2022/003443 1»（그1’/182021/054673 양이온성 리포좀을 포함하는 사포닌의 용혈 억제용 조성물 기술분야 본 발명은 사포닌에 의한 적혈구 용혈작용을 억제하는 효능을 가지는 양 이온성 리포좀에 관한 것으로， 더욱 상세하게는 불포화 지질이 함유된 양이온성 리포좀을 포함하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물， 이를 포함하는 면역증 강용 조성물과 약물 전달용 조성물 및 불포화 지질이 함유된 양이온성 리포좀을 포함하는 약물 전달체와 약물-전달체 복합체에 관한 것이다. 배경기술 사포닌 (saponin)은 스테로이드 및 트리테르펜의 2차 대사산물로서 생성되 는 글리코시드 (glycosides) 화합물이다. 사포닌은 강력하고 효과적인 면역학적 활성을 포함하여 항염증 등 광범위한 약리학적， 생물학적 활성을 나타낸다. 일반 적으로 사포닌의 면역기능 증가 효과가 알려져 있으며， 사포닌은 백신의 면역보 조제 (adjuvant)나， 항암제로 이용되고 있다(Newman MJ , et al. J Immunol 148；2357-2362, 1992； Sun HX, et al. Vaccine, 27： 1787-1796, 2009) . 다만, 사 포닌은 거품 작용 및 용혈작용 (hemolysis)이 있으며， 용혈작용이란 적혈구가 파 괴되어 내용물 (세포질)이 주변 액체 (예를 들면， 혈장) 안으로 용해되는 것을 말 한다. 용혈반응 또는 간단히 용혈이라고도 한다. 적혈구막 속의 콜레스테롤이 사 포닌과 강하게 결합하여 막 구조가 파괴되기 때문에 발생한다. 사포닌을 의약적 용도로 이용하기 위해서는， 사포닌의 적혈구 용혈을 억 제해야 하고， 이를 위해 통상적으로는 콜레스테롤 사용한다. 일 2022/003443 1»（그1’/182021/054673 반적으로 콜레스테롤은 동물 유래 성분으로서 의약품 등의 제조 시 관리 기준이 엄격하며， 이를 극복하기 위해 최근 반합성 또는 합성 콜레스테롤이 개발되어 의 약품 제조에 사용되고 있지만 단가가 매우 높은 단점이 있다. 여러 약물들의 안전하고 효율적인 전달 기술은 오랫동안 연구되어 왔다. 제조， 유통과정 등에서 변질되지 않고 활성을 유지시키기 위해 캡슐화 (capsulation) 제형 기술이 이용되고 있다. 이는 리포좀과 같은 운반체 내에 약 물을 내포함으로써 약물의 변질과 손실을 최소화할 수 있으며， 친수성 및 친유성 물질을 모두 내포시킬 수 있다. 의약품에서는 약물전달체 및 보호체로서의 역할 을 하며， 의약 분야에서는 유전자 치료 및 암 화학요법， 화장품 분야에서는 효능 물질 전달체 및 수분 전달체로서의 역할을 한다. 캡슐화 기술은 내포된 물질을 안정한 상태로 보관하는 역할뿐만 아니라 방출 속도를 조절하는 역할을 할 수 있 다. 리포좀 ( 1iposome)은 지질로 된 이중증의 자가결집 (self-assembled) 구조 체로서， 소수성 (hydrophobic)을 띠는 부분과 친수성 (hydrophi 1ic)을 보이는 부분 을 동시에 가지고 있는 양친매성 (amphipathic)분자이다. 리포좀은 생체적합성이 우수하고， 제법이 간편하며， 수용성 및 지용성 약물을 운반할 수 있는 장점이 있 어 체내에서의 부작용이 적은 약물전달체로서 연구가 활발히 진행되고 있다 (Kwang Jae Cho, Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 2007:50(7) : 562-572) . 리포좀은 화학적으로 안정하며， 무자극 무독성으로 피부 생체 지질 막과 구조적으로 유사하다. 또한 표면 성질을 다양하게 변화시켜 제조 할 수 있어 화장품， 의약， 어쥬번트， 약물전달 등에 다양하게 이용될 수 있다. 2022/003443 1»（그1’/182021/054673 이러한 기술적 배경하에서， 본 발명자들은 사포닌의 치료 효능 또는 면역 증강 기능을 활용하는데 있어서， 사포닌을 체내에 투여했을 경우 발생하는 용혈 현상을 억제하고자 예의 노력한 결과， 불포화（11!1331；）끄' 1011） 양이온성 지질 또는 중성 지질을 포함하는 양이온성 리포좀과 사포닌을 혼합한 경우， 사포닌 단독 투 여시 발생하는 용혈현상이 효과적으로 억제되는 것을 확인하고， 본 발명을 완성 하였다. 본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이 해를 향상시키기 위한 것이며， 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식 을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다. 발명의 요약 본 발명의 목적은 사포닌의 적혈구 용혈 억제능을 가지는 양이온성 리포 좀을 포함하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하 는 사포닌의 적혈구 용혈 억제 방법， 사포닌의 적혈구 용혈 억제를 위한 상기 조 성물의 용도 및 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 약제 제조를 위한 상기 조성물의 사용을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 포함하는 면역증강용 조성물을 제공하는 데 있다 . 본 발명의 또 다른 목적은 상기 면역증강용 조성물을 대상체에 투여하는 2022/003443 1»（그1’/182021/054673 단계를 포함하는 면역증강방법， 면역증강을 위한 상기 면역증강용 조성물의 용도 및 면역증강용 약제 제조를 위한 상기 면역증강용 조성물의 사용을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공하는 데 있다 . 본 발명의 또 다른 목적은 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 양이 온성 리포좀을 포함하는 약물전달체 및 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 양이온성 리포좀에 약물이 흡착 또는 봉입되어 있는 약물-전달체 복합체를 제공 하는 데 있다. 상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 양이온성 리포좀， 및 사포닌을 포함하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 제공한다 . 본 발명은 또한， 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제 방법， 사포닌의 적혈구 용 혈 억제를 위한 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물의 용도 및 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 약제 제조를 위한 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물 의 사용을 제공한다. 본 발명은 또한， 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 포함하는 면역증강용 조성물을 제공한다 . 본 발명은 또한， 상기 면역증강용 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포 함하는 면역증강방법， 면역증강을 위한 상기 면역증강용 조성물의 용도 및 면역 2022/003443 1»（그1’/182021/054673 증강용 약제 제조를 위한 상기 면역증강용 조성물의 사용을 제공한다 . 본 발명은 또한， 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다 . 본 발명은 또한， 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 양이온성 리포 좀을 포함하는 약물전달체를 제공한다. 본 발명은 또한， 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 양이온성 리포 좀에 약물이 흡착 또는 봉입되어 있는 약물-전달체 복합체를 제공한다. 도면의 간단한 설명 도 1 및 도 2는 리포좀의 극성에 따른 crude saponin에 의한 hemolysis의 억제능을 비교한 그래프이다. 도 3 및 도 4는 Quillaja Saponaria유래 crude saponin및 QS21의 농도 에 따른 적혈구 용혈 (%)을 나타낸 그래프이다. 도 5 내지 도 13은 2.5 yg crude saponin및 QS21의 용혈작용에 대한 리 포좀의 억제 효과를 확인한 그래프이다. 도 14는 양이온성 리포좀 내 양이온성 지질 또는 중성 지질 중 불포화 지 방산의 유무에 따른 사포닌에 의한 용혈작용에 대한 억제 효과를 비교한 그래프 이다. 도 15는 양이온성 리포좀 내 양이온성 지질 또는 중성 지질 중 불포화 지 방산의 유무에 따른 세포독성을 비교한 그래프이다. 도 16은 Steroidal saponin의 농도에 따른 적혈구 용혈 (%)을 나타낸 그래 프이다. 2022/003443 1»（그1’/182021/054673 도 17 내지 도 20은 리포좀의 ¾ 01(131 크 !!에 의한 용혈 작용 억제 효과를 확인한 그래프이다. 도 21은 IV 6대61101(131 3크1)011111의 농도에 따른 적혈구 용혈 (%)을 나타낸 그래프이다. 도 22 내지 도 25는 리포좀의 IV 6대61101(131 3크1)011111에 의한 용혈 작용 억제 효과를 확인한 그래프이다. 도 26 내지 도 31은 사포닌에 의한 용혈을 억제하는 양이온성 리포좀 내 양이온성 및 중성 지질의 비율에 따른 효과를 확인한 결과이다. 발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예 다른 식으로 정의되지 않는 한， 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 리포좀 (1^0301116)은 표면 전하， 사이즈， 막 구조 등의 성질에 따라 다양하게 분류된다. 예를 들어， 리포좀의 표면 전하는 중성 지질， 양이온성 지질， 음이온성 지질 등 다양한 지질 원료 조합에 의해 결정된다. 본 발명의 일 실시예에서는， 사포닌의 적혈구 용혈작용을 억제할 수 있는 양이온성 리포좀을 개발하였으며， 사포닌에 의한 용혈현상을 억제시키기 위해 일반적으로 사용되는 콜레스테롤의 사용 없이도 사포닌을 이용한 면역증강용 제제 및 약물전달체 제조에 있어서 효과적으로 이용될 수 있음을 확인하였다. 2022/003443 1»（그1’/182021/054673 이는 사포닌을 안전하게 의학적， 약학적 용도로 사용할 수 있음을 시사한다. 따라서， 본 발명은 일 관점에서， 양이온성 리포좀 및 사포닌을 포함하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물에 있어서， 상기 양이온성 리포좀은 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 것을 특징으로 하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 있어서， '지질 ’은 지방산， 인지질， 지방산 에스터 및 스테로이드 등을 포함한다. '불포화 지질 ’은 지질에 포함된 지방산 사슬에 탄소 란소 이중결합이 하나 이상 포함된 지질을 의미한다. 본 발명에 있어서， 상기 양이온성 지질 또는 중성 지질은 하나 이상의 불포화 지방산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서， 상기 양이온성 지질 또는 중성 지질은 불포화 지방산 사슬을 1개 이상 포함할 수 있으며， 각 불포화 지방산 사슬의 탄소수는 10 내지 20이고， 바람직하게는 14 내지 18이며， 각 지방산 사슬에 포함된 탄소-탄소 이중결합 수는 1 내지 6이고， 바람직하게는 1일 수 있다. 본 발명에 따른 용혈 억제용 조성물에 포함되는 양이온성 지질 또는 중성 지질 중 어느 하나가 불포화 지질이고， 다른 하나는 불포화 지질 또는 포화 지질일 수 있다. 본 발명에 있어서， 상기 양이온성 지질 (cat ionic l ipid)은 1,2 - 디올레오일- 3 -트리메틸암모늄프로페인 (1， 2-d i 01 eoy卜3_

