提 升 口腔免 疫球 蛋 白 A含 量及 抑制 病原 菌 的组 合物 及用 途 技术 领域 本发 明是有关 于一种益 生菌用 于制备 口腔组合物 的用途 ， 特别是一种益 生菌 用于提 升口腔 IgA含量及抑制 口腔病 原菌的组 合物的用 途。 背景 技术 人的 口腔中存 在上万 种的细菌 ， 这些细菌分解 口腔的糖 类作为基 质并黏 附在 口腔黏 膜、 牙齿表面或 牙齿周边 组织上， 形成顽强的生物膜 ， 进而影响 口腔 的健康 ，其中变形链球 菌 OSVreptococcMS 等好氧菌偏好附 着于牙齿 表面 上， 分泌酸性物 质并腐蚀 牙齿的 珐琅质， 造成牙齿 的蛀洞 。 另外， 牙龈 口卜啉单 胞 菌 ｛Porphyrom onas gingivalis）、 具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）、 伴放线 ^MMMiAggregatibacter actinomycetemcomitans）等厌氧 菌则 偏好附着 于牙龈 沟或牙周 囊袋里 ， 释放毒素刺激牙 周组织 ， 导致牙周发 炎肿 胀， 造成齿槽骨及 组织的 破坏， 进而引发牙 齿松动 、 口臭及刷牙流血 等 症状 。 作为 人体连接 外界的通 道之一 ， 口腔表面覆有 黏膜， 以抵御病原菌， 其 中免 疫球蛋 白 A（Immunoglobulin A, IgA）在黏膜层免疫系统和体液免疫 系统 中扮 演重要 角色。唾液中的 IgA可维持 口腔微生 物的生态 平衡、避免病 菌（如: 呼吸 道融合 病毒、 轮状病毒、 流感病毒及 新型冠 状病毒等 ）侵入呼吸道， 并防 止 口腔病原 菌黏附在 口腔中 。 除 了免疫系 统之外， 益生菌也可协助人 体抵御 口腔病原 菌。 益生菌不仅 可和 口腔病 原菌竞争 口腔中 的养分与生 存空间 ， 也可分泌抑菌成份 （如： 抗菌 肽、 短链脂肪酸及 H ₂ 0 ₂ ：）来抑制口腔病原菌的生长， 还可改善口腔 病原菌 感 染所 导致的 发炎现象（如： 红肿、 流血及溃烂）。 此外， 有些益生菌（无论是否 有活 性）及其代谢产物（益萃质）还可提升唾 液中的 IgA含量， 从而提升 口腔免 疫力 。 有鉴 于此， 亟须提供一种 益生菌用 于制备 提升口腔 免疫球蛋 白 A含 量及 抑制 口腔病 原菌的组 合物， 以提升口腔免疫力 并抑制 口腔病原 菌。 发明 内容 因此 ， 本发明的一样态 系提供 一种益生 菌用于制 备提升 口腔免疫 球蛋白 A(immunoglobulin A, IgA)含量的组合物， 其中益生 菌包含特 定的菌 株作为 有效 成分。 本发 明的另一 样态系提 供一种 益生菌用 于制备抑 制口腔 病原菌 的组合物 的用 途， 其中组合物 包含上述 益生菌株 作为有 效成分 。 本发 明的又一 样态系提 供一种提 升口腔 IgA含量及抑 制口腔 病原菌的 组 合物 ，其中组合物 包含上 述益生 菌株作为 有效成分 ， 以提升口腔 IgA的含量 。 根据 本发明 的上述的态 样， 提出一种益 生菌用于 制备提升 IgA含量的 组 合物 的用途 ， 其中益生菌可 例如作为 有效成分 ， 且益生菌可包 含植物乳 酸杆 麗｛Lactobacillus plantarum) LPL28， 该植物乳酸杆菌 LPL28在 2019年 6月 18 日保藏于 中国微生 物菌种保 藏管理 委员会 普通微 生物中 心， 保藏编号为 CGMCC 17954， 以提升口腔该 IgA的含量 。 在 本发 明的 一实 施例 中 ， 益生菌 可选 择 性包 含唾 液乳 酸 杆菌 salivarius)AP-32及 /或副干酪乳杆菌 (L. /?aracove/)ET-66。 所述唾液乳酸杆菌 AP-32 在 2011年 4月 10日保藏 于中国典 型培养物 保藏中 心， 且保藏编号为 CCTCC M 2011127 _o 所述副干酪乳杆 菌 ET-66在 2016年 12月 29日保藏于 中 国微生物 菌种保 藏管 理委员会 普通 微生物 中心， 且保藏编号为 CGMCC 13514。 在本 发明的一 实施例 中，组合物可例如 为食品 组合物或 口腔外用 组合物 。 在本 发明的一 实施例 中， 食品组合物可 例如为乳 制品、 非乳制饮品及洁 牙食 品。 在本 发明的一 实施例 中， 口腔外用组合 物可例 如为口腔 护理组合 物或口 气清 新组合物 。 根据 本发明 的另一态样 ， 提出一种益生 菌用于制 备抑制 口腔病原 菌的组 合物 的用途 ， 其中益生菌可 例如作为 有效成分 ， 且益生菌可包 含植物乳 酸杆 菌 (Lactobacillus j?lantarum)LPL28， 以抑制口腔病原菌的生长。上述植物乳酸 杆菌 LPL28的保 藏编号是 CGMCC 17954。 在本 发明的 一实施例 中， 益生菌可选 择性包含 唾液乳酸 杆菌 AP-32 及 / 或副 干酪乳 杆菌 ET-66。 所述唾液乳酸 杆菌 AP-32及副干酪乳 杆菌 ET-66的 保藏 编号分别 为 CCTCC M 2011127及 CGMCC 13514。 {Porphyromonas gingivalis)、具核梭杆菌 (FMSo/jacfcrzMW nucleatum)及伴敢线聚 MMMiAggregatibacter actinomycetemcomitans)。 在本 发明的一 实施例 中，组合物可例如 为食品 组合物或 口腔外用 组合物 。 