CN101587043A | 2009-11-25 | |||
CN101880650A | 2010-11-10 | |||
CN101144070A | 2008-03-19 |
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权 利 要 求 书 1. 一种用于从疾病动物模型的哺乳类动物血液中快速获取循环的非血缘性有核稀 有细胞的组合物, 由下述成份组成: 缓冲液, 包被了抗血缘性有核细胞表面标 识物抗体的磁性或非磁性免疫微球或免疫颗粒, 以及细胞分离介质, 其中, 所 述缓冲液的渗透压介于 260〜320 mOsm/kg H20、 pH为 6.8〜7.8, 所述细胞分 离介质在 20°C下的比重为 1.072〜1.076 克 /毫升, 所述细胞分离介质包含选自 下列试剂中的任意一种或任意两种以上的成份: 聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二 氧化硅, 多聚糖和泛影酸钠或其衍生物, 一种含糖的溶液, 由蔗糖和表氯醇聚 合而成的非离子聚合物。 2. 根据权利要求 1所述的组合物, 其中, 所述免疫微球或免疫颗粒的比重高于所 述细胞分离介质的比重, 所述免疫微球或免疫颗粒共价或非共价结合有特异性 地识别下述哺乳类动物的白细胞表面标示物的一种或多种的多克隆或单克隆抗 体: CD3、 CD31、 CD34、 CD45、 CD69、 CD84、 或 CD 102。 3. 根据权利要求 1或 2所述的组合物, 其中, 所述循环的非血缘性有核稀有细胞 选自: 循环的具有上皮来源的任何实体瘤细胞、 或不具有上皮来源的任何肿瘤 细胞, 循环的血管内皮细胞, 肿瘤干细胞, 干细胞, 以及免疫细胞。 4. 根据权利要求 1至 3中任一项所述的组合物, 其中, 所述缓冲液的渗透压介于 260〜320 mOsm/kg H20、 pH为 6.85〜7.75,所述含糖溶液为选自以下的糖的溶 液: 右旋糖苷, 多聚糖和泛影酸钠或其衍生物, 或蔗糖, 所述细胞分离介质在 20°C下的比重为 1.0722〜1.0758 克 /毫升。 5. 根据权利要求 3所述的组合物, 疾病动物模型为肿瘤动物模型, 所述肿瘤细胞 来自动物自身生长, 或因引入人或动物的所有上皮来源的实体瘤细胞, 包括但 不局限于胰腺癌、 肺癌、 宫颈癌、 食管癌、 结直肠癌、 乳腺癌、 胃癌、 肝癌等; 或不具有上皮来源的肿瘤细胞, 如黑色素瘤; 循环的血管内皮细胞, 肿瘤干细 胞, 血中胎儿细胞, 干细胞, 以及免疫细胞等。 6. 一种用于从血液中快速获取循环的非血缘性有核稀有细胞的试剂盒, 包括: 一种组合物, 所述组合物由下述成份组成: 缓冲液; 包被了抗哺乳类动物 血缘性有核细胞表面标识物抗体的磁性或非磁性免疫微球或免疫颗粒; 细胞分 离介质; 其中, 所述缓冲液的渗透压介于 260〜320 mOsm/kg H20、 pH为 6.8〜 7.8, 所述细胞分离介质在 20°C下的比重为 1.072〜1.076 克 /毫升, 所述细胞 分离介质包含选自下列试剂中的任意一种或任意两种以上的成份: 聚乙烯吡咯 烷酮包被的胶质二氧化硅, 多聚糖和泛影酸钠或其衍生物, 一种含糖的溶液, 由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物; 容纳所述组合物的容器; 适用于保存外周血中循环稀有细胞的抗凝剂; 适 用于免疫荧光或免疫组织化学染色并保证细胞不会脱落的包被电荷的载玻片; 以及所述试剂盒的使用说明书。 7. 