( t r i me t hy 1 ammon i um ) pr opane : DOTAP) , 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (dimethyldioctadecylammonium bromide; DDA) , 3p_[N_(N' ,N’_ 2022/003443 1^(:1^ 2021/054673 디메틸아미노에테인 카바모일 콜레스테롤(3(3-[N-d N'-dimethylaminoethane) carbamoyl cholesterol； DC-Chol), 1 ,2-디올레오일-3 -디메틸암모늄프로페인 (1 ,2 - dioleoyl-3-(dimethylammonium)propane； D0DAP), 1 ,2-디 -0-옥타데세닐-3- 트리에틸암모늄 프로페인(l,2-di-0-octadecenyl-3_trime1:hylammonium propane； D0TMA), 1 ,2 -디미리스토레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포� ��린 (1 ,2- dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine； 14: 1 Ethyl PC), 1- 팔미토일-2 -올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1-palm itoy卜2-oleoy卜sn- glycero-3-ethylphosphocholine； 16:0-18: 1 Ethyl PC), 1 ,2-디올레오일_3]1- 글리세로-3-에틸포스포콜린(l,2-dioleoyl-sn-glycero -3_ethylphosphocholine; 18: 1 Ethyl PC), 1 ,2 -디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1 ,2- distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin； 18:0 Ethyl PC), 1 ,2 -디팔미토일- sn-글리세로-3 -에틸포스포콜린(1,2-(1^ _¾ 111111: ₀ 1- _3]1 -요1아 ₀ -3- ethylphosphocholine; 16:0 Ethyl PC), 1,2 -디미리스토일-sn_글리세로-3- 에틸포스포콜린(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphos phocholine; 14:0 Ethyl PC), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린( 1,2-dilauroy卜sn-glycero- 3-ethylphosphocholin； 12:0 Ethyl PC), Nl-[2-((lS)-l-[(3- 아미노프로필 )아미노]-4 - [디 (3 -아미노-프로필 )아미노]부틸카복사미도)에틸 ]-3,4 - 디 [올레일옥시 ]_벤자마이드(Nl_[2-((1S)-1_[(3-aminopropyl)amino]-4-[di (3- amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]- benzamide, MVL5), 1,2 -디미리스토일-3 -디메틸암모늄-프로페인(1,2-dimyristoy卜3- dimethylammonium-propane; 14:0 DAP), 1,2 -디팔미토일-3 -디메틸암모늄- 2022/003443 1^(:1^ 2021/054673 프로페인 (1, -dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane； 16:0 DAP) 12 디스테아로일- 3 -디메틸암모늄-프로페인 (1,2_ 6 0 -3-(1111161：]¾^1 ■■)111·- propane 18:0 DAP) -(4 -카복시벤질 )- -디메틸- 2,3 - 비스 (올레오일옥시 )프로판- 3(0160 10 7) ₁ ¾)¾]1-1 -· 1八1!11; 1)08ᅀ ) , 1,2 -스테아로일- 3 -트리메틸암모늄 프로페인 (1,2- 6 0 1-3- ^6 1¾_0 1그111- ₁ ¾)¾］16; 18:0 ᅀ! ⁾ ) 12 디팔미토일- 3 -트리메틸암모늄-프로페인 (1,2-(1^¾111111：0 1-3-11 11161：]¾^1··)]!! ■- propane 16:0 TA) 1 , 2 -디미리스토일- 3 -트리메틸암모늄-프로페인 (1 , 2 - dimyristoyl -3- 1rimethylammonium-propane ; 14:0 TAP ) 및 N4_콜레스테릴 퍼민 (N4_Cholesteryl -Spermine; GL67)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 양이온성 지질에는 콜레스테롤 유도체에 양이온성 작용기가 도입된 지질 등이 포함될 수 있다. 본 발명에 있어서 , 상기 중성 지질 (116111:대1 11^(1)은 1,2 -디미리스토일-

