuerdo con la presente invención. Con respecto a la concentración se observa que todas las modalidades presentaron resultados superiores a lxlO ⁷ clamidosporas/g y no se observaron diferencias significativas entre ellas. Este orden de concentración obtenido facilita la administración de la composición, ya que permite administrar una baja cantidad de esta para alcanzar la dosificación requerida. Así mismo, estas concentraciones permitirán la dilución del prototipo con algún suplemento nutricional para facilitar la administración del hongo a los animales.

Con respecto a la viabilidad se observa que los datos son similares entre las modalidades y que se encuentran en una unidad exponencial inferior al resultado de concentración, es decir, la concentración es del orden de lxlO ⁷ clamidosporas/g y la viabilidad lxlO ⁶ UFC/g. De esta manera, no se observaron diferencias significativas en la viabilidad de las clamidosporas de las diferentes modalidades, lo cual permite inferir que el proceso de formulación y los componentes de la emulsión de recubrimiento no afectan esta repuesta, obteniéndose resultados satisfactorios para todas las modalidades de la presente invención.

Con respecto a la actividad nematófaga se observa que todas las modalidades tuvieron un porcentaje de alrededor del 80% o superior. De hecho, las composiciones de acuerdo con la presente invención obtuvieron, en promedio, un porcentaje de nematofagia del 89,2%. De esta manera, se evidencia que los excipientes adicionados le permiten a la composición alcanzar una capacidad nematófaga importante, lo cual es fundamental para alcanzar el efecto esperado del microorganismo.

De acuerdo con lo anterior, se concluye que la composición de acuerdo con la presente invención obtiene resultados favorables en concentración, viabilidad y actividad nematófaga in vitro. Ejemplo 2. Actividad nematofaga bajo condiciones del tracto digestivo

La composición de acuerdo con la presente invención permite alcanzar una buena actividad nematofaga al proteger al hongo de manera apropiada durante su paso por el tracto gastrointestinal del animal.

Con el fin de evaluar la protección otorgada por la emulsión de recubrimiento de acuerdo con la presente invención, se realizó una evaluación in vitro que simula las tres cavidades más representativas del tracto gastro intestinal de los rumiantes: cavidad ruminal, abomasal e intestino delgado.

Las modalidades de emulsión de recubrimiento de acuerdo con la presente invención que fueron evaluadas en esta prueba corresponden a las composiciones B, E y H, descritas en la tabla 1. Adicionalmente, se evaluó el desempeño de las clamidosporas del hongo sin ningún tipo de recubrimiento (control) con el fin de analizar comparativamente los resultados. A continuación, se describe el procedimiento realizado:

Cavidad ruminal: El ensayo se inició preparando saliva artificial, la cual se llevó a temperatura de 39 °C ± 2 °C y fue posteriormente gasificada con CO2 hasta alcanzar un pH de 6,5 a 7,0. Simultáneamente, en un recipiente previamente temperado a 90 °C se colectaron 100 mL de fluido ruminal a partir de un ovino sano fistulado en ayunas. Se realizó una mezcla en relación 4:1 de Saliva-fluido ruminal, adicionando a 320 mL de saliva constantemente gasificada 80 mL del fluido ruminal filtrado.

A continuación, se adicionaron en un recipiente 0,8 g de pasto kikuyo y 5 g de la modalidad de composición evaluada para ajustar el volumen efectivo de trabajo a una concentración aproximada de lxlO ⁶ clamidosporas/mL, posteriormente a este recipiente se le adicionó 80 mL de la mezcla de fluido ruminal y saliva mientras se gasificaba cada recipiente. El ensayo se ejecuto en una incubadora con agitación orbital constante a 150 rpm y 39 °C ± 2 °C. El muestreo se realizó a las 16 horas, en cada muestreo se garantizó que los recipientes conservaran la temperatura al ser muestreados en una plancha de calentamiento (39 °C ± 2 °C), se gasificó con CO2 los recipientes con la mezcla de saliva y fluido ruminal, se ajustó el pH en cada muestreo en los dos tratamientos con soluciones de NaOH 3N o HCI 0,5 % según fuese requerido, y el pH se ajustó a lo establecido para el ensayo (6, 5-7,0 rumen).