根据权利要求 6所述的试剂盒, 其中, 所述免疫微球或免疫颗粒的比重高于所 述细胞分离介质的比重, 所述免疫微球或免疫颗粒共价或非共价结合有特异性 地识别下述的抗哺乳类动物白细胞表面标示物的一种或多种的抗体: CD3、 CD31、 CD34、 CD45、 CD69、 CD84、 或 CD 102。 8. 根据权利要求 6或 7所述的试剂盒, 其中, 所述循环的非血缘性有核稀有细胞 来自人或动物的所有上皮来源的实体瘤细胞, 包括但不局限于胰腺癌、 肺癌、 宫颈癌、 食管癌、 结直肠癌、 乳腺癌、 胃癌、 肝癌等; 或不具有上皮来源的肿 瘤细胞, 如黑色素瘤; 循环的血管内皮细胞, 肿瘤干细胞, 血中胎儿细胞, 干 细胞, 以及免疫细胞等。 9. 根据权利要求 1〜5任一项所述的组合物或根据权利要求 6〜8任一项所述的试 剂盒在用于各种疾病动物模型的生物医学实验中的应用, 所述生物医学实验包 括但不限于新药开发, 新的生物标识物的发现。 10. 根据权利要求 9所述的应用, 其中疾病动物模型包括所有与人类疾病相关的疾 病模型, 包括肿瘤、 心血管疾病、 神经系统疾病和糖尿病。 |
7.75, 所述含糖溶液为选自以下的糖的溶液: 如右旋糖苷、 多聚糖和泛影酸钠或其衍 生物、 或蔗糖等。 在优选实施例中, 所述循环的非血缘性有核稀有细胞选自: 循环的具有上皮来源 的任何实体瘤细胞、 或不具有上皮来源的任何实体瘤细胞, 循环的血管内皮细胞, 肿 瘤干细胞, 干细胞, 以及免疫细胞。 适用于本试剂盒富集的循环的非血缘性有核稀 有细胞包括但不限于循环肿瘤细胞 及循环血管内皮细胞, 可源自动物自发生长, 或因引入人或动物的异常致病细胞 (如肿 瘤细胞;)、 致病基因或蛋白质在相应条件下而生长的肿瘤 或其它疾病模型。 在优选实施例中, 所述肿瘤细胞选自所有实验动物自身生长或因 引人动物或人的 上皮来源的实体瘤细胞, 如肺癌、 宫颈癌、 食管癌、 结直肠癌、 乳腺癌、 胃癌、 肝癌 等; 或不具有上皮来源的肿瘤细胞, 如黑色素瘤等。 在本发明的具体实施方式中, 去除血缘性有核细胞的试剂是将一种或多种识 别哺 乳类实验动物白细胞表面标识物的抗体与磁性 或非磁性固体颗粒或固体表面共价偶联 而成为免疫颗粒。离心分离介质的密度为 1.072〜1.076 克 /毫升, 比重可用任何渗透压 介于 260〜320 mOsm/kg H 2 0、 pH 6.8-7.8 的缓冲液调制而成。 此分离介质可将非血 缘性有核细胞从红细胞及结合了血缘性有核细 胞的免疫颗粒中进行有效的分离。 在优选具体实施例中, 本发明的用于从疾病动物模型的哺乳类动物血 液中快速获 取循环的非血缘性有核稀有细胞的试剂盒, 其中的组合物不包括融破裂解红细胞的组 分, 如红细胞裂解剂等。 在具体实施例中, 本发明还提供了上述组合物或试剂盒在用于生 物医学实验, 或 手动或用于借助于自动化检测仪器设备的操作 中的应用。 在肿瘤新药研究过程中常见的肿瘤动物模型异 种移植实验,以肿瘤大小的变化来 衡量已有的抗肿瘤药或正在研发的抗肿瘤新药 药效,其缺点是耗时长,不敏感。使用本发 明试剂盒分离循环肿瘤细胞可以从细胞水平进 行药效判断,更加准确与敏感。 使用该试剂盒从肿瘤动物模型分离循环肿瘤细 胞可用于有效判断抗肿瘤药或在研 发的抗肿瘤新药是否有效阻断肿瘤血路转移。 循环肿瘤细胞降低或消失可被视为对肿 瘤血路转移的有效抑制。 肿瘤动物模型中的循环肿瘤细胞不仅可以作为 判读抗肿瘤药 物药效的指标, 亦作为现有或正在研制的抗肿瘤新药的靶标。 对循环肿瘤细胞的直接 杀伤可有效阻断肿瘤的转移。 通过对疾病动物模型如心脏病模型动物外周血 中的循环稀有细胞包括但不限于循 环血管内皮细胞的检测可用于心脏病早期诊断 的研究及治疗心脏病新药的开发。 名词解释 血缘性有核细胞: 指白细胞, 包括淋巴细胞(T细胞、 B细胞等); 嗜中性粒细胞; 嗜酸性粒细胞; 嗜碱性粒细胞等。 