DMPC) 1 ,2 -디올레오일- 글리세로- 3 -포스포콜린 (1 ,2-(11()160 1-3]1-요1 아0-3- 油애油0( 01比6 : 1)0 ), 1,2 -디올레오일- _글리세로- 3 -포스포에탄올아민 (1,2 - dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine； DOPE) 1, 2 -디팔미토일- - 글리세로-3-포스포콜린(1,2- ᄆ¾1파 0父1- -요17。아0-3- 03 0(:]1011]16; ^1 ⁾

1 , 2 -디스테아로일- 글리세로- 3 -포스포콜린 ( 1 , 2- 근 1 - 311-요1 아0-3- ᄆ］!03ᄆ］10(：］1011 !½ ; 드  ) 1 , 2 -디리노레오일- _글리세로- 3 -포스포콜린 (1 , 2 - di 1 ino 1eoy 1 -sn-g 1ycero-3-phosphocholine； DLPC) 2022/003443 1»(그1’/182021/054673 포스파티딜세린 (]닛1031 ₎ ]131: 1 ₍ ¾，1361，1116 ; PS) 포스포에탄올라민 (phosphat idylethanolamine; PE)， 포스파티딜글리세롤 (phosphat idylglycerol ; PG) , 포스포릭 액시드 (phosphoric acid; PA) 및 포스파티딜콜린 (phosphat idylchol ine; PC)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다 . 바람직하게는， 상기 양이온성 지질은 D0TAP 또는 DDA이고， 중성 지질은 DMPC, DOPC, DOPE, DPPC 또는 DSPC인 것을 특징으로 할 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다 . 본 발명에 있어서， 상기 양이온성 리포좀 내 양이온성 지질의 중량비 ( 는 10 내지 100%인 것을 특징으로 할 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다 . 본 발명에서， 상기 중량비는 함량과 동일한 의미로 사용된다 . 본 발명의 일 실시 예에서， 사포닌의 용혈을 억제하는 양이온성 리포좀 내 양이온성 지질의 함량은 양이온성 지질 DDA는 30%〜 70%, 양이온성 지질 D0TAP은 10M00% 인 것을 확인할 수 있었다 . 본 발명에 있어서， 상기 리포좀은 글리코리피드 (glycol ipid)를 더 포함할 수 있으며， 상기 글리코리피드는 digalactosyldiglycer ide, ga 1 act osyldi glyceride sulfuric acid ester , galactosylceramide와 같은 sphingoglycol ipids , galactosylceramide sulfuric acid ester , lactosy leer amide, gang 1 i os ide G7 , gang 1 i os ide G6 및 gang 1 i os ide G4로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다 . 상기 리포좀은 스테롤 유도체를 더 포함할 수 있으며， 상기 스테롤 유도체는 cholesterol , dihydrocholesterol , cholesterol ester , phytosterol , 2022/003443 1^(:1^ 2021/054673 sterolglucoside, 1-0-sterolmaltoside및 l-0-sterolgalactoside와 같은 스테롤 유도체로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 리포좀은 글리콜 (glycol) 유도체를 더 포함할 수 있으며， 상기 글리콜 유도체는 ethylene glycol , diethylene glycol , triethylene glycol , propylene glycol , dipropylene glycol , trimethylene glycol 및 1,4 - butanediol로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나， 반드시 이에 제한되지는 않는다. 상기 리포좀은 지방성 아민(aliphatic amine)을 더 포함할 수 있으며， 상기 지방성 아민은 stearylamine, octylamine, oleylamine 및 linoleylamine으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나， 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 리포좀 제조법은 큰 사이즈의 리포좀을 만든 뒤 작은 사이즈로 분할하는 ¹ top-down methods ’와 지질 단량체를 이용해 작은 사이즈 리포좀을 조립하는 'bottom-up methods ’로 구분할 수 있다. Top-down method로 리포좀을 만들기 위해서는 지질을 유기용매에 용해시킨 후 유기용매를 제거하고 수용액으로 지질을 재수화하는 과정을 거치게 된다. 일반적으로 사용하는 리포좀 제조법은 film-rehydration method또는 lipid hydration method등이 있다. 이 방식을 통하면 LUV가 형성되며 이를 homogenizer , microfluidizer , 혹은 고압균질기 등을 이용해 물리적으로 파쇄시킴으로써 목적하는 사이즈의 리포좀을 제조할 수 있다. 2022/003443 1»（그1’/182021/054673 본 발명의 양이온성 리포좀은 thin f i lm method, injection method 또는 freeze-drying method의 방법으로 제조될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 thin f i lm method는 유기용매에 지질을 녹이고 건조시켜 생성되는 막에 용액을 넣어 제조하는 방법이며， 상기 injection method는 지질을 함유한 유기용매를 syringe로 떨어뜨려 제조하는 방법이고， 상기 freeze-drying method는 유기용매에 지질을 녹이고 동결건조하여 유기용매를 휘발시킨 후 용액으로 지질을 재수화하여 제조하는 방법이다. 본 발명에 있어서， 상기 제조된 리포좀은 보관의 용이성을 위해 선택적으로 동결건조를 수행할 수 있다. 리포좀을 동결건조하여 형성된 케이크， 플라그， 또는 분말은 사용시 멸균수로 재구성하여 투여할 수 있다. 상기 본 발명의 방법에 따라 제조된 리포좀은 주사제， 경피， 경비， 및 폐로의 약물송달에 사용될 수 있다. 이러한 제제화에 필요한 기술 및 약제학적으로 적절한 담체， 첨가제 등에 관해서는 당해 제제학 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려져 있으며， 이와 관련하여 Remington' s Pharmaceutical Sciences(19th ed. , 1995)를 참조할 수 있다. 본 발명에 있어서， 상기 양이온성 리포좀에 사포닌이 정전기적 인력에 의해 흡착된 것을 특징으로 할 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 양이온성 리포좀의 내부에 사포닌이 내포되거나， 양이온성 리포좀의 지질막에 사포닌이 결합될 수 있다. 본 발명의 용어 '흡착’은 리포좀 내부 또는 외부에 물질이 결합되는 것을 2022/003443 1»（그1’/182021/054673 의미하며， 본 발명에 따른 사포닌이 효과적으로 전달될 수 있는 형태라면 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서， 상기 사포닌은 Ginsenoside Rbl, 디지토닌， p-에스킨