根据 本发明 的另一态样 ， 提出一种提升 口腔 IgA含量及抑制 口腔病原 菌 的组 合物 ， 可包含益生 菌作为有 效成 分， 且益生菌 可例如 由植物 乳酸杆 菌 LPL28 、 唾液乳酸杆菌 AP-32及副干 酪乳杆菌 ET-66所组成 。 所述植物乳酸 杆菌 LPL28、 唾液乳酸杆菌 AP-32及副干酪乳 杆菌 ET-66的保藏编号 分别为 CGMCC 17954、 CCTCC M 2011127及 CGMCC 13514。 应用 本发明的 组合物 ，可显著提升 唾液中的 IgA含量及 /或抑制口腔病 原 菌 的生长， 从而维持 口腔健康 。 生物 材料保 藏 2019年 6月 18日保 藏 于中 国微 生 物菌 种保 藏管 理 委员 会普 通微 生 物中 心 (China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC) (地址： 中国北京市朝阳区 北辰 西路 1号院 3号， 邮编： 100101)， 且保藏编号为 CGMCC 17954。 唾液 乳酸杆 菌亚种 salicinius {Lactobacillus salivarius subsp. salicinius) AP-32 系于 2011年 4月 10日保藏于 中国典型培 养物保 藏中心 (China Center for Type Culture Collection, CCTCC)(地址：中国武汉武汉大学，邮编： 430072) 保藏 编号为 CCTCC M 2011127 _o 6系 于 2016年 12月 29日保 微 生物 中心 (China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC) (地址： 中国北京市朝阳区 北辰 西路 1号院 3号， 邮编： 100101)， 保藏编号为 CGMCC 13514。 此外 ， 2011年 12月 27 日保藏 于食品工 业发展研 究所生物 资源保存 及研究 中心（FIRDI BCRC）（地 址 ： 中国台湾新竹食 品路 331号）， 保藏编号为 BCRC 910536。 2009年 07月 30日保 藏于 BCRC ， 保藏编号为 BCRC 910437。 2016 年 11月 03日保 藏于 BCRC ， 保藏编号为 BCRC 910753。 附 图说明 为让 本发明的 上述和 其他目的 、 特征、 优点与实施例能 更明显 易懂， 所 附 图式的详细 说明如 下： 图 1是显示根据 本发明 的一实施 例的不 同益生菌 的单菌株 后生元于 体外 对不 同口腔病 原菌的 抑菌百分 比。 图 2A至图 2E分别是 根据本发 明的一实 施例进行 H ₂ 0 ₂ 分泌量 的测量实 验 的菌株 AP-32（图 2A）、 ET-66（图 2B）、 LPL28（图 2C）、三菌株（图 2D）的 H ₂ 0 ₂ 含量 及比色 卡（图 2E）。 图 3是根据本 发明的一 实施例的 三菌株后 生元 口含锭对 口腔致病菌 的抑 菌 百分比的 直条图 。 图 4A至图 4D分 别是根据 本发明 的一实施例 的口腔 好氧菌（图 4A）、 变 形链 球菌（图 4B）、双歧杆菌（图 4C）及乳杆菌（图 4D）含菌量变化百分比的直条 图 。 图 5 是根据本 发明的 一实施例 的三菌 株益生 菌口含 锭的口腔 菌相变 化

NGS 热图。 图 6 是根据本 发明的 一实施例 的不 同口含锭 投予不 同时间对 唾液相对 IgA 含量百 分比的盒 状图。 图 7是根据本 发明的一 实施例的 投予三菌 株后生 元口含锭 在不同时 间对 唾液 IgA变化百 分比的点 状图。 具体 实施方 式 承 上所 述 ， 本发 明提 供 益生 菌 用于 制 备提 升 口腔 免 疫球 蛋 白 A （immunoglobulin A, IgA）含量及抑制口腔病原菌 的组合物 的用途 ， 其中益 生 菌可 例如 作为 有效 成分 。 上述益 生菌 可包 含但 不限 于植 物乳 酸杆菌 （Lactobacillus plantarum）。在一实施例中， 植物乳酸杆菌是于 2019年 6月 18 保 藏 于中 国微生 物菌 种保 藏管 理委 员会 普通 微生 物中 心（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC）（地址： 中国北京市朝阳区 北辰 西路 1 号院 3 号， 邮编： 100101）的植物乳酸 杆菌 （/^（：?0 0（：/// plantarum）LPL2S , 保藏编号为 CGMCC 17954。 中，于 2011年 4月 10保藏于中国典 型培养物 保藏 中心（China Center for Type Culture Collection, CCTCC）（地址： 中国武汉武汉大学， 邮编： 430072）， 保 藏 编号为 CCTCC M 2011127的唾液乳酸 杆菌 AP-32（Lacto subsp. salicinius）。 在一实施例中， 副干酪乳杆菌是中国专利 CN 108338361 中，于 2016年 12月 29日保藏 于中国微 生物菌 种保藏管 理委员会 普通微 生物 中心（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC）（地址： 中国北 京市朝 阳区北辰 西路 1 号院 3 号， 邮编： 100101）, 且保藏编号为 CGMCC 13514 的副干 酪乳杆菌 ET-66（Lacto/ _? acz//M5 ^* pamcasd）。 在一实施例 中， 益生菌是由植 物乳酸杆 菌 LPL28、 唾液乳酸杆 菌 AP-32及副干 酪乳杆 菌 ET-66 等菌 株所组成 。 