循环的非血缘性有核细胞: 主要指在血液中循环的具有上皮来源的或不具 有上皮 来源的肿瘤细胞和循环的血管内皮细胞; 肿瘤干细胞, 干细胞, 血中胎儿细胞, 某些 免疫细胞等稀有细胞。 疾病动物模型:在哺乳类动物体内使用各种技 术手段包括但不限于引入致病基因、 肿瘤细胞、 蛋白质等在相应实验条件下建立与人或动物相 关的疾病模型。 本发明主要用于从血液样品中快速去除血浆蛋 白、 红细胞以及血缘性有核细胞, 从而达到富集血液样品中的非血缘性有核细胞 的目的。 在本发明的实施过程中, 将血液采集于含抗凝剂的采血管中。 采用本发明的组合物用于富集血液样品中非血 缘性有核细胞的主要步骤, 包括: 去除血浆蛋白; 应用抗血缘性有核细胞表面标志的特殊单克隆 抗体组合群包被的免疫微球或免疫 颗粒(将抗体共价或非共价偶联于固体表面) ,其中特殊单克隆抗体组合群指的是抗下 述任意一个或几个 CD 的抗体组合: CD3、 CD31、 CD34、 CD45、 CD69、 CD84、 或 CD102; 加入比重为 1.072〜1.076 克 /毫升的细胞分离介质,进行基于特殊密度的 胞分离 介质的离心, 从而富集血中的非血缘性有核细胞。 在本发明的组合物中, 细胞分离介质的比重为 1.072〜1.076 克 /毫升 (gr/ml 或 gr/cm 3 )。 细胞分离介质包含下列任何一种或任意两种以 上的试剂成份: 聚乙烯吡咯烷 酮包被的胶质二氧化硅 ( polyvinylpyrrolidine coated colloidal silica ); 多聚糖 (polysucrose) 与泛影酸钠 (sodium diatrizoate) 或其衍生物的混合物; 由蔗糖和表 氯醇聚合而成的非离子聚合物; 以及可选的任意蛋白溶液。 细胞分离介质的比重可用 任何渗透压介于 260〜320 mOsm/kg H 2 O、 pH 6.8—7.8 的缓冲液调制而成。 在优选实施例中,所述缓冲液的渗透压介于 260〜320 mOsm/kg H 2 0、pH为 6.85〜 7.75。 在优选实施例中,所述细胞分离介质在 20°C下的比重为 1.0722〜 1.0758 克 /毫升。 在优选实施例中, 本发明的用于从疾病动物模型的哺乳类动物血 液中快速获取循 环的非血缘性有核稀有细胞的组合物不包括融 破裂解红细胞的组分, 如红细胞裂解剂 等。 在另一优选实施例的异体移种 (Xenograft)实验中,将人的肝癌细胞注射于裸鼠 (1 百万或以上细胞 /裸鼠)。 注射后第二周起, 在使用小鼠体内成像系统观测到肿瘤转移 病灶形成前, 已在不同动物体内检测到数目不等的循环肿瘤 细胞。 实验证明循环肿瘤 细胞的可检查数目的出现远早于借助显微成像 系统观测到的肿瘤, 其数目多的裸鼠其 肿瘤转移病灶出现早于循环肿瘤细胞数目低的 动物。 此现象亦在接种了乳腺癌的裸鼠 中得到了证实。 对这些肿瘤动物模型进行现有的或正在进行临 床验证的抗肿瘤药治疗, 证明循环 肿瘤细胞数目的变化远早于借助体内成像系统 观察到的肿瘤大小的变化, 且循环肿瘤 细胞数目的变化与肿瘤大小的变化呈正相关。 实验证明,一旦肿瘤动物模型中的循环肿瘤细 胞数目经药物治疗后得到有效控制, 肿瘤原发灶与转移灶及肿瘤的转移都能够得到 有效的控制。 其疗效与药效的敏感性及 意义要远高于观察肿瘤大小的变化。 实施例 1 利用本发明组合物从疾病动物模型哺乳类实验 动物的外周血液样品中快速获取 非血缘性循环有核细胞 采集 l ml动物的外周血于含抗凝剂的采血管中离心 (1000 xg, 15分钟)后, 去 掉血浆蛋白。 将沉积的细胞重悬于 3毫升缓冲液中。 向其中加入 1 毫升包被有抗动物白细胞表 面抗原的单克隆抗体的磁珠后室温孵育 60分钟。 