Quillaja Saponaria유래 조 사포닌(crude saponin) 및 이의 분획물， QS21 , Qui 1 A, QS7, QS18, QS17 및 이의 염， 스테로이드성 사포닌(steroidal saponin) 및 트리테르페노이드 사포닌(triterpenoid saponin)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 스테로이드성 사포닌에는 Digitonin 또는 Paris VII이 포함되고， 상기 트리테르페노이드 사포닌어]는 Aescin, a-Hederin, Hederagenin, Echinocystic acid, Chrysanthel 1in A, Chrysanthel 1in B, Bayogenin, Medicagenic acid, Maslinic acid, Oleanolic acid, Erythroidal , Asiatic acid가 포함될 수 있다. 바람직하게는， 상기 사포닌은 Quillaja Saponaria 유래 조 사포닌(crude saponin) , QS21 , Digitonin, Paris VII , Aescin 또는 a-Hederin인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 따른 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 상기 양이온성 리포좀을 단독으로 포함하거나， 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체， 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 사포닌의 적혈구 용혈작용을 억제하기에 충분한 양을 말한다. 2022/003443 1^(:1^ 2021/054673 상기 "약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때， 통상적으로 위장 장애， 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 의미한다. 상기 담체， 부형제 및 희석제의 예로는， 락토즈， 텍스트로즈， 수크로즈， 솔비톨， 만니톨， 자일리톨， 에리스리톨， 말티톨， 전분， 아카시아 고무， 알지네이트， 젤라틴， 칼슘 포스페이트， 칼슘 실리케이트， 셀룰로즈， 메틸 셀룰로즈， 폴리비닐피롤리돈， 물， 메틸하이드록시벤조에이트， 프로필하이드록시벤조에이트， 탈크， 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한， 충진제， 항응집제， 윤활제， 습윤제， 향료， 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물은 인간을 제외한 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속， 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말， 과립， 정제， 에멀젼， 시럽， 에어로졸， 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀， 멸균 주사용액， 동결건조 분말， 멸균 분말의 형태일 수 있다. 본 발명의 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물은 경구， 경피， 피하， 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며， 활성 성분의 투여량은 투여 경로， 환자의 연령， 성별， 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 본 발명은 다른 관점에서， 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 사포닌의 적혈구 용혈 억제 방법에 관한 것이다. 2022/003443 1»（그1’/182021/054673 본 발명은 또 다른 관점에서， 사포닌의 적혈구 용혈 억제를 위한 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또 다른 관점에서， 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 약제 제조를 위한 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물의 사용에 관한 것이다. 본 발명에 있어서， 상기 방법， 용도， 사용은 상술한 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 포함하기 때문에， 상술한 본 발명의 용혈 억제용 조성물과 중복된 내용은 그 기재를 생략한다. 본 발명은 또 다른 관점에서， 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또 다른 관점에서， 상기 면역증강용 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 면역증강방법에 관한 것이다. 본 발명은 또 다른 관점에서， 면역증강을 위한 상기 면역증강용 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또 다른 관점에서， 면역증강용 약제 제조를 위한 상기 면역증강용 조성물의 사용에 관한 것이다. 본 발명에 있어서， 상기 면역증강용 조성물， 면역증강방법， 면역증강용 조성물의 용도 및 사용은 상술한 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 포함하기 때문에， 상술한 본 발명의 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물과 중복된 내용은 그 기재를 생략한다. 본 명세서에서 사용된 용어， ”면역증강"은 초기 면역반응을 유도하거나 항원에 대한 기존의 면역반응을 측정 가능할 정도로 증가시키는 것을 의미한다. 2022/003443 1»（그1’/182021/054673 본 발명에 있어서， 상기 면역증강용 조성물은 단독 또는 추가의 면역보조제 (adjuvant)를 포함하여 약학적 조성물로 제형화할 수 있다. 상기 면역보조제는 예를 들어 Mg, Ca, Sr , Ba 및 Ra으로 구성된 군으로부터 선택되는 제 2족 원소 또는 이의 염 ; Ti , Zr , Hf 및 Rf로 구성된 군으로부터 선택되는 제 4족 원소; 알루미늄의 염 또는 그의 수화물; 또는 디메틸옥타데실암모니윰 브로마이드를 포함할 수 있다. 상기 염은， 예를 들면， 옥사이드， 퍼옥사이드， 하이드록사이드， 카보네이트， 포스페이트， 파이로포스페이트， 하이드로겐포스페이트， 다이하이드로겐포스페이트， 설페이트 또는 실리케이트와 함께 형성된다. 또한， 상기 면역보조제는 예를 들어， TLRs(Tol 1-l ike receptors) agonist , RLRs(RIG_I_l ike receptors) agonist 및 NLRs(N0D-l ike receptors) agonist로 구성된 군에서 선택되는 PRRs(pattern recognition receptors) agonist를 포함할 수 있다. 본 발명은 또 다른 관점에서， 상기 사포닌의 적혈구 용혈 억제용 조성물을 포함하는 약물 전달용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또 다른 관점에서， 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 양이온성 리포좀을 포함하는 약물전달체에 관한 것이다. 본 발명은 또 다른 관점에서， 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 양이온성 리포좀에 약물이 흡착 또는 봉입되어 있는 약물-전달체 복합체에 관한 것이다. 본 발명에 있어서， 상기 양이온성 지질 또는 중성 지질은 하나 이상의 2022/003443 1»（그1’/182021/054673 불포화 지방산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서， 상기 약물 전달용 조성물， 약물전달체 및 약물-전달체 복합체는 상술한 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 양이온성 리포좀을 포함하기 때문에， 상술한 본 발명의 양이온성 지질 및 중성 지질을 함유하는 양이온성 리포좀과 중복된 내용은 그 기재를 생략한다 . 본 발명에 있어서， 상기 약물은 단백질， 유전자， 펩타이드， 화합물， 항원 또는 천연소재 등 본 발명에 따른 양이온성 리포좀을 이용하여 전달될 수 있는 것이라면 제한 없이 적용 가능하다. 본 발명에 따른 면역증강용 조성물， 약물 전달용 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다 (Remington ’ s Pharmaceut ical Science, Mack Publ ishig Co. , Easton PA) . 또한， 각각 통상의 방법에 따라 산제， 과립제， 정제， 캡슐제， 현탁액， 에멀젼， 시럽， 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 면역증강용 조성물 또는 약물 전달용 조성물에 포함될 수 있는 담체， 부형제， 희석제로는 락토즈， 텍스트로스， 슈크로스， 솔비톨， 만니톨， 자일리톨， 말티톨， 전분， 글리세린， 전분， 아카시아 고무， 알지네이트， 젤라틴， 칼슘포스페이트， 칼슘 실리케이트， 셀룰로즈， 메틸 셀룰로즈， 미정질 셀룰로즈， 폴리비닐 피롤리돈， 물， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트， 탈크， 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 중진제， 증량제， 결합제， 습윤제， 2022/003443 1»（그1’/182021/054673 붕해제， 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제， 환제， 산제， 과립제， 캡슐제 등이 포함되며， 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분， 칼슘카보네이트(calcium carbonate) , 슈크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose) , 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제， 내용액제， 유제， 시럽제 등을 사용할 수 있으며， 흔히 사용되는 단순 희석제인 물， 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제， 예를 들면 습윤제， 감미제， 방향제， 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액， 비수용성제， 현탁제， 유제， 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제， 현탁제로는 프로필 렌글리콜(propylene glycol ) , 폴리에틸렌 글리콜， 올리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 면역증강용 조성물 또는 약물 전달용 조성물은 투여대상의 나이， 성별， 체중 등에 따라 투여량이 달라질 수 있고， 투여 경로， 질병의 정도， 성별， 체중， 나이 등에 따라서도 투여량이 증감될 수 있다. 이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서， 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 2022/003443 1^(:1^ 2021/054673 실시예 1： 재료 하기 실시예들에서 사용된 리포좀의 재료인 하기 표 1에 나타내었다.

【표 11 상기 표 1에서 (18:0), (18:1), (14:0), (16:0) 등은 각 지질의 포화도(saturation)를 나타낸 것으로, "N:0"은 모두 saturated된 지질을 의미하며 , "N:l"은 개의 탄소당 1개의 비율로 unsaturated된 지질을 의미한다. 각 지질의 출처는 다음과 같다:

Cationic lipid:D0TAP(Merck),DDA(Sigma-Aldrich)

Neutral lipid： DMPC(Corden pharma), DOPC, DOPE, DSPC, DPPC(Avanti plolar lipids)

Anionic lipid:DMPG(Avanti polar lipids) 2022/003443 1»(그1’/182021/054673 실시예 2: 리포좀 극성에 따른 이"1!(16 3크1)01 11의 용혈작용 (11611101x^3) 억제능 비교 리포좀 극성에 따른 crude saponin의 용혈작용 억제능을 확인하고자 Freezing-drying method로 양이온성， 중성， 음이온성 리포좀을 제조하고 hemolysis 분석을 수행하였다. 실시 예 2-1： 리포좀 제조 본 실시 예에서 사용된 리포좀의 종류를 하기 표 2에 나타내었다.