将 上述益 生菌以发 酵培养基 进行发酵 步骤， 可获得发酵物， 其中发酵培 养 基的种 类不限， 可例如为市售细 菌培养基 ， 且发酵物中包含 活性菌 体。 发 酵 步骤可 例如为利 用一种益 生菌株 进行的单 菌株发酵 步骤， 以获得单菌株发 酵 物。 在一实施例 中， 发酵步骤可 例如同时 利用对 多种益生 菌株进行 多菌株 发酵步骤 ， 以获得多菌株 发酵物， 其中上述益生菌可 例如选 自于由植 物乳酸 杆 菌 LPL28、 唾液乳酸杆 菌 AP-32、 副干酪乳杆菌 ET-66及上述 任意组合 所 组 成的一 族群 。 在一实施例 中， 发酵步骤可 例如 同时利用 对植物 乳酸杆 菌 LPL28 、唾液乳酸 杆菌 AP-32及副干酪乳 杆菌 ET-66进行的三菌株 发酵步 骤， 以获得三 菌株发酵 物。 接 着， 对发酵物（如： 单菌株发酵物 或多菌 株发酵物 ）进行后处理， 以获 得 后生元 （postbioticsX如： 单菌株后生元或三菌株后生元）， 其中后生元包含 益生 菌的菌体 及其分 解培养基 后产生 的代谢物 。 前述后处理的方 法不限 ， 可 包含 热灭杀步 骤及 /或固液分离步骤 。 前述的热灭杀步骤 可抑制菌 体活性 ， 从 而形 成去活性 菌体， 而固液分离 步骤可 去除活性 菌体及 /或去活性菌体 。在一 实施 例中， 所述有效 成分可例 如选 自于由益生 菌的活性 菌体、 去活性菌体、 后生 元及上述 任意组 合所组成 的族群 。 在一实施例中 ， 热灭杀步骤可例如 湿 热灭 菌法（如： 高温高压蒸气灭 菌法、 微波加热 、 隔水加热步骤）及 /或干热灭 菌法 。在一实施例 中，固液分离步 骤可例 如利用离 心步骤及 /或过滤步骤进行。 上述 益生菌具 有提升 IgA含量及抑 制口腔病 原菌的 功效， 其中 IgA存在 于 口腔黏膜及 唾液中 ， 且 IgA与口腔健康相 关， 因此唾液中 IgA含量提升 可 减少 由口腔病 原菌引 发的病症 ， 所述抑制口腔 病原菌可 例如为 抑制口腔 病原 菌的 生长。 所述 「口腔病原菌」 是指可影响口腔 健康的微 生物， 其中口腔 病原菌可 包 含但不 限于 致龋 菌及 /或牙周致病 菌。 上述致龋菌 可包 含变 形链球 菌 [Streptococcus mutans） , 且上述牙周致 病 菌可 包 含牙 銀 卩卜啉单胞 菌 集杆 菌 acfcr 此 外， 牙銀卩卜啉单胞菌、 具 核梭 杆菌及伴 放线聚 集杆菌 皆会产生硫 化物， 从而引起口臭。 除了影响口腔 健康 ， 口腔病原菌 尚与口腔 以外的其 他疾病相 关， 如： 具核梭杆菌与结 肠癌 有关 ， 伴放线聚集杆 菌与大肠 癌密切相 关， 且牙龈卟啉 单胞菌与 伴放线聚 集 杆菌 的含量 罹患胰腺 癌的机率 正相关 。 因此， 抑制口腔病原菌 的生长不 仅可 维持 口腔健康 ， 还可降低上述 疾病的发 生率。 在应 用上述组 合物时 ， 其投予途径无特 别限制 ， 可例如经口投予 或经口 腔吸 收， 端视实际需求 与剂型 调整。 上述组合物 的有效 剂量亦可 视需求弹 性 调整 。 在一实施例中 ， 益生菌的有效剂 量可例如 为大于 10 ⁶ CFU/g， 然以 10 ⁷ CFU/g 至 10 ¹¹ CFU/g为较佳。 在一 实施例 中，上述组合物可 选择性包 含食品或 医学上 可接受 的赋形剂 、 稀释 剂或载体 等。 在一实施例 中， 组合物可例如 为食品 组合物或 口腔外用 组 合物 ，其中食品组合 物可例 如为乳制 品（如：优格、乳酪或发酵乳制 饮品乳粉 ）、 非乳 制饮品（如： 茶饮、 咖啡、 健康饮品）或洁牙食品（如： 口香糖、 口含锭、 软糖 及宠物用 肉干）， 且口腔外用组合物可 例如为 口腔护理 组合物（如： 牙膏、 牙线 、 漱口水、 洁牙粉、 假牙清洁剂 或口内 膏）、 口气清新组合物（如： 口气 清新 剂）或其他组合物（如： 牙齿美白剂）。 经体 外实验证实 ， 上述植物乳酸 杆菌 LPL28 搭配其他 菌种（例如唾液乳 酸杆 菌 AP-32及副干 酪乳杆菌 ET-66）可有效提升口腔中 IgA含量及抑制 口腔 病原 菌， 表示上述益生 菌具有减 少龋齿及 /或牙周病的潜能， 从而维持 口腔健 康 。 需补 充的是 ， 在体外实验中， 相较于进行单菌株 发酵物 ， 三菌株发酵物 可分 泌较多 H ₂ 0 ₂ 。 其次， 相较于单菌株后生元的个 别， 三菌株后生元 可提升 口腔 中 IgA含量， 显示相较于植 物乳酸 杆菌 LPL28的单 菌株发酵 物及 /或后 生元 ， 而植物乳酸杆菌 LPL28与唾 液乳酸杆 菌 AP-32及副 干酪乳杆 菌 ET-66 的三 菌株发酵 物及 /或后生元维持 口腔健康 的效果较 佳。 以下 利用数个 实施例 以说明本 发明的应 用， 然其并非用 以限定本 发明， 本领 域普通技 术人员在 不脱离 本发明之 精神和 范围内， 当可作各种的更动 与 润饰 。 实施例 一、 植物乳酸杆 菌 LPL28 的分离、 保存及微生物学性 质 植物 乳酸杆菌 LPL28（以下称 LPL28）是分离自味噌 的菌株 。 分离后， 以 含有 20%的甘油 的 MRS 培养液 （厂牌： 美商必帝股份有限公 司， DIFCO）将菌 株 LPL28保存于 -80°C。使用前， 于 37°C下将菌株 LPL28接种到 含有 0.05% 半胱 氨酸的 MRS 培养液 中培养 24小时， 并以相同的方法 再继代 一次， 以确 保菌 株 LPL28具 有较佳活 性。 