Se muestreo un volumen de 2 mL por cada recipiente, y se remplazó por 2 mL de la mezcla saliva/ fluido ruminal, o únicamente saliva, mantenidas a 39 °C ± 2 °C. Las muestras fueron centrifugadas a 5000 rpm por 3 minutos, se decantó el sobrenadante y posteriormente se realizó un lavado con agua estéril, centrifugando con las condiciones ya nombradas, con el objetivo de detener el efecto que pudiera tener el fluido ruminal sobre el hongo nematófago. A continuación, se resuspendió el pellet en 2 mL de agua estéril. Finalmente, en cada muestra, se determinó la actividad nematófaga.

Cavidad abomasal: Una vez finalizó el procedimiento de la cavidad ruminal las muestras fueron tratadas para simular la cavidad abomasal en la que el pH disminuye a 2 y se adiciona pepsina. Para esto, se preparó una la solución de HCI 50 % (v/v) con la cual se ajustó el pH de las muestras a 2,5. Posteriormente se preparó una solución madre de pepsina de 50 mg/mL y se adicionó la cantidad requerida a las muestras para obtener una concentración final de pepsina de 4,75 mg/mL. Cada Erlenmeyer se cerró con un tapón de caucho provisto de una válvula para la regulación de la salida de gases. El muestreo se realizó después de 2 horas, siguiendo el mismo procedimiento descrito para la cavidad ruminal, para la determinación de la capacidad nematófaga.

Intestino delgado: Una vez finalizó el tiempo de exposición a la cavidad abomasal, las muestras pasaron por la simulación del intestino delgado. Para esto, se ajustó el pH a 8,0 con NaOH 6N, posteriormente se adicionó pancreatina en polvo (Sigma-Aldrich, P1750) para obtener una concentración de 3,38 mg/mL. El muestreo se realizó después de 5 horas de exposición, siguiendo el mismo procedimiento descrito para la cavidad ruminal para la determinación de la capacidad nematófaga.

En la Figura 1 se presentan los resultados de la actividad nematófaga de las modalidades de composición de acuerdo con la presente invención, después de ser sometidas a las condiciones fisicoquímicas encontradas en la cavidad ruminal, abomasal e intestino delgado, sucesivamente.

Como se puede observar en esta figura, las modalidades de acuerdo con la presente invención alcanzan al final del recorrido una capacidad nematófaga sustancialmente mayor en comparación con el hongo sin emulsión de recubrimiento (control). En efecto, las composiciones H, B y E obtuvieron un incremento en la capacidad nematófaga final del 23%, 32% y 25%, respectivamente, comparada con la capacidad nematófaga alcanzada por el control.

De esta manera, al culminar el paso por las tres cavidades se obtuvieron resultados satisfactorios para todas las modalidades evaluadas. Se observa que las composiciones H, B y E presentaron variaciones a lo largo de la prueba, de forma que la capacidad nematófaga aumentó con la exposición sucesiva a las cavidades, alcanzando al finalizar la prueba los valores de 84%, 89% y 85%, respectivamente. Este comportamiento demuestra la capacidad que tiene la emulsión de recubrimiento desarrollada de proteger al hongo de forma pH dependiente.

De lo anterior adicionalmente se evidencia que la inclusión de un vehículo oleoso en la emulsión de recubrimiento, el cual está presente en todas las composiciones de acuerdo con la presente invención, tiene una baja digestibilidad debido a las características metabólicas del tracto digestivo de los rumiantes, lo cual contribuye a obtener el efecto de proteger a las estructuras reproductivas del hongo de procesos enzimáticos y microorganismos que se encuentran en el tracto digestivo y que afectan el rendimiento del hongo, permitiéndole obtener mejores resultados de nematofagia al finalizar su recorrido. De esta manera, se observa que las composiciones de acuerdo con la presente invención le otorgan una protección al hongo conveniente, de forma que la actividad nematófaga obtenida al pasar por el tracto gastrointestinal es mucho mayor que la que alcanza únicamente el hongo sin recubrimiento.