【표 2】 상기 표 2의 리포좀은 하기의 방법으로 제조하였다:

1) 70mL 유리 용기에 40mg의 DDA, DOPC, DMPG를 칭량하여 넣는다.

2) 각각의 용기에 20mL의 t -butyl alcohol을 넣어 2mg/mL의 l ipid stock solut ion을 제조하고 10분간 65 ^° C에서 중탕하여 l ipid를 완전히 용해시킨다.

3) 하기 표 3과 같이， 10mL 유리용기에 DDA, D0PC, DMPG를 혼합하여 l ipid mixture를 만든다.

【표 3] 2022/003443 1^(:1^ 2021/054673

4) 각 vial의 입구를 sealing tape로 감은 뒤 5초 동안 vortex mix하여 혼합하고, 주사기 바늘을 이용해 sealing tape에 츰츰하게 구멍을 낸다.

5) -70°C냉동고에서 2시간 동안 동결한 후 동결 건조기로 옮겼다. 20 Pa,

-80°C조건에서 약 18시간 동안 동결 건조하여 유기 용매를 휘발시킨다.

6) 리포좀 케이크는 사용 전까지 냉장 보관하고, vial당 lOmL의 sucrose in HEPES buffer(pH 7.4)로 수화하여 실험에 사용한다. 실시예 2 ^~ 2： Hemolysis분석 방법

1) 96 well plate에 liposome, saponin, sucrose in HEPES buffer(pH 7.4) 및 정제수를 하기 표 4및 표 5에 기재된 바와 같이 넣는다.

【표 4] 2022/003443 1»（그1’/182021/054673

【표 5] 상온， 300 제 조건으로 30분 동안 반응시킨다.

3) 3mL의 RBC를 lOmL의 PBS로 suspension하고 상온， 1500rpm조건으로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하였다.

4) 2)-3)과정을 3회 반복하여 RBC를 washing한다.

5) RBC pellet을 lmL의 PBS로 suspension하고 1/100로 희석한 후 cell 2022/003443 1^(:1^ 2021/054673

0)11111: 1 한다 .

6) PBS를 이용하여 RBC를 1.5 x 10 ⁹ cells/mL이 되도록 희석하고, 상기 2)의 시험물질이 처리된 96 wellplate에 3 x 10 ⁷ cells/20|」L/wel1씩 처리한다.

7) Orbital shaker를 이용해 상온, 300rpm 조건으로 1시간 동안 반응시킨다.

8) 96 wellplate를 상온, 1500rpm조건으로 5분 동안 원심분리한다.

9) 상층액 50ML를 새 96 well plate로 옮긴 뒤 415·에서 흡광도를 측정한다.

10)다음의 공식으로 hemolysis %를 계산한다.

Hemolysis (%) = (샘플의 0D - 0% Hemolysis의 0D)/(100% Hemolysis의0D - 0% Hemolysis의 0D)xl00 실시예 2 ^~ 3： Hemolysis분석 결과

10yg의 Crude saponin에 의한 용혈 효과를 억제하는 리포좀 극성을 확인하였다. 그 결과, 중성 리포좀(D0PC)및 음이온성 리포좀(DMPG:D0PC)은 Crude saponin에 의한 Hemolysis를 억제하지 못한 반면 (도 1), 100|Jg의 양이온성 리포좀(DDA:D0PC)은 Crude saponin에 의한 Hemolysis를 85%억제하였다 (도 2). 실시예 3： 양이온성 리포좀의 사포닌에 의한 용혈작용(1½111017 3)억제 2022/003443 1»(그1’/182021/054673 스크리닝 양이온성 및 중성 리피드의 불포화도에 따른 양이온성 리포좀의 사포닌 용혈 억제 효과를 확인하기 위하여， Lipid f i lm법으로 다양한 리포좀을 제조하고 hemolysis 및 cytotoxicity(HaCat , L6, J774A.1)를 분석하였다. 실시예 3-1： 리포좀 제조 본 실시예에서 사용된 리포좀의 종류를 하기 표 6에 나타내었다.

【표 6】 상기 표 6의 리포좀은 하기의 방법으로 제조하였다:

1) 01388 止6에 양이온성 지질 및 중성 지질을 각각 칭량하여 넣는다. 2022/003443 1^(:1^ 2021/054673

2) Lipid농도가 2mg/mL이 되도록 chloroform(Daejung)을 넣고, 37°C에서

10분간 완전히 용해시켜 lipid solution을 만든다.

3) 둥근 바닥 플라스크에 cationic lipid solution과 neutral lipid solution을 각각 1:1(중량비 )로 혼합하여 lipid mixture를 만든다.

4) Rotary evaporator로 D0TAP을 함유하는 lipid mixture는 60°C, DDA를 함유하는 lipid mixture는 80°C에서 30분간 휘발을 진행하여 chloroform이 남아있지 않고 플라스크 벽면에 지질막 필름이 형성되는지 확인한다.

5) 리포좀의 농도가 2mg/mL이 되도록 플라스크에 sucrose in HEPES buffer(pH 7.4)를 넣고 65°C에서 지질막을 녹였다.

6) 제조된 리포좀을 glass vial에 500此씩 분주하고 고무전을 vial 입구에 올린 후, 동결건조기 (Ilshinbiobase/Lyoph-pridelO, SXX2)에 넣고 하기 표 7과 같이 동결건조하였다.

【표 7] 2022/003443 1^(:1^2021/054673

7) 제조된 리포좀은 시험 전까지 4%: 냉장고에 보관하였다. 실시 예 3 ^~ 2： Hemolysis 분석 방법

1) 동결건조 후 Glass vial에 보관된 리포좀에 225ᅭ의 정제수를 넣어 수화하고 , 60°C에서 10분간 반응시켜 리포좀을 완전히 용해시킨다.

2) 96 wel l plate에 l iposome, saponin, sucrose in HEPES buf fer(pH 7.4) 및 정제수를 하기 표 8 및 표 9와 같이 넣는다.

【표 8] 2022/003443 1»(그1’/182021/054673

【표 9] 상온， 300 제 조건으로 30분 동안 반응시킨다.

4) 3mL의 RBC를 lOmL의 PBS로 suspension하고 상온， 1500rpm조건으로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하였다.

5) 3)-4)의 과정을 3회 반복하여 RBC를 washing한다.

6) RBC pellet을 lmL의 PBS로 suspension하고 1/100로 희석한 후 cell counting한다.

7) PBS를 이용하여 RBC를 1.5 X 10 ⁹ cells/mL이 되도록 희석하고， 상기

2)의 시험물질이 처리된 96 well plate에 3 x 10 ⁷ cel 1S/20|JL八vel 1씩 처리한다. 2022/003443 1»（그1’/182021/054673

8) 이용해 상온， 300대111 조건으로 1시간 동안 반응시킨다.

9) 96 wel l plate를 상온， 1500rpm 조건으로 5분 동안 원심분리한다.

10) 상층액 50i止를 새 96 wel l plate로 옮긴 뒤 415·에서 흡광도를 측정한다.