将菌 株 LPL28活 化后，涂布在 MRS 琼脂培 养基上 ， 并于 37°C下进行培 养至 长出菌落 （约 48小时）。观察活化后菌株 LPL28 的形态特 征， 并将结果列 于表 1。 表 1 _ 接着 ， 利用微生物鉴定 试剂盒 API 50 CHL（bioMerieux， 法国）分析鉴定 菌株 LPL28的 菌种， 并将结果列 于表 2， 其中 「+」 表示阳性， 「-」 表示阴 性， 且 「？」 表示反应较微弱。 根据表 2的结果， 菌株 LPL28的 生物化学 性 质 与植物 乳酸杆菌 相似， 因此判断菌株 LPL28为植物乳 酸杆菌 。 表 2 接 下 来 ， 进行 RNA 纯 化 及反 转 录 聚 合 酶连 锁 反 应 (reverse transcription-PCR, RT-PCR), 以获得菌株 LPL28的 16S rDNA， 再利用序列 分 别如序 列编号序 列辨识编 号 (SEQ ID NOs.): 1及 2所示的上游引 物及下游 弓 1物进行 PCR， 以获得序列如 SEQ ID NO: 3所示 145 bp的片段。 利用基本 局 部比对 搜索工具 (Basic Local Alignment Search Tool， BLAST)进行比对， 菌 株 LPL28确实 为植物乳 酸杆菌 。将所分离 的菌株是 于 2019年 6月 18日保藏 于中 国 微生 物 菌种 保 藏管 理 委员 会 普通 微 生物 中 心 (China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC) (地址： 中国北京市朝阳区 北辰西路 1号院 3号， 邮编： 100101)， 保藏编号为 CGMCC 17954。 实施 例二、 评估植物乳 酸杆菌 LPL28体外 抑制口腔 病原菌 的功效 利用 双层琼脂 法来评估 益生菌 抑制口腔 病原菌 的功效 ， 其中使用的益生 菌株 是列于表 3, 且作为示例的 口腔病原 菌株是列 于表 4。值得注意的是 ， 菌 株 LGG是 抑制变形 链球菌 的市售益 生菌，在此 作为正对 照菌株 。补充说明的 是 ， 丰华生技是丰华 生物科技 股份有 限公司的 简称。 表 3中， 鼠李糖乳杆 菌 LGG 是保 藏于美 国弗吉 尼亚马纳 萨斯的美 国典型 培养物保 藏中心 (American Type Culture Collection, ATCC), 乳双歧杆菌 BB-12及嗜酸乳杆菌 LA- 5是 保藏 于德国 微生物及 细胞培养 收集中心 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, DSMZ), 且表 4的口腔病原 菌株是保 藏在瑞 典哥德 堡 的 哥 德堡 大 学 培 养物 保 藏 中 心 (Culture Collection University Of Gothenburg, CCUG)或美 国典型 培养物保 藏中心 。表 4的口腔病 原菌株 也保 藏在 食品工 业发展研 究所 (Food Industry Research and Development Institute， FIRDI)生物资 源保存及 研究中 心 (Bioresource Collection and Research Center, BCRC)( 地址： 中国台湾新竹食 品路 331号)。 表 3 表 4 首先， 利用 MRS 培养液来 培养表 3所示 的益生菌株 ， 再利用大豆分 解 蛋白质 干酪素培 养液 (tryptic soy broth， TSB)来培养变形链球菌、 牙銀卟啉单 胞菌及 具核 梭杆菌 多形 亚种， 并利用脑心浸 出培 养液 (brain heart infusion broth, BHI)来培养伴放线聚 集杆菌 ， 以分别获得益生 菌液及病 菌液。 调整益 生菌液 及病菌液 的含菌 量，使含菌量分别 为 lxlO ⁹ cfu/g及 lxlO ⁷ cfu/g至 lxlO ⁹ cfu/g _o 将益生 菌液以划 线的方式 涂布在第 一琼脂 培养基上 ， 藉以在 37°C 下厌 氧环境 中培养约 48小时后，形成 约 2公分 的益生菌 带。上述第一 琼脂培养 基 是由 MRS培 养液配制 而成。 接着， 分别将 45°C 的第二层培 养琼脂添 加在第一 琼脂培养 基上。 待第 二层培 养琼脂冷 却凝固后 ， 将口腔病原菌 株的病 菌液分别 涂布在第 二层培养 琼脂， 并在 37°C下培养 48小时， 其中变形链球菌 、 牙龈卟啉单胞菌及 具核 梭杆菌 多形亚种 的第二层 培养琼脂 是由 TSB培养液 配制而成 ，且伴放线 聚集 杆菌的 第二层培 养琼脂是 由 BHI培养液 配制而 成。如果益生菌 具有抑菌 能力， 则在第 二层培养 琼脂上 ， 会在益生菌带的 两侧形成 抑菌带 。 利用抑菌带的宽 度来可 量化抑菌 能力， 其中当抑 菌带为 0公分至 1公分、 1公分至 2公分 、 2 公分至 3公分及 大于 3公分时， 分别定义抑菌分数 为 0分、 1分、 2分及 3 分。 益生菌株 对不同 口腔病原 菌株的 抑菌分数 及各抑 菌分数 的平均是 列于表 5。 如表 5所示， 菌株 LPL28的 抑菌分数 较高， 且高于正 对照菌株 LGG， 显 示菌株 LPL28的活 性菌体具 有良好 的抑菌能 力。 表 5 实施例三 、评估植物 乳酸杆菌 LPL28的后 生元的 体外抑制 口腔病 原菌的 功效 对益生菌 株 LPL28、 唾液乳酸杆菌 AP-32及副干 酪乳杆菌 ET-66进行单 菌株发 酵步骤， 以获得单菌株发酵 物， 其中单菌株 发酵步骤 是在 37°C 下以 MRS 培养液 进行达 48 小时。 