Ejemplo 3. Estabilidad de la composición durante el almacenamiento

3.1 Evaluación de diferentes envases

Con el fin de evaluar la capacidad que tienen las composiciones de acuerdo con la presente invención de mantener su capacidad nematófaga en diferentes condiciones de almacenamiento, se evaluó la composición H, y se compararon 3 tipos de envase: i) recipientes rígidos con tapa rosca de polietileno tereftalato (frascos PET) ii) bolsas de polietileno de alta densidad (Bolsas ziploc), y iii) bolsas trilaminadas selladas al vacío (Bolsas metalizadas).

Cada uno de estos envases fue seleccionado con base en las características de los materiales en términos de permeabilidad al vapor de agua y oxígeno. En efecto, la permeabilidad al oxígeno y la humedad son características propias del material del empaque utilizado y pueden alterar las propiedades fisicoquímicas y microbiológicas del producto que contienen.

Cada unidad experimental consistió en un envase con 12 g de la composición. Los envases se almacenaron a dos temperaturas: (1) 20 °C y (2) 30 °C y se realizaron muéstreos hasta 6 meses después de empacada la composición, evaluando la actividad nematófaga in vitro y la concentración de clamidosporas en estas condiciones.

En las figuras 2 y 3 se presentan los resultados alcanzados por la composición de acuerdo con la presente invención a los 2 y a los 6 meses de almacenamiento en las dos temperaturas (20°C y 30°C) y en los tres tipos de empaque preseleccionados. Se observa que, para la composición de acuerdo con la presente invención, no hay diferencias significativas entre los empaques evaluados en este tiempo de muestreo. Adicionalmente, aunque si se evidencia una disminución de la actividad nematofaga con el aumento de la temperatura de almacenamiento, considerando que el porcentaje de nematofagia de la composición en el tiempo cero fue del 94,63%, se observa que la composición de acuerdo con la presente invención logra que la disminución en la nematofagia a los dos meses no sea, en la mayoría de los casos, superior al 5%. Aún más, luego de 6 meses de almacenamiento, la composición logra que el porcentaje de nematofagia se mantenga en cualquier caso por encima del 85% (89% en promedio), incluso a condiciones de temperatura de 30°C.

Adicionalmente, la emulsión de recubrimiento también permite que la concentración de clamidosporas no cambie a través del tiempo. En este aspecto particular, la composición de acuerdo con la presente invención obtuvo valores en el orden de lxlO ⁷ clamidosporas/g en cada situación, similar a la concentración registrada al inicio del estudio.

De esta manera, la composición de acuerdo con la presente invención logra que, después de 2 meses de almacenamiento del producto, la capacidad nematofaga del microorganismo sea superior al 88% en las temperaturas de 20°C y 30°C, independientemente del tipo de envase utilizado.

Adicionalmente, la composición de acuerdo con la presente invención asegura que la capacidad nematofaga del microorganismo se mantenga por encima del 85%, incluso cuando ésta es almacenada por un tiempo tan largo como 6 meses y a una temperatura tan alta como 30°C, en cualquier tipo de recipiente.

3.2. Capacidad nematofaga en el tiempo de la composición almacenada a diferente temperatura

Continuando con la evaluación de estabilidad a diferentes temperaturas de la composición de la presente invención, se registró la capacidad nematofaga de la modalidad de composición H en comparación con el hongo sin recubrimiento (control), durante un periodo de 7 meses a 20 C y 29 C, con el fin de evaluar el aporte de la emulsión de recubrimiento al rendimiento del ingrediente activo.

La composición fue envasada en viales de vidrio de 10 mL con tapa rosca los cuales se almacenaron en cámaras climáticas con control de temperatura. Para los análisis en cada tiempo de muestreo (capacidad nematófaga in vitro) se dispusieron 3 viales para cada temperatura de almacenamiento.

De acuerdo con los resultados obtenidos, mostrados en las figuras 4 y 5, se observa que la composición de acuerdo con la presente invención mantiene un mejor porcentaje de nematofagia comparado con el hongo sin recubrimiento, incluso durante un periodo de 210 días. En efecto, durante este periodo de tiempo, la composición llegó a registrar una capacidad nematófaga hasta un 20% superior a la capacidad nematófaga otorgada por el hongo sin recubrimiento, esto se debe a la naturaleza de los excipientes empleados, así como a las proporciones específicas utilizadas.