11) 다음의 공식으로 hemolysis %를 계산한다.

Hemolysis (%) = (샘플의 0D - 0% Hemolysis의 0D)/(100% Hemolysis의 0D - 0% Hemolysis의 0D)xl00 실시 예 3-3： 사포닌 별 용혐 농도 확인

Quillaja Saponaria 유래 crude saponin(VET_SAP ^® ， Desert King) 및

QS21(Desert King)의 농도에 따른 용혈현상을 확인한 결과， crude saponin은 2.5 Mg일 때， QS21은 2.5jjg일 때， 100% Hemolysis가 나타나는 것을 확인하였다 (도 3 및 도 4) . 실시 예 3-4： 양이온성 리포좀의 사포닌에 의한 용혐현상 억제 효과 확인 2.5 y요의 crude saponin 및 QS21에 의한 용혈을 억제하는 양이온성 리포좀과 그 농도를 확인하였다. 그 결과， DDA：DMPC, DDA：DPPC 및 DDA:DSPC는 Crude saponin, QS21에 의한 hemolysis를 100%까지 억제하지는 못하였다 (도 5 내지 도 7) . 반면， crude 2022/003443 1^(:1^ 2021/054673 saponin, QS21에 의한 Hemolysis가 100%억제되는 용량은, DDA:D0PC는 25yg일 때(Liposome:Saponin = 10:1), D0TAP:DMPC는 50y요일 때(Liposome:Saponin = 20:1), D0TAP:DPPC는 50yg일 때(Liposome:Saponin = 20:1), D0TAP:DSPC는 50u g일 때(Liposome:Saponin = 20:1), D0TAP:D0PC는 25yg일 때(Liposome:Saponin = 10:1), D0TAP:D0PE는 12.5yg¾ 때(Liposome:Saponin = 5:1)임을 확인할 수 있었다 (도 8내지 도 13). 또한, 2.5yg crude saponin 및 QS21에 의한 Hemolysis를 억제하는 양이온성 리포좀의 LP함량을 IC5o(Liposome concentration to inhibit 50% of hemolysis)및 ICioo(Liposome concentration to inhibit 100% of hemolysis)을 이용하여 확인하였다 (표 10및 표 11).

【표 10] 2022/003443 1^(:1^ 2021/054673

【표 111 2022/003443 1»（그1’/182021/054673 결과적으로， 중성 지질만을 포함하는 중성 리포좀과 달리， 양이온성 지질을 포함하는 양이온성 리포좀의 경우 용혈억제능을 갖는 것을 확인하였으며， 양이온성 리포좀에 포함되는 지질의 saturat ion 조합에 따라서 리포좀의 용혈억제능에 현저한 차이가 있음을 확인할 수 있었다 . 즉， 양이온성 리포좀 내 불포화 지방산의 함량이 높을수록 사포닌에 의한 용혈작용에 대한 억제 효과가 뛰어난 것을 확인할 수 있었다 (도 14) . 실시예 4: 리포좀의 세포독성 (cytotoxicity) 분석 실시 예 4-1： 분석 방법

1) HaCat (Human kerat inocyte)(High glucose DMEM, 10% FBS, 1%

Penici 11 in-streptomycin)을 각각 37 ^° C , 5% CO ₂ incubator에서 배양한다 .

2) 각각의 세포가 100mm dish의 80〜 90%의 conf luency를 나타낼 때， 세포 배양액을 suet ion하여 제거하고， PBS 5mL로 세포를 세척한다 .

3) 상기 100mm dish에 Trypsin-EDTA solut ion 5mL을 넣고 37 ^° C , 5% CO ₂ 조건에서 3~6분 동안 반응시킨 후 , 세포 배양 배지 5mL을 추가하고， 세포 부유액을 15mL tube로 옮겨 l，500rpm, 상온， 3분 조건으로 원심분리한 후 상층액을 제거한다 .

4) 상기 세포를 lOmL의 PBS로 suspension 하고 l，500rpm, 상온， 3분 조건으로 3분 원심분리한 후 상층액을 제거한다 .

5) 상기 과정들을 2회 반복하여 세포를 2022/003443 1»（그1’/182021/054673

6) 수득한 세포에 세포 배양 배지 3mL을 넣어 세포를 부유시킨 후 trypan blue staining하여 세포수와 viability를 확인하기 위한 cell counting을 한다.

6) 세포의 viability가 85% 이상임을 확인하고， 배양 배지를 사용하여 세포부유액의 농도를 lxl0 ⁵ cells/mL로 맞춰 96 well plate에 100j止八 veil로 분주하고， 37 ^° C, 5% C0 ₂ 조건에서 24시간 동안 배양한다.

7) 동결건조 후 리포좀이 보관된 glass vial에 225ᅭ의 정제수를 넣어 수화하고， 60 ^° C에서 10분간 반응시켜 리포좀을 완전히 용해한다 (리포좀 농도: 4.4mg/mL) .

8) 96 well plate에 22.5|JL 리포좀， 10|JL 사포닌 (0.25mg/mL)， 67.5|JL buffer를 혼합하고 Orbital shaker에서 상온， 300rpm 조건으로 30분 동안 반응시킨다.

9) 리포좀과 사포닌 혼합물을 96 well plate에 2()ML/well로 분주하고，

37 ^° C, 5% CO ₂ 조건에서 18시간 동안 배양한다.

10) Ez-cytox와 세포 배양 배지를 7:3으로 혼합한 후 24 well plate에

50MUwell씩 분주하고 37 ^° C, 5% C0 ₂ 조건에서 3시간 동안 반응시킨다.

11) 96 well plate를 1500rpm, 상온， 5분 조건으로 원심분리 한다.

12) 상층액 1001止를 새 96 well plate로 옮긴 뒤 450·에서 흡광도를 측정한다.

13) 다음의 공식으로 cytotoxicity %를 계산한다.

Cytotoxicity (%) = 100 - [(샘플의 0D/Buffer의 0D)xl00] 2022/003443 1»（그1’/182021/054673 실시 예 4-2： 결과 도 15에 나타난 바와 같이， 양이온성 리포좀 내 불포화 지방산의 함량이 높을수록 적은 cytotoxicity를 나타내었다. 실시 예 3의 결과와 종합하면， 불포화 지방산을 함유하는 양이온성 리포좀을 사용할 경우 적은 cytotoxicity를 나타내면서 사포닌에 의한 hemolysis를 100%억제할 수 있음을 확인할 수 있다. 실시예 5： 다양한 사포닌 용혈 억제 스크리닝 양이온성 리포좀의 사포닌에 의한 용혈 억제 효과를 Qui 1laja Saponaria 유래 crude saponin및 QS21외의 다양한 사포닌에서 확인하고자 하였다. 실시 예 5-1： 방법

Lipid film법으로 다양한 리포좀을 제조하였으며， hemolysis 분석을 수행하였다. 본 실시 예에서 사용된 사포닌 및 양이온성 리포좀의 종류는 각각 하기 표 12 및 표 13에 나타내었다.

【표 12] 2022/003443 1»(그1’/182021/054673 상기 표 12의 함량에 있어서， 사용 가능한 리포좀 함량에 한계가 있기 때문에 60% 1½1110 3를 일으키는 사포닌 농도를 선택하였다.

【표 13] 실시 예 5-2： 리포좀 제조 본 실시 예에서 사용된 리포좀은 하기의 방법으로 제조하였다: 2022/003443 1^(:1^ 2021/054673

1) Glass tube에 양이온성 지질 및 중성 지질을 각각 칭량하여 넣는다.