唾液乳酸杆菌 AP-32 （保藏编号： CCTCC M 2011127）（以下称 AP-32）、副干酪乳杆菌 ET-66（保藏编号： CGMCC 13514）（以 下称 ET-66）说明于专利号 TW I639389B的菌株 ， 在此不再赘述 。 接着， 对单菌株 发酵物进 行后处理 ， 以获得单菌株 后生元， 其中后处理 包含热 灭杀步骤及 离心步 骤。 所述热灭杀步 骤是在 100°C下隔水加 热， 使单 菌株发 酵物中的 菌体失去 活性， 且离心步骤是以 4000 rpm离心 10分钟， 其 中所分 离的上清 液包含 单菌株后 生元。 将 100 W的单菌株后生 元加入至 4.8 ml TSB培养液或 BHI培养 液，再分 别加入 100 0的病菌 液 10 ⁶ CFU/mL（变形链球菌、 牙龈卟啉单胞 菌及具 核梭 杆菌多 形亚种加 到 TSB 培养液 中， 且伴放线聚集 杆菌加到 BHI培养 液中）， 以于 37°C下进行培养 （变形链球菌培养 20小时， 牙龈卟啉单胞菌 、具核梭杆 菌多形 亚种及伴 放线聚集 杆菌培养 4天）， 从而获得后生元培养物 。另外配制 对照培 养物， 其配制方法 与前述 后生元培 养物相 同， 但不加入后生 元。 分别将 后生元培 养物及对 照培养 物序列稀 释并涂 布于 TSB 琼脂培养基 （变形链球菌、 牙龈卟啉单 胞菌及具 核梭杆菌 多形亚种 ）或 BHI琼脂培养 基上 （伴放线聚集杆菌 ）， 并于 37°C下培养达 48小时 ， 再计数菌落数 ， 从而计算 抑菌 百分 比， 其中抑菌百分 比是 100%减去存 活百分 比， 且存活百分 比是后 生元 培养物 的菌数除 以对照培 养物的 菌数的百 分比。 因此， 对照培养物的抑 菌百 分比是 0%。 图 1是显示根据 本发明 的一实施例 的不同 益生菌 的单菌株后 生元于 体外 对不 同口腔病 原菌 的抑菌百 分比， 其中横轴表 示益生 菌株的后 生元， 纵轴表 示抑 菌百分 比，且图号 「*」、 「**」及「***」分别表示以学生 t检验（student’s t-test）统计后，后生元培养物与对照培养物 的抑菌 百分比相 比具有统 计上的显 著差 异（p<0.05、 p<0.001） _o 如 图 1所示 ， 相较于无添加后 生元的 对照培养 物， 菌株 LPL28、 AP-32 及 ET-66的单菌株后 生元对 口腔致病 菌的抑菌 百分比 较高，显示菌株 LPL28、 AP-32 及 ET-66的单 菌株后生 元具有较 佳的抑 菌能力 。 实施 例四、 测量不同益 生菌株 的 H ₂ 0 ₂ 分泌量

H ₂ 0 ₂ 可以抑制 细菌的生 长， 还可以美 白牙齿， 因此进行 H ₂ 0 ₂ 分泌量 的 测量 实验， 可评估益生 菌株的 抑菌能力 。 首先， 以 MRS 培养液分别对 菌株

AP-32、 ET-66及 LPL28进行上述 单菌株发 酵步骤 ， 从而获得单菌株发 酵物。 另一 方面， 以 MRS培 养液同时对 菌株 AP-32、 ET-66及 LPL28的混 合进行 三菌 株发酵步 骤， 从而获得三 菌株发酵 物， 其中三菌株 发酵步骤 的条件 与单 菌株 发酵步骤 相同， 只是接种的菌株 数量不同 。 上述单菌株发酵 物及三 菌株 发酵 物的 总含菌 量相 同（约为 10 ⁹ CFU/mL）, 其中三菌株发 酵物 中， 菌株 AP-32、 ET-66及 LPL28的 菌量比例 为 1 : 1 : 1。以 4500 rpm分别离心 0.1 mL 的单 菌株发酵 物及三 菌株发酵 物达 5分钟， 以获得菌体， 再利用 4.9 mL的哌 嗓 -1,4 -二乙磺酸［piperazine-N,N’-bis （2-ethanesulfonic acid）， PIPES］缓冲液 （100 mM）回溶菌体，并于 37°C下以 220 rpm的转速进行 反应达 5小时， 以获 得 PIPES培养物。接着 ， 以 4500 rpm进行离心，再取 10 pL的上清液 至 H ₂ 0 ₂ 试纸 （制造商： Merck）上反应， 10秒后观察试纸的颜色变化 。对照试纸与 比色 卡 的颜色， 可获得 H ₂ 0 ₂ 浓度。 将结果记录于 图 2A至图 2E。 图 2A至图 2E是根据 本发明的 一实施例 进行 H ₂ 0 ₂ 分泌量的测量 实验的 菌株 AP-32（图 2A）、 ET-66（图 2B）、 LPL28（图 2C）、 三菌株（图 2D）的 H ₂ 0 ₂ 含 量及 比色卡（图 2E） _o 如图 2A至图 2D所示 ， 菌株 AP-32、 ET-66及 LPL28的 单菌 株发酵物 的 PIPES培养物 中分别 含有 5 mg/L、0 mg/L及 2 mg/L的 H ₂ 0 ₂ , 而三 菌株发酵 物的 PIPES培养物的 H ₂ 0 ₂ 含量为 10 mg/L,大于单菌株发酵 物 的 PIPES培养物中 H ₂ 0 ₂ 含量之和 ， 显示相较于分别对 菌株 AP-32、 ET-66及 LPL28 的进 行单菌株 发酵步 骤后获得 的单菌株 发酵物 ， 同时对菌株 AP-32、 ET-66 及 LPL28的进行 三菌株 发酵步骤 后获得 的三菌株 发酵物的 H ₂ 0 ₂ 含量 较高 。 实施 例五、 评估三菌株 后生元 口含锭体 外抑制 口腔致病 菌的功效 制备 安慰剂 口含锭及三 菌株后 生元口含 锭。 上述安慰剂 口含锭的 成分包 含甜 味剂（如： D-山梨醇、 赤藻糖醇及 蔗糖素）、 果寡糖、 乳糖、 香料、 硬脂 酸镁 及二氧化 硅等食 品添加物 ， 其中食品添加 物的含 量可在符 合法规 的前提 下视 情况进行 调整。