De estos resultados se evidencia que la emulsión de recubrimiento de la composición de acuerdo con la presente invención no solo garantiza un efecto contundente en el control de nemátodos, al ofrecer un mejor rendimiento en el porcentaje de nematofagia, sino que además contribuye a disminuir la dosis de administración necesaria para alcanzar el objetivo deseado. Lo anterior, permitiendo además que la composición sea almacenada durante un tiempo considerable a alta temperatura sin riesgo de perder su efectividad.

Ejemplo 4. Reducción de la cantidad de huevos de parásitos en la materia fecal por acción de la composición

Como parte de un ensayo in vivo realizado para evaluar la efectividad de la composición de acuerdo con la presente invención, se seleccionaron 24 animales de las razas Hampshire, Corriedale y criolla, se formaron 4 grupos experimentales de 6 animales distribuidos según periodo de gestación (ecografía transabdominal), tipo de parto (solo una oveja de parto multiple por grupo), y grupo racial (2 ovejas de cada raza en cada grupo). Los animales no fueron tratados con ningún antihelmíntico 90 días antes de la gestación y se ubicaron en cuatro diferentes lotes, cada uno con tres parcelas, en las cuales rotaban de manera independiente. La pradera en donde se mantuvieron los animales fue previamente contaminada de manera homogénea por un grupo de 12 corderos en levante con un HGP promedio (aproximadamente 1600).

Para este desarrollo experimental se evaluaron las modalidades de composición B, E y H, descritas en la tabla 1, junto con un grupo de control al cual no se administró el hongo nematófago ni ningún otro tratamiento equivalente. La administración de las formulaciones se realizó durante 5 días de la semana en las horas de la mañana.

Todas las composiciones evaluadas se administraron durante los últimos 30 a 45 días previos al parto y hasta 3 meses posteriores al parto no se presentaron efectos adversos en el desarrollo final de los corderos ni en los mismos animales durante la gestación. Las hembras consumieron la dosis del microorganismo sin presentar rechazo a la ración o efectos gastrointestinales adversos.

Con el fin de evaluar la efectividad de las formulaciones, se tomaron periódicamente muestras de materia fecal de los animales. Los resultados de la excreción de huevos por gramo de materia fecal (HPG) se muestran en la figura 6.

Es importante resaltar que en el grupo control hubo conteos de HPG superiores a 6000 y valores de Famacha de 4-5, por lo tanto, durante los 75 a 90 días se desparasitaron dos animales de este grupo, lo que explica su reducción a partir del día 75.

No obstante, los resultados muestran claramente que las composiciones de acuerdo con la presente invención presentan una reducción significativa en la cantidad de huevos de nemátodos comparada con el control. En efecto, la composición de acuerdo con la presente invención alcanzó una reducción de hasta el 78%. Adicionalmente, durante el ensayo se realizaron dos ciclos de pastoreo. El esquema de pastoreo consistió en un periodo de ocupación de 21 días y 42 días de descanso de la pradera.

De esta manera, se evalúo la cantidad de las larvas en la pradera (L3 Kg /MS) posterior a la salida de los animales de la rotación, tomándose dos muestras (400 g aproximadamente) de la parcela con un muestreo tipo zigzag previamente definido, las cuales se procesaron con lavados, posterior migración larvaria y secado para cálculo de la materia seca en las muestras.

De acuerdo con los resultados, mostrados en la figura 7 para la parcela, la contaminación del potrero disminuyó considerablemente luego del segundo ciclo de rotación al administrar las composiciones de acuerdo con la presente invención. En efecto, las modalidades de composición H y E evaluadas, mostraron una reducción significativa, alcanzando una reducción en el número de larvas de hasta 94%.

De esta manera, se evidencia que la administración periódica de las composiciones de acuerdo con la presente invención, en conjunto con pastoreo rotacional y buena nutrición, puede llegar a eliminar la presencia de nemátodos en la pradera. Los resultados obtenidos muestran una disminución drástica de huevos en periodos tan cortos como 120 días de administración.