2) Lipid농도가 4mg/mL이 되도록 chloroform을 넣고, 37°C에서 10분간 완전히 용해시켜 lipid solution을 만든다.

3) 둥근 바닥 플라스크에 cationic lipid solution과 neutral lipid solution을 각각 1:1(중량비 )로 혼합하여 lipid mixture를 만든다.

4) Rotary evaporator로 D0TAP을 함유하는 lipid mixture는 60°C , DDA를 함유하는 lipid mixture는 80°C에서 30분간 휘발을 진행하여 chloroform이 남아있지 않고 플라스크 벽면에 지질막 필름이 형성되는지 확인한다.

5) 리포좀의 농도가 4mg/mL이 되도록 플라스크에 sucrose in HEPES buffer(pH 7.4)를 넣고 60°C에서 지질막을 녹였다.

6)제조된 리포좀은 시험 전까지 4 ^° C냉장고에 보관하였다. 실시 예 5 ^~ 3： Hemolysis분석 방법

1) 96 well plate에 liposome, saponin, sucrose in HEPES buffer(pH 7.4) 및 정제수를 하기 표 14및 표 15에 기재된 바와 같이 넣는다.

【표 14] 2022/003443 1»（그1’/182021/054673

【표 15]

2) Orbital shaker에서 상온， 300rpm조건으로 30분 동안 반응시킨다.

3) 3mL의 RBC를 lOmL의 PBS로 suspension하고 상온， 1500rpm조건으로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 2022/003443 1^(:1^ 2021/054673

4) 2)-3)과정을 3회 반복하여 한다.

5) RBC pellet을 lmL의 PBS로 suspension하고 1/100로 희석한 후 cell counting한다.

6) PBS를 이용하여 RBC를 1.5 x 10 ⁹ cells/mL이 되도록 희석하고,상기 2)의 시험물질이 처리된 96 wellplate에 3 x 10 ⁷ cells/20|」L/wel1씩 처리한다.

7) Orbital shaker를 이용해 상온, 300rpm 조건으로 1시간 동안 반응시킨다.

8) 96 wellplate를 상온, 1500rpm조건으로 5분 동안 원심분리한다.

9) 상층액 50ML를 새 96 well plate로 옮긴 뒤 415·에서 흡광도를 측정한다.

10)다음의 공식으로 hemolysis %를 계산한다.

Hemolysis (%) = (샘플의 0D - 0% Hemolysis의 0D)/(100% Hemolysis의 0D - 0% Hemolysis의 0D)xl00 실시 예 5-4: Steroidal saponin에 의한 용혈 작용(hemolysis)억제 효과 확인

100% hemolysis를 일으키는 Digitonin,Paris VII의 농도를 확인한 결과, Digitonin은 10|jg, Paris VII는 5|jg일 때 100% hemolysis가 나타났으며,

Digitonin이 2.5|jg,Paris VII이 1.25|jg일 때 60% hemolysis가 나타났다 (도 16) 2022/003443 1^(:1^ 2021/054673 이에 따라, 2.5y요의 Digitonin에 의한 용혈 효과를 억제하는 DDA(18:0):DMPC(14:0),DDA(18:0):D0PC(18:1)의 농도를 확인한 결과,DDA:DMPC는

Digitonin에 의한 hemolysis를 억제하지 못하였으며 , DDA:D0PC는 400|jg일 때(Liposome:Saponin = 160:1) Digitonin에 의한 hemolysis를 100%억제함을 확인하였다 (도 17).

2.5y요의 Digitonin에 의한 용혈 효과를 억제하는 D0TAP(18:1):DMPC(14:0), D0TAP(18:1):D0PC(18:1 )의 농도를 확인한 결과，

D0TAP:DMPC가 400|jg일 때(Liposome:Saponin = 160:1) Digitonin에 의한 hemolysis가 100%억제되었으며 , D0TAP:D0PC가 200|」g일 때(Liposome:Saponin = 80:1) Digitonin에 의한 hemolysis가 100%억제됨을 확인하였다 (도 18). 또한, 1.25 의 Paris VII에 의한 용혈 효과를 억제하는

DDA(18:0):DMPC(14:0),DDA(18:0):D0PC(18:1)의 농도를 확인한 결과,DDA:DMPC는

Paris VII에 의한 hemolysis를 억제하지 못하였고,DDA:D0PC는 400|jg일 때 Paris

VII에 의한 hemolysis가 50%억제됨을 확인하였다 (도 19).

1.25y요의 Paris VII에 의한 용혈 효과를 억제하는 D0TAP(18:1):DMPC(14:0), D0TAP(18:1):D0PC(18:1 )의 농도를 확인한 결과，

D0TAP:DMPC가 400|jg일 때(Liposome:Saponin = 320:1) Paris VII에 의한 hemolysis가 100% 억제되었고. D0TAP:D0PC가 400jjg일 때 Paris VII에 의한 hemolysis가 100%억제됨을 확인하였다 (도 20). 2022/003443 1^(:1^2021/054673 실시 예 5-5: Triterpenoidal saponin에 의한 용혈 작용(hemolysis)억제 효과 확인

100% Hemolysis를 일으키는 Aescin, a-Hederin의 농도를 확인한 결과, Aescin은 5|jg, a-Hederin은 10|jg일 때 100% hemolysis가 나타났으며, Aescin 2.5|jg,a-Hederin 1.25|jg일 때 60% hemolysis가 나타났다 (도 21). 이에 따라, 2.5|jg의 Aescin에 의한 용혈 효과를 억제하는

DDA(18:0):DMPC(14:0),DDA(18:0):D0PC(18:1)의 농도를 확인한 결과,DDA:DMPC는 Aescin에 의한 hemolysis를 억제하지 못하였고, DDA:D0PC는 400y요일 때(Liposome:Saponin = 160:1) Aescin에 의한 hemolysis를 100%억제하였다 (도 22) .

2.5yg의 Aescin에 의한 용혈 효과를 억제하는 D0TAP(18：1)：DMPC (14:0), D0TAP(18:1):D0PC(18:1)의 농도를 확인한 결과, D0TAP:DMPC, D0TAP:D0PC는 각각

200|Jg일 때(Liposome:Saponin = 80:1)Aescin에 의한 hemolysis를 100%억제함을 확인하였다 (도 23). 또한, 1.25|jg의 a-Hederin에 의한 용혈 효과를 억제하는

DDA(18:0):DMPC(14:0),DDA(18:0):D0PC(18:1)의 농도를 확인한 결과,DDA:DMPC는 a-Hederin에 의한 hemolysis를 억제하지 못하였고, DDA:D0PC는 13|jg일 2022/003443 1^(:1^ 2021/054673 때 (Liposome:Saponin = 10.4:1) a-Hederin에 의한 hemolysis가 100% 억제되었다 (도 24).

1.25|jg의 a-Hederin에 의한 용혈 효과를 억제하는

D0TAP(18:1):DMPC(14:0 )， D0TAP(18:1):D0PC(18:1 )의 농도를 확인한 결과， D0TAP:DMPC, D0TAP:D0PC는 각각 13|」g일 때 (Liposome:Saponin = 10.4:1) a-

Hederin에 의한 hemolysis가 100%억제되었다 (도 25). 실시 예 5-6： 결과 다양한 saponin에 의한 hemolysis를 억제하는 리포좀의 함량은 하기 표

16에 나타난 바와 같다. 【표 16】

IC ₅₀ :Liposome concentration to inhibit 50% of hemolysis.