上述 食品添加 物皆属 习知成分 ，可视实际需 求任意调 整， 且此 调整不影 响抑菌 功效的 评估， 故在此不另 赘述。 此外， 三菌株后生 元口 含锭 的成分包 含安慰 剂口含锭 所含的食 品添加 物及三菌 株后生 元。 三菌株后 生元 是对菌株 AP-32、 ET-66及 LPL28进行 上述三菌 株发酵步 骤及上述 后处 理后 获得， 其中三菌株 发酵物的含 菌量为 lxl0 ⁹ CFU/mL, 且三菌株后生元 于 口含 锭的含量 为 50 mg/g。 分别 将 100 的病菌 液加入 4.8 mL 的 TSB培养液 （变形链球菌、 牙龈 卟啉 单胞菌及 具核梭 杆菌多形 亚种）及 BHI培养液（伴放线聚集 杆菌）中， 再分 别加 入一锭安 慰剂口含 锭或三 菌株后生 元口含锭 后， 于 37°C下进行 培养（变 形链 球菌培养 20小时，牙龈 卟啉单胞 菌、具核梭杆 菌多形 亚种及伴 放线聚集 杆菌 培养 4 天）， 以获得安慰剂口含锭及 三菌株后 生元 口含锭的 口含锭培养 物 。 另外配制对照培 养物， 其配制方 法与前述 口含锭培 养物相 同， 但不加入 口含 锭。 然后， 如实施例三的 方法计算 抑菌百分 比， 并将结果记 录于图 3。 图 3是根据本发 明的一 实施例的 三菌株后 生元口含 锭对口腔 致病菌 的抑 菌百 分比的 直条图， 其中横轴表示组别 ， 纵轴表示抑菌 百分比， 且图号 「*」 及 「 **」 分别表示以 student’s t test统计分析后， 相比安慰剂口含锭具有显著 上 的统计差异 （p<0.05、 p<0.01） _o 如图 3所示， 相较于安慰剂口含锭， 三菌株 后生 元口含 锭对口腔 病原菌株 的抑菌 百分较高 ， 显示三菌株后生 元可有 效抑 制 口腔病原 菌。 实施 例六、 评估三株 益生菌 口含锭于 口腔中抑 制口腔致 病菌的功 效及改 善 口腔及 /或肠胃健康的功 效 利用 实施例 四的单 菌株 发酵物及 三菌株 发酵物 分别 离心后 的菌体 配制 AP-32、 ET-66、 LPL28及三菌株 益生菌 口含锭， 其中益生 菌口含锭 包含对应 的菌 体及安 慰剂口含 锭的添加 剂， 且益生菌口含 锭的总含 菌量为 50 mg/g。 分别 投予受试 者上述安 慰剂口含 锭及三 株益生菌 口含锭达 4周， 其中投 予方 式为在 早、 中及晚各含 (未咬碎)一颗口含锭。 上述受试者为无 全身性疾 病 、 不抽烟， 且唾液中含有约 10 ⁵ 的变形链球菌的 20岁至 40岁的健 康成人 。 需特 别说明 的是，每颗口含 锭重约 10 g,不予咬碎，可停留 口腔中约 10分钟， 但视 受试者 的口水含 量及体温 等因素而 有个体 差异。 分别 在未投予 口含锭 、 投予口含锭 2周及 4周后， 利用棉花 棒刮取受 试 者牙 齿内外侧 ，以搜集口腔组 织样本 。接着，将口腔组织样本 均匀接种 到 5 mL 含有 50%甘油的 TSB培养 基中， 以获得口腔菌 样本。然后，依据 检测的 目标， 分别 利用对应 的培养条 件于 37°C下培养口腔 菌样本达 2天， 再计算菌落数 。 详细 而言， 对应的培养 条件是 指特定 的培养基及 氧气环 境。 口腔菌样本 的口 腔好 氧菌对应 的培养 条件是平 板计数琼 脂培养基 及好氧 环境。 变形链球菌 对 应的 培养条件 是轻型 唾液链球 菌琼脂 (mitis salivarius agar, MSBA)培养基及 兼性 厌氧环 境。 双歧杆菌 及乳 杆菌对应 的培养 条件是 半胱氨 酸 MRS 琼脂 (cysteine MRS agar)培养基、 厌氧环境或兼性厌氧环境。 上述各菌株 的含菌量 如 图 4A至图 4D所示 。 图 4A至图 4D分 别是根据 本发明 的一实施例 的口腔 好氧菌 (图 4A)、 变 形链 球菌 (图 4B)、双歧杆菌 (图 4C)及乳杆菌 (图 4D)含菌量变化百分比的直条 图， 其中横轴表示 口含锭的种 类及投予 条件， 纵轴表示以未投予 口含锭 的口 腔含 菌量为 100%的含 菌量变 化百分 比， 图号 「*」 、 「**」 及 「***」 表示 经 student’s t-test 统计分析， 与投予安慰剂口含锭具有统计上 的显著 差异 (p<0.05、 p<0.01、 p<0.001)(n=25)，且图号「#」、 「##」及「###」表示经 student’s t-test 统计分析， 与未投予三菌株 益生菌 口含锭 相比具 有统计上 的显著 差异 (p<0.05、 p<0.001)(n=25)。 如 图 4A 所示， 相较于投 予安慰剂 口含锭及 未投予 口含锭， 投予益生 菌 口含 锭后， 口腔好氧菌含菌 量变化百 分比显 著下降 ， 且投予 ET-66、 LPL28 及三 菌株益 生菌口含 锭 2周后就 有显著 效果， 其中三菌株 益生菌 口含锭的 效 果较 AP-32、 ET-66及 LPL28益生菌 口含锭的 效果更佳 。 如 图 4B所示 ， 相较于投予安 慰剂口含 锭 4周及未投予 口含锭 ， 投予益 生菌 口含锭 4周后的变 形链球菌 含菌量变 化百分 比显著下 降， 其中三菌株 益 生菌 口含锭 在投予 2 周后就有显著效 果， 且三菌株 益生菌 口含锭 的效果较 AP-32、 ET-66及 LPL28益生菌 口含锭的 效果更佳 。 