Ejemplo 5. Ganancia en peso quincenal de corderos lactantes

Para este desarrollo experimental, la administración de las composiciones se realizó durante 5 días de la semana en las horas de la mañana. Las ovejas comenzaron a consumir las composiciones aproximadamente entre 30 a 45 días previos al parto, asegurando que al nacer los corderos la pastura tuviera una baja carga de nemátodos gastrointestinales. Adicionalmente, se evaluó un grupo de ovejas a las cuales no se administró la composición (control). Como se muestra en la Figura 8, con respecto a la ganancia de peso de los corderos lactantes, cuando las madres siguieron siendo suplementadas con los hongos nematófagos, los corderos de las composiciones de acuerdo con la presente invención ganaron mayor peso durante la lactancia con respecto al grupo control.

Por ejemplo, los pesajes de los corderos del grupo al que se administró la modalidad de composición H tuvieron 9,66%, 71,66% y 83,93% mayor ganancia de peso que el grupo control, alcanzando en promedio una ganancia de peso 41% mayor. Esto puede estar relacionado con que las hembras, al estar menos parasitadas gracias al efecto controlador de la composición de acuerdo con la presente invención, tienen una mejor condición para la lactancia, favoreciendo el aumento de peso en los corderos.

Los resultados obtenidos demuestran que la administración de la composición de acuerdo con la presente invención es segura durante el último tercio de la gestación y durante la lactancia. En otras palabras, la composición de acuerdo con la presente invención logró reducir la excreción de huevos al periparto y mejorar la ganancia de peso de los corderos durante la lactancia.

De esta manera, los corderos lactantes de madres a las que se les administró la composición de acuerdo con la presente invención tuvieron una ganancia hasta 40% superior a corderos de madres que no fueron alimentadas con esta composición. Demostrando su efecto diferencial.

Ejemplo 6. Diseño de medio de cultivo para la producción de clamidosporas: efecto del incremento de glucosa

Dentro de la estrategia de diseño del medio de cultivo líquido para la producción de clamidosporas del hongo nematófago se evaluó el medio de cultivo M, cuyos componentes se muestran en la tabla 3. Este medio en particular obtuvo un rendimiento de 1.23±0.69 xlO ⁴ Clam mL ^-1 , 1.07±0.9 xlO ⁷ Clam g ¹ biomasa seca.

Tabla 3

A partir de este medio, se consideró la posibilidad de que se tuviera una limitación en la fuente de carbono. En este sentido, se evaluaron dos tratamientos con mayor concentración de glucosa (codificados como M-3% y M-7%), con el fin de incrementar la disponibilidad de carbono y mantener el estrés osmótico sobre el hongo. En estos ensayos se implemento el medio M como control y se tomaron muestras a los 7 y 14 días.

Como parte del desarrollo experimental, se realizaron fermentaciones con un volumen efectivo de trabajo de 100 mL de medio, se inocularon con 4 discos agar del hongo con 8 días de crecimiento y se mantuvieron a una agitación constante de 150 rpm a 28±2°C en una incubadora refrigerada durante 14 días. Se tomaron muestras de medio fermentativo a los 7 y 14 días de incubación para determinar la concentración de clamidosporas (Clam mL-1), la viabilidad (UFC mL-1) y la actividad biológica (% nematofagia).

Como se observa en la figura 9, los resultados obtenidos a los 7 días de muestreo para los tratamientos M-3% (1.86±1.01 xlO ⁴ Clam mL ¹ ) y M-7% (2.41±1.35 xlO ⁴ Clam mL ^-1 ) presentaron concentraciones de clamidosporas más altas que el control (1.23±0.69 xlO ⁴ Clam mL ^-1 )

De manera similar, a los 14 días de muestreo las concentraciones de clamidosporas para los tratamientos M-3% (1.09±0.43 x 10 ⁶ Clam mL ^-1 ) y M-7% (5.04±8.74 xlO ⁴ Clam mL ^-1 ) fueron igualmente superiores al control (1.95±1.25 xlO ⁴ Clam mL ^-1 ). Sin embargo, la concentración de clamidosporas para el tratamiento M-3% presento un cambio sustancial con respecto a la obtenida a los 7 días de fermentación, indicando una alta velocidad de crecimiento del hongo durante la segunda semana de incubación.