1C· :Liposome concentration to inhibit 100% of hemolysis. 그 결과,양이온성 리포좀 내 불포화 지방산이 존재하는 경우 사포닌에 2022/003443 1»(그1’/182021/054673 의한 용혈 효과 억제 효과가 뛰어난 것을 확인할 수 있다. 실시 예 6: 사포닌에 의한 용혈 (hemolysis)을 억제하는 양이온성 리포좀 내 양이온성 및 중성 지질의 비율 확인 사포닌에 의한 용혈 효과를 억제하는 양이온성 리포좀 내 양이온성 지질과 중성 지질의 비율을 확인하고자， Freeze-drying method로 양이온성 지질 및 중성 지질의 비율별 양이온성 리포좀을 제조하고 hemolysis 분석을 수행하였다. 실시 예 6-1： 리포좀 제조 본 실시 예에서 사용된 리포좀의 종류를 하기 표 17에 나타내었다. 【표 17】 상기 표 17의 리포좀은 하기의 방법으로 제조하였다:

1) 70mL유리 용기에 240mg의 DDA, DOPC, DOTAP, DMPC를 칭량하여 넣는다.

2)각각의 용기에 60mL의 t-butyl alcohol을 넣어 4mg/mL의 lipid stock solution을 제조하고 10분간 가열하여 lipid를 완전히 용해시킨다.

3)하기 표 18과 같이， lOmL유리용기에 DDA, DOPC, DMPG를 혼합하여 2022/003443 1^(:1^ 2021/054673 lipid mixture를 만든다.

【표 18]

4)각 vial의 입구를 sealing tape로 감은 뒤 5초 동안 vortex mix하여 혼합하고, 주사기 바늘을 이용해 sealing tape에 줌줌하게 구멍을 낸다.

5) -70°C냉동고에서 2시간 동안 동결한 후 동결 건조기로 옮겼다. 20Pa,

-80°C조건에서 약 18시간 동안 동결 건조하여 유기 용매를 휘발시킨다. 2022/003443 1^(:1^ 2021/054673

6) 리포좀 케이크는 사용 전까지 냉장 보관하고,vial당 lOmL의 sucrose in HEPES buffer(pH 7.4)로 수화하여 실험에 사용한다. 실시 예 6 ^~ 2： Hemolysis분석 방법

1) 96 well plate에 liposome, saponin, sucrose in HEPES buffer(pH 7.4) 및 정제수를 하기 표 19및 표 20에 기재된 바와 같이 넣는다.

【표 19] 2022/003443 1»(그1’/182021/054673

【표 20] 상온， 300 제조건으로 30분 동안 반응시킨다. 의 표 로 3배?6 1011하고 상온， 1500 제 조건으로 5분 동안 원심분리한후 상층액을 제거하였다. 2022/003443 1»（그1’/182021/054673

4) 2)-3)을 3회 반복하여 한다.

5) RBC pellet을 lmL의 PBS로 suspension하고 1/100로 희석한 후 cell counting한다.

6) PBS를 이용하여 RBC를 1.5 X 10 ⁹ cells/mL이 되도록 희석하고， 상기 2)의 시험물질이 처리된 96 wellplate에 3 x 10 ⁷ cells/20|jL/wel1씩 처리한다.

7) Orbital shaker를 이용해 상온， 300rpm 조건으로 1시간 동안 반응시킨다.

8) 96 wellplate를 상온， 1500rpm조건으로 5분 동안 원심분리한다.

9) 상층액 50i止를 새 96 well plate로 옮긴 뒤 415 ■에서 흡광도를 측정한다.

10)다음의 공식으로 hemolysis %를 계산한다.

Hemolysis (%) = (샘플의 0D - 0% Hemolysis의 0D)/(100% Hemolysis의 0D - 0% Hemolysis의 0D)xl00 실시 예 6-3: Hemolysis분석 결과에 따른 양이온성 리포좀 내 양이온성 및 중성 지질의 비율 확인

1)사포닌의 용혐 효과를 억제하는 DDA(18:0):D0PC(18:1)의 지질 비율 2.5|Jg Digitonin에 의한 hemolysis는 DDA:D0PC내 DDA의 함량이 40% ~

60%일 때 100%억제되었으며， 1.25!jg a-Hederin에 의한 hemolysis는 DDA：D0PC 내 DDA의 함량이 30% - 70%일 때 100%억제되었다 (도 26). 2022/003443 1»（그1’/182021/054673

2.5| 011（16 3요1）01 11에 ^）쇼의 함량이 30%

- 70%일 때 100% 억제되었으며， 2.5!花 £21에 의한 1½1110 3는 예 1）0灰： 내 抑쇼의 함량이 30% - 70%일 때 100% 억제되었다（도 27）.

2）사포닌의 용혐 효과를 억제하는 1） 쇼?（18:1）:¾灰：（14:0）의 지질 비율 내 쇼 의 함량이 30%이상일 때 100%억제되었다（도 29）.

3）사포닌의 용혈 효과를 억제하는 1） 쇼?（18:1）:1）0比（18:1）의 지질 비율

2.51擔 1）^ ₀ 11에 의 함량이 40% 이상일 때 100% 억제되었으며， 1.25 «- （뇨!^!!에 의한 1161110173 는

1）（付쇼?:1）0灰： 내 쇼 의 함량이 20% 이상일 때 100% 억제되었다（도 30）.

2.5| 011（1 _{6 3} 표1） ₀₁₁ 111에 의한］1 ₆₁₁₁₀ 17 ₃ 는 ⑴ ］ ³ :!^］ ¹ !: 내 ⑴ ］ ³ 의 함량이

10% 이상일 때 100% 억제되었으며， 2.5!花 £21에 의한 1½1110 3^는 1）（付쇼?:1）0 ： 내 쇼 의 함량이 10% 이상일 때 100% 억제되었다（도 31）. 2022/003443 1»（그1’/182021/054673 실시 예 6-4： 결과 상기 실시 예 6-3에 기재된 바와 같이， 다양한 사포닌에 대한 다양한 양이온성 리포좀 내의 양이온성 지질 및 중성 지질의 비율을 확인한 결과， 양이온성 리포좀 내 양이온성 지질의 비율이 10 〜 100%일 때 사포닌에 의한 효과적으로 억제되었다（표 21）.

【표 21] 2022/003443 1^（:1^2021/054673

◦ : 사포닌에 의한 11611101 3^가 억제됨. 2022/003443 1»（그1’/182021/054673 산업상 이용가능성 사포닌은 강력하고 효과적인 면역학적 활성을 포함하여 항염증 등 광범위한 약리학적， 생물학적 활성을 나타내어 의학적， 약학적으로 유용하게 이용될 수 있으나， 적혈구에 대해 용혈현상을 일으키는 단점이 있다. 이에 일반적으로 콜레스테롤 등을 함께 사용하여 사포닌의 용혈작용을 억제하나， 본 발명에서는 사포닌의 용혈 억제능에 있어 보다 효과적이고， 경제적인 양이온성 리포좀을 이용하여 사포닌의 적혈구 용혈작용을 억제할 수 있음을 확인하였다. 따라서， 본 발명에 따르면， 면역증강제， 약물전달체 제조 등에 있어서， 사포닌을 보다 유용하게 사용할 수 있다. 이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며， 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.