如 图 4C所示 ， 相较于投予安 慰剂口含 锭 4周及未投予 口含锭 ， 投予益 生菌 口含锭 4周后的双 歧杆菌含 菌量变 化百分 比显著提升 ， 其中投予三菌 株 益 生菌 口含锭在 2 周后就有显 著效果 ， 且三菌株 益生菌 口含锭 的效 果较 AP-32、 ET-66及 LPL28益生菌 口含锭的 效果更佳 。 如 图 4D 所示， 相较于投 予安慰剂 口含锭及 未投予 口含锭， 投予益生 菌 口含 锭后， 乳杆菌含菌 量变化百 分比显著 上升， 其中投予 LPL28及三菌 株益 生菌 口含锭 2周后就有 显著效 果， 且三菌株益 生菌口含 锭的效果 较 AP-32、 ET-66 及 LPL28益 生菌口含 锭的效 果更佳 。由上述可知 ，投予益生菌 口含锭 ， 可有 效降低 口腔致病 菌（变形链球菌）， 并提升口腔益菌（如： 双歧杆菌及乳 杆 菌）， 且相较于单菌株益 生菌 口含锭（即 AP-32、 、 ET-66及 LPL28益生菌 口 含锭 ）， 三菌株口含锭的效果较 佳。 此外 ， 分别在未投予 口含锭、 投予口含锭 2周及 4周后， 搜集受试者 的 唾液 样本， 并萃取唾液 样本中的 DNA 样本 ， 再检送 DNA样 本至图尔 思生物 科技 公司进行 次世代 测序（next generation sequencing, NGS）。 NGS的操作方 法如 下： 首先， 使用市售引物（如： SEQ ID NOs:4及 5所示）及市售 PCR试 剂 盒（Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix; 厂商： New England Biolabs， 美 国）扩增出 16S rRNA的 V3及 V4区段的 核酸片段 并进行 电泳，再以萃取试 剂 盒［Qiagen Gel Extraction kit;厂商 :德国凯杰公司（Qiagen）］（约 400 bp至 4 ⁵ 0 bp） 分离 核酸片 段。 接着 ， 利用全基因组 测序样品 制备试剂 试剂盒（TmSeq® DNA PCR-free sample preparation kit；厂商：美国 Illumina）制备测序样本，并建立基因组 DNA 文 库（genomic DNA library）。 接下来， 利用萤光 检测 仪器 （Qubit® 2.0 Fluorometer；厂商：美国赛默飞世尔科 技）和测序分析系 统［Agilent Bioanalyzer 2100 system； 厂商： 美国安捷伦科技 (Agilent Technologies, Inc.)］分析 DNA基 因文库。最后 ，在 IlluminaHiSeq 2500平台上对 DNA进 行序列分 析。将 NGS 的结果记录 于图 5。 图 5 是根据本发明 的一实施 例的三 菌株益 生菌口含 锭的 口腔菌相 变化 NGS 热图 (heat map)，其中横轴代表投予的口含锭 种类及实 验时间，纵轴 表示 菌 的分类 (可为属、种或亚种)，且图号 「*」及「***」分别表示经 student’s t-test 统 计分析 ， 与投予安慰 剂口含 锭的含 菌量具 有统计 上的显著 差异 (p<0.05、 p<0.001)(n=25) _o 由图 5可知， 投予三菌株益生 菌口含锭 4周后， 可有效增加 口腔益生 菌 (如： 唾液乳酸杆菌、 乳杆菌数及齿 双歧杆菌)的 含量。 另 外， 以问卷的方 式， 调查受试者 口腔及肠道 生理状态 的改变 ， 并将结 果 分别列于 表 6及表 7, 其中数字 0、 1、 2及 3分别表示无症状、 轻度症状、 中度症状及 重度症 状 (在表 7中， 超过 3天排便为数 字 2、 1至 3天排便 3天 为 数字为 1， 1天排便超过 1次为数字 0)，字母「a」及「b」分别表示以 student’s t test统计分析后， 相比投予安 慰剂口含 锭的受试 者具有显 著上的 统计差异 。 如 表 6所示，投予三菌 株益生菌 口含锭 的受试者 的口疮 (或称口破、嘴巴破裂)、 脓 包及流 口水等的 症状显著 下降， 且如表 7所示， 便秘、 胃食道逆流、 感冒 及 睡意等 的症状 皆获得明显 改善， 显示三菌株益生菌 口含锭不 仅可改 善口腔 的不适症状 ， 还对口腔以外 的生理状 态有正面 的影响 。 表 6 安慰剂口含锭 三菌株益生菌口含锭 未投予 投予 2周 投予 4周 未投予 投予 2周 投予 4周 牙齿痛 / 牙齿艮月中胀 0.4±0.71 0.2±0.41 0.16±0.47 0.48±0.59 0.28±0.54 0.16±0.37 刷牙时牙齿流血 0.48±0.78 0.44±0.65 0.44±0.65 0.44±0.58 0.28±0.61 0.16±0.37 口疮或脓包 0.6±0.76 0.72±0.98 0.52±0.82 0.44±0.82 0.04±0.2b 0.08±0.28a 喉口龙痛 0.48±0.59 0.4±0.87 0.36±0.76 0.28±0.46 0.2±0.41 0.16±0.47 流 P7jC 0.32±0.56 0.52±0.82 0.48±0.65 0.6±0.76 0.12±0.33a 0.16±0.37a 咳嗽 0.32±0.48 0.24±0.6 0.4±0.76 0.36±0.57 0.12±0.44 0.12±0.44 表 7 _ 安慰剂口含锭 三菌株益生菌口含锭