将反应液加到 20毫升的细胞分离介 质上方 (该细胞分离介质在 20°C下的比重为 1.0722〜1.0758 克 /毫升, 该细胞分离介 质包含下列成份: 聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅; 多聚糖和泛影酸钠; 含右旋 糖苷的糖溶液; 由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物), 然后离心 lOOOxg, 15分 钟。 取上清液, 将上清液再离心 1500xg, 10 分钟。 弃去上清液, 得到的沉积细胞即为富集的非血缘性有核细胞 。 离心后得到的沉积细胞重悬于磷酸盐缓冲液后 可做进一步分析。 具体地, 在本发明的组合物中, 免疫微球或免疫颗粒由特异性识别白细胞标示 物 的抗体与微球表面进行共价或非共价偶联而形 成, 所述微球的表面可经过或没有经过 化学处理以适于与蛋白质相偶联, 所述微球的直径介于 10纳米〜 100微米, 所述免疫 微球或免疫颗粒包含或部分包含任何一种下列 成份: 二氧化硅, 右旋糖苷, 琼脂糖, 或交联葡聚糖。 用于制备所述免疫微球的微球为磁性或非磁性 的。 在本发明的组合物中, 用于制备免疫微球或免疫颗粒的抗体特异性地 识别下述但 不局限于这些白细胞表面标示物的一种或几种 : CD3, CD31 , CD34, CD45, CD69, CD84, 或 CD102等。 在本发明的组合物中, 所述免疫微球或免疫颗粒是将任何经过或没有 经过化学处 理的适宜结合蛋白的固体表面如二氧化硅颗粒 与配体或特异的单克隆或多克隆抗体包 括抗白细胞表面标示物的抗体进行共价或非共 价偶联而制备而成。 在本发明的组合物中,所述独特的细胞分离介 质在 20°C温度下比重范围优选介于 1.0722〜1.0758克 /毫升 (gr/ml or gr/cm 3 ), 这一特定范围内的密度适于将几乎所有有 核细胞与红细胞及免疫微球或免疫颗粒进行分 离。 所述细胞分离介质包含下列任何一 种或任意两种以上的试剂成份: 聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅; 多聚糖; 泛影 酸钠或其衍生物; 由蔗糖和表氯醇构成的非离子聚合物; 或任何一种含糖的溶液, 如 右旋糖苷或蔗糖; 碘化小分子化合物 (如甲泛影酰胺 (或甲泛葡胺, metrizamide) ); 或任意蛋白溶液。 所述细胞分离介质的比重可用任何渗透压介于 285〜315mOsm/kg H 2 0、 pH 6.8-7.8的缓冲液在 20°C温度下调制在 1.0722〜1.0758克 /毫升范围内。 所 述免疫微球或免疫颗粒的比重高于所述细胞分 离介质的比重。 基于所述细胞分离介质 的离心在普通的商购的离心管内进行。 本发明的目的还在于提供了一种用于从血液中 快速获取循环的非血缘性有核稀有 细胞的试剂盒, 包括: 一种组合物, 所述组合物由下述成份组成: 缓冲液, 包被了抗血缘性有核细胞表 面标识物抗体的磁性或非磁性免疫微球或免疫 颗粒, 以及细胞分离介质; 其中, 所述 缓冲液的渗透压介于 260〜320 mOsm/kg H 2 0、 pH为 6.8〜7.8, 所述细胞分离介质在 20°C下的比重为 1.072〜1.076克 /毫升, 所述细胞分离介质包含选自下列试剂中的任 意一种或任意两种以上的成份: 聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅, 多聚糖, 泛影 酸钠或其衍生物, 一种含糖的溶液, 由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物。 