En efecto, como se muestra en la figura 9, el tratamiento M-3% alcanzó una concentración mucho mayor a los 14 días que el control y el tratamiento M-7%.

Adicionalmente, el aumento en la concentración de glucosa en el medio incrementó la viabilidad del hongo a los 7 días en los tratamientos M-3% (3.37±0.49 xlO ⁶ UFC mL ^-1 ) y M-7% (3.45±0.54 xlO ⁶ UFC mL ¹ ), con respecto al control (2.82±0.30 xlO ⁶ UFC mL ¹ ). De manera similar, a los 14 días, las viabilidades alcanzadas por los tratamientos M-3% (9.33±4.00 xlO ⁶ UFC mL ^-1 ) y M-7% (9.22±2.91 xlO ⁶ UFC mL ^-1 ) fueron significativamente más altas en comparación con el control (4.00±1.76 xlO ⁶ UFC mL ^-1 ).

Con respecto a la capacidad nematófaga, también se registró un aumento para los tratamientos M-3% (98.69%) y M-7% (91.34%), en comparación con el control M (83.48%).

Los resultados encontrados permiten concluir que la adición de alrededor de 3% (30 g/L) de glucosa al medio produce un incremento significativo en la concentración de clamidosporas, viabilidad y actividad nematófaga del hongo nematófago D.flagrans con respecto al control.

En este sentido, concentraciones muy altas de glucosa en el medio parecen tener un efecto negativo sobre el crecimiento y actividad del hongo debido a condiciones extremas de estrés osmótico.

Ejemplo 7. Diseño de medio de cultivo para la producción de clamidosporas: Efecto de condiciones de estrés osmótico sobre el medio

Con el objetivo de favorecer el crecimiento del hongo y mejorar la producción de clamidosporas, se evaluaron condiciones de estrés osmótico mediante la adición de dos concentraciones de micropartículas de talco: 5 g L ¹ y 20 g L . En este ensayo se implemento como control el medio liquido Sabouraud y el medio de cultivo M, descrito en la tabla 3. El desarrollo experimental realizado corresponde al descrito en el ejemplo anterior, empleando una incubadora refrigerada.

Como se muestra en la figura 10, los resultados obtenidos a los 7 días de muestreo con los tratamientos con 5 g L ¹ de talco (3.38±0.96 xlO ⁴ Clam mL ¹ ) y 20 g L ¹ de talco (5.44±1.45 xlO ⁴ Clam mL ^-1 ) fueron significativamente superiores a los obtenidos con los controles Sabouraud (2.25±2.09 xlO ⁴ Clam mL ¹ ) y el medio de cultivo M (1.38±0.67 xlO ⁴ Clam mL ^-1 )

Un comportamiento similar se observa a los 14 días de muestreo, en donde los resultados obtenidos con 5 g L ¹ de talco (6.19±2.19 xlO ⁴ Clam mL ^-1 ) y 20 g L ¹ de talco (2.31±0.70 xlO ⁵ Clam mL ¹ ) fueron notablemente mayores a los registrados para los controles Sabouraud y el medio de cultivo M, para los que se registraron 1.84±0.86 xlO ⁴ Clam mL ¹ y 2.58±1.22 xlO ⁴ Clam mL ^-1 , respectivamente.

De esta manera, como se observa en la figura 10, la mayor concentración de clamidosporas se obtuvo para los medios de cultivo con adición de talco, siendo significativamente más alta cuando se adicionaron 20 g L ¹ .

Por otra parte, la actividad biológica no se vio afectada por el estrés osmótico ni por el talco, en todos los tratamientos evaluados el porcentaje de nematofagia fue superior al 93%. Los tratamientos con 5 g L ¹ de talco (93.25±4.12%) y 20 g L ¹ de talco (93.83±4.12%) mostraron una actividad biológica superior a los tratamientos control Sabouraud (92.99±4.21%) y el medio de cultivo M (90.65±4.74%).