_ 未投予 投予 2周 投予 4周 未投予 投予 2周 投予 4周 ^~~ 排便 0.08±0.28 0.2±0.41 0.36±0.49 0.2±0.41 0.4±0.5 0.32±0.48 便禾必 0.48±0.65 0.44±0.65 0.6±0.71 0.28±0.46 0.16±0.37 0.12±0.33 ^b 腹泻 0.2±0.41 0.32士 0.63 0.36士 0.64 0.12士 0.33 0.24士 0.66 0.16士 0.37 肚子痛 0.68士 0.8 0.4士 0.65 0.32士 0.63 0.36士 0.49 0.12±0.33 0.16士 0.37 胃食道逆流 0.68±0.9 0.48士 0.65 0.52士 0.71 0.28士 0.46 0.08士 0.28 ^b 0.12士 0.33 ^a 感冒 0.36士 0.57 0.4牡 0.71 0.56士 0.82 0.32士 0.47 0.2士 0.41 0.16士 0.37 ^a 睡意 0.36士 0.7 0.4士 0.58 0.52士 0.65 0.32士 0.56 0.16士 0.37 0.12士 0.33 ^b 实施 例七、 评估单菌株 及三菌株 的益生 菌口含锭 提升口腔 IgA浓度的 能 力 利用 实施例 四的菌株 AP-32、 ET-66及 LPL28的单菌 株发酵物 分别制备 AP-32 口含锭 、 ET-6口含锭 6及 LPL28 口含锭， 其中口含锭 的含菌量分 别为

50 mg/g。分别投予 受试者上 述安慰 剂口含锭 、 AP-32口含锭、 ET-66口含锭、 LPL28 口含 锭及三菌 株益生 菌口含锭 ， 并于未投予、 投予 2周及投予 4周搜 集 受试者 唾液， 再利用酶联免 疫吸 附分析 法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测量 IgA含量 ， 并将结果记录于 图 6。 ELISA的方法为所 属领 域具 有通常 知识者所 熟知， 在此不再 赘述。 图 6 是根据本 发明的 一实施例 的不同 口含锭 投予不 同时间对 唾液相对 IgA 含量 百分比 的盒状 图， 其中横轴表示 口含锭种类 及时间 ， 纵轴表示以未 投予 口含锭 的唾液 IgA含量为 100%的相对 IgA含量 百分比，图号 「*」、 「**」 及 「***」 表示以 student’s t test统计分析后， 与投予安慰剂口含锭具有统计 上 的显著差异 (p<0.5、 p<0.01、 p<0.001)(n=25), 且图号 「##」 及 「###」 表示 以 student’s t test统计分析后， 与未投予口含锭相比具有统计上 的显著差 异 (p<0.01 _> p<0.001)(n=25)。 如 图 6所示， 相较于投 予安慰剂 口含锭， 投予 AP-32口含锭、 ET-66口 含锭 、 LPL28口含锭 及三菌株 益生菌 口含锭的 受试者的 唾液相对 IgA含量百 分 比皆在投 予 2周及 4周后显著增 加， 显示菌株 AP-32、 ET-66及 LPL28具 有提 升唾液 IgA含量的功 效。 然而， 相较于投予 AP-32口含锭、 ET-66口含 锭、 LPL28 口含锭， 投予三菌株益生 菌口含锭 的受试者 的唾液相 对 IgA含量 百分 比较高 ， 显示相较于单菌 ， 菌株 AP-32、 ET-66及 LPL28的三菌株 发酵 物提 升唾液 IgA含量的效 果较佳 。 实施 例八、 评估三菌株 后生元 口含锭提 升口腔 IgA浓度的能 力 将实施 例五的 三菌株后 生元 口含锭投予 受试者达 4周， 其中投予方 式及 受试 者的条件 同实施例 六。 分别于未投 予、 投予 2周及投 予 4周后 ， 搜集受 试者 的唾液 ， 并利用上述 ELISA 测量唾液 中 IgA含量 。 图 7是根据本发 明的一实 施例的 投予三菌 株后生元 口含锭在 不同时 间对 唾液 IgA变化百分 比的点 状图， 其中横轴表 示时间及 组别， 纵轴表示 以投予 前的 唾液 IgA含量为 100%的 IgA含量百分 比， 图号 「**」 及 「***」 表示经 student’s t-test 统计分析， 与投予安慰剂 口含锭 具有 统计 上的 显著差 异 (p<0.01、 p<0.001)(n=25), 且图号 「###」 表示经 student’s t-test统计分析， 与 未投 予三菌 株后生元 口含锭 相比具 有统计上 的显著差 异 (p<0.001)(n=25)。 如 图 7所示，相较于投予 安慰剂 口含锭，投予三 菌株后生 元的受 试者的唾 液 IgA 含量 在投予 2周及 4周后显著上升 ，显示菌株 AP-32、菌株 ET-66及菌株 LPL28 的三 菌株后生 元可有 效提升唾 液 IgA含量 。 由上 述结果显 示，本发明的 植物乳酸 杆菌 LPL28可确实提 升口腔 IgA含 量并 抑制口腔 病原菌 ，意味着应用 本发明 的植物乳 酸杆菌 LPL28可降低 龋齿 及 /或牙周病的发 生率， 而有预防龋 齿及 /或牙周病的潜能 。 综言 之， 本发明虽以特 定菌株 、 特定的剂型、 特定的对 象、 特定的投予 方式 、 或特定的评估方 式作为例 示， 说明本发明的 植物乳酸 杆菌 LPL28提升 口腔 IgA含量并抑 制口腔 病原菌 的用途， 然而本领域普通技 术人员可 知， 本 发明 并不限于 此， 在不脱离本 发明的精 神和范 围内， 本发明亦可 使用其 他菌 株、 其他的剂型、 其他的对象 、 其他的投予方 式或其他 的评估方 式进行 。 虽然 本发明 已以数个实 施例揭 露如上， 然其并非用以限 定本发 明， 本领 域普 通技术人 员在不脱 离本发 明的精神 和范围 内，当可作各种 的更动与润 饰， 因此 本发明 的保护范 围当视随 附的权利 要求书所 界定者为 准。