该试剂盒还包括用于容纳所述组合物的容器以 及包括适合保存循环稀有细胞的抗 凝剂; 适用于免疫荧光或免疫组织化学染色并保证细 胞不会脱落的包被载玻片 在本发明的试剂盒中, 缓冲液, 包被了抗血缘性有核细胞表面标识物抗体的磁 性 或非磁性免疫微球或免疫颗粒, 以及细胞分离介质被分开容纳在不同的容器中 。 在本发明的试剂盒中, 免疫微球或免疫颗粒由特异性识别白细胞标示 物的抗体与 微球或颗粒的表面进行共价或非共价偶联而形 成, 所述微球或颗粒的表面可经过或没 有经过化学处理以适于与蛋白质相偶联, 所述微球或颗粒的直径介于 10纳米〜 100微 米, 所述微球或颗粒包含或部分包含任何一种下列 成份: 二氧化硅, 右旋糖苷, 琼脂 糖, 或交联葡聚糖。 用于制备所述免疫微球的微球为磁性或非磁性 的。 在本发明的试剂盒中, 用于制备免疫微球或免疫颗粒的抗体特异性地 识别下述但 不局限于这些白细胞表面标示物中的一种或多 种: CD3, CD31 , CD34, CD45 , CD69, CD84, 或 CD102等。 在本发明的试剂盒中, 免疫微球或免疫颗粒是将任何经过或没有经过 化学处理的 适宜结合蛋白的固体表面如二氧化硅微球, 或右旋糖苷、 琼脂糖、 或交联葡聚糖微球 与配体或特异的单克隆或多克隆抗体包括抗白 细胞表面标示物的抗体进行共价或非共 价偶联而制备而成。 在本发明的试剂盒中, 优选该细胞分离介质在 20°C 温度下比重范围优选介于 1.0722〜1.0758克 /毫升 (gr/ml或 gr/cm 3 ), 这一特定范围内的密度适于将几乎所有有 核细胞与红细胞及免疫微球进行分离。 所述细胞分离介质包含下列任何一种或任意两 种以上的试剂成份: 聚乙烯吡咯烷 酮包被的胶质二氧化硅; 多聚糖加泛影酸钠或其衍生物; 由蔗糖和表氯醇构成的非离 子聚合物; 或任何一种含糖的溶液, 如右旋糖苷或蔗糖; 碘化小分子化合物 (如甲泛 影酰胺 (metrizamide) ); 或任意蛋白溶液。 所述细胞分离介质的比重可用任何渗透压 介于 260〜320mOsm/kg H 2 0、 pH 6.8—7.8的缓冲液在 20°C温度下调制在 1.0722〜 1.0758 克 /毫升范围内。 所述免疫微球或免疫颗粒的比重高于所述细胞 分离介质的比 重。 细胞分离介质的离心在普通商购的离心管内进 行。
实施例 2 利用本发明判断抗肿瘤药物的有效性 向裸鼠皮下注射人肺转移肝癌细胞 (lxlO 6 细胞 /鼠)。 3-4周后,可见皮下肿瘤形成。 将部分此肿瘤移植到另一裸鼠肝脏。此后, 每周使用体内成像系统观察转移癌的生成。 与此同时, 每周尾静脉取血一次,并利用本发明试剂盒检 测血中循环肿瘤细胞。 另外一 种实验方法为在裸鼠乳腺附近皮下注射人肺转 移乳腺肿瘤细胞 (lxlO 6 /鼠), 从注射第 二周开始, 每周使用本发明试剂盒监测鼠外周血循环肿瘤 细胞, 并使用体内成像系统 观察肿瘤转移灶的形成。 实验证明, 使用成像系统需要在至少 5-6周或更长时间以后 才可观测到肺转移灶的形成,而循环肿瘤细胞 在接种后第二周即可从血中检测到。 应用目前常规使用的化疗药 5-FU或某些正在研发的抗肿瘤药对按上述方法 备 的肿瘤动物模型进行给药, 循环肿瘤细胞在给药后第 2-3天即开始下降, 而依赖成像 系统观察到的肿瘤缩小则要等到 4-5周以后才可观察到。 本领域的技术人员应当明了, 上述所有优选实施例只是对本发明的具体说明 , 并 不构成对本发明的限制。 根据需要可以对其进行多种改进, 组合, 亚组合以及变换, 所有的改进, 组合, 亚组合、 变换以及等效替换都落入在所附的权利要求的 范围内。
Next Patent: WIRELESS TERMINAL