Los resultados encontrados permiten concluir que la adición de talco contribuye a alcanzar mejores resultados de concentración y viabilidad del hongo, sin afectar su actividad nematófaga. Ejemplo 8. Diseño de medio de cultivo para la producción de clamidosporas: Efecto combinado de condiciones de estrés

En esta última fase de experimentación a escala de laboratorio se evaluaron las mejores condiciones del medio encontradas para la producción de clamidosporas: 20 g L ¹ de talco y 3% de glucosa. Este medio de cultivo, codificado como O, está conformado como se muestra en la tabla 4.

Como se observa en la figura 11, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los 7 y 14 días de muestreo para el medio de cultivo O (3.18±1.20 xlO ⁵ clam mL ¹ y 3.63±1.72 xlO ⁵ clam mL ^-1 , respectivamente). Este resultado indica que el efecto combinado de la adición de 20 g L ¹ de D¡05 y 3% de glucosa al medio de cultivo permitió reducir el tiempo de fermentación de 14 días a máximo 7 días.

Adicionalmente, no se observó pérdida en la actividad biológica del hongo. De hecho, ésta se mantuvo por encima del 90%, siendo la nematofagia obtenida a los 7 y 14 días de 93.1 ± 2.3% y 96.2 ± 2.4%, respectivamente.

Con base en estos resultados, se concluye que el medio que incorporó talco junto con glucosa (Medio de cultivo O) mejoró el rendimiento durante el crecimiento y las características biológicas del hongo en cultivo sumergido. Adicionalmente, el comportamiento de este medio fue evaluado mediante ensayos en biorreactor. Como parte de este desarrollo experimental las fermentaciones se realizaron en un biorreactor de 5 L con un volumen efectivo de trabajo de 3 L adaptado con un sensor de oxígeno disuelto. El medio fue inoculado con 10% v/v de una suspensión de clamidosporas con una concentración de 10 ⁶ clam mL-1, preparada mediante raspado de 5 cajas de agar harina de trigo de un segundo pase del hongo D. flagrans con 8 días de crecimiento. El biorreactor se mantuvo en agitación constante a 150 rpm y a 28 ± 2 °C con una aireación de 1 vvm (3 L/min de aire estéril) durante 7 días. Al final de la fermentación, la biomasa producida se recuperó mediante centrifugación (4500 rpm, 20 minutos) descartando el sobrenadante.

La concentración promedio de clamidosporas obtenidas en este ensayo fue de 3.41±0.70 xlO ⁵ Clam mL ¹ , la cual fue 3 veces mayor con respecto al inicio de la fermentación.

En la figura 12 se observa el efecto significativo del medio y de la escala de fermentación. Tanto a nivel de incubadora como de biorreactor se demuestra claramente la diferencia significativa del medio de cultivo O sobre la concentración de clamidosporas con respecto al medio de cultivo M.

De igual manera, se evidencia que el cultivo en biorreactor con el medio de cultivo O permitió mejorar la producción de clamidosporas (5.13±1.46 xlO ⁵ Clam mL ¹ ) en comparación con el resultado obtenido en incubadora (3.18±1.20 xlO ⁵ Clam mL ^-1 ).

De esta manera, se encontró suficiente evidencia estadística para afirmar que el cultivo en biorreactor con el medio de cultivo O mejora significativamente la producción de clamidosporas de D. flagrans en comparación con el medio de cultivo M bajo las mismas condiciones de fermentación. Este resultado es un indicador de que el medio de cultivo O a diferencia del medio M favorece la esporulación y no la germinación de las clamidosporas producidas, favoreciendo la producción de la composición a mayor escala. Finalmente, los ensayos de fermentación en biorreactor con el medio de cultivo O permitieron obtener clamidosporas de estructura robusta como se muestra en la figura 13, con paredes gruesas clasificadas como tipo B y C (Figura 13-a y Figura 13-b). Este tipo de pared ofrece una mayor resistencia del hongo frente a las condiciones fisicoquímicas y microbiológicas encontradas en el tracto digestivo ruminal, permitiendo mantener su integridad hasta llegar a la materia fecal. Además, se observó la formación de estructuras parecidas a pellets (Figura 13-c) conformadas por micelio y clamidosporas.